Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Biomoleculaire condensaten gevormd via vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) worden als cruciaal beschouwd voor de cellulaire organisatie en een toenemend aantal cellulaire functies. Het karakteriseren van LLPS in levende cellen is ook belangrijk omdat afwijkende condensatie in verband is gebracht met tal van ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve aandoeningen. LLPS wordt vaak aangedreven door selectieve, voorbijgaande en multivalente interacties tussen intrinsiek ongeordende eiwitten. Van groot belang is de interactiedynamiek van eiwitten die deelnemen aan LLPS, die goed worden samengevat door metingen van hun bindingsverblijftijd (RT), dat wil zeggen de hoeveelheid tijd die ze doorbrengen gebonden in condensaten. Hier presenteren we een methode op basis van live-cell single-molecule imaging die ons in staat stelt om de gemiddelde RT van een specifiek eiwit in condensaten te meten. We visualiseren tegelijkertijd individuele eiwitmoleculen en de condensaten waarmee ze associëren, gebruiken single-particle tracking (SPT) om trajecten van één molecuul in kaart te brengen en passen de trajecten vervolgens aan in een model van eiwitdruppelbinding om de gemiddelde RT van het eiwit te extraheren. Ten slotte tonen we representatieve resultaten waarbij deze single-molecule beeldvormingsmethode werd toegepast om de gemiddelde RT's van een eiwit op zijn LLPS-condensaten te vergelijken wanneer het gefuseerd en niet-gefuseerd is met een oligomeriserend domein. Dit protocol is breed toepasbaar op het meten van de interactiedynamiek van elk eiwit dat deelneemt aan LLPS.
Inleiding
Een groeiend aantal onderzoeken suggereert dat biomoleculaire condensaten een belangrijke rol spelen in de cellulaire organisatie en tal van cellulaire functies, bijvoorbeeld transcriptionele regulatie 1,2,3,4,5, DNA-schadeherstel 6,7,8, chromatineorganisatie 9,10,11,12, X-chromosoom inac....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Etikettering van eiwitten in cellen
- Breng het eiwit van belang dat is gefuseerd met HaloTag in de gewenste cellijn tot expressie.
- Breng Halo-gelabelde H2B stabiel tot expressie in hetzelfde type cellen als in 1.1 met behulp van transposons of virale transductie.
2. Opstellen van dekglaasjes
- Voordat u dekglaasjes voor celkweek gebruikt, moet u dekglaasjes reinigen om autofluorescerende verontreinigingen te verwijderen.
- Monteer dekglaasjes met een diameter van 25 mm #1.5 op een keramisch kleurrek en plaats ze in een polypropyleen container.
- Dompel dekgl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier presenteren we representatieve resultaten van Irgen-Gioro et al.40, waar we dit SPT-protocol hebben gebruikt om de interactiedynamiek van twee eiwitten in hun respectievelijke zelfgeassembleerde LLPS-condensaten te vergelijken. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) bevat een IDR die LLPS kan ondergaan bij overexpressie in menselijke cellen. We veronderstelden dat het fuseren van TAF15(IDR) met FTH1 (ferritine zware keten 1), dat een oligomeer van 24 subeenheden vormt, zou leid.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol zoals hier gepresenteerd is ontworpen voor systemen zoals die onderzocht in Irgen-Gioro et al.40. Afhankelijk van de toepassing kunnen sommige componenten van het protocol worden gewijzigd, bijvoorbeeld de methode voor het genereren van fluorescerend gelabelde cellijnen, het fluorescerende labelsysteem en de stijl van het gebruikte dekglaasje. Halo-tagging van een eiwit in een cel kan worden gedaan met behulp van twee strategieën, afhankelijk van welke het meest geschikt is voor een b.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), de Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), de Mallinckrodt Research Grant (S.C.) en de Margaret E. Early Medical Research Trust 2024-subsidie (SC). S.C. wordt ook ondersteund door de NIH/NCI onder Award Number P30CA016042.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.1 µm TetraSpeck microsphere | Invitrogen | T7279 | Single-molecule imaging |
| 25 mm Diameter, #1.5 Coverslips | Marienfeld Superior | 111650 | Preparation of coverslips |
| 593/40 nm bandpass filter | Semrock | FF01-593/40-25 | Single-molecule imaging |
| 676/37 nm bandpass filter | Semrock | FF01-676/37-25 | Single-molecule imaging |
| 6-Well TC Plate | Genesee | 25-105MP | Preparation of cells for microscopy |
| Cell Line: U-2 OS | ATCC | HTB-96 | Labeling of proteins in cells |
| ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
| Coverglass Staining Rack | Thomas | 24957 | Preparation of coverslips |
| Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549) | Janelia Research Campus | Preparation of cells for microscopy | |
| DMEM, Low Glucose | Gibco | 10-567-022 | Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep |
| Eclipse Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | Single-molecule imaging | |
| Ethanol 200 Proof | Lab Alley | EAP200-1GAL | Preparation of coverslips |
| evalSPT | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020 | ||
| Fetal Bovine Serum | Cytiva | SH30396.03 | Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep |
| Fiji | Analysis of single-molecule imaging data | ||
| Ikon Ultra CCD Camera | Andor | X-13723 | Single-molecule imaging |
| Longpass dichroic beamsplitter | Semrock | Di02-R635-25x36 | Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter |
| LUN-F Laser Unit | Nikon | Single-molecule imaging: 405/488/561/640 | |
| MatTek glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-20-C | Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture. |
| NIS-Elements | Nikon | Single-molecule imaging: Microscope acquisition software | |
| nucleus and cluster mask_v2.txt | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15-140-122 | Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Labeling of proteins in cells |
| Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646) | Janelia Research Campus | Preparation of cells for microscopy | |
| PLOT_ResidenceHist_css.m | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
| Potassium Hydroxide | Mallinckrodt Chemicals | 6984-06 | Preparation of coverslips |
| pretracking_comb.txt | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
| SLIMfast | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016 | ||
| Stage-top incubation system | Tokai Hit | Single-molecule imaging: For live-cell imaging | |
| TwinCam dual emission image splitter | Cairn Research | Single-molecule imaging | |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 5800 | Preparation of coverslips |
Referenties
- Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
- Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
