Aplysia californica neuronen ontwikkelen van grote groei van kegels in de cultuur die zijn uitstekend geschikt voor hoge-resolutie beeldvorming van groeikegel motiliteit en begeleiding. Hier presenteren we een protocol voor dissectie en plating van Aplysia zak cel neuronen, alsook voor het opzetten van een kamer voor live cell imaging.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Neuronale celkweken van Aplysia voor High-Resolution Imaging van Groei Cones
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neuronale groei kegels zijn de zeer beweeglijke structuren op het puntje van axonen die leiding signalen kan detecteren in de omgeving en transduceren deze informatie in directionele beweging in de richting van de juiste doelcel. Om volledig te begrijpen hoe begeleiding informatie wordt doorgestuurd vanaf de cel oppervlak naar de onderliggende dynamische cytoskelet-netwerken, moet men een model dat geschikt is voor live-cell imaging van eiwitten dynamiek bij hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Typische gewervelde groei kegels zijn te klein om kwantitatief te analyseren F-actine en microtubuli dynamiek. Neuronen van de zee haas Aplysia californica zijn 5-10 keer groter dan gewervelde neuronen, kan gemakkelijk worden bewaard bij kamertemperatuur en zijn zeer robuust cellen voor micromanipulatie en biofysische metingen. Hun groei kegels zijn zeer gedefinieerd cytoplasmatische regio's en een goed beschreven cytoskelet systeem. De neuronale cellichamen kan worden gemicroinjecteerd met een verscheidenheid van sondes voor het bestuderen van de groei kegel beweeglijkheid en begeleiding. In het huidige protocol waarin we aantonen dat er een procedure voor dissectie van de abdominale ganglion, de cultuur van de tas cel neuronen en het opzetten van een imaging kamer voor live-cell imaging van de groei kegels.
Protocol
Oplossingen
- L15-ASW celcultuurmedium (1l)
- 1 zakje poeder L15
- Voeg 800 ml H 2 O ultrapuur
- NaCl 400 mM
- MgSO 4 27 mM
- MgCl 2 28 mM
- L-Glutamine 4 mM
- Gentamicine 50 ug / ml
- HEPES 5 mM
- Aan te passen aan de pH 7,9
- Voeg druppelsgewijs CaCl2 9,3 mM (stoppen als precipitaten)
- Voeg H 2 O ultrapuur tot 1 l
- Controleer osmolariteit (950-1000 mmol / kg) met osmometer (dampspanning, Wescor # 5520)
- Filter 0,22 urn met behulp van een positieve druk filtratie-eenheid (Filters: Millipore SVGV010R....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Aplysia zak cel neuronen zorgen voor een serumvrij neuronale celkweek systeem met zeer weinig niet-neuronale cellen. Deze neuronen vormen zeer grote toename kegels geschikt is om een aantal belangrijke celbiologische vragen te beantwoorden. Tas cel neuronen kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd en afgebeeld op kamertemperatuur gedurende enkele uren. Het gebruik van TL-Speckle Microscopy (FSM) kan men kwantitatief de verschillende parameters van F-actine en microtubuli polymerisatie en translocatie dynamiek te analyseren. Deze imaging-to.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
We willen graag Ryan Maneri (Scholekster Productions, LLC) bedanken voor het filmen onze procedure en Rodney McPhail (Department of Biological Sciences, Purdue University) voor hulp bij het bewerken van de dissectie video. Onderzoek in het lab Suter wordt ondersteund door subsidies van de NIH (R01 NS049233) en de Bindley bio-Center aan de Purdue University naar DMS
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| #1 glazen dekglasjes 22x22 mm | Instrument | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glazen dekglasjes 22x22 mm | Instrument | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petrischalen | Instrument | Falcon BD | 353001 | |
| Filters voor mediumfiltratie | Instrument | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| Hoogvacuümvet | Instrument | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Instrument | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Instrument | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calciumchloride | Reagens | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicine | Reagens | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagens | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagens | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagens | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesiumchloride | Reagens | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesiumsulfaat | Reagens | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagens | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Natriumchloride | Reagens | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutrale protease (Dispase) | Reagens | Worthington Biochemical | LS02111 |
Referenties
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
