Differentiatie van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel van menselijke pluripotente stamcellen

Samenvatting

Het afleiden van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel (ENS) uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) biedt een schaalbare bron van cellen om de ontwikkeling en ziekte van ENS te bestuderen en om te gebruiken in regeneratieve geneeskunde. Hier wordt een gedetailleerd in vitro protocol gepresenteerd om enterische neuronen af te leiden uit hPSC's met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden.

Samenvatting

Het menselijk enterisch zenuwstelsel, ENS, is een groot netwerk van glia- en neuronale celtypen met een opmerkelijke diversiteit aan neurotransmitters. Het ENS regelt de darmmotiliteit, enzymsecretie en opname van voedingsstoffen en interageert met het immuunsysteem en het darmmicrobioom. Bijgevolg zijn ontwikkelings- en verworven defecten van het ENS verantwoordelijk voor veel ziekten bij de mens en kunnen ze bijdragen aan de symptomen van de ziekte van Parkinson. Beperkingen in diermodelsystemen en toegang tot primair weefsel vormen aanzienlijke experimentele uitdagingen bij studies van het menselijke ENS. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor effectieve in vitro afleiding van de ENS-lijnen uit menselijke pluripotente stamcellen, hPSC, met behulp van gedefinieerde kweekomstandigheden. Ons protocol begint met gerichte differentiatie van hPSC's naar enterische neurale topcellen binnen 15 dagen en levert binnen 30 dagen diverse subtypes van functionele enterische neuronen op. Dit platform biedt een schaalbare bron voor ontwikkelingsstudies, ziektemodellering, het ontdekken van geneesmiddelen en regeneratieve toepassingen.

Inleiding

Het enterische zenuwstelsel (ENS) is het grootste onderdeel van het perifere zenuwstelsel. Het ENS bevat meer dan 400 miljoen neuronen die zich in het maagdarmkanaal bevinden en bijna alle functies van de darm controleren^. Moleculair begrip van de ontwikkeling en functie van het ENS en de defecten ervan bij enterische neuropathieën vereist toegang tot een betrouwbare en authentieke bron van enterische neuronen. De toegang tot menselijk primair weefsel is beperkt en diermodellen slagen er niet in om de belangrijkste ziektefenotypes in veel enterische neuropathieën te recapituleren. Menselijke pluripotente stamceltechnologie (hPSC) is buitengewoon nuttig gebleken bij het bieden van een onbeperkte bron van gewenste celtypen, vooral die welke moeilijk te isoleren zijn van primaire bronnen 2,3,4,5,6,7. Hier geven we details over een stapsgewijze en robuuste in vitro methode om ENS-culturen uit hPSC's te verkrijgen. Deze schaalbare hPSC-afgeleide culturen openen wegen voor ontwikkelingsstudies, ziektemodellering en high-throughput medicijnscreening en kunnen transplanteerbare cellen leveren voor regeneratieve geneeskunde.

Enterische neuronlijnen zijn afgeleid van neurale topcellen (NC) die het ENS-ontwikkelingspad volgen tijdens de embryogenese. In embryo's verschijnen NC-cellen langs de randen van de vouwende neurale plaat. Ze vermenigvuldigen, migreren en geven aanleiding tot veel verschillende celtypen, waaronder sensorische neuronen, Schwann-cellen, melanocyten, craniofaciale skelet- en darmneuronen en glia ^8,9,10. De beslissing over het lot van de cel hangt af van het specifieke gebied langs de voorste-achterste as waaruit de NC-cellen tevoorschijn komen, d.w.z. craniale NC, vagale NC, romp NC en sacrale NC. Het ENS ontwikkelt zich uit vagale en sacrale NC-cellen, waarbij de eerste de populatie van de darmneuronen domineert als gevolg van de uitgebreide migratie langs de lengte van de darm en het koloniseren van de darm¹¹.

Afleiding van NC-cellen uit PSC's omvat gewoonlijk een combinatie van dubbele SMAD-remming en activering van de WNT-route^12,13. Tot voor kort betroffen alle NC-inductieprotocollen serum- en andere additieven van dierlijke producten in de kweekomstandigheden. Chemisch ongedefinieerde media verlagen niet alleen de reproduceerbaarheid van NC-inductie, maar dagen ook mechanistische ontwikkelingsstudies uit. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, ontwikkelden Barber et al¹⁴ een NC-inductieprotocol met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden en was daarom voordelig ten opzichte van alternatieve methoden die afhankelijk zijn van serumvervangende factoren (bijv. KSR)^13,14. Dit werd verkregen door basale mediavervangingen en het optimaliseren van een protocol dat oorspronkelijk werd gepresenteerd door Fattahi et al. om enterische NC-cellen af te leiden uit hPSC's. Dit verbeterde systeem is de basis van het hPSC-differentiatieprotocol dat hier wordt gepresenteerd. Het begint met inductie van enterische neurale crest (ENC)-cellen in een periode van 15 dagen door nauwkeurige modulatie van BMP-, FGF-, WNT- en TGFβ-signalering naast retinoïnezuur (RA). Vervolgens leiden we de ENS-lijnen af door cellen te behandelen met gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF). Alle mediasamenstellingen zijn chemisch gedefinieerd en leveren binnen 30-40 dagen robuuste enterische neuronale culturen op.

Naast het hier beschreven monolayer celkweeksysteem zijn er alternatieve NC-inductiebenaderingen ontwikkeld die gebruik maken van vrij zwevende embryoïde lichamen ^15,16. Van migrerende cellen in deze culturen is aangetoond dat ze NC-markers tot expressie brengen met een subset die de vagale NC vertegenwoordigt. Co-culturen met primair darmweefsel zijn gebruikt om enterische NC-voorlopers in deze culturen te verrijken. Mediasamenstellingen in deze onderzoeken bevatten een combinatie van verschillende factoren, zoals zenuwgroeifactor, NT3 en van de hersenen afgeleide neurotrofe factor. In dit stadium is het niet volledig duidelijk hoe deze factoren de bindingsidentiteiten van de voorlopers van enterische neuronen kunnen beïnvloeden. Voor een efficiënte vergelijking van de enterische NC-inductie in de monolaag en de embryoïde-lichaam-gebaseerde culturen zijn meer gegevens nodig. Gezien de verschillende cultuurlay-outs in deze strategieën, moet het gebruik van elke methode worden overwogen en geoptimaliseerd op basis van de specifieke toepassing in gedachten.

Het hier gepresenteerde protocol is reproduceerbaar en is door ons en anderen met succes getest met behulp van verschillende hPSC-lijnen (geïnduceerd en embryonaal) ^8,14,16.

Protocol

1. Voorbereiding van de media

OPMERKING: De concentraties die in het hele protocol worden genoemd, zijn de eindconcentraties van de mediacomponenten. Bereid alle media onder steriele omstandigheden voor in een laminaire vloeikap en bewaar ze bij 4 °C in het donker. Gebruik binnen 2 weken.

1. hPSC-onderhoudsmedium: Meng het voedingsvrije hPSC-onderhoudsmediumsupplement (20 μL/ml) met het basismedium.
2. Medium A: Voeg botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP4; 1 ng/ml), SB431542 (10 μM) en CHIR99021 (600 nM) toe aan het differentiatiebasismedium.
3. Medium B: Voeg SB431542 (10 μM) en CHIR99021 (1,5 μM) toe aan het differentiatiebasismedium.
4. Medium C: Voeg SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) en RA (1 μM) toe aan het differentiatiebasismedium.
5. Neural crest complete (NCC) Medium: Voeg FGF2 (10 ng/ml), CHIR99021 (3 μM), N2-supplement (10 μL/ml), B27-supplement (20 μL/ml), L-glutaminesupplement (10 μL/ml) en MEM NEAA's (10 μL/ml) toe aan neurobasaal medium.
6. ENC-medium: Voeg GDNF (10 ng/ml), ascorbinezuur (100 μM), N2-supplement (10 μL/ml), B27-supplement (20 μL/ml), L-glutaminesupplement (10 μL/ml) en MEM NEAA's (10 μL/ml) toe aan neurobasaal medium.
7. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) 1x: Verdun 500 mM EDTA (1000x) tot een eindconcentratie van 500 μM in PBS.
   OPMERKING: Gebruik Ca²⁺ en Mg²⁺ vrije PBS in dit protocol, tenzij anders vermeld.

2. Coaten van kweekplaten

1. Met basale membraanmatrix beklede platen: Ontdooi en verdun snel een bevroren aliquot van 500 μl basale membraanmatrix in 50 ml gekoelde DMEM:F12 door krachtig te pipetteren met een serologische pipet van 50 ml. Smeer de putjes in met de verdunde basaalmembraanmatrixoplossing (100 μl per^cm2 putoppervlak) en incubeer ze een nacht bij 37 °C. Zuig het coatingmedium op voor gebruik. Om verstijfseling van de basale membraanmatrix te voorkomen, voert u deze stap zo snel mogelijk uit en gebruikt u koude DMEM:F12 voor het oplossen van de bevroren aliquot.
   OPMERKING: De temperatuur van de basale membraanmatrix moet koud worden gehouden tijdens het ontdooien (op ijs) en aliquoteren (buizen op ijs) om coagulatie te voorkomen.
2. PO/FN/laminine gecoate platen: Bereid een 15 μg/ml polyornithine (PO) oplossing in PBS door een 1000x bouillon te verdunnen. Smeer de putjes in met 100 μl PO/PBS-oplossing per cm² putoppervlak en incubeer de platen een nacht bij 37 °C. Aspireer de volgende dag PO/PBS en smeer de putjes in op 100 μl per^cm2 putoppervlak met vers gemaakte FN/laminine/PBS-oplossing die 2 μg/ml fibronectine (FN) en 2 μg/ml laminine bevat. Platen kunnen worden gebruikt na minimaal 2 uur incubatie bij 37 °C. Zuig FN/laminin/PBS op voor gebruik.

3. Behoud van de hPSC-cultuur

OPMERKING: Alle celincubatiestappen zijn bij 5% CO₂ en bij 37 °C in een bevochtigde incubator.

1. Aspireer hPSC-medium uit de hPSC-cultuur en voeg om de dag vers medium toe (200 μL per^cm2 putoppervlak) totdat de kolonies ~80% samenvloeien.
2. Om te passeren, zuigt u hPSC-medium op en wast u de cellen met 100 μL PBS per^cm2 putoppervlak.
   LET OP: Het is belangrijk om Ca²⁺ en Mg²⁺ vrije PBS te gebruiken om de cellen te wassen.
3. Voeg 500 μM EDTA toe (100 μL per^cm2 putoppervlak). Plaats het deksel van de plaat terug. Kijk door een omgekeerde microscoop en controleer de cellen op loslating van de kolonieranden (2-4 min).
4. Gebruik een serologische pipet van 5 of 10 ml om hetzelfde volume hPSC-medium in elk putje over te brengen en oogst de cellen mechanisch door een paar keer op en neer te pipetteren.
   OPMERKING: De optimale EDTA-incubatietijd is afhankelijk van de iPSC-lijn. Vermijd krachtig pipetteren voor het losmaken van kolonies, omdat dit kan leiden tot overmatige dissociatie van de kolonie en celdood. Bij het passeren om een differentiatieplaat te starten, incubeer cellen met EDTA 1-2 minuten langer.
5. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml. Draai de cellen rond (2 min, 290 x g, 20-25 °C) en gooi het supernatant voorzichtig weg.
6. Resuspendeer de cellen in een geschikt volume hPSC-medium en breng ze over naar putjes van een nieuwe met basaalmembraanmatrix beklede plaat.
   OPMERKING: Gebruik voor regelmatig hPSC-onderhoud een passaging-verhouding van 1:18 - 1:24 (1:18 betekent het overbrengen van een derde van de cellen gedissocieerd van een enkel putje van een plaat met 6 putjes naar een volledig nieuwe plaat). Om een differentiatieplaat te starten, volgt u een passaging-verhouding van 5:6.
7. Incubeer bij 5% CO₂ en 37 °C.

4. Inductie van neurale kam

OPMERKING: Deze stap is schematisch weergegeven in figuur 1A. Begin met NC-differentiatie wanneer cellen voor ongeveer 80% samenvloeien. Dit zal binnen 1-2 dagen worden bereikt wanneer cellen worden gepasseerd in een verhouding van 5:6 (zie hierboven). Start NC-differentiatie op dag 0 met pluripotente en volledig ongedifferentieerde hPSC-cellen. Voor een hoge efficiëntie moeten de koloniegrenzen minimale differentiërende cellen hebben. Passage en plaat hPSC voor differentiatie wanneer kolonies groot zijn, of het centrum van de kolonie begint dikker/donkerder te worden wanneer het wordt gecontroleerd met een omgekeerde microscoop. Aandacht besteden aan de samenvloeiing en morfologie is meestal betrouwbaarder dan het aantal vergulde cellen, aangezien dit kan variëren afhankelijk van de cellijn en kan variëren van 50.000-200.000 per cm².

1. Vervang op dag 0 hPSC-onderhoudsmedium door medium A met 1 ng/ml BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μL medium per cm² putoppervlak).
2. Op dag 2 moeten de cellen 100% samenvloeiend zijn. Zuig verbruikt medium A voorzichtig op en voed de cellen met medium B met 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μL medium per^cm2 putoppervlak).
   OPMERKING: Naarmate culturen groeien tijdens de NC-inductie, kunnen cellen loskomen van de onderliggende monolaag. Voorkom overmatig celverlies door oude media voorzichtig te verwijderen en nieuwe media aan de zijkant van de put toe te voegen.
3. Op dag 4 voed de cellen de cellen opnieuw met Medium B (200 μL medium per^cm2 putoppervlak).
4. Vervang op dag 6 medium B door medium C met 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 en 1 μM retinoïnezuur (400 μL medium per cm² putoppervlak).
5. Op dag 8 en 10 voer je zoals dag 6.

5. ENC-sferoïde vorming

OPMERKING: Deze stap is schematisch weergegeven in Figuur 1B.

1. Aspireer op dag 12 voorzichtig Medium C en was de cellen met 100 μL PBS per^cm2 putoppervlak. Voeg dezelfde hoeveelheid oplossing voor celloslating toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 5% CO₂ en 37 °C.
2. Verdun de oplossing voor celloslating door hetzelfde volume NCC-medium toe te voegen dat 10 ng/ml FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μL/ml N2-supplement, 20 μL/ml B27-supplement, 10 μL/ml L-glutaminesupplement en 10 μL/ml mem NEAA bevat. Gebruik een serologische pipet om de eencellige suspensie te oogsten en toe te voegen aan een conische buis van 15 ml.
3. Draai de cellen rond (2 min, 290 x g, 20-25 °C) en gooi het supernatant voorzichtig weg.
4. Voeg met een serologische pipet van 10 ml 12 ml (voor een volledige plaat met 6 gaatjes) NCC-medium toe en resuspendeer de cellen volledig door 1-2 keer mechanisch op en neer te pipetteren. Breng de celsuspensie over naar een ultralage bevestigingsplaat.
   OPMERKING: Ongeveer 10^cm2 ENC-monolaagcellen worden geresuspendeerd in 2 ml NCC-medium en overgebracht naar een putje van een ultralage bevestigingsplaat. Dit komt overeen met een volledige NC-inductieplaat met 6 putjes die is overgebracht naar een volledige ultralage bevestigingsplaat met 6 putjes.
5. Draai op dag 14 de platen voorzichtig rond totdat er kleine sferoïden in het midden van elk putje zijn verzameld. Gebruik een P1000-micropipet en in een langzame cirkelvormige beweging om het gebruikte NCC-medium rond de omtrek van elk putje op te zuigen. Probeer te voorkomen dat de vrij zwevende sferoïden worden verwijderd.
6. Voed de cellen met het oorspronkelijke volume NCC-medium.

6. EN inductie

OPMERKING: Deze stap is schematisch weergegeven in Figuur 1B.

1. Pas op dag 15 dezelfde techniek toe die op dag 14 wordt gebruikt om het medium voorzichtig te verwijderen en de sferoïden te wassen met PBS. Verwijder zoveel mogelijk PBS en vermijd de sferoïden.
2. Voeg de oplossing voor celloslating toe (100 μl per^cm2 van het oppervlak van de put) en dissocieer de sferoïden in afzonderlijke cellen door 30 minuten te incuberen bij 5% CO₂ en 37 °C.
3. Voeg met behulp van een serologische pipet van 10 ml een gelijk volume ENC-medium (met 10 ng/ml GDNF, 100 μM ascorbinezuur, 10 μL/ml N2-supplement, 20 μL/ml B27-supplement, 10 μL/ml L-glutaminesupplement en 10 μL/ml mem NEAA in neurobasaal medium) toe aan elk putje en breek de resterende sferoïden door 2-3 rondes mechanisch pipetteren. Breng de cellen over in een conische buis van 50 ml.
   OPMERKING: Vermijd overmatige stress en celdood die kunnen optreden door geforceerd pipetteren of het gebruik van pipetten met een kleinere tipopening.
4. Draai de cellen rond (2 min, 290 x g, 20-25 °C) en gooi het supernatant voorzichtig weg. Gebruik een serologische pipet van 10 ml om ~ 5-10 ml ENC-medium toe te voegen en resuspendeer de cellen volledig door 1-2 keer op en neer te pipetteren.
5. Tel de concentratie van levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw en een celtelmethode zoals een hemocytometer.
   LET OP: Trypanblauw is vermoedelijk kankerverwekkend. Voorzichtig behandelen, op de juiste manier weggooien.
6. Voeg voldoende volume ENC-medium toe om ongeveer 300.000-400.000 levensvatbare cellen per^cm2 oppervlak te bedekken met een dichtheid van ongeveer ~ 1.000.000 cellen per ml. Zuig FN/laminine/PBS-oplossing op uit putjes van de plaat.
   OPMERKING: Kies het plaatformaat op basis van de tests die zijn gepland voor de EN-culturen, aangezien deze fase de laatste stap van het opnieuw plateren van het protocol markeert. Voorlopers van enterische neuronen kunnen op dag 15 worden ingevroren. Na het dissociëren van de bolletjes met een oplossing voor celloslating, resuspendeert u de voorlopercellen bij ongeveer 5 x 10⁶ cellen/ml in vriesmedium zoals 10% DMSO of Stem-cellbanker. Indien nodig ontdooien in warme ENC-media met 5 μM Y-27632 ROCK-remmer. Plaatcellen in het gewenste plaatformaat. Vervang de media na een paar uur door verse ENC.
7. Voeg de cellen voorzichtig toe aan de met PO/FN/laminine beklede putjes. Voorkom dat luchtbellen vast komen te zitten onder de celsuspensie, waardoor de cellen zich niet hechten aan de PO/FN/lamininecoating, vooral bij gebruik van platen met een kleinere putgrootte, zoals platen met 384 putjes. Dit kan leiden tot celdood.
8. Voer de cellen om de dag met ENC-medium (200 μL per^cm2 putoppervlak) tot dag 30-40, verlaag daarna de voedingsfrequentie (tot één of twee keer per week) maar verdubbel het voedingsvolume (tot 400 μL medium per^cm2 putoppervlak).
   OPMERKING: Dit is belangrijk omdat overmatig verwijderen en toevoegen van media de loslating van de neuronale cultuur van het oppervlak van de putten kan vergemakkelijken. Om prospectief loslating te voorkomen, vooral bij culturen op langere termijn, vult u ENC eenmaal per week aan met FN (2 μg/ml) en laminine (2 μg/ml).

Resultaten

Dit protocol biedt een methode om enterische neurale kam en enterische neuronen af te leiden uit hPSC's met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden (Figuur 1A-B). Het genereren van neuronen van hoge kwaliteit is afhankelijk van een efficiënte inductiestap voor de enterische neurale top. Dit kan visueel worden beoordeeld door de morfologie van de vrij zwevende bollen te controleren die er rond uit moeten zien met gladde oppervlakken met een grootte van ongeveer 0,1 - 0,4 mm, zoals te zien is in figuur 1C. Deze sferoïden moeten ook de neurale topmarker SRY-Box transcriptiefactor 10 (SOX10)^17,18 tot expressie brengen, zoals te zien is in figuur 1D. Tijdens de inductiefase van enterische neuronen kunnen neurieten al op dag 25-30 zichtbaar worden (Figuur 1E). Dit kan echter worden vertraagd in differentiaties met een lagere efficiëntie die ongewenste mesenchymale celcontaminaties bevatten. Het menselijk enterisch zenuwstelsel is een verzameling van diverse neuronen die verschillende neurotransmitters tot expressie brengen. Deze heterogeniteit wordt gerecapituleerd in het meegeleverde in-vitroprotocol en de expressie van belangrijke markers kan worden beoordeeld door middel van celkleuringsmethoden zoals immunofluorescentiebeeldvorming en flowcytometrie volgens eerder beschreven protocollen 13,14,19,20,21 (Figuur 1F,G).

Figuur 1: Afleiding van menselijke ENC-cellen en subtypes van enterische neuronen uit hPSC's. (A) Enterische neurale top (ENC) inductie uit hPSC. Protocol (dag 0-12) met mediasamenstellingen voor het afleiden van ENC-cellen uit hPSC's. (B) ENC-sferoïde vorming en darmneuroneninductie volgens ENC. Protocol (dag 12-15) met gemiddelde samenstelling voor ENC-sferoïde vorming. Daarna worden darmneuronen gegenereerd en gerijpt door behandeling met een medium dat GDNF en AA bevat. (C) Representatieve fasecontrastbeelden van differentiërende hPSC's op verschillende tijdstippen van het protocol. Schaalbalk: 1000 μM. (D) SOX10::GFP die H9 iPSC-afgeleide ENC-sferoïden tot expressie brengt op dag 14. Schaalbalk: 1000 μm. (E) Fasecontractbeeld van dag 33 neuronen. Schaalbalk: 400 μm. (F-G) Immunofluorescentiebeeldvorming (F) en flowcytometrie (G) van neurotransmittermarkers in dag 40 neuronen. Schaal balk: 50 μm. Afkortingen: BMP4 = recombinant humaan BMP4-eiwit; RA = retinoïnezuur; FGF2 = recombinant humaan FGF basisch; GDNF = recombinante humane gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor; AA = ascorbinezuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven differentiatieprotocol biedt een robuuste in vitro methode om binnen 30-40 dagen enterische neuronen uit hPSC's te verkrijgen (Figuur 1E) en enterische glia die gliaal fibrillair zuur eiwit, GFAP en SOX10 tot expressie brengen in oudere culturen (> dag 55)^13,14,19,22. Deze neuronen en glia worden geïnduceerd door stapsgewijze differentiatie van hPSC's in vagale en enterische neurale topcellen, gevolgd door enterische neuron- en glia-voorlopercellen^13,14. De neurale topcellen brengen neurale topmarkers, transcriptiefactor AP-2 alfa en bèta, TFAP2A en TFAP2B, respectievelijk²¹ tot expressie. We hebben eerder aangetoond dat CD49 kan worden gebruikt als een marker om de efficiëntie van hPSC-afgeleide neurale topcellen aan te geven¹⁴. De efficiëntie en het succes van deze methode hangt af van een combinatie van factoren. Ten eerste is het van cruciaal belang om alle stappen onder steriele omstandigheden uit te voeren. Het testen van hPSC-culturen op mycoplasma-besmetting is belangrijk omdat het de groei van stamcellen nadelig kan beïnvloeden en visueel niet detecteerbaar is. Ten tweede vermindert het gebruik van gelijkmatig en goed gecoate platen de kans op fragmentarische hPSC-cultuurgroei en loslating van NC-culturen en oudere neuronen van het oppervlak van de putjes. Ten derde is het voor een hoge efficiëntie in differentiatie essentieel om te beginnen met pluripotente en volledig ongedifferentieerde hPSC-cellen. hPSC-kolonies moeten minimale differentiërende cellen hebben aan de grenzen van de kolonie. hPSC's moeten worden gepasseerd of geplateerd voor differentiatie wanneer kolonies groot zijn, of wanneer het midden van de kolonie dikker/donkerder van kleur begint te worden, zoals waargenomen door een fasecontrastmicroscoop. Ongewenste gedifferentieerde cellen (meestal mesenchymale cellen) verminderen niet alleen de algehele differentiatie-efficiëntie, maar ze kunnen ook leiden tot loslating van neuronen van het oppervlak van de put naarmate de culturen ouder worden. Het is daarom aan te raden om de ENC-culturen de eerste 15 dagen goed te monitoren. Onder efficiënte differentiatieomstandigheden verschijnen er donkere schijven op het oppervlak van de cultuur ~dag 6, wat wijst op efficiënte sferoïde vorming op dag 12-15. Bovendien moeten in de sferoïde fase (dag 12-15) vrij zwevende bollen gladde oppervlakken hebben (Figuur 1D). Het handhaven van de 3D-sferoïde fase op dag 12-15 is over het algemeen voldoende om de zuiverheid van ENC's te verbeteren voor de stroomafwaartse differentiatie van culturen in ENS-afstammingslijnen. Voor onderzoeken die vroege en zuivere populaties van ENC-voorlopercellen vereisen, wordt FACS met CD49D aanbevolen. CD49D is een specifieke oppervlaktemarker voor SOX10:hPSC-afgeleide NC-lijnen en is met succes gebruikt in cellijnen^13,14. Voor meer informatie over het isoleren van CD49D+-cellen met behulp van FACS en aanbevelingen over gating-strategie verwijzen lezers naar het artikel van Barber et al, Figuur 2D, Kader 1 en Aanvullende Figuur 6¹⁴. Ten vierde, om de efficiëntie te maximaliseren, moet differentiatie beginnen wanneer hPSC-culturen monolaag en ~80% confluent zijn. Dit betekent dat je op dag 2 een volledig confluente cultuur hebt. Een lagere confluentie heeft een negatieve invloed op de efficiëntie en zeer dichte culturen hebben de neiging om een hogere celdoodsnelheid te hebben en kunnen mogelijk leiden tot het ontstaan van ongewenste gedifferentieerde cellen.

Het opnieuw plateren van cellen op dag 15 markeert een belangrijke stap in dit protocol. Dit is de laatste celoverdrachtsstap voor een monolaagse neuronale cultuur en daarom moet de plaatlay-out worden gekozen op basis van de geplande tests. Het aantal cellen dat naar elk putje wordt overgebracht, kan een aanzienlijke invloed hebben op de neuronale diversiteit en oudere neuronen die aan het oppervlak van de putjes blijven vastzitten. Over het algemeen is een celdichtheid in het bereik van 250.000-350.000 cellen per^cm2 (ongeveer 75.000-100.000 cellen per put van een plaat met 96 putjes of 500.000-700.000 per put van een plaat met 24 putjes) wenselijk. Vanaf dag 30-40 zou men kunnen overwegen om fibronectine en laminine aan het voedingsmedium toe te voegen (niet meer dan één keer per week) om prospectief loslating van neuronen te voorkomen, vooral voor cellen die gepland zijn voor langere neuronculturen. Op dit punt wordt aanbevolen om de voedingsfrequentie te verminderen tot eens in de 5-7 dagen en wat medium in elk putje te laten voordat u extra vers medium toevoegt. Dit verkleint de kans dat er onnodige fysieke belasting wordt uitgeoefend op de neuronale projecties. Uitgaande van verdamping van het medium (vooral voor putjes in de rand van de plaat) kan men 75 μL verwijderen en 100 μL vers medium aan elk putje toevoegen. Op basis van ervaring hebben culturen die op polymeer dekglaasjes aan de onderkant worden gekweekt, de neiging om te leven en langer aan het oppervlak van de put vast te blijven zitten. Daarom wordt aanbevolen om de polymeer coverslip bottom imaging plates te overwegen voor experimenten die zeer oude neuronale culturen vereisen, zoals co-culturen met andere celtypen. Hoewel aan de lucht gedroogde PO/FN/laminin gecoate platen nog steeds een efficiënte differentiatie kunnen opleveren, is dit niet systematisch getest voor de toepassing van dit protocol. Daarom wordt het gebruik van vers gecoate platen aanbevolen.

Het hier beschreven protocol is gebaseerd op een eerder gepubliceerd protocol van Barber et al¹⁴. Vergeleken met oudere ENC-inductiemethoden die media gebruiken die serumvervangende factoren bevatten (bijv. KSR)^13,14, zijn de huidige protocolmediacondities chemisch gedefinieerd. Dit is gunstig voor meer consistente differentiaties en maakt nauwkeurigere ontwikkelingsstudies mogelijk door de cultuuromstandigheden te manipuleren. Dit robuuste protocol genereert reproduceerbaar culturen van enterische neuronen uit onafhankelijke geïnduceerde en embryonale stamcellijnen die zijn getest, zoals H9, UCSF4 en WTC11. Een krachtig aspect van het gepresenteerde protocol is het vermogen om een verscheidenheid aan ENS-neuronale subtypes te genereren die lijken op die in het menselijke ENS. De expressie van specifieke markers voor verschillende ENS-neurochemische identiteiten kan bijvoorbeeld worden gecontroleerd door middel van flowcytometrie en fluorescentiebeeldvorming (Figuur 1F,G). Het typische bereik van hPSC-afgeleide enterische neuronale populaties die positief zijn voor stikstofmonoxidesynthase 1 (NOS1) is 5%-20%; choline O-acetyltransferase (CHAT) is 40%-60%; gamma-aminoboterzuur (GABA) is 15%-30% en serotonine (5-HT) is 15%-30%. De mate waarin de in vitro structurele en functionele connectiviteit tussen deze subtypes de in vivo cellulaire netwerken nauwkeurig modelleert, vereist echter verder onderzoek. Bovendien zouden analyses van afzonderlijke cellen om de transcriptionele profilering van individuele subtypes uit te breiden, niet alleen helpen om de in vivo en in vitro cellulaire identiteiten beter te vergelijken, maar zouden ze ook ten goede komen aan ontwikkelings- en moleculaire studies, evenals aan toekomstige protocoloptimalisaties om specifieke subtypes te verrijken voor het ontdekken van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde.

Ondanks de culturen die verschillende neuronale en in oudere culturen gliacellen bevatten, genereert dit protocol niet de andere celtypen die van nature in de in vivo niche van het ENS voorkomen, zoals spiercellen, epitheelcellen en immuuncellen. Het bestuderen van de ENS-interactie met deze celtypen in de context van gezondheid en ziekte vereist investeringen in het optimaliseren van co-cultuur en darmorganoïdensystemen. Over het algemeen wordt hier een krachtige methode beschreven om verschillende subtypes van het ENS in te genereren uit hPSC's in vitro . De schaalbare culturen zijn geschikt voor ontwikkelingsstudies van het menselijke ENS, toxicologische tests en ziektemodelleringsexperimenten gericht op het ontwikkelen van medicamenteuze therapieën en het leveren van transplanteerbare cellen voor de behandeling van enterische neuropathieën.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254