Methodenartikel

3D-printbacteriën om beweeglijkheid en groei in complexe 3D-poreuze media te bestuderen

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66166

⸱

19 januari 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, University of Colorado Boulder, 2Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een procedure voor driedimensionaal (3D) printen van bacteriekolonies om hun beweeglijkheid en groei te bestuderen in complexe 3D poreuze hydrogelmatrices die meer verwant zijn aan hun natuurlijke habitat dan conventionele vloeibare culturen of petrischalen.

Samenvatting

Bacteriën zijn alomtegenwoordig in complexe driedimensionale (3D) poreuze omgevingen, zoals biologische weefsels en gels, en ondergrondse bodems en sedimenten. Het grootste deel van het eerdere werk was echter gericht op studies van cellen in bulkvloeistoffen of op platte oppervlakken, die de complexiteit van veel natuurlijke bacteriële habitats niet volledig samenvatten. Hier wordt deze lacune in kennis aangepakt door de ontwikkeling te beschrijven van een methode om dichte kolonies bacteriën te 3D-printen in vastgelopen granulaire hydrogelmatrices. Deze matrices hebben afstembare poriegroottes en mechanische eigenschappen; ze sluiten de cellen fysiek op en ondersteunen ze zo in 3D. Ze zijn optisch transparant, waardoor de verspreiding van bacteriën door hun omgeving direct kan worden gevisualiseerd met behulp van beeldvorming. Als bewijs van dit principe wordt hier de mogelijkheid van dit protocol gedemonstreerd door het 3D-printen en afbeelden van niet-beweeglijke en beweeglijke Vibro cholerae, evenals niet-beweeglijke Escherichia coli, in vastgelopen korrelige hydrogelmatrices met verschillende interstitiële poriegroottes.

Inleiding

Bacteriën leven vaak in diverse, complexe 3D poreuze omgevingen, variërend van mucosale gels in de darm en longen tot grond in de grond 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. In deze omgevingen kan de beweging van bacteriën door beweeglijkheid of groei worden belemmerd door omringende obstakels, zoals polymeernetwerken of pakkingen van vaste minerale korrels, die het vermogen van de cellen beïnvloeden om zich door hun omgeving te verspreiden26, toegang te krijgen tot voedingsbronnen, nieuw terrein te koloniseren en beschermende biofilmgemeenschappen te vormen27. Traditionele laboratoriumstudies maken echter meestal gebruik van sterk vereenvoudigde geometrieën, waarbij de nadruk ligt op cellen in vloeibare culturen of op platte oppervlakken. Hoewel deze benaderingen belangrijke inzichten in de microbiologie opleveren, geven ze de complexiteit van natuurlijke habitats niet volledig weer, wat leidt tot dramatische verschillen in groeisnelheden en beweeglijkheidsgedrag in vergelijking met metingen die in de echte wereld worden uitgevoerd. Daarom is een methode nodig om bacteriekolonies te definiëren en hun beweeglijkheid en groei te bestuderen in poreuze 3D-omgevingen die meer lijken op veel van hun natuurlijke habitats.

Het inoculeren van cellen in een agargel en vervolgens hun macroscopische verspreiding visualiseren met het oog of met behulp van een camera biedt een eenvoudige manier om dit te bereiken, zoals voor het eerst voorgesteld door Tittsler en Sandholzer in 193628. Deze aanpak heeft echter te kampen met een aantal belangrijke technische uitdagingen: (1) Hoewel de poriegroottes in principe kunnen worden gevarieerd door de agaroseconcentratie te variëren, is de poriënstructuur van dergelijke gels slecht gedefinieerd; (2) Lichtverstrooiing zorgt ervoor dat deze gels troebel zijn, waardoor het moeilijk is om cellen op individuele schaal met hoge resolutie en getrouwheid te visualiseren, vooral in grote monsters; (3) Wanneer de agarconcentratie te groot is, wordt de celmigratie beperkt tot het bovenste platte oppervlak van de gel; (4) De complexe reologie van dergelijke gels maakt het een uitdaging om inocula met goed gedefinieerde geometrieën te introduceren.

Om deze beperkingen aan te pakken, ontwikkelde het laboratorium van Datta in eerder werk een alternatieve benadering met behulp van korrelige hydrogelmatrices - bestaande uit vastgelopen, biocompatibele hydrogeldeeltjes gezwollen in vloeibare bacteriecultuur - als "poreuze petrischalen" om cellen in 3D op te sluiten. Deze matrices zijn zachte, zelfherstellende, vloeistressvaste stoffen; dus, in tegenstelling tot verknoopte gels die worden gebruikt in andere bioprintprocessen, kan een injectiemicronozzle vrij bewegen in de matrix langs elk voorgeschreven 3D-pad door de hydrogeldeeltjes lokaal te herschikken29. Deze deeltjes verdichten zich vervolgens snel en genezen zichzelf rond geïnjecteerde bacteriën, waardoor de cellen op hun plaats worden ondersteund zonder enige extra schadelijke verwerking. Dit proces is dus een vorm van 3D-printen die het mogelijk maakt om bacteriële cellen te rangschikken - in een gewenste 3D-structuur, met een gedefinieerde gemeenschapssamenstelling - binnen een poreuze matrix met afstembare fysisch-chemische eigenschappen. Bovendien zijn de hydrogelmatrices volledig transparant, waardoor de cellen direct in beeld kunnen worden gebracht met behulp van beeldvorming.

Het nut van deze aanpak is eerder op twee manieren aangetoond. In één reeks onderzoeken werden verdunde cellen verspreid over de hydrogelmatrix, waardoor studies van de beweeglijkheid van individuele bacteriën mogelijkwerden30,31. In een andere reeks onderzoeken werden meercellige gemeenschappen 3D-geprint in gels op centimeterschaal met behulp van een injectiemondstuk dat op een programmeerbare microscooptafel was gemonteerd, waardoor studies van de verspreiding van bacteriële collectieven door hun omgeving mogelijk waren32,33. In beide gevallen onthulden deze studies voorheen onbekende verschillen in de verspreidingskenmerken van bacteriën die poreuze omgevingen bewonen in vergelijking met die in vloeibare cultuur/op vlakke oppervlakken. Aangezien ze echter op een microscooptafel waren gemonteerd, waren deze eerdere onderzoeken beperkt tot kleine monstervolumes (~ 1 ml) en dus korte experimentele tijdschalen. Ze waren ook beperkt in hun vermogen om inocula-geometrieën met een hoge ruimtelijke resolutie te definiëren.

Hier wordt de volgende generatie van dit experimentele platform beschreven dat beide beperkingen aanpakt. Concreet worden protocollen verstrekt waarmee men een aangepaste 3D-printer met een bevestigde spuitextruder kan gebruiken om bacteriekolonies op grote schaal te 3D-printen en in beeld te brengen. Bovendien geven representatieve gegevens aan hoe deze aanpak nuttig kan zijn voor het bestuderen van de beweeglijkheid en groei van bacteriën, met behulp van de biofilm-voormalige Vibrio cholerae en planktonische Escherichia coli als voorbeelden. Deze aanpak maakt het mogelijk om bacteriekolonies gedurende lange tijd in stand te houden en te visualiseren met behulp van verschillende beeldvormingstechnieken. Daarom heeft het vermogen van deze benadering om bacteriële gemeenschappen in 3D-poreuze habitats te bestuderen een enorm onderzoeks- en toegepast potentieel, wat van invloed is op de behandeling en studie van microben in de darm, de huid, de longen en de bodem. Bovendien zou deze aanpak in de toekomst kunnen worden gebruikt voor het 3D-printen van op bacteriën gebaseerde gemanipuleerde levende materialen in complexere vrijstaande vormen.

Protocol

Deze aanpak is om een commerciële 3D-gefuseerde depositiemodelleringsprinter om te zetten in een 3D-bioprinter met behulp van een eerder vastgesteld protocol van Tashman et al.34. In het kort kwamen Tashman et al. erop neer dat een commerciële extruderkop werd vervangen door een op maat gemaakte spuitpompextruder. Deze extruder maakt het mogelijk om sterk geconcentreerde vloeibare suspensies van bacteriële cellen in 3D te printen, waarbij het geëxtrudeerde volume en de 3D-positie worden aangestuurd door de programmeertaal G-code. Het geëxtrudeerde volume wordt in de software gespecificeerd door de extruderstap (E-step) en wordt bovendien gekalibreerd zoals hieronder verder beschreven. Deze bacteriële suspensies worden daarbij rechtstreeks in een korrelige hydrogelmatrix geprint, die fungeert als een 3D-ondersteuning voor de cellen. Hieronder beschrijft het protocol ook hoe matrices met verschillende polymeerconcentraties kunnen worden bereid, de resulterende veranderingen in poriegrootte en reologische eigenschappen kunnen worden gekarakteriseerd en de daaropvolgende bacteriële motiliteit en groei kunnen worden gekarakteriseerd met behulp van directe beeldvorming.

1. Ombouw van een commerciële 3D-printer naar een 3D-bioprinter

  1. Verwijder de extruder en de verwarmer uit een in de handel verkrijgbare 3D-printer (zie Materiaaltabel).
  2. Volg eerdere protocollen om de extruder van de spuitpomp34 te fabriceren, met een extra aanpassing om plaats te bieden aan een Luer-lock-wegwerpspuit. Monteer de extruder van de spuitpomp op de printer.
    OPMERKING: De CAD-bestanden die nodig zijn voor het aanpassen van de spuitpompextruder voor plastic spuiten vindt u in aanvullende bestanden 1-3.
  3. Installeer en open de 3D-printersoftware (zie Materiaaltabel) op een computer. Sluit de 3D-printer aan op de computer.
  4. Plaats een wegwerpspuit van 1 ml met een naald van de juiste grootte in de 3D-geprinte klemmen door de bovenste en onderste helft van het mechanisme uit te lijnen (Figuur 1). Bevestig de klemmen rond de spuit met behulp van drie M8-inbusbouten en dunne stalen zeskantmoeren (zie Materiaaltabel). De plunjer van de spuit wordt aangesloten op de spindel in de extruder van de spuitpomp. Breng de zuiger handmatig omhoog door aan de spindel te draaien om een luchtspleet van 0.5 ml in de spuit te creëren.
  5. Als besmetting een probleem is voor het experiment, transporteert u het spuitklemcomplex naar een biokap en steriliseert u het bij binnenkomst met 70% ethanolspray voordat u de volgende stappen voltooit.

2. Bereiding van de bacteriële suspensie

  1. Voor V. cholerae en E. coli, 's nachts kweken op een 2% Lennox LB (Luria Broth, zie Tabel met materialen) agarplaat bij 37 °C.
    1. Voor V. cholerae, inoculeer de cellen in 3 ml vloeibare LB met tien steriele glasparels. Kweek de cellen in een schudincubator bij 37 °C gedurende 5-6 uur tot de mid-exponentiële fase tot een optische dichtheid (OD) van 600 van ~0,9.
    2. Voor E. coli inoculeert u de cellen in 3 ml vloeibare LB. Kweek de cellen een nacht in een schudincubator bij 37 °C. Innoculeer 200 μL van de nachtcultuur in verse LB gedurende 3 uur tot de OD 0,6 bereikt.
  2. Breng de cultuur over in een centrifugebuis van 10 ml. Centrifugeer de cultuur gedurende 5 minuten bij 5.000 x g bij kamertemperatuur om een pellet te vormen. Verwijder het supernatant. Resuspendeer met ~10 μL vloeibare LB om een celdichtheid van ~9 x 1010 cellen per ml te bereiken.

3. Laden van de bacteriële suspensie in de spuit

OPMERKING: Er zijn twee methoden om de bacteriën in de spuit te laden (stap 3.1 en stap 3.2). Stap 3.1 werkt voor het laden van kleine hoeveelheden bacteriële suspensies, <200 μL, en stap 3.2 werkt voor het laden van grotere volumes bacteriële suspensies, >200 μL. Stap 3.1 werd gebruikt voor de representatieve resultaten die hier worden getoond.

  1. Plaats een lege plastic Luerlock-spuit van 1 ml in de 3D-bioprinter. Verbind de zuiger van de spuit met de spindel. Trek de spuit handmatig terug om 0,2 ml van de luchtspleet toe te voegen om ruimte te bieden voor de zuiger om in de spuit te bewegen, aangezien voor elke batch experimenten een klein volume cellen ~20-50 μL wordt gebruikt.
    1. Bevestig een stompe naald aan de punt van de spuit met de naaldgrootte die nodig is voor de grootte van de vereiste afdrukfuncties. Hier wordt een naald van 2 inch van 20 G gebruikt.
    2. Laad de bacteriële suspensie in de spuit door een centrifugebuisje van 10 ml met het bacteriële inoculum onder de naald te plaatsen. Draai de schroef handmatig om de zuiger van de spuit terug te trekken en laad de cellen in de spuit. De bacteriële celvolumes zijn zo klein dat de cellen vaak alleen in de naald worden geladen.
  2. Verwijder de zuiger van het spuitklemcomplex en gebruik een andere spuit en naald om het spuitklemcomplex voorzichtig te vullen met de gewenste bacteriële suspensies, waarbij u ervoor moet zorgen dat er geen luchtbellen in de lucht komen te zitten. Het spuitklemcomplex moet iets over de rand worden gevuld met de gewenste bacteriële suspensie en vervolgens worden overgebracht naar de bioprinter.
    1. Steek het spuitklemcomplex zonder plunjer voorzichtig in de overeenkomstige aansluiting op de hoofdkern van de bioprinter-extruder.
    2. Zorg ervoor dat de printerslede zich ongeveer halverwege de spindel bevindt en dat er een opvangbakje onder de geladen spuit aanwezig is. Steek vervolgens de plunjer voorzichtig door zowel de slede als het spuitklemcomplex totdat deze op de slede blijft haken. Druk de zuiger langzaam in de bacteriële suspensie om te voorkomen dat er luchtbellen in de spuit terechtkomen.
    3. Schuif de adapterklem op de slede over de achterkant van de plunjer om deze op zijn plaats te houden voor zowel extrusie- als intrekmanoeuvres.

4. Kalibratie van de extruderstap naar het gestorte volume

  1. Om de extruderstap (E-step) te kalibreren op het gedeponeerde volume, stelt u eerst de bioprinter in met de exacte spuit, spuitnaald en deponerende bacteriële suspensie die in het experiment zal worden gebruikt. Hier wordt een Luerlock-spuit van 1 ml gebruikt.
  2. Bepaal een geschat E-stepbereik om te kalibreren door een willekeurig E-step-nummer (~200) te extruderen en noteer de volumeverandering van de zuiger met volumemarkeringen voor de spuit.
  3. Gebruik deze grove E-step-volumeverhouding om de E-step-instellingen te bepalen om de kalibratie uit te voeren. Als bijvoorbeeld een E-step van 200 ongeveer 20 μL extrudeert door visuele inspectie en men wil 10-200 μL deponeren, test dan E-steps tussen 100-2000.
  4. Om de lineaire kalibratie uit te voeren, labelt en meet u eerst de droge massa van twintig bemonsteringsbuisjes van 1,5 ml op een analytische balans met een gevoeligheid van 0,1 mg.
  5. Extrudeer de bacteriële suspensie in de vooraf afgemeten buisjes van 1,5 ml. Voer voor elke E-stap ten minste 2 replica's uit. Herhaal dit voor alle E-stappen over het lineaire bereik en vervang indien nodig de bacteriële suspensie. Als verontreiniging een probleem is voor het experiment, veeg dan na elk monster de buitenkant van de spuitnaald af met een pluisvrij doekje dat verzadigd is met 70% ethanol.
  6. Meet de massa van alle buisjes van 1,5 ml met dezelfde analytische balans. Trek de eerste massawaarde af van de tweede om een nettomassa van de afgezette bacteriële suspensie te verkrijgen.
  7. Zet de massa van de bacteriële suspensie om in een volume met de materiaaldichtheid. Voor veel bacteriële suspensies die voornamelijk uit water bestaan, is 1 g/ml een geschikte dichtheidsbenadering.
  8. Voer een lineaire fit uit tussen de E-step en het geëxtrudeerde volume om het kalibratieproces te voltooien.

5. Bereiding van de granulaire hydrogelmatrix

  1. Voeg in een bioveiligheidskast droge korrels van verknoopt acrylzuur/alkylacrylaatcopolymeren (zie materiaaltabel) toe aan 400 ml 2% Lennox Luria-Bertani (LB) om de matrix steriel te houden; Andere vloeibare celkweekmedia kunnen echter ook worden gebruikt om de hydrogelmatrix op te zwellen.
    OPMERKING: Het gewichtspercentage van de korrels die aan de LB worden toegevoegd, hangt af van de poriegrootte die men nastreeft. In de huidige studie wordt voor een 0,9% granulaire hydrogelmatrix 3,6 g droge korrels toegevoegd aan de LB en voor een 1,2% korrelige hydrogelmatrix wordt 4,8 g droge korrels aan de LB toegevoegd. De hydrogelkorrels worden homogeen gedispergeerd door ze gedurende 2 minuten in een keukenmixer te mengen.
  2. Eenmaal gemengd, past u de pH aan tot 7,4 door stappen van 20 tot 500 μL 10 M natriumhydroxide (NaOH) toe te voegen om de levensvatbaarheid van de cel te garanderen. Meet na elke toevoeging van NaOH de pH door een pipetpunt in het mengsel te dopen en vervolgens de hydrogelmatrix op een pH-testpapier te vegen.
    OPMERKING: Naarmate de NaOH wordt toegevoegd, zal de viscositeit van het mengsel toenemen naarmate de hydrogelkorrels beginnen op te zwellen. De gezwollen hydrogelkorrels hebben een diameter van ~5 μm tot 10 μm en zijn samengeklemd in een hydrogelmatrix. De inwendige maaswijdte van de korrels is ~40 nm tot 100 nm, zoals eerder vastgesteld32. De maaswijdte is groot genoeg voor kleine moleculen (bijv. zuurstof en voedingsstoffen) om vrij te diffunderen, maar klein genoeg om bacteriën tussen de interstitiële poriën te houden.
  3. Breng vervolgens de granulaire hydrogelmatrix over in een centrifugebuis van 50 ml met behulp van een steriele plastic spuit van 50 ml. Centrifugeer de hydrogelmatrix op 161 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur om de belletjes te verwijderen die tijdens het mengproces zijn gevormd.
  4. Laat de hydrogelmatrix minimaal 2 dagen op kamertemperatuur staan om er zeker van te zijn dat er geen verontreiniging is opgetreden. De verontreiniging verschijnt als microkolonies die in de hydrogelmatrix zijn gesuspendeerd. Centrifugeer na twee dagen de hydrogelmatrix op 161 x g gedurende 1 minuut om eventuele extra luchtbellen te verwijderen.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd door de hydrogelmatrix maximaal een week bij kamertemperatuur te bewaren.
  5. Breng in de bioveiligheidskast met behulp van een steriele plastic spuit van 30 ml de gewenste hoeveelheid hydrogelmatrix over naar de container waar de bedrukking zal plaatsvinden (hier werden ~20 ml voor een weefselkweekkolf van 20 ml of 1 ml voor 1 ml plastic microcuvetten gebruikt).

6. Karakterisering van de reologische eigenschappen van de granulaire hydrogelmatrix

  1. Laad ~3 ml van de hydrogelmatrix in een afschuifreometer (zie Materiaaltabel) met een opening van 1 mm tussen opgeruwde parallelle platen met een diameter van 50 mm om de reologische eigenschappen te meten.
  2. Kwantificeer het vloeigedrag met behulp van unidirectionele afschuifmetingen op de afschuifreometer door de schuifspanning te meten als functie van een logaritmische veeg van de afschuifsnelheid van 10-4 s-1 tot 102 s-1 (bijv. Figuur 2A).
    OPMERKING: Bij lage afschuifsnelheden heeft de hydrogelmatrix een constante schuifspanning (de vloeispanning) die onafhankelijk is van de afschuifsnelheid. Bij hoge afschuifsnelheden zal de schuifspanning toenemen met een machtswetafhankelijkheid van de afschuifsnelheid, wat wijst op de fluïdisatie van de hydrogelmatrix. Door dit vloei-stressgedrag kunnen bacteriën 3D-geprint worden in de granulaire hydrogelmatrix29.
  3. Meet de opslag- en verliesmoduli, respectievelijk G' en G'', als functie van de frequentie met behulp van oscillerende reologie met een kleine amplitude met een rekamplitude van 1% en frequenties tussen 0,1 en 1 Hz (bijv. Figuur 2B).
    OPMERKING: De ideale granulaire hydrogelmatrix voor 3D-printen moet een opslagmodulus hebben die groter is dan de verliesmodulus, wat aangeeft dat het medium werkt als een vastgelopen elastische vaste stof29.

7. Karakterisering van de interstitiële poriegrootte van de granulaire hydrogelmatrix

  1. Sonicaat 100 nm gecarboxyleerde fluorescerende polystyreen nanodeeltjes (~3,6 x 1013 deeltjes/ml, zie Tabel met materialen) in hun verpakking gedurende 15 minuten om te resuspenderen om eventuele aggregaties/clusters van deeltjes te breken. Breng 50 μL nanodeeltjes over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    1. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 9.500 x g bij kamertemperatuur totdat de pellet zich vormt en het supernatans helder is. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 1 ml van het vloeibare groeimedium (hier LB) dat wordt gebruikt om de granulaire hydrogelmatrix te bereiden.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd door de geresuspendeerde nanodeeltjes maximaal 3 maanden bij 4 °C op te slaan.
  2. Sonificeer de geresuspendeerde nanodeeltjes gedurende 30 minuten. Breng 1 ml granulaire hydrogelmatrix over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 1 μL van de geresuspendeerde nanodeeltjes toe aan de granulaire hydrogelmatrix en meng ze met een pipetpunt. Centrifugeer na het mengen gedurende 30 s bij 161 x g bij kamertemperatuur.
  3. Breng de hydrogelmatrix en het nanodeeltjesmengsel over in een petrischaal met een diameter van 35 mm en een glazen bodemput van 0,1 mm dik. De put heeft een diameter van 20 mm en een diepte van 1 mm. Plaats er een glazen dekglaasje op en druk naar beneden om stroming en verdamping tijdens de beeldvorming uit te schakelen. Een alternatief voor het glazen dekglaasje is om 1 ml paraffineolie aan de bovenkant toe te voegen.
  4. Breng de nanodeeltjes in beeld met behulp van een confocale microscoop met een 40x olieobjectief met 8x extra zoom in de beeldvormingssoftware (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: Een objectief met een hogere vergroting kan worden gebruikt in plaats van extra digitale zoom in de software te gebruiken.
    1. Stel een tijdlus voor zonder vertraging (idealiter ~19 frames/s) in een enkel z-vlak gedurende 2 minuten met ten minste vier nanodeeltjes binnen het gezichtsveld. Herhaal dit 15 tot 20 keer op verschillende locaties om voldoende gegevens te verzamelen voor statistieken (100 tot 200 nanodeeltjes).
  5. Gebruik software voor het volgen van deeltjes om de verplaatsing van de deeltjes te analyseren. Hier wordt een op maat geschreven script gebruikt op basis van het klassieke Crocker-Grier-algoritme om het zwaartepunt van het nanodeeltje35 te volgen (zie aanvullend bestand 7).
    1. Bereken op basis van het volgen van deeltjes de gemiddelde vierkante verplaatsing (MSD). Het MSD vertoont vrije diffusie in de porieruimte op korte lengtes en tijdschalen en gaat over op subdiffuse schaalvergroting op grote lengtes en tijdschalen als gevolg van opsluiting35.
  6. Identificeer de lengteschaal waar de overgang naar subdiffuse schaling plaatsvindt om de lokale poriegrootte te schatten. Bereken de poriegrootte door deze lengteschaal op te tellen bij de diameter van de nanodeeltjes. Herhaal de analyse van de poriegrootte voor elk gemeten nanodeeltje. Dit levert een poriegrootteverdeling op waaruit een gemiddelde poriegrootte kan worden berekend (bijv. Figuur 3).

8. 3D drukproces

  1. 3D-print op maat gemaakte houders voor de monstercontainers (zie aanvullende bestanden 4-6 voor de CAD-bestanden). Hier worden houders voor de weefselkweekkolven en microcuvetten gebruikt. De houders maken het mogelijk om de printer te programmeren om meerdere monsters in één printsessie af te drukken. Plaats de monstercontainers met hydrogelmedia in de houders op het bouwplatform.
  2. Open de 3D-printsoftware. Laad een voorgeprogrammeerde g-code in de software. Voor de representatieve resultaten wordt stap 3.1 gebruikt om de bacteriële suspensie in de 3D-printer te laden.
    OPMERKING: Een voorbeeld van een g-code voor het afdrukken van lineaire verticale geometrieën wordt gegeven in tabel 1.
  3. Verplaats via de 3D-printsoftware de x-y-z-vlakken om de printkop op het x-y-vlak te centreren om de eerste container te zijn en vervolgens de z-as naar huis te brengen. De homing z-as brengt de printkop omhoog. Draai de schroef handmatig langzaam om de zuiger van de spuit in te drukken totdat een kleine hoeveelheid van de bacteriële suspensie zichtbaar is aan de punt van de naald.
    1. Veeg de overtollige bacteriële suspensie lichtjes weg met een steriel wegwerpdoekje. Op basis van de hoogte van de monsterhouder, naald en spuit laat u met behulp van de 3D-printsoftware de printkop op een vaste afstand in de hydrogelmedia in de monstercontainer naar keuze zakken. Start het afdrukproces door op Afdrukken te klikken.
  4. Zodra het afdrukken is voltooid, sluit u de monstercontainers. Veeg de printer schoon met 70% ethanol. Gooi de spuit en naald op de juiste manier weg.

9. Kweken en in beeld brengen van de V. cholerae

  1. Gebruik voor beeldvorming met een groot gezichtsveld een camera met een zoomlensbevestiging om de celgroei met een lichtbak in beeld te brengen. Breng de monsters direct na het printen bij kamertemperatuur in beeld en breng ze vervolgens over naar een incubator. Houd de monsters tijdens het experiment bij 37 °C in een stationaire incubator tussen de beeldvormingssessies.
  2. Leg beelden vast gedurende een gewenste hoeveelheid tijd om het groeigedrag gedurende lange perioden in de granulaire hydrogelmatrix te observeren.

Resultaten

Het gebruik van een 3D-bioprinter met de granulaire hydrogelmatrix breidt de mogelijkheden van bioprinters uit om bacteriekolonies te printen in vormen die, wanneer ze in plaats daarvan op een plat substraat worden geprint, zouden inzakken vanwege de lage viscositeit van de bacteriële suspensie. De resolutie van de hier gepresenteerde aanpak hangt af van de extrusiesnelheid, de grootte van de naald, de snelheid van de printkop, de lucht in de naald en de viscositeit van de bacteriële suspensie. Vanwege het lage volume van de bacteriële suspensie kunnen er onbedoeld luchtbellen worden ingebracht tijdens het laden van de bacteriële suspensie in de spuit en naald. Dit kan ertoe leiden dat er een luchtbel wordt afgezet in de uiteindelijke geprinte structuur (Figuur 4). Een andere manier om luchtbellen in de afdruk te brengen, is als men de zuiger niet indrukt om een kleine druppel bacteriële suspensie aan de punt van de naald te vormen voordat u gaat afdrukken en er een luchtspleet bestaat aan de punt van de naald. Het niet indrukken van de zuiger van de spuit voor het printen kan er ook toe leiden dat verschillende volumes cellen in dezelfde batch worden geprint. Naarmate de tijd vordert, lost de luchtbel echter op in het omringende medium, zoals weergegeven in figuur 4.

Voor het kalibreren van de extrusiestap is het gestorte volume afhankelijk van hoe de lineaire actuator van de printkop de zuiger van de spuit vertaalt, de binnendiameter van de spuit heeft een directe invloed op het volume. Verder zullen de reologische eigenschappen van bacteriële suspensie van invloed zijn op hoe gemakkelijk ze door de samentrekking van de naald scheren om soepel af te drukken. Deze kalibratieprocedure moet dus opnieuw worden uitgevoerd voor elke spuit/naald/bacteriële suspensie. In principe zou de kalibratie van de spuit kunnen worden geautomatiseerd. In de praktijk zou het echter een uitdaging zijn om een dergelijke code te schrijven die in grote lijnen van toepassing is op veel gebruiksscenario's. Een gebruiker die bijvoorbeeld de extrusie van ongeveer 300 μl uit een spuit van 1 ml wil kalibreren, zou de spuit veel vaker opnieuw moeten laden dan een gebruiker die rond een doelvolume van 30 μl kalibreert. Aangezien de E-stap naar volumekalibratieconstante onbekend is wanneer het kalibratieproces begint, kan de gebruiker mogelijk niet precies voorspellen hoe vaak opnieuw laden daadwerkelijk nodig is. Om het kalibratieproces te automatiseren, zouden de exacte posities van elke voorgewogen buis van 1,5 ml moeten worden gespecificeerd. Om ervoor te zorgen dat alle bioinkt van de naald in de buis wordt afgezet voor een nauwkeurige kalibratie, moet nauwkeurig contact worden gemaakt tussen de naald en de bodem/wand van de buis. Zonder goed contact kunnen kleine druppeltjes nat blijven en aan de naald blijven zitten. Elke positievariatie tussen buizen kan dus in hoge mate bijdragen aan fouten in het kalibratieproces. Om deze redenen raden de auteurs aan dat elke gebruiker een kalibratieprogramma bouwt dat past bij zijn unieke behoeften.

Een belangrijk kenmerk van de hier gepresenteerde aanpak is de mogelijkheid om bacteriën die zich rechtstreeks door hun omgeving verspreiden via beweeglijkheid en groei te visualiseren met behulp van beeldvorming. In een eerdere versie van het protocol voor beeldvorming werden platen met 6 putjes gevuld met 19 ml van een granulaire hydrogelmatrix. Maar zelfs met een succesvolle 3D-print van een horizontale lijn cellen die op een omgekeerde microscoop kan worden waargenomen, zou er ook een dichte kolonie groeien op het bovenoppervlak van het medium, waardoor visualisatie met helderveldmicroscopie wordt beperkt (Figuur 5). De kolonie op het bovenoppervlak was waarschijnlijk het gevolg van besmetting toen de naald van de spuit tijdens het printen in of verwijderd was van het medium. Om dit probleem te omzeilen, worden verticale lijnen van cellen afgedrukt in scintillatieflacons (Figuur 6A). De kromming van de cilindrische flacons veroorzaakte echter vervorming tijdens de beeldvorming. Dit leidde tot de keuze van platwandige cuvetten en weefselkweekkolven als monsterhouders voor het bedrukken, waardoor een onvervormde beeldvorming mogelijk is (figuur 6B-D). Een beperking van weefselkweekkolven is de kleine gekantelde hals die de geometrieën die kunnen worden afgedrukt beperkt.

Alles bij elkaar maakt dit protocol het mogelijk om bacteriële motiliteit en groei in complexe poreuze omgevingen over lange tijdschalen te observeren. Enkele voorbeelden worden getoond in figuur 6B-G voor biofilmvormende V. cholerae met behulp van helderveldmicroscopie, evenals planktonische cellen van E. coli met behulp van laserscanning, fluorescentie, confocale microscopie, wat de veelzijdigheid van deze benadering aantoont. Een potentieel probleem van hydrogelmatrices is inderdaad hun mogelijke autofluorescentie wanneer ze worden afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie; de afbeeldingen in figuur 6F,G tonen echter aan dat een dergelijke autofluorescentie minimaal is in het hier gepresenteerde experimentele platform. Een andere beperking van dergelijke optische microscopiebenaderingen is hun ruimtelijke resolutie, die wordt ingesteld door de diffractielimiet op ~100 s nanometer; deze lengteschaal is echter veel kleiner dan de grootte van een individuele bacteriële cel, en daarom bieden optische technieken de mogelijkheid om bacteriële cellen af te beelden van de schaal van individuele cellen (Figuur 6G) tot de schaal van grotere, meercellige kolonies 30,31,32,33. Aanvullende voorbeelden worden hieronder beschreven.

Zoals hierboven vermeld, kan de hier gepresenteerde aanpak worden gebruikt om bacteriekolonies in kleine (1 ml) en grote (20 ml) matrixvolumes in 3D-print en -beeld af te beelden. Daarom worden de verschillen in de resultaten verkregen met behulp van verschillende volumes hieronder beschreven, met behulp van 3D-geprinte kolonies van beweeglijke en niet-beweeglijke V. cholerae als representatieve voorbeelden. De ruimtelijke resolutie (breedte van de lijn) van de afdruk wordt bepaald door de binnendiameter van de nozzle. In de hieronder beschreven voorbeelden resulteert een naald met een binnendiameter van 0,6 mm in een initiële cilindrische kolonie van 0,6 mm. Eerder werk heeft aangetoond dat de printresolutie nog verder kan worden verlaagd door gebruik te maken van een getrokken glazen capillair met een binnendiameter van ~100-200 μm33.

Voor de kleine volumes worden twee verschillende granulaire hydrogelmatrices gebruikt met twee verschillende poriegrootteverdelingen: één met een gemiddelde poriegrootte groter dan de gemiddelde diameter van een V. cholerae-cel, 0,2-0,4 μm36, en de andere met een gemiddelde poriegrootte kleiner dan deze diameter. De monsters gedurende twaalf dagen worden in beeld gebracht en gemeten door middel van beeldanalyse van de oppervlakte-uitbreiding van de kolonies in de loop van de tijd (Figuur 7 en Figuur 8). Voor niet-beweeglijke cellen, die zich alleen door cellulaire groei door hun omgeving kunnen verspreiden, was de snelheid van oppervlakte-expansie vergelijkbaar tussen de verschillende onderzochte matrices (Figuur 7), wat aangeeft dat verschillen in de poriegrootte van de matrix geen invloed hebben op cellulaire verspreiding door groei - zoals verwacht. Daarentegen, voor de beweeglijke cellen die zich door actieve beweeglijkheid door hun omgeving verspreiden, was de snelheid van oppervlakte-expansie van V. cholerae hoger voor de hydrogelmatrix met de grotere poriën - waarvoor opsluiting door de hydrogelkorrels de cellulaire beweeglijkheid minder belemmert. Deze verschillen in bacteriële verspreiding waren ook zichtbaar in de koloniemorfologieën (Figuur 8). De kolonie van V. cholerae in hydrogelmatrices met grotere poriën verspreidt zich door gladde, diffuse pluimen (figuur 8A), wat wijst op verspreiding door actieve beweeglijkheid, zoals eerder waargenomen32. In overeenstemming met deze interpretatie worden deze diffuse pluimen inderdaad niet waargenomen in het geval van niet-beweeglijke cellen (figuur 8C). Bovendien zijn de poriën voldoende groot zodat de cellen de kralen niet duwen als ze door de poriën zwemmen. Bovendien is de stroperige spanning die wordt uitgeoefend door zwemmen minder dan 1 Pa, wat onvoldoende is om de omringende hydrogelmatrix merkbaar te vervormen. Daarentegen verspreidt de kolonie in hydrogelmatrices met kleinere poriën zich alleen door ruwe, fractalachtige pluimen voor zowel beweeglijke als niet-beweeglijke cellen (Figuur 8B,D), wat de verspreiding uitsluitend weerspiegelt door cellulaire groei, terwijl de cellen groeien die tijdelijk vervormen en de omringende matrix opleveren. Aangezien de vloeispanning van de hydrogelmatrices veel kleiner is dan de turgordruk van de cellen, biedt de matrix in deze limiet van kleine poriegrootte slechts een zwakke weerstand tegen cellulaire groei en lijkt hij de 3D-geprinte structuur niet sterk te beïnvloeden, ook zoals geverifieerd in ons vorige werk37.

Vergelijkbare resultaten worden waargenomen voor experimenten die worden uitgevoerd in monsters met een groot volume; Gezien de grotere overvloed aan voedingsstoffen in deze monsters, konden de experimenten de cellulaire groei over langere tijdschalen ondersteunen. Als voorbeeld worden resultaten getoond met behulp van de granulaire hydrogelmatrices waarbij de gemiddelde poriegrootte kleiner was dan de celgrootte - en dus was cellulaire spreiding voornamelijk te wijten aan groei. De monsters worden gedurende ~30 dagen afgebeeld in de granulaire hydrogelmatrices en gedurende de eerste 150 uur een vergelijkbare oppervlakte-expansie waargenomen voor zowel niet-beweeglijke als beweeglijke cellen; op nog langere tijdstippen wordt echter een sterke variabiliteit waargenomen tussen de monsters, waarbij sommige monsters een snellere verspreiding vertonen (figuur 9 en figuur 10). Interessant is dat bij het opnieuw bemonsteren van de hydrogelmatrix na het experiment - een voordeel van het grote volume van de hydrogelmatrix - een afname van de opbrengstspanning, opslagmoduli en verliesmoduli wordt gemeten (Figuur 11), wat aangeeft dat de matrices zachter werden. Deze verandering zou te wijten kunnen zijn aan het feit dat de V. cholerae een molecuul produceert dat de eigenschappen van de hydrogelmatrix verandert en de cellulaire verspreiding op lange tijden bevordert, wat interessant zal zijn om in toekomstig onderzoek te testen. Voorbeelden van de ruwe, fractal-achtige koloniemorfologieën die in deze experimenten resulteren, zijn weergegeven in figuur 10.

figure-results-1
Figuur 1: Afbeeldingen van de op maat gemaakte 3D-bioprinter. (A) Bioprinter met een aangepaste spuitpompextruderkop met een Luerlock-wegwerpspuit en naald. Bioprinter is ~46 cm breed. (B) Afbeelding van 3D-printen van cellen in kolven gevuld met vastgelopen hydrogelmatrix. De breedte van de afbeelding is 87 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Karakterisering van de reologische eigenschappen van de hydrogelmatrices in korrelvorm. (A) Schuifspanning als functie van de toegepaste afschuifsnelheid. (B) Opslag- en verliesmoduli, respectievelijk G' en G'', als functie van de oscillatiefrequentie. De legenda geeft de hydrogelmassafractie aan die wordt gebruikt om elke hydrogelmatrix te bereiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Metingen van de poriegrootte van twee representatieve granulaire hydrogelmatrices. Door tracers te volgen, wordt de verdeling van karakteristieke porieafmetingen voor elke hydrogelmatrix bepaald. De gegevens worden weergegeven door 1-CDF, waarbij CDF de cumulatieve verdelingsfunctie is. De legenda geeft de hydrogelmassafractie aan die wordt gebruikt om elke matrix te bereiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Voorbeelden van belletjes die ontstaan tijdens het 3D-printen van bacteriën. (A) Schema van de beeldvormingsopstelling. (B) Snapshots van de groei van V. cholerae met een luchtbel aan de onderkant van de print (rode doos) in 1,2% hydrogelmatrix gezwollen in LB. Na 59 uur groeien bij 37 °C is de luchtbel volledig opgelost en zakt de kolonie terug door de elasticiteit van de hydrogelmatrix. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Afbeeldingen van de horizontale lijn van beweeglijke V. cholerae geprint in een plaat met zes putjes gevuld met 1,2% hydrogelmatrix gezwollen in LB en de biofilm die zich op het bovenoppervlak vormde na 48 uur incubatie bij 37 °C. (A) Schema van de beeldvormingsopstelling. (B) De biofilmvorming op het bovenoppervlak als gevolg van vervuiling tijdens 3D-printen vermindert de opaciteit en maakt geen duidelijke beeldvorming van de horizontale lijn mogelijk. Het bovenoppervlak vormt rimpels, vermoedelijk als gevolg van differentiële groei. Schaalbalk = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Voorbeelden van verschillende monsterhouders die bij deze methode kunnen worden gebruikt. (A) V. cholerae na 470 uur afgedrukt in een glazen injectieflacon gevuld met 1,2% granulaire hydrogelmatrix. De kromming van de flacon maakt het moeilijk om de groei in beeld te brengen. Schaalbalken = 5 mm. (B) V. cholerae gedrukt in een micro-cuvet gevuld met 1,2% korrelige hydrogelmatrix. De platte zijkanten zorgen voor een duidelijke beeldvorming, maar de kleine volumes beperken de duur van experimenten voordat cellen geen groeisubstraten meer hebben. (C) Beeldvormingsopstelling met een zoomlens om V. cholerae in beeld te brengen, afgedrukt in een weefselkweekkolf gevuld met 1,2% korrelige hydrogelmatrix. Net als bij de micro-cuvettenkast zorgen de platte zijkanten voor een duidelijk beeld. De weefselkweekkolven kunnen worden gevuld met grotere volumes granulaire hydrogelmatrix, waardoor de experimentele tijdspanne wordt verlengd. (D) Beeld van de zoomlens van de V. cholerae , geprint in een 1,2% korrelige hydrogelmatrix na 100 uur incubatie bij 37 °C. Schaalbalk = 1 mm. (E) Beeldvormingsopstelling met een confocale microscoop om fluorescerende cellen in beeld te brengen. F) 3D-projectie van confocale microfoto's van fluorescerende E. coli in de 1,2% granulaire hydrogelmatrix na 10 dagen incubatie bij 37 °C. Schaalbalk = 50 μm. (G) Confocale microfoto met eencellige resolutie van fluorescerende E. coli in de hydrogelmatrix. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Uitbreiding van het gebied als functie van de tijd van kolonies van V. cholerae afgedrukt in 1 ml granulaire hydrogel-ondersteuningsmatrices. De gegevens op de plot zijn afkomstig uit de beeldanalyse van figuur 8. Er werd waargenomen dat beweeglijke cellen (gesloten rode cirkel en vierkant) zich sneller verspreiden dan de niet-beweeglijke cellen, wat een weerspiegeling is van verspreiding door zowel groei als beweeglijkheid. Bovendien verspreiden de beweeglijke cellen in de hydrogelmatrix met een grote poriegrootte (rode vierkanten) zich sneller dan de cellen in de hydrogelmatrix met poriën van 0,3 μm (rode cirkels). Niet-beweeglijke cellen vertonen geen verschil in oppervlakte-uitzettingssnelheid tussen de twee poriegroottes, omdat ze alleen maar groeien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Kolonies van V. cholerae geprint in 1 ml granulaire hydrogel-ondersteuningsmatrices. (A) Snapshots van de groei en beweeglijkheid van beweeglijke V. cholerae in een 0,9% granulaire hydrogelmatrix waarbij de poriegrootte groter is dan de gemiddelde celdiameter. Pijlen geven een diffuse pluim aan die ontstaat als gevolg van cellen die door de hydrogelmatrix bewegen. (B) Snapshots van de groei en beweeglijkheid van beweeglijke V. cholerae in een 1,2% granulaire hydrogelmatrix waarbij de poriegrootte kleiner is dan de gemiddelde celdiameter. Pijlen geven een ruwe, fractalachtige pluim aan die zich vormt als gevolg van celgroei. (C) Momentopnamen van de tijdsevolutie van niet-beweeglijke V. cholerae in 0,9% granulaire hydrogelmatrix waarbij de poriegrootte groter is dan de gemiddelde celdiameter. In dit geval zijn diffuse pluimen die de beweeglijkheid weerspiegelen niet waarneembaar. (D) Snapshots van de groei van niet-beweeglijke V. cholerae in een 1,2% granulaire hydrogel-ondersteuningsmatrix waarbij de poriegrootte kleiner is dan de gemiddelde celdiameter. In dit geval zijn ruwe, fractal-achtige pluimen die de groei weerspiegelen opnieuw waarneembaar. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Uitbreiding van het gebied als functie van de tijd van kolonies van V. cholerae geprint in 20 ml 1,2% granulaire hydrogel-ondersteuningsmatrices. Niet-beweeglijke (open cirkels) en beweeglijke cellen (gesloten cirkels) verspreiden zich gedurende de eerste 100 uur met vergelijkbare snelheden. Na 100 uur worden verschillen in de oppervlakte-expansiesnelheden waargenomen, mogelijk als gevolg van de evolutie van de variabiliteit op lange tijdstippen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: Kolonies van V. cholerae geprint in 22 ml 1,2% korrelige hydrogelmatrices gekweekt bij 37 °C. (Boven) Snapshots van de groei van beweeglijke V. cholerae. (Onder) Snapshots van de groei van niet-beweeglijke V. cholerae. In beide gevallen zijn ruwe, fractal-achtige pluimen waarneembaar die de groei weerspiegelen. Schaalbalken = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 11: Karakterisering van de reologische eigenschappen van de 1,2% granulaire hydrogelmatrix voor (0 uur) en na het experiment (397 uur). (A) Schuifspanning als functie van de toegepaste afschuifsnelheid. (B) Opslag- en verliesmoduli, respectievelijk G' en G'', als functie van de toegepaste oscillatiefrequentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gcode-opdrachtenTaken
M82Absolute extrusiemodus
M302 S0Koude extrusie inschakelen
M92 E14575Stel de extrusiestappen per mm in
G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0Stel de z-as en extrusiepositie in op nul, en de x-, y-positie op 35,71 mm en y 88 mm waar de printkop zich bevindt wanneer de g-code begint
M221 S100 T0stelt het debiet in op 100%
M107Zet de ventilator uit
G1 F1 X35.61 Y81 E0.1Extrudeer de 20 μL bioinkt in de matrix met een voedingssnelheid van 50 μL/min op de plaats waar de huidige positie is ingesteld
G0 F200 Z60Trek de naald uit de matrix en bemonster de contianer met een snelheid van 200 mm/min
G0 F500 X65.81 Y81.0Verplaats de naald naar de volgende monstercontiainer met een snelheid van 500 mm/min
G0 F100 Z0Laat de naald in de volgende monstercontiainer zakken naar dezelfde z-positie waar het printen begon met een snelheid van 100 mm/min
G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2Extrudeer de 20 μL bioinkt in de matrix met een voedingssnelheid van 50 μL/min op de plaats waar de huidige positie is ingesteld
G0 F200 Z60Trek de naald uit de matrix en bemonster de contianer met een snelheid van 200 mm/min
G0 F500 X96.01 Y81.0Verplaats de naald naar de volgende monstercontiainer met een snelheid van 500 mm/min
G0 F100 Z0Laat de naald in de monstercontiainer zakken in dezelfde z-positie waar het printen begon met een snelheid van 100 mm/min
G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3Extrudeer de 20 μL bioinkt in de matrix met een voedingssnelheid van 50 μL/min op de plaats waar de huidige positie is ingesteld
G0 F200 Z60Trek de naald uit de matrix en bemonster de contianer met een snelheid van 200 mm/min
G0 F500 X126.21 Y81.0Verplaats de naald naar de volgende monstercontiainer met een snelheid van 500 mm/min
G0 F100 Z0Laat de naald in de volgende monstercontiainer zakken naar dezelfde z-positie waar het printen begon met een snelheid van 100 mm/min
G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4Extrudeer de 20 μL bioinkt in de matrix met een voedingssnelheid van 50 μL/min op de plaats waar de huidige positie is ingesteld
G0 F200 Z80Trek de naald uit de matrix en bemonster de contianer met een snelheid van 200 mm/min

Tabel 1: G-code programmering voor het printen van verticale lijnen van de bacteriële suspensie.

Aanvullend bestand 1: STL-vijl voor de onderste klem 1 ml wegwerp Luer lock-spuiten voor de spuitextruder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: STL-vijl voor de bovenste klem voor 1 ml wegwerp Luer lock-spuiten voor de spuitextruder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: STL-bestand voor de spuitadapter voor 1 ml Luer lock-wegwerpspuiten voor de spuitextruder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: STL-vijl voor de cuvettenmonsterhouder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 5: STL-vijl voor de monsterhouder van de weefselkolf. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: STL-bestand voor de 6-wells plaat en het 35 mm petrischaaldrukbed. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 7: Aangepast script voor het volgen van deeltjes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Kritieke stappen in het protocol
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat bij het bereiden van elke hydrogelmatrix de matrix in een steriele omgeving wordt gemaakt. Zo niet, dan kan er besmetting optreden, die zich na enkele dagen manifesteert als bijvoorbeeld microkolonies (kleine sferoïden) in de matrix. Tijdens het mengproces is het belangrijk dat alle droge korrelige hydrogeldeeltjes worden opgelost. Bovendien zullen de korrels bij het aanpassen van de pH van elke hydrogelmatrix met de NaOH beginnen op te zwellen, waardoor de viscositeit van de hydrogelmatrix toeneemt, waardoor mengen moeilijker wordt. Het gebruik van de keukenmixer zorgt ervoor dat de NaOH goed in de hydrogelmatrix wordt gemengd. Tijdens het laden van elke bacteriële suspensie kunnen zich luchtbellen in de naald vormen. Om dit probleem te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de punt van de naald altijd in de bacteriële suspensie in de centrifugebuis zit en niet aan de onderkant van de buis of in de buurt van het bovenoppervlak. Een andere manier om dit probleem op te lossen, is door grote hoeveelheden cellen te kweken en zo grotere volumes van de bacteriële suspensie te hebben om te printen.

Beperkingen
Momenteel beperkt de lage viscositeit van de bacteriële suspensie tijdens het printen de geometrieën die kunnen worden geprint en leidt dit vaak tot de vorming en groei van biofilm op de bovenkant van het oppervlak van de hydrogelmatrix als gevolg van sporencellen. Er zijn een paar mogelijke methoden om deze beperking te overwinnen, waaronder het verhogen van de viscositeit van de bacteriële suspensie of het verder optimaliseren van de 3D-printerinstellingen. Om de viscositeit van de bacteriële suspensie te verhogen, zou men de bacteriële suspensie kunnen mengen met een ander polymeer - bijvoorbeeld alginaat, dat eerder is gebruikt voor het 3D-printen van bacteriën op vlakke oppervlakken38. De printerinstellingen kunnen verder worden geoptimaliseerd om het terugtrekken van de zuiger van de spuit mogelijk te maken tijdens het terugtrekken van de naald uit de granulaire hydrogelmatrix, wat het potentieel zou hebben om te voorkomen dat cellen worden afgezet tijdens het verwijderen van de naald uit de hydrogelmatrix.

De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden
De hier beschreven methode maakt het mogelijk om bacteriekolonies te printen in korrelige hydrogelmatrices. De granulaire hydrogelmatrices maken het mogelijk om de impact van externe omgevingsfactoren (bijv. poriegrootte, vervormbaarheid van de matrix) op de beweeglijkheid en groei van bacteriën te bestuderen. Bovendien, terwijl LB in dit werk wordt gebruikt als het vloeibare groeimedium om de hydrogelmatrix op te zwellen, kan de hydrogelmatrix worden opgezwollen met andere vloeibare groeimedia, waaronder media met antibiotica. Eerdere methoden voor het bestuderen van bacteriën in besloten omgevingen werden beperkt door de lengte van de experimentele tijd, de polymeermaaswijdte en de stijfheid van de omringende hydrogelmatrix37,38. Er bestaan al protocollen voor het maken van granulaire hydrogelmatrices uit verschillende polymeren, dus het potentieel voor het bestuderen van de effecten van verschillende omgevingsomstandigheden op de beweeglijkheid en groei van bacteriën is enorm. Deze methode maakt het mogelijk om bacteriën te bestuderen in controleomgevingen die gemakkelijker de omgevingen recapituleren die bacteriën in de echte wereld bewonen, zoals gastheerslijm of bodem. Een andere beperking van veel andere methoden is de ondoorzichtigheid van de omringende matrix; deze benadering met behulp van optisch transparante materialen biedt echter de mogelijkheid om bijvoorbeeld optogenetische controle en patronen van bacteriën in 3D te onderzoeken.

Naast het bestuderen van beweeglijkheid en groei, overwint de hier beschreven 3D-printmethode de beperking van vele andere bioprintmethoden die de afzetting van een bio-inkt op een substraat vereisen en daarom beperkt zijn in de hoogte van het gemanipuleerde levende materiaal dat ze kunnen produceren. In de toekomst kan dit bioprintprotocol verder worden uitgebreid om biohybride materialen te fabriceren door polymeren te mengen met biofilmvormende cellen. De granulaire hydrogelmatrices bieden ondersteuning voor het 3D-printen van dikkere, grootschaligere gemanipuleerde levende materialen en complexere geometrieën dan veel andere huidige bioprintmethoden voor bacteriën. Hoewel dit werk alleen V. cholerae en E. coli gebruikte, zijn ook andere soorten, zoals Pseudomonas aeruginosa, met succes 3D-geprint37. Naast printen kan de printer worden aangepast om na de groei een gecontroleerde bemonstering van bacteriën uit te voeren om bijvoorbeeld te zien of er genetische veranderingen zijn opgetreden.

Openbaarmakingen

Het experimentele platform dat wordt gebruikt om bacteriële gemeenschappen in deze publicatie in 3D te printen en in beeld te brengen, is het onderwerp van een octrooiaanvraag ingediend door Princeton University namens Tapomoy Bhattacharjee en S.S.D. (PCT-aanvraagnummer PCT/US/2020/030213).

Dankbetuigingen

R.K.B. erkent de steun van het Presidential Postdoctoral Research Fellows Program. Dit materiaal is ook gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door NSF Graduate Research Fellowship Program Grant DGE-2039656 (aan AMH). A.S.D.-M. en H.N.L. erkennen de steun van het Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund aan de Princeton University. We danken ook het laboratorium van Bonnie Bassler voor het leveren van stammen van V. cholerae. S.S.D. erkent steun van NSF Grants CBET-1941716, DMR-2011750 en EF-2124863, evenals het Eric en Wendy Schmidt Transformative Technology Fund, de New Jersey Health Foundation, het Pew Biomedical Scholars Program en het Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL cuvettesVWR97000-586
1 mL Luer lock syringeBH SuppliesBH1LL
10 M NaOHSigma-Aldrich72068
100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres)  Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)
F8803
15 mL centrifuge tubesThermoFischer Scientific14-955-237
20 G blunt needleMcMaster Carr75165A252
25 mL tissue culture flasksVWR10861-566
3D printerLulzbotLulzBot Mini 2
3D printing softwareCuraCura-Lulzbot
50 mL centrifuge tubesThermoFischer Scientific14-955-239
AgarSigma-AldrichA1296
Carbomer Granular Hydrogel ParticlesLubrizol Carbopol 980NFdry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers
Centrifuge (2 mL tube capacity)VWR2405-37
Centrifuge (50 mL tube capacity)ThermoFischer Scientific75007200Sorvall (brand) ST 8 (model)
Confocal MicroscopeNikonA1R+ inverted laserscanning
confocal microscope
Glass bottom petri dishCellvisD35-10-1-N
Lennox LB (Lubria Broth)Sigma-AldrichL3022
M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket CapMcMaster Carr91290A478
M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex NutMcMaster Carr93187A300
Open-source syringe pumpCustom-madeReplistruder 4https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791
Petri dish (60 mm round)ThermoFischer ScientificFB0875713A
Shear RheometerAnton PaarMCR 501
Ultrasonic cleanerVWR97043-992

Referenties

  1. Persat, A., et al. The mechanical world of bacteria. Cell. 161 (5), 988-997 (2015).
  2. Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system. Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).
  3. Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores. Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).
  4. Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387(2017).
  5. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nature Reviews Microbiology. 9 (4), 244-253 (2011).
  6. Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).
  7. Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more. Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).
  8. Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).
  9. Harman, M. W., et al. The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).
  10. Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
  11. Siitonen, A., Nurminen, M. Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).
  12. Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).
  13. O’Neil, H. S., Marquis, H. Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion. Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).
  14. Gill, C. O., Penney, N. Penetration of bacteria into meat. Applied and Environmental Microbiology. 33 (6), 1284-1286 (1977).
  15. Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding. Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).
  16. Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration. Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).
  17. Toley, B. J., Forbes, N. S. Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue. Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).
  18. Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).
  19. de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).
  20. Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots. FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).
  21. Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. Rhizosphere biology and crop productivity—a review. Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).
  22. Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment. Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).
  23. Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources. Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).
  24. Ford, R. M., Harvey, R. W. Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).
  25. Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies. Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).
  26. Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Influence of confinement on the spreading of bacterial populations. PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063(2022).
  27. Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. A biophysical threshold for biofilm formation. eLife. 11, e76380(2022).
  28. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).
  29. Bhattacharjee, T., et al. Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming. Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).
  30. Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media. Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).
  31. Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075(2019).
  32. Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. Chemotactic migration of bacteria in porous media. Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).
  33. Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S. Chemotactic smoothing of collective migration. eLife. 11, e71226(2022).
  34. Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting. HardwareX. 9, e00170(2021).
  35. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  36. Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 9671(2017).
  37. Martínez-Calvo, A., et al. Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119(2022).
  38. Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward approach for 3D bacterial printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
  39. Zhang, Q., et al. Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118(2021).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bacteri le beweeglijkheidgranulaire hydrogelmatrixkoloniegroeiVibrio choleraeEscherichia colieffecten van poriegroottebio printtechniekceluitspreiding
3D-printbacteriën om beweeglijkheid en groei in complexe 3D-poreuze media te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.