Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Controle van de bloedglucose bij nakomelingen van muizen na intracytoplasmatische sperma-injectie

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66212

⸱

17 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om een intracytoplasmatisch sperma-injectie (ICSI)-embryotransfer (ET) muismodel op te zetten, waardoor we leeftijdsgerelateerde veranderingen in het glucosemetabolisme kunnen observeren die kunnen worden toegeschreven aan ICSI, waardoor we inzicht krijgen in de mogelijke langetermijneffecten op de menselijke ontwikkeling.

Samenvatting

De menselijke levensduur is aanzienlijk lang, terwijl muismodellen de gehele menselijke levensduur in een relatief korte periode kunnen simuleren, waarbij een jaar muisleven ongeveer gelijk is aan 40 mensenjaren. Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) is een veelgebruikte geassisteerde voortplantingstechnologie in de klinische praktijk. Gezien de relatief recente opkomst ongeveer 30 jaar geleden, blijven de langetermijneffecten van deze techniek op de menselijke ontwikkeling echter onduidelijk. In deze studie hebben we de ICSI-methode in combinatie met embryotransfer (ET) vastgesteld met behulp van een muismodel. De resultaten toonden aan dat normaal muizensperma, na het ondergaan van een in-vitrocultuur en daaropvolgende ICSI, een bevruchtingspercentage van 89,57% en een tweecellig percentage van 87,38% vertoonde. Na ET was het geboortecijfer van de nakomelingen ongeveer 42,50%. Bovendien werden, naarmate de muizen ouder werden, fluctuaties in het glucosemetabolisme waargenomen, die in verband kunnen worden gebracht met de toepassing van de ICSI-techniek. Deze bevindingen betekenen dat de ICSI-ET-techniek van muizen een waardevol platform biedt voor het evalueren van de impact van spermaafwijkingen op de ontwikkeling van het embryo en hun langetermijneffecten op de gezondheid van het nageslacht, met name met betrekking tot het glucosemetabolisme. Deze studie biedt belangrijke inzichten voor verder onderzoek naar de mogelijke effecten van de ICSI-techniek op de menselijke ontwikkeling, en benadrukt de noodzaak van diepgaand onderzoek naar de langetermijnimplicaties van deze technologie.

Inleiding

Vruchtbaarheidsproblemen zijn naar voren gekomen als een belangrijk aandachtspunt van medische en sociologische zorg, vooral in de moderne samenleving waar dalende vruchtbaarheidscijfers en de toenemende ernst van de prevalentie en ernst van onvruchtbaarheid op de voorgrond zijn getreden. Geassisteerde voortplantingstechnologie (ART) biedt een breed scala aan mogelijkheden om deze uitdagingen aan te pakken, waarbij intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) vaak wordt gebruikt als therapeutische interventie.

Sinds Palermo in 1992 de eerste succesvolle zwangerschap meldde die werd bereikt door middel van intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI), is ICSI een cruciale techniek geworden in geassisteerde voortplantingstechnologieën (ART)1. Gezien het feit dat ICSI slechts 30 jaar in klinische omgevingen wordt gebruikt, een relatief korte periode in vergelijking met de menselijke levensduur, zijn de langetermijneffecten van ICSI, met name op de ontwikkeling van nakomelingen, echter niet uitgebreid onderzocht en opgehelderd. Op dit moment zijn muizen, gekenmerkt door hun uniforme genetische achtergrond en kortere levensduur, naar voren gekomen als een veelgebruikt alternatief model in medisch onderzoek. Bovendien kan het muismodel de gehele menselijke levensduur samenvatten binnen een gecomprimeerd tijdsbestek, waarbij één jaar bij muizen ongeveer overeenkomt met 40 jaar bij mensen2.

In het afgelopen decennium hebben verschillende kleinschalige onderzoeken gemeld dat personen die via ICSI zijn verwekt, een verhoogd risico lopen op het ontwikkelen van metabole syndromen, zoals abnormale bloedsuikerspiegels, later inhet leven3,4. Hoewel het bewijs niet definitief is, heeft deze bevinding niettemin geleid tot ernstige bezorgdheid binnen de wetenschappelijke gemeenschap over de gezondheidsimplicaties van ICSI op de lange termijn. Deze situatie onderstreept de dringende behoefte aan strengere beoordelingen van ART en de gevolgen voor de gezondheid op de lange termijn. Vooral in het licht van de beperkingen en ethische overwegingen van studies bij mensen is het steeds belangrijker geworden om diermodellen te ontwikkelen die de ontwikkeling van menselijke nakomelingen na ICSI nauwkeurig kunnen samenvatten. In deze context is het ICSI-ET-model (Intracytoplasmatische Sperma-injectie-Embryotransfer) van muizen, vanwege zijn vermogen om de menselijke ICSI na te bootsen en langetermijnmonitoring van de gezondheidsresultaten van nakomelingen te vergemakkelijken, een effectief hulpmiddel geworden voor het beoordelen van de potentiële gezondheidsrisico's van ICSI-technologie voor nakomelingen5.

Deze studie heeft tot doel de impact van ICSI-ET-technologie op een gangbaar metabool fenotype, namelijk de metabole gezondheid van glucose bij het nageslacht, te onderzoeken door gebruik te maken van willekeurige bloedglucosemonitoring, nuchtere bloedglucosetesten en glucosetolerantietests om de glucosemetabolische toestand van muizen te beoordelen. Willekeurige bloedglucosemonitoring wordt gebruikt om de natuurlijke fluctuaties in het glucosemetabolisme tijdens normale fysiologische activiteiten vast te leggen, terwijl nuchtere bloedglucose- en glucosetolerantietests worden gebruikt om mogelijke prediabetische toestanden te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het hieronder beschreven protocol van ICSI-ET volgt de richtlijnen en is goedgekeurd door de Animal Ethical Review van het Shanghai Institute of Planned Parenthood onderzoek. Veiligheidsprocedures: Draag altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij het hanteren van chemicaliën of biologische materialen. Gebruik van afzuigkappen: Voer alle procedures uit met betrekking tot vluchtige chemicaliën of het genereren van aërosolen binnen een gecertificeerde zuurkast of bioveiligheidskast. Gebruik vrouwelijke muizen (6-8 weken oude B6D2F1-stam) voor de superovulatieprocedure.

1. ICSI bij muizen

  1. Superovulatie van muizen
    1. Dien op de eerste dag rond 20.00 uur een intraperitoneale injectie toe met drachtige merrieserum gonadotrofine (PMSG) in een dosis van 7,5 IE per muis.
    2. Dien op de derde dag rond 20:00 uur (48 uur na PMSG-injectie) een intraperitoneale injectie van humaan choriongonadotrofine (HCG) toe in een dosis van 7,5 IE per muis.
  2. Bereid HTF-medium voor in aliquots van 1 ml en laat ze onbedekt voor een nachtelijke equilibratie bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator op dezelfde dag van HCG-injectie bij vrouwelijke muizen.
  3. Bereiding van ICSI-bemestingsdruppels
    1. Verdeel op dezelfde dag van HCG-injectie bij vrouwelijke muizen het deksel van een celkweekschaal van 50 x 9 mm in de bovenste en onderste helften. Gebruik de bovenste helft om 4-6 druppeltjes van elk 5 μl te maken, gebruik 10% polyvinylpyrrolidon (PVP) voor het plaatsen van sperma. Gebruik de onderste helft om 8-10 druppels van elk 5 μl te maken, gebruik M2-medium voor de ICSI-procedure.
    2. Bedek de middelgrote PVP- en M2-druppels met ongeveer 3 ml minerale olie (Figuur 1).
  4. Bereiding van cultuurgerechten
    1. Doseer op dezelfde dag van HCG-injectie bij vrouwelijke muizen 12 druppels KSOM medium (MR-020P-D) van 20 μL gelijkmatig in een celkweekschaaltje van 35 x 10 mm. Bedek de druppels met ongeveer 3 ml minerale olie.
  5. Sperma oogsten:
    1. Euthanaseer mannelijke muizen door cervicale dislocatie om ongeveer 9.00 uur op de vierde dag (13 uur na HCG-injectie).
    2. Isoleer de epididymale cauda en reinig deze grondig om eventuele vetweefsel- en bloedresten te verwijderen door voorzichtig te deppen met steriel gaasje en af te spoelen in voorverwarmd HTF-medium.
    3. Snijd de cauda epididymis open zodat het sperma vrij in het HTF-medium kan zwemmen. Knijp voorzichtig in de cauda met een tang om het sperma los te laten, verzamel ze in vooraf gebalanceerde HTF-buisjes en bewaar ze onbedekt in een incubator van 37 °C, 5% CO2 voor spermacapaciteit voor verder gebruik.
  6. Ophalen van eicellen
    1. Euthanaseer vrouwelijke muizen die zijn gestimuleerd voor het ophalen van eicellen door cervicale dislocatie rond 9.30 uur op de vierde dag. Maak voorzichtig een incisie langs de middellijn van de buikhuid en spierlaag om de buikholte bloot te leggen.
    2. Gebruik een fijne pincet om het weefsel aan beide zijden van de eileiders, vooral de gezwollen ampulla-gebieden, voorzichtig te isoleren en over te brengen in M2-medium in een gesteriliseerde kweekschaal. Herhaal deze procedure totdat de eileiders van alle aangewezen muizen zijn verzameld.
    3. Gebruik onder een ontleedmicroscoop een injectienaald van 1 ml om het transparante gedeelte van de gezwollen ampulla van de eileider voorzichtig te doorboren, waardoor de afgifte van cumulus-eicelcomplexen (COC's) in het medium wordt vergemakkelijkt.
    4. Pluk de COC's met dezelfde spuit voorzichtig en doe ze in een nieuw schaaltje met 100 μL vers M2-medium. Herhaal deze stap totdat alle COC's met succes zijn overgebracht van de oorspronkelijke eileidersegmenten.
    5. Veeg bloed en weefselvloeistoffen weg en scheur onder een ontleedmicroscoop de ampulla van de eileider open met een naald van 25 G, wat resulteert in het vrijkomen van talrijke COC's.
    6. Verwijder de eileider en weefselfragmenten, breng de COC's over in druppeltjes M2-medium dat hyaluronidase (HY) bevat en verwarm ze voor tot 37 °C.
    7. Voer na een incubatietijd van ongeveer 5 minuten voorzichtig pipetteren uit om de scheiding van cumuluscellen en eicellen te vergemakkelijken. Breng de metafase II (MII) eicellen over van de HY-bevattende oplossing naar vers M2-medium; voer vervolgens de sequentiële overdracht uit in meerdere druppels M2-medium.
    8. Breng de eicellen na 2-3 wasbeurten over in druppeltjes KSOM-kweekmedium en bewaar ze in een incubator van 37 °C, 5% CO2 voor verder gebruik.
  7. Rond 10.00 uur op de vierde dag sonificeert u 100 μL van het gecapaciteerde sperma (zie stap 1.5.2.) gedurende 5 s om de koppen van de staarten te scheiden met een frequentie van 46 kHz, met een vermogensinstelling van 50 watt.
    OPMERKING: Wees voorzichtig bij het soniceren van sperma om de staart af te kappen om de tijd te beheersen, die niet langer mag zijn dan 5 s. Een paar seconden na sonicatie kan sperma worden waargenomen onder een omgekeerde microscoop; Stop met soniceren wanneer ongeveer de helft van het sperma afgeknotte staarten vertoont.
  8. ICSI-procedure
    1. Gebruik voor de injectie een in de handel verkrijgbare micromanipulatienaald met een platte punt en een binnendiameter van 6 μm, ingesteld in een hoek van 25°. Vul de naald met de operatievloeistof met het gevulde gedeelte met een lengte van 0,5 cm in de naald. Zorg ervoor dat het niveau van de vloeistof ~0.5 cm bereikt.
      OPMERKING: Houd de kamertemperatuur tijdens de injectie op 19 °C om hoge temperaturen te vermijden die de overlevingskans van bevruchte eicellen kunnen verminderen. De precisie om ervoor te zorgen dat het vloeistofniveau 0,5 cm bereikt, is cruciaal voor het behoud van de integriteit van het injectieproces en het waarborgen van de levensvatbaarheid van de eicellen.
    2. Installeer de injectienaald op de rechterarm van de micromanipulator, stevig bevestigd door de bevestigingsdop vast te draaien. Installeer een in de handel verkrijgbare micromanipulatiepipet met platte punt die is ontworpen voor eicellen van muizen op de linkerarm van de micromanipulator en plaats de injectienaald en de bevestigingspipet in het gezichtsveld van de microscoop.
    3. Voeg met behulp van een pipet 1 μL gesonificeerd sperma toe aan een druppel PVP-oplossing.
    4. Plaats 20 MII-eicellen in een druppel M2-medium.
    5. Gebruik de injectienaald om 10-20 spermakoppen in PVP-oplossing op te zuigen. Beweeg vervolgens de injectienaald in de druppel met de eicellen.
    6. Bepaal direct de positie van de metafasespoel in de eicel onder een polarisatiemicroscoop om er zeker van te zijn dat het spoelapparaat zich niet aan de kant van de injectie bevindt, waarbij het polaire lichaam zich meestal op de 12-uurs of 6-uurspositie bevindt ten opzichte van de oriëntatie van de eicel.
    7. Houd de eicel in contact met de bodem van het kweekschaaltje. Stel het brandvlak zo in dat de zona pellucida van de eicel en de injectienaald zich in hetzelfde vlak bevinden.
    8. Bij contact van de injectienaald met de zona pellucida, oefent u een lichte negatieve druk uit op de injectienaald, waarbij een deel van de zona pellucida wordt aangezogen.
    9. Activeer tegelijkertijd piëzo-pulsen met een intensiteitsinstelling van 5 en een frequentie van 1, waardoor effectief een perforatie in de zona pellucida wordt gecreëerd en de injectienaald wordt doorgelaten.
    10. Schuif de injectienaald in de perivitelline-ruimte en duw de spermakop naar de punt van de naald. Steek de injectienaald in de eicel totdat deze de andere kant van de zona pellucida bereikt.
    11. Gebruik piëzopulsen met een intensiteit van 1 en een frequentie van 1 om een kleine porie in het plasmamembraan te creëren, zodat de spermakop in het oöplasma wordt geïnjecteerd met minimale invoer van PVP en optimaal behoud van de integriteit van de eicel.
    12. Herhaal stap 1.8.11 totdat alle 20 eicellen zijn geïnjecteerd, gevolgd door een incubatie van 15 minuten bij 19 °C.
    13. Breng de overlevende eicellen over in KSOM medium en plaats ze in de couveuse. Observeer de vormingssnelheden van 2-cellen, 4-cellen, morula en blastocysten.
      OPMERKING: De timing voor intracytoplasmatische injectie van enkelvoudig sperma (ICSI) in de eicel moet worden gecontroleerd, met als doel de procedure binnen 14-18 uur na de injectie van HCG te voltooien.

2. Baarmoedertransplantatie van blastocysten van muizen

  1. Bereiding van gesteriliseerde mannelijke muizen
    OPMERKING: Gebruik ICR mannelijke muizen van 6-8 weken oud voor het onderzoek.
    1. Induceren anesthesie door intraperitoneale injectie van 1,25% 2,2,2-tribroomethanol in een dosering van 0,2 ml/10 g lichaamsgewicht. De afwezigheid van een pijnrespons duidt op een succesvolle verdoving.
      OPMERKING: Hoewel het huidige protocol het aanbrengen van dierenartszalf op de ogen van verdoofde dieren niet omvat, wordt het aanbevolen als een beste praktijk om droge ogen te voorkomen en de gezondheid en het comfort van de dieren tijdens procedures te waarborgen. Tijdens het chirurgische en herstelproces werden alle chirurgische instrumenten voor gebruik gesteriliseerd en werd het operatiegebied voorbereid met behulp van antiseptische oplossingen om een schone werkomgeving te garanderen.
    2. Om u te beschermen tegen mogelijke stress of letsel, huisvest u de muizen die een operatie hebben ondergaan afzonderlijk tijdens de eerste herstelfase.
    3. Dien buprenorfine toe in een dosering van 0,05 mg/kg lichaamsgewicht om optimale pijnverlichting te garanderen.
      OPMERKING: Om het welzijn van de muizen te garanderen, moet u de muizen tijdens de herstelperiode nauwlettend in de gaten houden en ze niet onbeheerd achterlaten totdat ze weer voldoende bij bewustzijn zijn om sternale ligging te behouden.
    4. Bereid de operatieplaats voor in de onderbuik, superieur aan de teelballen. Verwijder de vacht en desinfecteer met povidon-jodium. Maak met een steriele schaar een incisie in de lengterichting van 1 cm langs de linea alba. Verwijder voorzichtig al het bloed met steriel, stofvrij papier en ga verder met het botut ontleden van de buikspieren langs de linea alba en ga naar de buikholte.
    5. Gebruik een gebogen pincet om de linker testis en het bijbehorende vetkussentje voorzichtig vast te pakken en bloot te leggen. Identificeer de zaadleider en isoleer deze zorgvuldig met een puntige pincet, zodat een segment van 10 mm ontstaat voor manipulatie.
    6. Steriliseer de gebogen tang door ze enkele seconden in de buitenste vlam van een alcohollamp te houden. Pak de zaadleider voorzichtig vast, waardoor deze door cauterisatie plat en wit wordt. Maak een tweede cauterisatiepunt 3-5 mm distaal van het eerste. Snijd met een steriele chirurgische schaar het segment van de zaadleider tussen de twee cauterisatiepunten weg.
    7. Inspecteer zorgvuldig de dichtgeschroeide uiteinden van de zaadleider en zorg ervoor dat er een kort, afgeplat, wit segment overblijft. Breng met behulp van een gebogen tang de testis en het bijbehorende vetkussentje voorzichtig terug naar de buikholte.
    8. Herhaal de in stap 2.1.6 beschreven procedure aan de contralaterale (rechter) zijde.
    9. Sluit de operatieplaats met hechtingen, waarbij meestal één hechting in de spierlaag en drie hechtingen in de huid worden geplaatst. Zorg voor een goede uitlijning van de chirurgische incisie en desinfecteer met povidonjodium. Breng het dier over naar een verwarmingskussen voor observatie en houd het 10-15 minuten in de gaten totdat het dier weer bij bewustzijn komt. Eenmaal hersteld, brengt u het dier terug naar zijn woonkooi.
      OPMERKING: Na een vasectomie-operatie hebben muizen een herstelperiode van 14 dagen nodig, gevolgd door een proefparingsexperiment van 1 week.
    10. Paren gedurende deze week continu de gesteriliseerde mannetjes met vrouwtjes en observeert de zwangerschapsstatus van alle vrouwtjes die zich presenteren met copulatiepluggen. Succesvolle paring wordt aangegeven door de aanwezigheid van een geelachtig witte, blokkerige vaginale plug bij de vaginale opening van de vrouwelijke muis.
      1. Koppel de muizen op de eerste dag tussen 16:00 en 18:00 uur en controleer de vaginale pluggen tussen 7:00 en 9:00 uur op de tweede dag. Beschouw vrouwen met vaginale pluggen als in een pseudo-zwangere toestand na 0,5 dagen en gebruik ze voor daaropvolgende embryotransferexperimenten. Breng vrouwtjes zonder vaginale pluggen terug naar de ontvangende groep.
        OPMERKING: Deze vrouwtjes zonder vaginale pluggen kunnen nog steeds worden gebruikt voor paring om pseudo-zwangere vrouwtjes voor te bereiden. Zorg ervoor dat alle aangesloten vrouwtjes niet zwanger worden; Alleen dan kunnen de gesteriliseerde mannen worden gebruikt voor formele experimenten.
      2. Hoewel mannetjes met een sterilisatie dagelijks kunnen paren, moet u 1 dag rust nemen tussen de paringssessies.
        OPMERKING: Op basis van onze ervaring kunnen mannen met een gesteriliseerde bloederbreedte meer dan een jaar een hoog percentage copulatieproppen behouden. Gesteriliseerde mannetjes die er niet in slagen om copulatiepluggen te produceren bij parende vrouwtjes gedurende 4-6 opeenvolgende pogingen, moeten echter uit het onderzoek worden verwijderd.
  2. Voorbereiding van pseudo-zwangere vrouwtjes
    1. Genereer pseudozwangere vrouwelijke muizen door ICR-vrouwelijke muizen (7-10 weken oud, met een gewicht van meer dan 25 g) te paren met gesteriliseerde mannelijke muizen (3-6 maanden oud) in een verhouding van 1:1.
      OPMERKING: De gesteriliseerde mannetjes werden gebruikt om de baarmoederhals van de vrouwelijke muizen te stimuleren, wat resulteerde in de activering van de corpora lutea.
  3. Voorbereiding van de pipet voor het overbrengen van blastocysten
    1. Haal de te transplanteren embryo's uit de incubator en breng ze over in een druppel M2-medium bij een temperatuur van 37 °C.
    2. Gebruik een transferpipet om een kleine hoeveelheid vloeistof op te zuigen, een kleine hoeveelheid lucht op te zuigen en 6-10 embryo's op te zuigen. Zuig ten slotte nog een kleine hoeveelheid lucht op om de pipet af te sluiten.
      OPMERKING: De lengte van de vloeistof in de transferpipet mag niet langer zijn dan 0.5 cm.
  4. Baarmoedertransplantatie (blastocysten)
    1. Weeg de pseudozwangere vrouwelijke muizen (2,5 dagen na de paring) en verdoven ze door middel van een intraperitoneale injectie van 1,25% 2,2,2-tribroomethanol in een dosis van 0,2 ml/10 g lichaamsgewicht. Druk voorzichtig met een pincet op het oor.
    2. Na het toedienen van anesthesie aan de muizen en het verzekeren van asepsis door middel van alcoholdesinfectie, maakt u een incisie in de middellijn in de lengterichting op de ventrale buik. Gebruikmakend van het losse onderhuidse weefsel, verschuift u de incisie naar de linker- of rechterkant, zoals nodig voor de transplantatie. Gebruik een kleine schaar om een stompe dissectie van de spierlaag van de buikwand uit te voeren op ~0,5 cm lateraal van de lumbale wervelkolom om toegang te krijgen tot de peritoneale holte.
    3. Gebruik een atraumatische pincet om de eierstokken, eileiders en baarmoeder voorzichtig naar buiten te halen.
    4. Maak met de punt van een injectiespuitnaald een kleine, naar boven gerichte incisie op de baarmoederwand onder de overgang tussen baarmoeder en eileiders, waarbij u bloedvaten vermijdt. Deze incisie geeft toegang tot de baarmoederholte; Steek de eileider voorzichtig 2-3 mm door het kleine gaatje.
    5. Verwijder voorzichtig de kleine luchtbel aan het uiteinde van de transferpipet terwijl u de transferpipet voorzichtig in de gaten houdt tijdens de langzame injectie van de embryo's. Zodra is bevestigd dat het centrale deel van het kweekmedium is verdreven, stopt u de procedure en verwijdert u voorzichtig de transferpipet.
    6. Plaats de eierstokken, eileiders en baarmoeder terug in de buikholte. Hecht de spierlaag en de huid apart. Leg de muizen op een verwarmingskussen totdat ze herstellen van de narcose. Om het welzijn van de muizen te garanderen, moet u de muizen tijdens de herstelperiode nauwlettend in de gaten houden en ze niet onbeheerd achterlaten totdat ze weer voldoende bij bewustzijn zijn om sternale lighouding te behouden.
  5. Observatie van de zwangerschap
    1. Observeer de muizen na de operatie gedurende 18-21 dagen om het aantal geboren nakomelingen te controleren. Voer in geval van dystocie (moeilijke bevalling) een keizersnede uit. Laat de pasgeboren muizen worden opgevangen door zogende moederdieren van dezelfde leeftijdsgroep.

3. Willekeurige bloedglucose, nuchtere bloedglucose en glucosetolerantietest

  1. Het volgen van willekeurige bloedglucosewaarden tijdens de groei van muizen
    1. Controleer sinds de geboorte van de muizen elke 4 weken om 9 uur 's ochtends de willekeurige bloedglucosespiegel na een goede nacht van eten en plezier.
      1. Prik in de punt van de muisstaart om bloed in de staartader te verkrijgen.
      2. De eerste druppel bloed heeft een hogere suikermeetwaarde door de aanwezigheid van de weefselvloeistof die ermee vermengd is. Veeg daarom de eerste druppel bloed voorzichtig af met schoon, absorberend papier.
      3. Meet de bloedglucose van de tweede druppel (~4 μL) uit de staartader met een draagbare glucometer.
  2. Het volgen van veranderingen in nuchtere bloedglucose en glucosetolerantie tijdens de ontwikkeling van muizen
    OPMERKING: Aangezien het tijdstip van de eerste bloedafname 15 minuten is, moeten alle muizen binnen 15 minuten worden geïnjecteerd. Aangezien elke injectie met muizen 20-30 s duurde, mag het maximale aantal muizen dat in elke test kan worden gebruikt, niet hoger zijn dan 30 om ervoor te zorgen dat de injecties binnen dit tijdsbestek worden voltooid.
    1. Voer de nuchtere bloedglucose- en glucosetolerantietests elke 4 weken na de geboorte uit bij muizen die 's nachts vasten.
      1. Bereid op de eerste dag vers bestraald krullend beddengoed, schone kooien, deksels en waterflessen voor. Breng de muizen over in een verse kooi zonder voedsel. Voeg 'niet voeren'-tags toe aan de kooien.
      2. Bereid voldoende 10% glucose-injectie (steriel en pyrogeenvrij) en spuiten van 1 ml voor.
      3. Zorg ervoor dat de muizen in elke groep 16 uur vasten, van 17.00 uur op dag 1 tot 9.00 uur op dag 2, maar geef vrije toegang tot water. Meet de nuchtere bloedglucosewaarden zoals beschreven in stap 3.1.1.1-3.1.1.3 met behulp van een glucosemeter.
    2. Weeg de muizen en markeer hun staarten om een snelle identificatie te vergemakkelijken. Bereid glucosespuiten voor met 10 μL/g muisgewicht.
    3. Injecteer met tussenpozen van 30 s 10 μL/g glucose in de intraperitoneale holte van de muis.
      OPMERKING: Hier moet speciale aandacht worden besteed aan injectietechnieken om een onnauwkeurig vloeistofinjectievolume te voorkomen. De belangrijkste punten van de werking zijn als volgt:
      1. Immobiliseer de muis en houd de staart met één hand vast. Houd het hoofd iets lager dan de billen, zodat de organen in de buikholte naar het hoofd verschuiven, zodat er voldoende injectieruimte overblijft.
      2. Plaats de naald tussen de middellijn en het heupbeen, steek deze in een hoek van 45 graden door de huid en leid de naald vervolgens voorzichtig dieper in de buikholte terwijl u deze evenwijdig aan het huidoppervlak gedurende ~0.5 cm uitlijnt.
        OPMERKING: Let op eventuele weerstand tijdens de injectie om te bepalen of de inwendige organen per ongeluk worden doorboord.
      3. Werp de spuit uit in de buikholte.
      4. Noteer de tijd waarop de injectie is gestart en gebruik een timer om de injectiesnelheid te regelen. Stel de timer in op 90 s voor drie muizen om te voorkomen dat u tijd verliest bij het hanteren van de timer.
    4. Voer de bloedglucosemeting uit vanaf de staartader met de gewenste tussenpozen (0 vóór glucosetoediening, 15, 30, 60, 90 en 120 minuten na de glucosebelasting).
      OPMERKING: Daaropvolgende bloedglucosetesten moeten ook 20-30 s duren voor elke muis.
    5. Breng de muizen na het experiment terug naar hun huiskooien uitgerust met voedsel en water.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In ons laboratorium hebben we een bevruchtingspercentage van 89,57% en een 2-cellig percentage van 87,38% bereikt met behulp van ICSI met epididymaal caudaal sperma bij muizen. Het geboortecijfer van nakomelingen na ET is ongeveer 42,50%. Opmerkelijk is dat alle bevruchtingspercentages, 2-celsnelheden en geboortecijfers van nakomelingen vergelijkbaar zijn met de niveaus die worden bereikt in menselijke ART, waardoor een uitgebreide simulatie van verschillende stadia van menselijke ART-te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie integreerde technieken voor intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) en embryotransfer (ET) van muizen om de menselijke geassisteerde voortplantingstechnologie (ART) uitgebreid samen te vatten en de impact van ICSI in combinatie met ET op de ontwikkeling van nakomelingen te onderzoeken. De toepassing van de ICSI-techniek met normaal muizensperma leverde een hoge bevruchting (86,76%) en 2-cellige snelheden (88,48%) op. Na ET bedroeg het geboortecijfer van nakomelingen van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Major Project Plan van het Special Development Fund for the Shanghai Zhangjiang National Independent Innovation Demonstration Zone (ZJ2022-ZD-006), het Shanghai Municipal Science and Technology Commission Targeted Funding Project (22DX1900400), het jeugdprogramma van de Shanghai Municipal Health Commission (20204Y0276). de Nationale Natuurwetenschappelijke Stichting van China (32070849).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.25% avertin (2,2,2-tribromoethanol)Nanjing AibeiM2960voor anesthetiserend effect
Bacteriologische petrischalen 35 x 10 mm stijl m/strakke deksel, kristalkwaliteit maagdelijk polystyreen, sterieelBD353001
Bacteriologische petrischalen 50 x 9 mm stijl m/strakke deksel, kristalkwaliteit maagdelijk polystyreen, sterieelBD351006
BioveiligheidskabinetESCOclass figure-materials-1 BSCAseptische operaties, het maken van kweekschalen, het opdelen van reagentia, enz.
CO2-incubatorThermo8000DHEmbryocultuur
DissectiemicroscoopOlympusSZX16Gebruik bij muis embryo transfer
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 is een thermisch stabiel volledig gefluoreerd vloeibaar middel met hoge diëlektrische sterkte en weerstand, gebruikt als werkingsvloeistof
handheld glucometerRocheAccuChek performaBloedglucosemeting
HTFMerckMR-070-DDe EmbryoMax Human Tubal Fluid (HTF) (1x), vloeistof ontworpen voor gebruik met Muis IVF is verkrijgbaar in een 50 mL formaat en is geoptimaliseerd en gevalideerd voor Embryo Cultuur.
Hydraulische micro-injectorEppendorfCellTram 4r Oil, 5196000030Voor sperma injectie
Omgekeerde microscoopNikonTI2-UMicromanipulatie observatie gastheer
KSOMMerckMR-020P-D(1x), Poeder, zonder Fenol Rood, 5 x 10 mL
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medium (1x), Vloeistof, met Fenol Rood
MicromanipulatorNARISHIGENTX-N4Micromanipulatie arm
minerale olie SIGMAM8410Minerale olie is geschikt voor gebruik als dekkingslaag om verdamping en kruisbesmetting in verschillende moleculaire biologie toepassingen te beheersen.
Naald snijderNanjing AibeiSutter MF-800Gebruik voor het fabriceren van micromanipulatie naalden
NaaldtrekkerNanjing AibeiSutter model p-100Gebruik voor het maken van micromanipulatie naalden
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087Toepassing van ICSI injectienaald.
Piezo-elektrische micromanipulator (Membraanbreker)EppendorfEppendorf PiezoXpertGebruik van micropulsen om de zona pellucida en oolemma van de eicel te doorbreken
Pneumatische micro-injectorEppendorfCellTram 4r Air, 5196000013Voor het fixeren van de eicel
Klaar voor gebruik Human Choriongonadotropine (Hcg)Nanjing AibeiM2520Sterilisatie reagens, intraperitoneale injectie. 50 IU/mL
Klaar voor gebruik Zwangere Mergse Serum Gonadotropine (PMSG)Nanjing AibeiM2620Sterilisatie reagens, intraperitoneale injectie. 50 IU/mL
StereomicroscoopOlympusSZX7Oocyte retrievaal en observatie van embryo ontwikkeling

Referenties

  1. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A. C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).
  2. Flurkey, K. M., Currer, J., Harrison, D. E. Vol. III Mouse models in aging research. Ch. 20. The mouse in biomedical research (second edition). Fox, J. G., et al. , Academic Press. Burlington. 637-672 (2007).
  3. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (art). J Dev Orig Health Dis. 8 (4), 388-402 (2017).
  4. Heber, M. F., Ptak, G. E. The effects of assisted reproduction technologies on metabolic health and diseasedagger. Biol Reprod. 104 (4), 734-744 (2021).
  5. Ma, R. C. W., Ng, N. Y. H., Cheung, L. P. Assisted reproduction technology and long-term cardiometabolic health in the offspring. PLoS Med. 18 (9), e1003724(2021).
  6. De Waal, E., et al. The cumulative effect of assisted reproduction procedures on placental development and epigenetic perturbations in a mouse model. Hum Mol Genet. 24 (24), 6975-6985 (2015).
  7. Carlin, J., George, R., Reyes, T. M. Methyl donor supplementation blocks the adverse effects of maternal high fat diet on offspring physiology. PLoS One. 8 (5), e63549(2013).
  8. Hiraoka, K., et al. Piezo-icsi for human oocytes. J Vis Exp. (170), e60224(2021).
  9. Sullivan-Pyke, C. S., Senapati, S., Mainigi, M. A., Barnhart, K. T. In vitro fertilization and adverse obstetric and perinatal outcomes. Semin Perinatol. 41 (6), 345-353 (2017).
  10. Luke, B., et al. The risk of birth defects with conception by art. Hum Reprod. 36 (1), 116-129 (2021).
  11. Norrman, E., et al. Cardiovascular disease, obesity, and type 2 diabetes in children born after assisted reproductive technology: A population-based cohort study. PLoS Med. 18 (9), e1003723(2021).
  12. Goldsmith, S., Mcintyre, S., Badawi, N., Hansen, M. Cerebral palsy after assisted reproductive technology: A cohort study. Dev Med Child Neurol. 60 (1), 73-80 (2018).
  13. Hansen, M., et al. Intellectual disability in children conceived using assisted reproductive technology. Pediatrics. 142 (6), e20181269(2018).
  14. Chang, R. C., Wang, H., Bedi, Y., Golding, M. C. Preconception paternal alcohol exposure exerts sex-specific effects on offspring growth and long-term metabolic programming. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 9(2019).
  15. Grasemann, C., et al. Parental diabetes: The akita mouse as a model of the effects of maternal and paternal hyperglycemia in wildtype offspring. PLoS One. 7 (11), e50210(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Bloedglucosemetingglucosetolerantietestembryotransfergeassisteerde voortplantingstechnologiespermacapacitatiemetabole stoornisnuchtere bloedglucosebewaking van het lichaamsgewicht
Controle van de bloedglucose bij nakomelingen van muizen na intracytoplasmatische sperma-injectie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.