Methodenartikel

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

DOI:

10.3791/66169

⸱

5 januari 2024

 , 
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomoleculaire condensaten gevormd via vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) worden als cruciaal beschouwd voor de cellulaire organisatie en een toenemend aantal cellulaire functies. Het karakteriseren van LLPS in levende cellen is ook belangrijk omdat afwijkende condensatie in verband is gebracht met tal van ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve aandoeningen. LLPS wordt vaak aangedreven door selectieve, voorbijgaande en multivalente interacties tussen intrinsiek ongeordende eiwitten. Van groot belang is de interactiedynamiek van eiwitten die deelnemen aan LLPS, die goed worden samengevat door metingen van hun bindingsverblijftijd (RT), dat wil zeggen de hoeveelheid tijd die ze doorbrengen gebonden in condensaten. Hier presenteren we een methode op basis van live-cell single-molecule imaging die ons in staat stelt om de gemiddelde RT van een specifiek eiwit in condensaten te meten. We visualiseren tegelijkertijd individuele eiwitmoleculen en de condensaten waarmee ze associëren, gebruiken single-particle tracking (SPT) om trajecten van één molecuul in kaart te brengen en passen de trajecten vervolgens aan in een model van eiwitdruppelbinding om de gemiddelde RT van het eiwit te extraheren. Ten slotte tonen we representatieve resultaten waarbij deze single-molecule beeldvormingsmethode werd toegepast om de gemiddelde RT's van een eiwit op zijn LLPS-condensaten te vergelijken wanneer het gefuseerd en niet-gefuseerd is met een oligomeriserend domein. Dit protocol is breed toepasbaar op het meten van de interactiedynamiek van elk eiwit dat deelneemt aan LLPS.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een groeiend aantal onderzoeken suggereert dat biomoleculaire condensaten een belangrijke rol spelen in de cellulaire organisatie en tal van cellulaire functies, bijvoorbeeld transcriptionele regulatie 1,2,3,4,5, DNA-schadeherstel 6,7,8, chromatineorganisatie 9,10,11,12, X-chromosoom inactivatie 13,14,15 en intracellulaire signalering 16,17,18. Bovendien is de ontregeling van biomoleculaire condensaten betrokken bij veel ziekten, waaronder kankers 19,20,21 en neurodegeneratieve aandoeningen 22,23,24,25,26. Condensaatvorming wordt vaak aangedreven door voorbijgaande, selectieve en multivalente eiwit-eiwit-, eiwit-nucleïnezuur- of nucleïnezuur-nucleïnezuurinteracties27. Onder bepaalde omstandigheden kunnen deze interacties leiden tot vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS), een dichtheidsovergang die lokaal specifieke biomoleculen verrijkt in membraanloze druppeltjes. Dergelijke multivalente interacties worden vaak gemedieerd door de intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) van eiwitten 1,28,29. Biofysische karakterisering van deze interacties op moleculair niveau is van cruciaal belang voor ons begrip van talrijke gezonde en afwijkende cellulaire functies, gezien de alomtegenwoordigheid van condensaten eroverheen. Hoewel technieken op basis van confocale fluorescentiemicroscopie, bijvoorbeeld fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP)30,31,32, op grote schaal zijn gebruikt om kwalitatief aan te tonen dat de moleculaire uitwisselingen tussen condensaten en de omringende cellulaire omgeving dynamisch zijn, is het kwantificeren van de interactiedynamiek van specifieke biomoleculen binnen condensaten over het algemeen niet mogelijk met conventionele confocale microscopie of enkelvoudige molecule microscopie zonder gespecialiseerde data-analysemethoden. De single-particle tracking (SPT)-techniek die in dit protocol wordt beschreven, is gebaseerd op live-cell single-molecule microscopie33 en biedt een uniek krachtig hulpmiddel om de interactiedynamiek tussen specifieke eiwitten in condensaten te kwantificeren. De uitlezing van SPT voor een dergelijke meting is de gemiddelde verblijftijd van een eiwit dat van belang is in de condensaten.

Het protocol kan worden opgesplitst in twee delen: data-acquisitie en data-analyse. De eerste stap van het verzamelen van beeldvormingsgegevens is het tot expressie brengen in cellen van een interessant eiwit dat is gefuseerd met een HaloTag34. Dit maakt het mogelijk om het eiwit van belang te labelen met twee fluoroforen, waarbij een meerderheid van de eiwitmoleculen moet worden gelabeld met een niet-fotoactiveerbare fluorofoor (bijv. JFX549 Halo-ligand35) en een klein deel ervan moet worden gelabeld met een spectraal verschillende, foto-activeerbare fluorofoor (bijv. PA-JF646 Halo-ligand36). Dit maakt het mogelijk om tegelijkertijd alle condensaatlocaties in de cel te verwerven en om films met één molecuul te maken van het eiwit dat zich bindt en ontbindt aan de condensaten. Ondertussen worden hetzelfde type cellen gemodificeerd om stabiel Halo-gelabeld H2B tot expressie te brengen, een histon dat grotendeels immobiel is op chromatine. De cellen worden vervolgens gekleurd met het PA-JF646 Halo-ligand om beeldvorming van H2B met één molecuul mogelijk te maken. Zoals hieronder in detail zal worden besproken, verklaart dit experiment de bijdrage van fotobleken om een nauwkeurige kwantificering van de interactiedynamiek van het eiwit van belang mogelijk te maken. Cellen voor beeldvormingsexperimenten moeten vervolgens worden gekweekt op schone dekglaasjes, gekleurd met HaloTag-ligand(en) en worden samengevoegd tot een beeldvormingskamer met levende cellen. Van daaruit wordt het monster afgebeeld onder sterk hellende en gelamineerde optische plaat (HILO) verlichting op een TIRF-microscoop (Total Internal Reflection Fluorescence) die in staat is tot tweekanaals beeldvorming en detectie van één molecuul. De emissie wordt vervolgens opgesplitst in twee camera's, één die condensaatposities volgt en één die afzonderlijke moleculen volgt. Acquisitie wordt uitgevoerd met een lange integratietijd (in de orde van honderden ms) om vrij diffuse eiwitten te vervagen en alleen eiwitten te vangen die minder mobiel zijn vanwege binding aan stabiele structuren in de cel37.

De eerste stap van data-analyse is het gebruik van een gevestigd single-particle tracking (SPT)-algoritme38,39 om individuele eiwitmoleculen in elk frame van de film te lokaliseren en de lokalisaties samen te voegen tot een traject voor elk molecuul gedurende zijn detecteerbare levensduur. De trajecten worden vervolgens gesorteerd in die welke moleculen binnen en die moleculen buiten de condensaten vertegenwoordigen door de lokalisaties van de moleculen gedurende hun trajecten te vergelijken met de lokalisaties van alle condensaten op de overeenkomstigetijdstippen 1.

Vervolgens wordt een overlevingscurve (1 - CDF) gegenereerd met behulp van de lengtes van alle in-condensaattrajecten. De schijnbare gemiddelde verblijftijd van de moleculen wordt vervolgens geëxtraheerd door de overlevingscurve aan te passen aan het volgende tweecomponenten exponentiële model van eiwitbinding,

figure-introduction-1,

met A als de fractie van moleculen die niet-specifiek gebonden zijn en met kobs,ns en kobs,s als de waargenomen dissociatiesnelheden van respectievelijk de niet-specifiek gebonden en specifiek gebonden moleculen. Vanaf nu wordt alleen kobs,s in aanmerking genomen. De dynamiek van zowel eiwitdissociatie, ktrue,s, als fotobleken van de fluorofoor, kpb, dragen bij aan kobs,s als

figure-introduction-2;

dus om de effecten van eiwitdissociatie te isoleren, wordt de specifieke dissociatiesnelheid van H2B-Halo in de eerder genoemde cellijn gemeten.

figure-introduction-3

H2B is een eiwit dat stabiel is geïntegreerd in chromatine en dat minimale dissociatie ervaart in de tijdschaal van een filmacquisitie met één molecuul37. De specifieke dissociatiesnelheid is dan gelijk aan de fotobleeksnelheid van het PA-JF646 Halo-ligand, of

figure-introduction-4.

De gemiddelde verblijftijd in condensaat van het eiwit van belang, figure-introduction-5, is dan

figure-introduction-6.

Representatieve resultaten van Irgen-Gioro et al.40 worden getoond, waarbij dit protocol werd toegepast om aan te tonen dat het fuseren van een oligomerisatiedomein met IDR resulteert in langere verblijftijden van de IDR in zijn condensaten. Dit resultaat suggereert dat het toegevoegde oligomerisatiedomein de homotypische interacties van de IDR stabiliseert die LLPS aanstuurt. In principe kan dezelfde methode met licht gewijzigde protocollen worden toegepast om de homotypische of heterotypische interacties te karakteriseren van elk eiwit dat deelneemt aan de vorming van alle soorten condensaten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Etikettering van eiwitten in cellen

  1. Breng het eiwit van belang dat is gefuseerd met HaloTag in de gewenste cellijn tot expressie.
  2. Breng Halo-gelabelde H2B stabiel tot expressie in hetzelfde type cellen als in 1.1 met behulp van transposons of virale transductie.

2. Opstellen van dekglaasjes

  1. Voordat u dekglaasjes voor celkweek gebruikt, moet u dekglaasjes reinigen om autofluorescerende verontreinigingen te verwijderen.
    1. Monteer dekglaasjes met een diameter van 25 mm #1.5 op een keramisch kleurrek en plaats ze in een polypropyleen container.
    2. Dompel dekglaasjes volledig onder in een 1 M-oplossing van KOH en sonificeer gedurende 1 uur.
    3. Spoel de dekglaasjes driemaal af met dubbel gedestilleerd water (ddH2O).
    4. Dompel dekglaasjes volledig onder in 100% ethanol en sonificeer gedurende 1 uur.
    5. Dompel dekglaasjes volledig onder in 20% ethanol verdund met ddH2O en bewaar ze tot gebruik bij 4 °C.

3. Voorbereiding van cellen voor microscopie

NOTITIE: Voer de stappen uit dit gedeelte uit in een bioveiligheidskast om besmetting van de cellen te voorkomen.

  1. Plaatcellen op gereinigde dekglaasjes. Voer 2 dagen voor de beeldvorming uit als het Halo-gelabelde eiwit tijdelijk tot expressie moet worden gebracht. Voer 1 dag voor de beeldvorming uit of het Halo-gelabelde eiwit stabiel of endogeen tot expressie wordt gebracht.
    1. Gebruik een steriele pincet om dekglaasjes in een plaat met 6 putjes te plaatsen (één dekglaasje/putje per celmonster) en laat de resterende ethanol verdampen.
    2. Plaat elk putje met een geschikt aantal cellen om 70% confluentie te bereiken tegen de tijd van beeldvorming. Plaat een extra putje met cellen die stabiel H2B-Halo tot expressie brengen met dezelfde doelconfluentie.
    3. Volg deze stap alleen als het Halo-gelabelde eiwit van belang tijdelijk tot expressie wordt gebracht. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 . Transfecteer vervolgens de cellen met het plasmide dat codeert voor het gelabelde eiwit van belang met behulp van geschikte transfectiereagentia en volgens de richtlijnen van de fabrikant.
    4. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 .
  2. Kleur de cellen die het Halo-gelabelde eiwit van belang tot expressie brengen met zowel een niet-fotoactiveerbaar Halo-ligand (bijv. JFX549) als een foto-activeerbare Halo-ligand (bijv. PA-JF646). Kleurcellen die H2B-Halo tot expressie brengen met alleen het fotoactiveerbare Halo-ligand.
    OPMERKING: De hier vermelde concentraties van halo-liganden moeten als uitgangspunt worden gebruikt; De optimale concentratie hangt af van het expressieniveau en de lokale concentratie in condensaat van het betreffende eiwit.
    1. Voor elk celmonster dat het Halo-gelabelde eiwit van belang tot expressie brengt, verdunt u 100 nM JFX549 Halo-ligand35 en 20 nM PA-JF646 Halo-ligand36 in 500 μL van geschikte celmedia. Verdun voor elk monster dat H2B-halo tot expressie brengt slechts 20 nM PA-JF646 Halo-ligand in 500 μL geschikte celmedia.
    2. Zuig voor elk putje bestaande media op, voeg 2 ml 1x PBS toe, zuig vervolgens PBS op (dit wordt een "spoeling" genoemd voor de rest van het protocol) en vervang door media die de juiste Halo-liganden bevatten.
    3. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2 .
    4. Spoel vier keer met PBS en vervang door nieuwe media die geen Halo-liganden bevatten.
    5. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
    6. Herhaal stap 3.2.4 en 3.2.5 driemaal (in totaal vier spoel-incubatiecycli).
    7. Gebruik een steriele pincet om het dekglaasje met cellen over te brengen naar een dekglaasjeskamer voor celkweek die compatibel is met de microscooptafel.
    8. Voeg fenolroodvrije media toe aan de kamer en ga verder met beeldvorming. Incubeer de monsters die niet onmiddellijk in beeld worden gebracht bij 37 °C en 5% CO2 totdat ze nodig zijn.

4. Beeldvorming met één molecuul

OPMERKING: Onafhankelijke experimenten die de verblijftijden van zowel H2B als het eiwit van belang meten, moeten gedurende meerdere (≥3) dagen worden uitgevoerd om statistisch significante resultaten te genereren. Voordat u celmonsters op de microscoop afbeeldt, lijnt u de twee camera's uit met behulp van 0,1 μm gekleurde microbolletjes (Materiaaltabel) of een vergelijkbare kalibratiestandaard.

  1. Bereid de microscoop voor.
    1. Zet de microscoop en de computer die de microscoop bestuurt aan.
    2. Schakel de incubatiecomponenten van levende cellen (verwarming en CO2) op de microscoop in en stel deze in op 37 °C en 5% CO2 . Laat het systeem in evenwicht komen.
    3. Doe een druppel van de juiste olie op een 100x TIRF-olie-onderdompelingsobjectief op de microscoop en laad het celmonster op de microscooptafel.
  2. Identificeer een cel om af te beelden.
    1. Maak een beeld van het celmonster onder helderveldverlichting en pas de z-positie aan totdat de cellen scherp zijn.
    2. Identificeer een cel die morfologische kenmerken van gezonde cellen vertoont.
    3. Snijd het gezichtsveld (FOV) bij zodat het alleen de kern van de doelcel vastlegt.
    4. Gebruik laserverlichting en pas de TIRF-hoek aan totdat HILO-verlichting41 met optimale signaal-ruisverhouding van afzonderlijke moleculen is bereikt.
  3. Afbeelding H2B-Halo in levende cellen.
    OPMERKING: De laservermogens die in dit gedeelte worden gebruikt, zijn specifiek voor dit experiment en zijn als voorbeeld opgenomen. Geschikte laservermogens moeten worden gekozen op basis van de criteria die in de discussie worden vermeld.
    1. Stel als volgt een acquisitieconfiguratie in. Stel de belichtingstijd in op 500 ms. Prikkel tijdens elke blootstelling van 500 ms PA-JF646-gelabelde H2B-Halo-moleculen met een straal van 9.1 mW, 640 nm. Tijdens de dode tijd tussen frames (158,01 μs op het hier gebruikte beeldvormingssysteem), fotoactiveer de moleculen met een straal van 111 μW, 405 nm.
    2. Leg 2000 frames continu vast met deze instellingen. Verhoog geleidelijk het vermogen van de 405 nm-bundel in de loop van de acquisitie wanneer het aantal foto-geactiveerde moleculen onvoldoende wordt.
  4. Stel je het Halo-gelabelde eiwit voor dat van belang is in levende cellen.
    1. Gebruik een dichroïsche spiegel met lange doorgang om emissiegolflengten over twee camera's te verdelen, één om PA-JF646 te detecteren en de andere om JFX549 te detecteren. Gebruik geschikte emissiefilters voor de camera's.
    2. Gebruik dezelfde acquisitieconfiguratie als beschreven in 4.3.1 met de volgende wijziging. Voeg een extra JFX549-kanaal toe om de locaties van de Halo-gelabelde eiwitcondensaten in de loop van de tijd te volgen. Verkrijg elke 10 s één frame (500 ms, 2.1 mW, 561 nm excitatie) in het JFX549-kanaal terwijl u de acquisitie van het PA-JF646-kanaal behoudt. Dit zal leiden tot doorbloeding in het PA-JF646-kanaal, wat zal worden verzorgd in de gegevensanalyse na acquisitie.
    3. Leg 2000 frames continu vast met deze instellingen. Verhoog geleidelijk het vermogen van de 405 nm-bundel in de loop van de acquisitie wanneer het aantal foto-geactiveerde moleculen onvoldoende wordt.

5. Analyse van beeldvormingsgegevens van één molecuul

OPMERKING: De parameters die in sectie 5 worden gebruikt, zijn specifiek voor dit experiment en zijn als voorbeeld opgenomen. Geschikte parameters moeten worden gekozen op basis van de criteria die in de discussie worden vermeld.

  1. Bereid onbewerkte beeldvormingsgegevens voor op verwerking.
    1. Voor de gegevens van het betreffende eiwit converteert u elk kanaal uit het onbewerkte beeldgegevensbestand naar een onafhankelijk .tif bestand met behulp van ImageJ of vergelijkbare beeldverwerkingssoftware. Voor de gegevens van H2B converteert u op dezelfde manier het enkele kanaal uit het onbewerkte beeldgegevensbestand naar een .tif bestand.
      OPMERKING: Afhankelijk van de acquisitiesoftware die wordt gebruikt, kunnen er lege frames in de condensaatfilm zitten, omdat er slechts één condensaatvolgframe per 10 s wordt gemaakt. De lege frames moeten worden gevuld met het meest recente condensaatframe (sommige acquisitiesoftware doet dit automatisch). Bovendien, als er een aanzienlijke doorbloeding is van het condensaatkanaal (JFX549) naar het kanaal met één molecuul (PA-JF646) tijdens die frames voor het volgen van condensaat, moeten de overeenkomstige frames met één molecuul worden vervangen door het meest recente frame met één molecuul.
    2. Als er frames zijn die in een van beide films moeten worden vervangen vanwege de bovenstaande redenen, vervang ze dan door het meest recente frame uit die film door (indien nodig) een ImageJ-macro die beschikbaar is in Chong et al.1 aan te passen en pretracking_comb.txt uit te voeren en de aanwijzingen te volgen.
  2. Genereer trajecten van afzonderlijke deeltjes met behulp van SPT-software, bijv. SLIMfast39, een GUI-implementatie van het MTT-algoritme38 dat beschikbaar is in Teves et al.42.
    1. Laad het bestand van 5.1.2 met de single-molecule film in SLIMfast door te klikken op Load > Imagestack.
    2. Stel de parameters in (lokalisatiefoutpercentage: 10-6; deflatielussen: 3) voor lokalisatie door te klikken op OPT > Blad: Lokalisatie.
    3. Stel de parameters in (piekemissie: 664 nm; vertragingstijd: 500 ms) voor acquisitie door te klikken op OPT > Blad: Acquisitie.
    4. Visualiseer de lokalisaties van alle moleculen in één frame om ervoor te zorgen dat de gekozen parameters geschikt zijn (TEST LOC). Indien dit niet het geval is, wijzigt u de parameters in de stappen 5.2.2 en 5.2.3 en herhaalt u deze stap.
    5. Genereer een bestand met de lokalisaties van alle moleculen in elk frame (LOC ALL).
    6. Laad het bestand vanaf 5.2.5 in SLIMfast door te klikken op Load > Particle Data > SLIMfast.
    7. Stel de parameters in (maximale verwachte diffusiecoëfficiënt: 0,1 μm2/s; maximaal aantal deelnemers: 5) voor het genereren van trajecten door te klikken op OPT > Blad: Tracking.
    8. Genereer een bestand met de banen van alle moleculen (GEN TRAJ).
  3. Filter de trajecten die korter zijn dan tmin, 2,5 s, uit met behulp van evalSPT39, beschikbaar in Drosopoulos et al.43, om rekening te houden met trackingfouten die resulteren in kunstmatig korte trajecten.
    1. Laad het bestand van 5.2.8 in evalSPT (+ > bestand van 5.2.8 > OK).
    2. Stel de parameters in (min: 5 frames; Max: maximale trajectlengte voor bestand vanaf 5.2.8) om de trajecten korter dan 2.5 s uit te filteren.
    3. Genereer een bestand met alle gefilterde trajecten (EXPORT DATA).
  4. Volg deze stap alleen voor de trajecten van het eiwit dat van belang is. Sorteer de trajecten in die in de condensaten en uit de condensaten en extraheer vervolgens de gemiddelde verblijftijd in het condensaat.
    OPMERKING: Alle codes voor deze sectie zijn beschikbaar in Chong et al.1.
    1. Leg een drempelwaarde op voor alle frames van de film die zijn verkregen in het JFX549-kanaal om een time-lapse-film te genereren die is gevuld met het in de tijd evoluerende binaire masker dat condensaatlocaties markeert door de ImageJ-macro-, kern- en cluster mask_v2.txt uit te voeren en de aanwijzingen te volgen.
    2. Formatteer de trajecten met één molecuul die in 5.3.3 zijn gegenereerd. met behulp van het MATLAB-script, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, en het aanpassen van de bestandsnamen, paden en parameters indien nodig. (Parameters: Belichting, 0,5 s; Resolutie, 0,16 μm/pixel).
    3. Sorteer trajecten op basis van het deel van de levensduur dat een bepaald molecuul doorbrengt in een condensaat, F, met behulp van het MATLAB-script, categorization_v4.m, en pas de bestandsnamen en paden indien nodig aan.
    4. Ga verder met alleen in-condensaattrajecten.
  5. Extraheer kobs,s en kpb en bereken de gecorrigeerde gemiddelde verblijftijd, figure-protocol-1.
    1. Extraheer kobs,s uit de in-condensate eiwittrajecten van belang met behulp van het MATLAB-script, PLOT_ResidenceHist_css.m, en pas indien nodig bestandsnamen, paden en parameters aan.
      (Parameters: Belichting, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 frames).
    2. Extraheer kpb uit de H2B-trajecten met behulp van het MATLAB-script, PLOT_ResidenceHist_css.m, en pas indien nodig bestandsnamen, paden en parameters aan.
      (Parameters: Belichting, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 frames).
    3. Bereken de gecorrigeerde gemiddelde verblijftijd van het eiwit van belang dat specifiek aan zijn condensaten is gebonden, figure-protocol-2, als
      figure-protocol-3
      OPMERKING: Er moeten controles worden uitgevoerd om te controleren of verschillende blootstellingstijden die lang genoeg zijn om mobiele deeltjes te vervagen, bijvoorbeeld 300 ms en 800 ms, nog steeds resulteren in dezelfde gemiddelde verblijftijd van het eiwit in kwestie.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we representatieve resultaten van Irgen-Gioro et al.40, waar we dit SPT-protocol hebben gebruikt om de interactiedynamiek van twee eiwitten in hun respectievelijke zelfgeassembleerde LLPS-condensaten te vergelijken. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) bevat een IDR die LLPS kan ondergaan bij overexpressie in menselijke cellen. We veronderstelden dat het fuseren van TAF15(IDR) met FTH1 (ferritine zware keten 1), dat een oligomeer van 24 subeenheden vormt, zou leiden tot stabielere homotypische eiwit-eiwitinteracties die LLPS aansturen. Om deze hypothese te testen, hebben we tijdelijk in U2OS-cellen Halo-TAF15(IDR) of TAF15(IDR)-Halo-FTH1-fusie tot expressie gebracht en tweekleurige single-molecule beeldvorming van elk eiwit uitgevoerd volgens het bovenstaande protocol. Een representatief frame van een TAF15(IDR)-Halo-FTH1-film wordt weergegeven in figuur 1A. Moleculen die in het PA-JF646-kanaal werden gedetecteerd, werden gelokaliseerd en die lokalisaties werden samengevoegd tot trajecten. De resulterende trajecten werden vervolgens gesorteerd tussen in-condensaat en niet-condensaat populaties door vergelijking met een binair masker dat condensaatlocaties markeerde (Figuur 1B). Hoewel we slechts een klein deel van de trajecten laten zien voor een goede zichtbaarheid, is er een duidelijk onderscheid tussen de trajecten van moleculen die aan de condensaten zijn gebonden en die buiten de condensaten zijn gebonden. Vervolgens werd een overlevingscurve van in-condensaat trajectlengtes gepast tegen het tweecomponenten exponentiële model (Figuur 1C). Ten slotte werden de gemiddelde verblijftijden na correctie voor fotobleken geëxtraheerd en uitgezet voor beide eiwitten (Figuur 1D). We ontdekten dat de gemiddelde verblijftijd van Halo-TAF15(IDR) in zijn LLPS-condensaten 10,23 s ± 1,10 s was, terwijl die van TAF15(IDR)-Halo-FTH1 64,15 s ± 11,65 s was. Dit resultaat suggereert dat de toevoeging van het oligomeriserende domein aan TAF15(IDR) inderdaad de eiwit-condensaatbinding stabiliseert.

figure-results-1
Figuur 1: De op SPT gebaseerde methode lost verschillen op in de verblijftijden van eiwitten in hun condensaten. Representatieve frames uit een tweekleurige film met één molecuul van TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Eiwitten werden gelabeld met een combinatie van een hogere concentratie niet-fotoactiveerbare kleurstof (100 nM JFX549, geel) om de locaties van condensaten te visualiseren, en een lagere concentratie fotoactiveerbare kleurstof (20 nM PA-JF646, magenta) om individuele eiwitten te visualiseren, waardoor SPT mogelijk werd. Films onder dezelfde beeldvormingsomstandigheden werden verkregen voor Halo-TAF15 (IDR) en single-channel, PA-JF646-films werden verkregen voor H2B-Halo. Een witte stippellijn schetst de kern. B. Representatief samengevoegd beeld dat een binair masker van condensaatpositie (grijs) en trajecten (veelkleurig) overlapt. C. Representatieve overlevingscurve van TAF15(IDR)-Halo-FTH1 uitgerust met het tweecomponenten exponentiële model. D. De gemiddelde verblijftijd van Halo-TAF15 in was significant korter dan die van TAF15(IDR)-Halo-FTH1 in hun respectievelijke condensaten. De waarde voor elk eiwit werd gemiddeld van 20 cellen gemeten in onafhankelijke experimenten die gedurende drie dagen werden uitgevoerd. Fout werd gepropageerd als standaardfout van het gemiddelde en het sterretje vertegenwoordigt een significant verschil in de verblijftijd van de twee eiwitten (p<0,05, Wilcoxon rank-sum test). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Irgen-Gioro et al.40. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol zoals hier gepresenteerd is ontworpen voor systemen zoals die onderzocht in Irgen-Gioro et al.40. Afhankelijk van de toepassing kunnen sommige componenten van het protocol worden gewijzigd, bijvoorbeeld de methode voor het genereren van fluorescerend gelabelde cellijnen, het fluorescerende labelsysteem en de stijl van het gebruikte dekglaasje. Halo-tagging van een eiwit in een cel kan worden gedaan met behulp van twee strategieën, afhankelijk van welke het meest geschikt is voor een bepaald experiment. 1) Exogene expressie: het samensmelten van het eiwit van belang met een HaloTag en het tot expressie brengen van de fusie in een doelcellijn, hetzij tijdelijk met behulp van transfectie, hetzij stabiel met behulp van transposons of virale transductie. 2) Genoombewerking: klop een HaloTag in op de genlocus die codeert voor het endogene eiwit van belang in een doelcellijn met behulp van genoombewerkingstechnieken, bijv. CRISPR44. De voor- en nadelen van elk worden elders besproken45, maar in het kort is de exogene expressiestrategie minder tijdrovend, maar produceert een populatie cellen met een breed scala aan expressieniveaus die vaak niet-fysiologisch zijn. De genoombewerkingsstrategie duurt veel langer, maar labelt endogeen tot expressie gebrachte eiwitten van belang op hun oorspronkelijke expressieniveaus.

Bovendien vereist dit protocol niet specifiek het gebruik van een HaloTag; het is eerder compatibel met elke tag die gelijktijdige labeling van één molecuul en ensemble van hetzelfde eiwit in de cel mogelijk maakt. Het protocol kan dus worden aangepast voor gebruik met andere zelflabelende tags zoals SNAP-tag46. Ten slotte kunnen voorgereinigde schalen met glazen bodem voor celkweek, zoals MatTek-schalen (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C), worden gebruikt in plaats van dekglaasjeskamers, op voorwaarde dat ze compatibel zijn met het microscoopobjectief en de immersieolie; Dekglaasjes kunnen echter direct voor gebruik grondiger worden gereinigd en hebben dus de voorkeur.

Hoewel de bovenstaande wijzigingen in het protocol optioneel zijn, zijn er experimentele en analyseparameters die moeten worden geoptimaliseerd, namelijk de concentraties van HaloTag-liganden, de laservermogens, de lokalisatie- en trackingparameters en tmin. De concentratie van het niet-fotoactiveerbare HaloTag-ligand moet zo worden gekozen dat het condensaat dicht genoeg wordt gelabeld om maskergeneratie mogelijk te maken. De concentratie van het fotoactiveerbare HaloTag-ligand en het fotoactiveringslaservermogen moeten zo worden gekozen dat eiwitmoleculen schaars genoeg worden gelabeld en gefotoactiveerd om hoogwaardige trajecten van één deeltje te genereren, aangezien een teveel aan lokalisaties in elk frame zal resulteren in onnauwkeurige trajectgeneratie. Voor experimenten die in de representatieve resultaten werden getoond, waren er over het algemeen minder dan vijf lokalisaties per frame. Het vermogen van de excitatielaser moet laag genoeg worden gehouden om snel fotobleken te minimaliseren, maar hoog genoeg om afzonderlijke moleculen nauwkeurig te lokaliseren. De lokalisatie- en volgparameters van één molecuul moeten worden aangepast afhankelijk van de dichtheid van excitaties en de verwachte diffusiedynamiek van het eiwit van belang. Ten slotte moeten de waarden van figure-discussion-1 worden berekend over een bereik van tmin (beginnend bij 0 s en toenemend in stappen van de blootstellingstijd). De waarden van figure-discussion-2 moeten convergeren boven een bepaalde drempel van tmin; deze tmin moet worden gebruikt in stap 5.3.

De hier beschreven methode kwantificeert de interactiedynamiek van eiwitten in condensaten met een precisie die ontoegankelijk is voor conventionele technieken. Bovendien kan het dit doen in levende cellen met minimale verstoring van het monster. Dit is van cruciaal belang, aangezien het interactiegedrag van IDR's, met inbegrip van hun condensaatvorming, sterk afhankelijk is van hun lokale omgeving40.

De representatieve resultaten van Irgen-Gioro et al.40 tonen aan dat deze methode in staat is om verblijftijden te extraheren voor eiwitten die binden aan hun zelf-geassembleerde LLPS-condensaten. Belangrijk is dat deze methode gemakkelijk kan worden uitgebreid naar elk eiwit dat zich bindt aan elk type condensaat door middel van homotypische of heterotypische interacties. Bovendien is het niet beperkt tot het meten van de interactiedynamiek van eiwitten die LLPS ondergaan. Van het fusie-oncoproteïne EWS::FLI1, waarvan bekend is dat het Ewing-sarcoom veroorzaakt, is aangetoond dat het lokale, hooggeconcentreerde hubs vormt die een essentiële rol spelen in de transcriptionele activering en oncogene transformatiefuncties 1,2. Hoewel de vorming van deze hubs wordt aangedreven door voorbijgaande, selectieve en multivalente IDR-IDR-interacties van EWS::FLI1, is er tot nu toe nog steeds geen overtuigend bewijs dat het bonafide LLPS-condensaten 1,2 zijn. Toch gebruikten we de hier gepresenteerde methode om de gemiddelde verblijftijd van EWS::FLI1 op zijn hubs te meten en toonden we aan dat de mutatie van specifieke residuen en de deletie van zijn IDR de binding van EWS::FLI1 aan zijn hubs1 aanzienlijk destabiliseerden.

Ondanks de veelzijdigheid van deze methode bij het karakteriseren van de bindingsdynamiek van eiwitten in condensaten, moet voorzichtigheid worden betracht bij het kiezen van het model voor eiwitbinding in specifieke contexten. Bestaande biochemische gegevens ondersteunen het idee dat een exponentiële verdeling met twee componenten vaak een geschikt model is voor veel systemen 1,37,40,42, maar van dezelfde verdeling is ook aangetoond dat het een ongeschikte weergave is van eiwitbinding in andere systemen waar alternatieve modellen zoals exponentiële 47,48,49 met drie componenten en machtswetverdelingen 50 beter aansluiten bij de experimentele waarnemingen. Om te voorkomen dat er onnauwkeurige conclusies worden getrokken, moet men een model zorgvuldig kiezen en motiveren, controleren of de kwaliteit van de pasvorm het gebruik van het model ondersteunt en de resultaten oordeelkundig interpreteren.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), de Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), de Mallinckrodt Research Grant (S.C.) en de Margaret E. Early Medical Research Trust 2024-subsidie (SC). S.C. wordt ook ondersteund door de NIH/NCI onder Award Number P30CA016042.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1 µm TetraSpeck microsphereInvitrogenT7279Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 CoverslipsMarienfeld Superior111650Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filterSemrockFF01-593/40-25Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filterSemrockFF01-676/37-25Single-molecule imaging
6-Well TC PlateGenesee25-105MPPreparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OSATCCHTB-96Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted MicroscopeNikonSingle-molecule imaging
Ethanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparation of coverslips
evalSPTAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
FijiAnalysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser UnitNikonSingle-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-20-CPreparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-ElementsNikonSingle-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific18912014Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparation of coverslips
pretracking_comb.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation systemTokai HitSingle-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitterCairn ResearchSingle-molecule imaging
Ultrasonic CleanerBranson5800Preparation of coverslips

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R. Tuning levels of low-complexity domain interactions to modulate endogenous oncogenic transcription. Molecular Cell. 82 (11), 2084-2097 (2022).
  3. Boehning, M., et al. RNA polymerase II clustering through carboxy-terminal domain phase separation. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (9), 833-840 (2018).
  4. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), New York, N.Y. (2018).
  5. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  6. Levone, B. R., et al. FUS-dependent liquid-liquid phase separation is important for DNA repair initiation. Journal of Cell Biology. 220 (5), e202008030(2021).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. The EMBO Journal. 38 (16), e101379(2019).
  8. Pessina, F., et al. Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors. Nature Cell Biology. 21 (10), 1286-1299 (2019).
  9. Nozaki, T., et al. Condensed but liquid-like domain organization of active chromatin regions in living human cells. Science Advances. 9 (14), (2023).
  10. Maeshima, K., et al. Nucleosomal arrays self-assemble into supramolecular globular structures lacking 30-nm fibers. The EMBO Journal. 35 (10), 1115-1132 (2016).
  11. Strickfaden, H., Tolsma, T. O., Sharma, A., Underhill, D. A., Hansen, J. C., Hendzel, M. J. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  12. Gibson, B. A., et al. Organization of chromatin by intrinsic and regulated phase separation. Cell. 179 (2), 470-484 (2019).
  13. Cerase, A., Armaos, A., Neumayer, C., Avner, P., Guttman, M., Tartaglia, G. G. Phase separation drives X-chromosome inactivation: a hypothesis. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (5), 331-334 (2019).
  14. Jachowicz, J. W., Strehle, M., Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Thai, J., Guttman, M. Xist spatially amplifies SHARP/SPEN recruitment to balance chromosome-wide silencing and specificity to the X chromosome. Nature Structural & Molecular Biology. 29 (3), 239-249 (2022).
  15. Pandya-Jones, A., et al. A protein assembly mediates Xist localization and gene silencing. Nature. 587 (7832), 145-151 (2020).
  16. Du, M., Chen, Z. J. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science. 361 (6403), 704-709 (2018).
  17. Zamudio, A. V., et al. Mediator condensates localize signaling factors to key cell identity genes. Molecular Cell. 76 (5), 753-766 (2019).
  18. Zhang, J. Z., et al. Phase separation of a PKA regulatory subunit controls cAMP compartmentation and oncogenic signaling. Cell. 182 (6), 1531-1544 (2020).
  19. Kovar, H. Dr. Jekyll and Mr. Hyde: The two faces of the FUS/EWS/TAF15 protein family. Sarcoma. 2011, e837474(2010).
  20. Linardic, C. M. PAX3-FOXO1 fusion gene in rhabdomyosarcoma. Cancer Letters. 270 (1), 10-18 (2008).
  21. Ahn, J. H., et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature. 595 (7868), 591-595 (2021).
  22. Wegmann, S., et al. Tau protein liquid-liquid phase separation can initiate tau aggregation. The EMBO Journal. 37 (7), e98049(2018).
  23. Friedman, M. J., et al. Polyglutamine domain modulates the TBP-TFIIB interaction: implications for its normal function and neurodegeneration. Nature Neuroscience. 10 (12), 1519-1528 (2007).
  24. Molliex, A., et al. Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. Cell. 163 (1), 123-133 (2015).
  25. Murakami, T., et al. ALS/FTD mutation-induced phase transition of FUS liquid Droplets and reversible hydrogels into irreversible hydrogels impairs RNP granule function. Neuron. 88 (4), 678-690 (2015).
  26. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  27. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  28. Kato, M., McKnight, S. L. A solid-state conceptualization of information transfer from gene to message to protein. Annual Review of Biochemistry. 87, 351-390 (2018).
  29. Li, P., et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature. 483 (7389), 336-340 (2012).
  30. Muzzopappa, F., et al. Detecting and quantifying liquid-liquid phase separation in living cells by model-free calibrated half-bleaching. Nature Communications. 13 (1), 7787(2022).
  31. Sprague, B. L., Müller, F., Pego, R. L., Bungay, P. M., Stavreva, D. A., McNally, J. G. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 91 (4), 1169-1191 (2006).
  32. Taylor, N. O., Wei, M. -T., Stone, H. A., Brangwynne, C. P. Quantifying dynamics in phase-separated condensates using fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 117 (7), 1285-1300 (2019).
  33. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  34. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  35. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores using deuterated auxochromes. JACS Au. 1 (5), 690-696 (2021).
  36. Grimm, J. B., et al. photoactivatable fluorophores for single-molecule imaging. Nature Methods. 13 (12), 985-988 (2016).
  37. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. eLife. 6, 25776(2017).
  38. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  39. Normanno, D., et al. Probing the target search of DNA-binding proteins in mammalian cells using TetR as model searcher. Nature Communications. 6 (1), 7357(2015).
  40. Irgen-Gioro, S., Yoshida, S., Walling, V., Chong, S. Fixation can change the appearance of phase separation in living cells. eLife. 11, e79903(2022).
  41. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  42. Teves, S. S., An, L., Hansen, A. S., Xie, L., Darzacq, X., Tjian, R. A dynamic mode of mitotic bookmarking by transcription factors. eLife. 5, e22280(2016).
  43. Drosopoulos, W. C., Vierra, D. A., Kenworthy, C. A., Coleman, R. A., Schildkraut, C. L. Dynamic assembly and disassembly of the human DNA polymerase δ holoenzyme on the genome In vivo. Cell Reports. 30 (5), 1329(2020).
  44. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), New York, N.Y. 819-823 (2013).
  45. Yoshida, S. R., Maity, B. K., Chong, S. Visualizing protein localizations in fixed cells: Caveats and the underlying mechanisms. The Journal of Physical Chemistry B. 127 (19), 4165-4173 (2023).
  46. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  47. Hipp, L., et al. Single-molecule imaging of the transcription factor SRF reveals prolonged chromatin-binding kinetics upon cell stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (3), 880-889 (2019).
  48. Agarwal, H., Reisser, M., Wortmann, C., Gebhardt, J. C. M. Direct observation of cell-cycle-dependent interactions between CTCF and chromatin. Biophysical Journal. 112 (10), 2051-2055 (2017).
  49. Chen, L., Zhang, Z., Han, Q., Maity, B. K., Rodrigues, L., Zboril, E., Adhikari, R., Ko, S. H., Li, X., Yoshida, S. R., Xue, P., Smith, E., Xu, K., Wang, Q., Huang, T. H., Chong, S., Liu, Z. Hormone-induced enhancer assembly requires an optimal level of hormone receptor multivalent interactions. Molecular cell. 83 (19), 3438-3456 (2023).
  50. Garcia, D. A., et al. Power-law behavior of transcription factor dynamics at the single-molecule level implies a continuum affinity model. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6605-6620 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single molecule imagingvloeistof vloeistof fasescheidingintrinsiek ongeordende eiwittenmeting van de verblijftijdlive cell imagingsingle particle trackingHalo getagde eiwittenbinding aan eiwitcondensaten

Gerelateerde artikelen