Muismodel van coronaire collaterale groei door repetitieve ischemie

Samenvatting

Dit artikel presenteert een methode om postnatale coronaire collaterale groei te bestuderen die wordt geïnduceerd door repetitieve ischemie bij muizen, inclusief de chirurgische implantatie van een pneumatische occluder op de linker voorste dalende slagader, een geautomatiseerd opblaassysteem voor het repetitieve ischemieprotocol en mogelijke methoden om collaterale groei te evalueren.

Samenvatting

Coronaire collateralen zijn een natuurlijke bypass bij ischemische hartziekten (IHD), en daarom is coronaire collaterale groei (CCG) al vele jaren een veelbelovend therapeutisch doelwit voor IHD, vooral bij patiënten met diabetes type 2 of metabool syndroom waarbij CCG is aangetast. Dit proces is echter onderbelicht, deels vanwege het ontbreken van muismodellen van CCG, hoewel er andere diermodellen, zoals varkens, honden en ratten, zijn vastgesteld. Een muismodel kan gebruik maken van de vele genetische modificaties die beschikbaar zijn voor de soort, waaronder het traceren van afstamming en genregulatie (overexpressie of knock-out), om het proces en het mechanisme van CCG op te helderen, inclusief de betrokken routes en celtypen. We zijn daarom begonnen met het ontwikkelen van een muismodel van CCG geïnduceerd door repetitieve ischemie (RI) via voorbijgaande, herhaalde occlusie van de linker voorste dalende slagader (LAD). Dit manuscript bevat details van dit CCG-muismodel, inclusief de RI-operatie om een pneumatische occluder op de LAD te implanteren, het geautomatiseerde op druk gebaseerde opblaassysteem dat wordt gebruikt voor het regelen van de druk en timing van het opblazen, en de volgorde van het RI-protocol. Deze methode heeft al een publicatie opgeleverd om het proces van CCG geïnduceerd door RI op te helderen, waaruit blijkt dat ontkiemende angiogenese aanleiding geeft tot rijpe kransslagaders in CCG in volwassen muizenharten.

Inleiding

Ischemische hartziekte (IHD) is de belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten en jaarlijks worden meer dan 200.000 bypassoperaties van de kransslagader uitgevoerd in een poging de ziekte te behandelen¹. Coronaire collateralen, anastomosen tussen takken van de kransslagader, zijn een natuurlijke bypass die bloed kan leveren aan ischemisch weefsel stroomafwaarts van een blokkade²; Mensen vertonen echter een grote variatie in de omvang van hun eigen collaterale netwerken ^3,4. Patiënten met IHD die een uitgebreidere coronaire collateralisatie hebben, hebben betere resultaten tijdens cardiale gebeurtenissen, waaronder verminderde infarctgrootte en mortaliteit. Daarom is coronaire collaterale groei (CCG) al meer dan een decennium een therapeutisch doelwit ^5,6,7. Het is van bijzonder belang voor het groeiende aantal patiënten met metabool syndroom⁸, die een slechtere coronaire collateralisatie vertonen⁹. Totdat het proces en het mechanisme van CCG beter worden begrepen, is het echter onwaarschijnlijk dat pogingen om CCG te induceren voor de behandeling van IHD vruchtbaar zullen zijn.

Coronaire collateralen zijn bestudeerd in grote diermodellen en korte, herhaalde occlusies van de belangrijkste kransslagaders zijn gebruikt om CCG te induceren bij varkens¹⁰, honden¹¹ en ratten¹². Een muismodel van CCG zou echter meer voordelen hebben bij het bestuderen van de moleculaire en cellulaire mechanismen van CCG vanwege de vele genetisch gemodificeerde muislijnen die direct beschikbaar zijn, waaronder afstammingstracering, genspecifieke of celspecifieke transgene en knock-outlijnen. Interessant is dat muizen, in tegenstelling tot mensen, naar verluidt geen inheemse coronaire collateralen hebben ^13,14, waardoor ze een aantrekkelijk model zijn om de vorming van coronaire collateralen te bestuderen. Uit een recent rapport bleek inderdaad dat bij patiënten met obstructieve hartziekte bijna de helft (47%) geen collateralisatie had (Rentrop graad 0)³; dus een muismodel van CCG zou klinisch relevant kunnen zijn voor patiënten met minimale native collateralisatie.

Daarom hebben we een muismodel ontwikkeld van CCG geïnduceerd door repetitieve ischemie, met een opblaasbare ballonafsluiter over de linker voorste dalende slagader (LAD) die gebruik maakt van een op druk gebaseerd opblaassysteem dat is geautomatiseerd met een timer. Het repetitieve ischemieprotocol is in staat om collaterale groei te stimuleren, zoals blijkt uit een recente publicatie¹⁴. Dit muismodel van CCG zal nieuw inzicht verschaffen in het proces van CCG op cellulair en moleculair niveau en kan worden gebruikt om potentiële doelen voor het bevorderen van CCG te valideren.

Protocol

De beschreven dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Northeast Ohio Medical University.

1. Chirurgische voorbereiding

OPMERKING: Gebruik voor het RI-protocol C57BL/6-muizen van beide geslachten die ten minste 25 g wegen. Gebruik een aseptische techniek tijdens de hele operatie.

1. Setup
   1. Steriliseer al het gereedschap in een autoclaaf of kralensterilisator. Steriliseer delicate materialen en implantaten, zoals occluder-, tether- en PE-slangen, met ethyleenoxide (EtO).
   2. Reinig het operatiegebied door alle gebieden af te vegen met 70% ethanol. Bereid het gebied voor door alle gereedschappen en benodigdheden op steriele gordijnen neer te leggen. Zie Materiaaltabel voor een volledige lijst van benodigdheden.
2. Intubatie bij muizen
   1. Verdoof de muis kort met 3% isofluraan met zuurstof (debiet van 1 l/min) totdat de oprichtreflex verloren is gegaan. Scheer de borst, het midden van de rug en achter het rechteroor; Verwijder losse haren volledig. Injecteer glycopyrrolaat intramusculair in een dosis van 0,01-0,02 mg/kg.
   2. Verdoof opnieuw met 3%-4% isofluraan gedurende 5 minuten. Plaats de muis in rugligging op een helling, vastgehouden aan de bovenste snijtanden, en gebruik een stompe tang om de tong opzij te bewegen. Intubeer de muis snel met een angiocath van 20 G met behulp van een glasvezellamp en een vergrotende laryngoscoop.
   3. Plaats de muis in rugligging op een verwarmend chirurgisch kussen en sluit de intubatieslang aan op een beademingsapparaat voor kleine dieren met 3% isofluraan. Bevestig de intubatie door te controleren op ritmische bilaterale borstkasstijging. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie door het ontbreken van een teenbeknellingsreactie.
3. Voorbereiding van het chirurgische veld
   1. Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
   2. Reinig de geschoren gebieden met betadine en vervolgens 70% ethanol, eenmaal op een unidirectionele manier afvegen.
   3. Breng elektrodecrème aan op de elektrocardiogramcontacten (ECG) op het operatiekussen en plak de ledematen van de muis eraan vast. Drapeer steriel gaasje over de onderste helft van de muis.
   4. Bewaak de ademhalingsfrequentie, temperatuur en diepte van de anesthesie tijdens de operatie met behulp van de software-interface van het operatiekussen.
4. Linker thoracotomie en implantatie van occluder
   1. Verlaag isofluraan tot 2%. Maak met een schaar een incisie van 2-3 cm in de middellijn in de huid op de borst en gebruik vervolgens een gebogen tang om de huid- en spierlagen aan de linkerkant van de borst voorzichtig te scheiden (Figuur 1A).
   2. Maak met een stompe tang voorzichtig een opening door de thoracale wand om het hart bloot te leggen, meestal tussen de^3e en 5e intercospalen.
   3. Gebruik een retractor om de ribben voorzichtig te spreiden en het hart te visualiseren. Scheur met een stompe tang het hartzakje om het hart bloot te leggen. Zoek de linker oorschelp (Figuur 1B) en visualiseer indien mogelijk het basale deel van de linker voorste dalende slagader (LAD).
   4. Geef een 8-0 door polypropyleen hechtdraad door het myocardium onder de LAD.
      OPMERKING: De afstand tussen de in- en uitgang moet ongeveer gelijk zijn aan de breedte van de afsluiter en loodrecht op de LAD staan.
   5. Verwijder het oprolmechanisme. Gebruik een puntige tang om het uiteinde van de occluderslang door de borstwand in de tweede inferieure intercostale ruimte te exterioriën en trek de occluderslang door de borstwand naar buiten totdat de occluder zich boven het hart in de borstholte bevindt.
   6. Bind de occluder stevig aan het hart met behulp van een chirurgische knoop (Figuur 1C) zodat de occluder op het hart ligt maar er niet in drukt.
   7. Blaas de afsluiter kort op (~10 s) bij 10 psi met behulp van de drukknopopblaasinrichting (Figuur 2). Controleer het ECG om de ST-hoogte tijdens het opblazen te bevestigen en, indien mogelijk, de blancheren van de harttop visueel te bevestigen. Pas de positie of spanning van de hechtdraad indien nodig aan om ischemie te bevestigen.
5. Afsluiting
   1. Sluit de flankerende ribben met 6-0 polypropyleen hechtdraad en breng de borstbuis in. Evacueer lucht en bloed uit de borstkas en verwijder vervolgens de thoraxbuis. Breng 2% lidocaïne aan op de gesloten incisie in de borstwand.
   2. Gebruik een puntige tang om de occluder tubing onder de huid van de rechterschouder te tunnelen om de tubing door de huid achter het rechteroor te exterioriën. Vervang de borstspieren en sluit de huid met een 6-0 polyglactine-hechtdraad (Figuur 1D).
   3. Draai de muis naar de buikligging. Dien ketoprofen subcutaan toe in een dosering van 3 mg/kg (met een verdunning van 1 mg/ml in 0,9% steriele zoutoplossing) ten minste 30 minuten voor het einde van de operatie.
6. Implantatie van ketting
   1. Maak met een kleine schaar een kleine incisie (1 cm) in de huid in het midden van de rug en scheid de huid voorzichtig van het onderhuidse vet- en spierweefsel.
   2. Tunnel de occluder-slang naar de incisie in het midden van de achterkant, exteioriseer deze en haal deze door de ketting. Gebruik een 6-0 hechting om het kleine gaatje bij het oor te dichten.
   3. Gebruik 6-0 polypropyleen hechtingen om de ketting aan de rugspieren te bevestigen (Figuur 1E). Sluit de huid over de tether-knop met 6-0 hechtingen.
7. Terugwinning
   1. Verwijder de intubatieslang zodra de muis zelfstandig kan ademen; plaats de muis in een postoperatieve RI-kooi (voor een enkel dier; Figuur 3) zodra de voetbeknellingsreactie is teruggekeerd. Houd de muis continu in de gaten totdat deze weer voldoende bewustzijn heeft om de sternale lighouding te behouden. Plaats de kooi op een warmtekussen totdat de muis weer volledig beweeglijk is.
   2. Dien de volgende dag een tweede dosis ketoprofen subcutaan toe in een dosis van 3 mg/kg.
   3. Laat de muis 5-7 dagen rusten voordat u met het RI-protocol begint. Controleer muizen dagelijks op integriteit van de instrumenten en vervang de kooien indien nodig. Zorg indien nodig voor de juiste verrijking, aangezien muizen alleen worden gehuisvest voor de duur van het RI-protocol.

2. Herhaalde ischemie

1. Controleer de plaatsing van de occluder door middel van echocardiografie op dag 0 van het RI-protocol, zoals eerder beschreven¹⁵. Let op de afname van de hartfunctie tijdens het opblazen van de occluder.
2. Sluit de occluderslang van de muis aan op het RI-opblaassysteem (Afbeelding 4). Het systeem blaast de afsluiter 4x per dag op tot 10 psi gedurende 6 minuten, met een pauze van 3 uur tussen elke keer opblazen (Figuur 5).
3. Controleer na 17 dagen RI de hartfunctie opnieuw zoals in stap 2.1.

3. Polymeerperfusie en weefseloogst

1. Verdoof de muis op het moment van offeren met 3%-4% isofluraan en injecteer heparine (500 E/kg) intraperitoneaal. Gebruik een neuskegel om de toediening van isofluraan met 2% gedurende ten minste 5 minuten voort te zetten en bevestig vervolgens de voldoende diepte van de anesthesie door het ontbreken van een teenknijpreactie.
2. Open de borstholte om het hart en de thoracale aorta bloot te leggen. Cannuleer de dalende thoracale aorta met PE20-slang en snijd de inferieure vena cava (IVC) in tweeën om uitstroom mogelijk te maken; verlaat het hart retrograde met 1x PBS totdat de vloeistof die de IVC verlaat helder is, gevolgd door 3 ml 1% lidocaïne en vervolgens 3 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Maak een permanente ligatie van de LAD op de exacte positie van de occluder.
3. Doordrenk het hart retrograde met een radiopaak reagens totdat het arteriële circuit is gevuld. Klem de PE20-slang vast met hemostaten en laat het polymeer 90 minuten uitharden. Stel het hart voor onder een dissectiescoop.

Resultaten

Van de 136 C57BL/6-muizen, waaronder zowel mannetjes als vrouwtjes, was het overlevingspercentage van de RI-operatie 93,4%, waarbij 80,9% van de muizen het volledige 17-daagse RI-protocol overleefde.

Het RI-protocol van de muis is geoptimaliseerd op basis van eerdere RI-modellen bij dieren^12,16, die korte episodes van ischemie hebben zonder blijvend letsel aan het myocardium. Tijdens de operatie kan de...

Discussie

Coronaire collateralen zijn een natuurlijke bypass voor IHD-patiënten. Na de mislukte klinische onderzoeken gericht op angiogenese¹⁷ zou het bevorderen van de ontwikkeling van coronaire collaterale een betere therapeutische benadering kunnen zijn voor deze patiënten. Anders dan haarvaten afgeleid van angiogenese, die slechts een enkele laag endotheelcellen hebben, zijn collateralen rijpe slagaders met de dekking van gladde spiercellen. Collateralen voeden de bloed...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#5/45 grade forceps	Fine Science Tools	11251-35
1/4" Gesloten Messing Elektrische Solenoidklep	U.S. Solid	USS2-00054	opblaassysteem
1/4" Open Messing Elektrische Solenoidklep	AceCrew		opblaassysteem
1/4" pneumatische buizen	‎China SNS Pneumatic Co.,Ltd	‎APU1/4-32.8ft	drukknopapparaat
1/4" push-in connectoren	RuoFeng	543Y	drukknopapparaat
1/8" messing fittingen	Edge Industrial		opblaassysteem
2 Positie Pneumatische Elektrische Solenoidklep	U.S. Solid	USS- PSV00033	drukknopapparaat
20G angiocath	BD	381703
45 graden Castroviejo naaldhouders	Roboz	RS-6421
6-0 polyglactin hechtingen	DemeTECH	G176011B13M
6-0 polypropyleen hechtingen	AD Sugical	XS-P618R11
70% Ethanol
8-0 polypropyleen hechtingen	DemeTECH	PM19800, 65G0P
Betadine	Purdue Products	367618150085
Blunt neus schaar	World Precision Instruments	500366
Koolstofvezel pijlschacht			post-chirurgisch kooi; gesneden tot 12,5 cm
Wattenstaafjes (3")	Puritan	872-PC DBL
Curity Gaas Sponges (2x2)	Cardinal Health	2146
Dipsey draaibare loodjes	Water Gremlin		post-chirurgisch kooi
Elektrode crème	Signacreme	17-05
Glycopyrrolate	Westward	0143-9679-01
Hartman hemostatis	Fine Science Tools	13003-10
Isofluraan	Covetrus	29404
Ketofen (ketoprofen)	zoetis	10004031
Lidocaine (2%)	Covetrus	14583
MICROFIL (geel)	Flow Tek	MV-122
Mini Drukknop	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	drukknopapparaat
Miniatuur Luchtdrukregelaar	PneumaticPlus	PPR2-N02BG-4	drukknopapparaat
Mini-Colibri veerretractor	Fine Science Tools	17000-01
MiniVent ventilator	Harvard Apparatus	73-0044
Occluder			Op maat gemaakt
Octagon handgreep forceps	Fine Science Tools	11041-08
Ohan knaagdier intubatie systeem	BMR Supply	Ohan-201
Paraformaldehyde oplossing 4% in PBS	Santa Cruz	sc-281692
PE20 buizen
PE50 buizen
Kunststof draaibaar (1 kanaal)	Instech	375/25PS	post-chirurgisch kooi
Voorgemixte PBS Buffer, 10x	Roche	11666789001	Verdund tot 1x
Drukmeter	PIC Gauges	102D-158D-10/32	drukknopapparaat
Programmeerbare Digitale Stopcontact Timer	BN-LINK	‎BND-60/SU105	opblaassysteem
Puralube Vet Opthalmic Zalf	Dechra	17033-211-38
Retractoren met 18200-07 elastomeer	Fine Science Tools	18200-10 en 18200-11
Rodent Surgical Monitor+	Scintica	900-0053-01
Rond handgreep hechtingen forceps	Fine Science Tools	18026-10
Snap-lock vat draaibaar (maat 5)	Eagle Claw	‎01032-005	post-chirurgisch kooi
Rechte naaldhouders	Fine Science Tools	12060-01
Tether	Instech	PS62