Het artikel presenteert methoden voor larvale cultuur van de gastropode Crepidula fornicata in een klein-volume laboratoriumschaal systeem en in een ambient-zeewater mesokosmos systeem dat in het veld kan worden ingezet.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Laboratorium- en veldcultuur van larven van de pantoffellimpet, Crepidula fornicata
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het calyptraeïde buikpotige weekdier, Crepidula fornicata, is veel gebruikt voor studies van de ontwikkelingsbiologie, fysiologie en ecologie van larven. Gebroede veligerlarven van deze soort werden verzameld door ze over te hevelen op een zeef na natuurlijke vrijlating door volwassenen, verdeeld in de cultuur met een dichtheid van 200/L en gevoed met Isochrysis galbana (stam T-ISO) in 1 x 105 cellen/ml. De groei van de schelp en het verwerven van competentie voor metamorfose werden gedocumenteerd voor larven van broers en zussen die werden gekweekt in geventileerde culturen van 800 ml die waren ontworpen voor evenwicht met de omgevingslucht of met gedefinieerde atmosferische gasmengsels. In tegenstelling tot deze laboratoriumcultuuromstandigheden; groei- en competentiegegevens werden ook verzameld voor larven die werden gekweekt in een 15 L flow-through ambient zeewatermesokosme in een veldpopulatie van reproductieve volwassenen. De groeisnelheden en timing van metamorfe competentie in de laboratoriumculturen waren vergelijkbaar met die gerapporteerd in eerder gepubliceerde studies. Larven die in het veld werden gekweekt, mesokosmos groeiden veel sneller en metamorfoseerden eerder dan gerapporteerd voor laboratoriumstudies. Samen zijn deze methoden geschikt voor het onderzoeken van de ontwikkeling van larven onder vooraf bepaalde gecontroleerde omstandigheden in het laboratorium en onder natuurlijk voorkomende omstandigheden in het veld.
Inleiding
De pantoffelmuis, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), is goed vertegenwoordigd in de huidige en historische onderzoeksliteratuur vanwege zijn bruikbaarheid als ontwikkelingsmodel en vanwege zijn wijdverbreide impact als invasieve soort. Het diende als een fundamenteel voorbeeld van spiraalvormige ontwikkeling in het klassieke tijdperk van experimentele embryologie1 en heeft een wedergeboorte van interesse ervaren met de toepassing van moderne beeldvormings- en genomische hulpmiddelen om mechanismen van de vroege ontwikkeling van lophotrochozoa te ontleden 2,3. Aan het andere einde van zijn levensgeschiedenis hebben andere onderzoeken zich gericht op de effecten van volwassen populaties van deze ecosysteemingenieur in gematigde mariene kustomgevingen die ver verwijderd zijn van zijn oorspronkelijke verspreiding in het oosten van Noord-Amerika 4,5. In de periode tussen embryo en volwassenheid zijn de veligerlarven van deze soort onderwerp geweest van talrijke studies naar de ontwikkeling en ecologie van larven, met name naar factoren die van invloed zijn op de groei en het verwerven van competentie voor metamorfose, de interne en externe signalen die de vestiging van larven bemiddelen, en de effecten van larvale ervaring opde prestaties van juveniele 6,7,8,9,10,11 . Recente studies hebben de veerkracht van larven en juvenielen van C. fornicata tegen verzuring van de oceaan aangetoond, nog een andere weg voor productief onderzoeksgebruik van dit dier 12,13,14,15,16.
Een voordeel van C. fornicata voor studies van de biologie van mariene larven is dat het relatief eenvoudig is om in het laboratorium in natuurlijk of kunstmatig zeewater te kweken op een uniek dieet van de flagellaat Isochrysis galbana. Cultuurmethoden zijn door de auteur gedetailleerd beschreven in een eerdere methodegerichte gedrukte publicatie17. De redenen voor deze bijdrage zijn tweeledig. Ten eerste zijn de routinematige fysieke manoeuvres die betrokken zijn bij het vestigen en verzorgen van culturen conceptueel heel eenvoudig, maar moeilijk correct uit te voeren zonder hands-on of videodemonstratie. Ten tweede worden twee variaties op eerder beschreven kweekmethoden beschreven die vooral geschikt zijn voor laboratorium- en veldstudies van reacties op milieustressoren zoals oceaanverzuring, eutrofiëring en zuurstofuitputting. De eerste hiervan is een kweeksysteem met een laag volume (800 ml) dat geschikt is voor manipulatie van pH en opgeloste zuurstof in zeewater via kleine hoeveelheden geborrelde gassen, en de tweede is een mesokosmossysteem met een groter volume (15 l) dat in het veld kan worden geplaatst en dat vrije uitwisseling van omringend zeewater mogelijk maakt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Routinematige manoeuvres voor het vestigen en onderhouden van larvale culturen van C. fornicata
OPMERKING: Deze methode begint met een pot van gallon (3,8 l) zeewater met volwassen C. fornicata die net uitgebroede veligerlarven hebben vrijgelaten. Volwassenen kunnen in het veld worden verzameld of worden verkregen bij een leverancier die in de Materiaaltabel wordt vermeld. De volwassenen zijn protandrous hermafrodieten die leven in paringsstapels met sessiele broedende vrouwtjes aan de onderkant van de stapel. Breek stapels voor volwassenen niet op. Seizoensgebondenheid van de voortplanting en methoden voor het conditioneren van volwassen dieren voor het paaien buiten het seizoen zijn eerder beschreven17. Larven kunnen het beste binnen 2-3 uur na vrijlating worden verzameld, wanneer ze sterk geonegatief zijn en zich in de buurt van het oppervlak van de pot zullen concentreren.
- Maak een zeef door de onderkant van een driehoekig plastic wegwerpbekerglas van 400 ml af te snijden en op een paneel van 236 μm nylon gaas te lijmen. Gebruik voor dit doel en vooral voor mesokosmosconstructie (hieronder) een smeltlijm die is geformuleerd voor een goede hechting aan polyethyleen.
- Verwijder de beluchting uit de pot voor volwassenen en laat deze 15-20 minuten staan, zodat vuil zich nestelt en larven gemakkelijk naar de oppervlakte kunnen zwemmen.
- Hevel de larven door een korte (15-20 cm) glazen buis van 5 mm die aan het uiteinde van een 60-80 cm lange zachte plastic aquariumslang is bevestigd in de zeef die hierboven is voorbereid, opgehangen in een glazen beker van 600 ml, zodat overtollig zeewater over het glazen bekerglas stroomt terwijl de larven op de zeef worden achtergehouden. Houd de bodem van de zeef onder water en voorkom dat larven stranden.
- Til de zeef kort uit het bekerglas en gebruik een spuitfles gefilterd zeewater (FSW) om de larven af te spoelen in een glazen kom met FSW die een handig formaat heeft om te manipuleren onder een ontleedmicroscoop met laag vermogen.
OPMERKING: Larven van C. fornicata gedijen goed in gefilterd natuurlijk zeewater met een zoutgehalte van 30 ppt of Instant Ocean kunstmatig zeewater met een zoutgehalte van 32 ppt. bij 20-25 °C17,18. Filtratie bij < 1 μm is voldoende om aangroei van epizoötische protisten te elimineren die problemen kunnen veroorzaken in laboratoriumculturen. - Breng handmatig het gewenste aantal larven over en tel ze in een kweekpot met behulp van een Pasteur-pipet. Gebruik voor het beste resultaat 1 larve/5 ml kweekvolume voor C. fornicata. Tel de larven en weersta de verleiding om aantallen te schatten.
- Voer de larven met het gewenste rantsoen microalgen wanneer de kweek wordt gestart en vervang de microalgen om de dag wanneer het kweekwater wordt vervangen.
OPMERKING: Een dieet van 1 x 105 cellen/ml Isochrysis galbana (stam T-ISO) is een goed standaarddieet dat bijna maximale laboratoriumgroeisnelheden oplevert. Voedselrantsoen en methoden voor de teelt van T-ISO zijn opgenomen in een eerdere publicatie17. - Ververs het kweekwater om de dag door de inhoud van de cultuur in een zeef in een bekerglas te gieten, zoals in stap 1.3 hierboven. Til de zeef eruit en gebruik een spuitfles FSW om larven in een kweekpot met verse FSW met nieuw voer te spoelen.
OPMERKING: Het beste is om al het glaswerk dat wordt gebruikt voor het kweken van larven te scheiden en om elk contact van dat glaswerk met fixeermiddelen, oplosbare zouten van zware metalen of reinigingsmiddelen te vermijden. Routinematige reiniging kan het beste worden gedaan met een pasta van zuiveringszout (NaHCO3) en een nylon schrobpad, terwijl minerale afzettingen kunnen worden verwijderd met een milde zure wasbeurt in witte azijn of verdund HCl.
2. Bouw van geventileerde culturen voor larven van C. fornicata
NOTITIE: De aanbevolen glazen pot (Tabel met materialen) heeft een deksel van polypropyleen, dat inert is voor zeewater en de juiste dikte heeft voor het bevestigen van slang, weerhaakinlaten voor een ventilerende gasstroom.
- Boor twee gaten van 5 mm in het deksel van elke kweekpot (inclusief de binnenvoering van het deksel), elk ongeveer 1,5 cm van de rand en tegenover elkaar. (Een 13/64 inch imperial of #7 ASME standaard machinistboor zal ook een geschikt vrijgavegat maken).
- Installeer een 1/8 inch x 10-32 schroefdraad nylon slangadapter in elk gat, met behulp van een 10-32 nylon moer, met de slangweerhaak op het buitenoppervlak van het deksel.
- Breng een beetje siliconenrubberen aquariumkit aan op de opening van het binnenste deel met schroefdraad van een van de slangadapters en duw een polyethyleen slang van 20 cm met een lengte van 2 mm (buitendiameter) van binnenuit door de opening zodat deze een paar mm buiten de buitenste opening van de slangpilaar uitsteekt.
- De slang heeft nu een kleine prop aquariumkit aan het uiteinde die door de weerhaak van de slang steekt, maar doorzichtige slangen zijn net voorbij het uiteinde van de weerhaak zichtbaar. Laat de kit uitharden en snijd vervolgens het uitstekende uiteinde van de polyethyleenslang af zodat het gelijk ligt met het uiteinde van de slangweerhaak.
- Vul de kweekpot met FSW tot op 1 cm van de schouder aan de bovenkant van de pot, schroef het deksel vast en bevestig de toevoer voor ventilerende lucht of experimenteel gasmengsel aan de slangpilaar die de polyethyleen ventilatieslang vasthoudt. Knip de lengte van de ventilatieslang af zodat het uiteinde netjes op de bodem van de pot ligt.
- Pas de stroom van het ventilatielucht- of gasmengsel aan om een langzame stroom bellen te verkrijgen (Figuur 1). Gebruik een aquariumluchtpomp met gewone aquariumgangventielen om de ventilatie van omgevingslucht te voorzien of gebruik massastroomregelaars voor andere experimentele atmosferische gasmengsels14.
3. Opbouw van een in het veld inzetbare mesokosmoscultuur voor larven van C. fornicata
- Snijd 4 gelijkmatig verdeelde rechthoekige openingen, elk 25 cm x 14,5 cm, in de zijkanten van een standaard polyethyleenemmer van 7 gallon. Plaats de bodem van elke opening ongeveer 3.5 cm van de binnenkant van de bodem van de emmer (Figuur 2A). Een elektrische handzaag met een fijnvertanding is hiervoor ideaal. Bewaar de uitgeknipte afvalstukken en snijd ze met een tafelzaag in de lengte in reepjes van 2 cm breed.
- Snijd 4 panelen van 236 μm nylon gaas uit, elk minimaal 30 cm x 20 cm, zodat ze de uitgesneden openingen in de emmer comfortabel (met minimaal 2 cm) overlappen. Zet tijdelijk een rand van een gaaspaneel vast over een lange rand van de uitsparing met behulp van kleine veerklemmen of wasknijpers.
- Lijm de rand van het gaaspaneel op de emmeropening met smeltlijm die is samengesteld voor polyethyleen. Zodra de eerste rand is bevestigd, lijmt u de andere randen vast terwijl u de spanning behoudt om een strak oppervlak op het gaaspaneel te krijgen.
- Knip de lengtes van de stroken met emmerafvalstukken uit stap 3.1 af om wapeningsstroken te maken om het gelijmde gebied waar de gaaspanelen de bakopeningen overlappen netjes te bedekken. Druk elke afdekstrip op zijn plaats met een ruime hoeveelheid smeltlijm en werk snel om elke strook op zijn plaats te krijgen voordat de lijm uithardt.
- Zet het uiteinde van elke strip vast met een nylon blindklinknagel die vanaf de buitenkant van de emmer is geïnstalleerd. Snijd overtollige lijm en gaas van de buitenranden van de verstevigingsstrips af met een scheermes.
NOTITIE: Elke klinknagel vereist een geleidegat van 15/64 inch. De inwendige (blinde) delen van de klinknagels zijn zichtbaar aan de binnenkant van het afgewerkte mesokosmos in figuur 2B. - Zet het mesokosmos in een drijvend rek dat de bovenkant van de emmer ruim boven water houdt (Figuur 2C). Het zwevende rek dat wordt getoond, is gemaakt van segmenten van 30 cm van 2 inch Schedule 40 PVC-buis, aan elkaar gecementeerd met elleboog- en T-verbindingen om een luchtdichte structuur te maken die een rij van 4 replicate mesokosmossen kan bevatten.
- Afhankelijk van de lokale omstandigheden kunnen de gaaspanelen binnen 1-2 dagen vervuild raken, op een manier die de uitwisseling van zeewater door de mesokosmos belemmert. Voor zover dit gebeurt, breng de larven over naar een frisse, schone mesokosmos door de vervuilde mesoosma 2/3e uit het water te trekken en herhaaldelijk van zijn bodem in het verse mesokosmos te springen met een kruik van 2 L.
- Voer 20-25 iteraties uit om de meeste larven over te brengen, of totdat larven niet langer worden waargenomen in de vervuilde mesokosmos. Reinig het vervuilde mesokosmos door de gaaspanelen voorzichtig te schrobben met een zachte spons geladen met een pasta van zuiveringszout (NaHCO3) en af te spoelen met kraanwater.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De groei van de larven en het verwerven van bekwaamheid voor metamorfose werden gemeten in 4 gelijktijdige replicaten van de 800 ml geventileerde culturen, elk met 160 larven, afkomstig van een groep larven die uit een enkele eimassa kwamen en die werden gevoed met Isochrysis galbana met een dichtheid van 1 x 105 cellen/ml. De pH was 7,9-8,0, de temperatuur was 20-21 °C en het zoutgehalte was 30-31 ppt. Groei en metamorfose werden ook bepaald met een andere groep larven in een enkele proef met het 15 ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel larven van C. fornicata relatief gemakkelijk te kweken zijn in vergelijking met andere planktotrofe mariene larven, is aandacht voor de basisprincipes van goede kweekpraktijken nog steeds essentieel17,19. Gezonde larven moeten zich onmiddellijk na het uitkomen beginnen te voeden. Dit kan de dag na het uitkomen gemakkelijk worden geverifieerd door hun volledige ingewanden, vol met algencellen, te observeren met behulp van een ontleedmicroscoop met ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
De eerste ontwikkeling van het geventileerde kweeksysteem met een laag volume werd gedeeltelijk ondersteund door de National Science Foundation (CRI-OA-1416690 aan Dickinson College). Dr. Lauren Mullineaux was zo vriendelijk om laboratoriumfaciliteiten ter beschikking te stellen in het Woods Hole Oceanographic Institution, waar de gegevens die voor dit systeem werden gepresenteerd (Figuur 4) werden verzameld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bucket, Polyethylene, 7 gallon | US Plastic | 16916 | voor mesocosm |
| Crepidula fornicata | Marine Biological Laboratory, Marine Resources Center | 760 | volwassen kweekdieren |
| Hotmelt glue, Infinity Supertac 500 | Hotmelt.com | INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB | goed voor het verbinden van polyethyleen |
| Pot, glas, 32 oz, met polypropyleen deksel | Uline | S-19316P-W | voor geventileerde culturen van 800 mL |
| Nitex mesh, 236 µm | Dynamic Aqua Supply Ltd. | NTX236-136 | voor mesocosm |
| Moer, zeskant, nylon, 10-32 draad | Home Depot | 1004554441 | voor het bevestigen van slangenaanzetstukken |
| Blinde klinknagels, nylon, 15/64" diameter, 5/32"-5/16" greepbereik, pak van 8 | NAPA auto-onderdelen | BK 6652844 | 4 pakketten nodig per mesocosm |
| Slangenaanzetstuk 1/8" x 10-32 draad | US Plastic | 65593 | 2 nodig per kweekpot |
| Slang, polyethyleen, 2,08 mm OD | Fisher Scientific | 14-170-11G | voor het ventileren van gasstroom binnen kweekpot |
| Slang, Tygon, 1/8"x3/16"x1/32" | US Plastic | 57810 | past op aanzetstukken voor het ventileren van culturen |
Referenties
- Conklin, E. G. The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods. Gasteropods. , (1897).
- Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan model system. Biol Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
- Lyons, D. C., Henry, J. Q. Slipper snail tales: how Crepidula fornicata and Crepidula atrasolea became model molluscs. Curr Top Dev Biol. 147, 375-399 (2022).
- Blanchard, M. Spread of the slipper limpet Crepidula fornicata (L. 1758) in Europe. Current state and consequences. ScientiaMarina. 61 (Suppl 2), 109-118 (1997).
- Beninger, P., Valdizan, A., Decottigies, P., Cognie, B. Field reproductive dynamics of the invasive slipper limpet, Crepidula fornicata. J Exp Mar Biol Ecol. 390 (2), 179-187 (2010).
- Pechenik, J. A. The relationship between temperature, growth rate, and duration of planktonic life for larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.). J Exp Mar Biol Ecol. 74 (3), 241-257 (1984).
- Pechenik, J. A. Latent effects: surprising consequences of embryonic and larval experience on life after metamorphosis. Evol Ecol Marine Invertebrate Larvae. , 208-225 (2018).
- Pechenik, J. A., Gee, C. C. Onset of metamorphic competence in larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.), judged by a natural and an artificial cue. J Exp Mar Biol Ecol. 167 (1), 59-72 (1993).
- Taris, M., Comtet, T., Viard, F. Inhibitory function of nitric oxide on the onset of metamorphosis in competent larvae of Crepidula fornicata: A transcriptional perspective. Mar Genomics. 2 (3-4), 161-167 (2009).
- Penniman, J. R., Doll, M. K., Pires, A. Neural correlates of settlement in veliger larvae of the gastropod, Crepidula fornicata. Invertebrate Biol. 132 (1), 14-26 (2013).
- Meyer-Kaiser, K. S. Carryover effects of brooding conditions on larvae in the slipper limpet Crepidula fornicata. Mar Ecol Prog Ser. 643, 87-97 (2020).
- Noisette, F., et al. Does encapsulation protect embryos from the effects of ocean acidification? The example of Crepidula fornicata. PLoS One. 9 (3), e93021(2014).
- Kriefall, N. G., Pechenik, J. A., Pires, A., Davies, S. W. Resilience of Atlantic slippersnail Crepidula fornicata larvae in the face of severe coastal acidification. Front in Mar Sci. 5, 312(2018).
- Bogan, S. N., McMahon, J. B., Pechenik, J. A., Pires, A. Legacy of multiple stressors: Responses of gastropod larvae and juveniles to ocean acidification and nutrition. Biol Bull. 236 (3), 159-173 (2019).
- Pechenik, J. A., et al. Impact of ocean acidification on growth, onset of competence, and perception of cues for metamorphosis in larvae of the slippershell snail, Crepidula fornicata. Mar Biol. 166, 128(2019).
- Reyes, C. L., et al. The marine gastropod Crepidula fornicata remains resilient to ocean acidification across two life history stages. Front Physiol. 12, 702864(2021).
- Pires, A. Artificial seawater culture of the gastropod Crepidula fornicata for studies of larval settlement and metamorphosis. In: Carroll, D., Stricker, S. (eds) Developmental biology of the sea urchin and other marine invertebrates. Methods Mol Biol. 1128, 35-44 (2014).
- Bashevkin, S. M., Pechenik, J. A. The interactive influence of temperature and salinity on larval and juvenile growth in the gastropod Crepidula fornicata (L.). J Exp Mar Biol Ecol. 470, 78-91 (2015).
- Strathmann, M. F. Reproduction and Development of Marine Invertebrates of the Northern Pacific Coast: Data and Methods for the Study of Eggs, Embryos, and Larvae. , University of Washington Press. (1987).
- Clark, H. R., Gobler, C. J. Diurnal fluctuations in CO2 and dissolved oxygen concentrations do not provide a refuge from hypoxia and acidification for early-life-stage bivalves. Mar Ecol Prog Ser. 558, 43114(2016).
- Gobler, C. J., Baumann, H. Hypoxia and acidification in ocean ecosystems: coupled dynamics and effects on marine life. Biol Lett. 12 (5), 20150976(2016).
- Pechenik, J. A., Hilbish, T. J., Eyster, L. S., Marshall, D. Relationship between larval and juvenile growth rates in two marine gastropods, Crepidula plana and C. fornicata. Mar Biol. 125, 119-127 (1996).
- Padilla, D. K., McCann, M. J., McCarty Glenn, M., Hooks, A. P., Shumway, S. E. Effect of food on metamorphic competence in the model system Crepidula fornicata. Biol Bull. 227 (3), 242-251 (2014).
- Wallace, R. B., Baumann, H., Grear, J. S., Aller, R. C., Gobler, C. J. Coastal ocean acidification: the other eutrophication problem. Estuarine, Coast Shelf Sci. 148, 1-13 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
