Methodenartikel

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

DOI:

10.3791/66218

⸱

1 december 2023

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Brody School of Medicine, East Carolina University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een ziektemodel dat de auto-immuunziekte multiple sclerose (MS) op histopathologisch en moleculair niveau recapituleert. EAE wordt geïnduceerd door het immuniseren van proefdieren via subcutane injectie van korte myelinepeptiden samen met specifieke adjuvantia om de immuunrespons te versterken. Net als de menselijke tegenhanger ontwikkelen EAE-muizen demyeliniserende laesies, infiltratie van immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS), glia-activering en neuronaal letsel. Een consistente hoeveelheid bewijs ondersteunt ook een mechanistische rol voor B-celdisfunctie in de etiologie van zowel MS als EAE. B-cellen kunnen dienen als antigeenpresenterende cellen en als een primaire bron van pro-inflammatoire cytokines en auto-antilichamen. Bij EAE worden antilichamen gegenereerd tegen de myelinepeptiden die werden gebruikt om de ziekte te induceren. Van dergelijke auto-antilichamen is aangetoond dat ze ofwel myelineverlies ofwel pathogene reactivering van T-cellen in het CZS mediëren. Dit artikel beschrijft een efficiënt op ELISA gebaseerd protocol om auto-antilichamen te kwantificeren in het serum van C57BL/6J-muizen die zijn geïmmuniseerd met het myeline-oligodendrocytglycoproteïne 35-55 (MOG35-55) peptide. De voorgestelde methode dient als een krachtig hulpmiddel om de specificiteit en omvang van de afwijkende humorale respons in de context van auto-immuundemyelinisatie te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) die wordt gekenmerkt door focale infiltratie van immuuncellen in het hersenparenchym, afbraak van myelineschulzen die axonen omhullen, glia-activering en neuronaal verlies1. Naast de gevestigde rol van pathogene T-cellen, hebben meerdere bewijslijnen de betrokkenheid van B-cellen bij het mediëren van de auto-immuunrespons tegen het CZS benadrukt. B-cellen ondergaan klonale expansie in de MS-hersenen en antilichamen tegen myelinecomponenten zijn gedetecteerd in demyelinistische laesies 2,3. De selectieve activering van perifere B-cellen bij het begin van de ziekte is onlangs gedocumenteerd, wat suggereert dat dit immuuncelcompartiment ook een vermeende rol speelt bij het ontstaan van de ziekte4. Het succes van B-cel-afbrekende therapieën zoals anti-CD20 monoklonale antilichamen bevestigt verder het mechanistische verband tussen afwijkende B-celwerking en auto-immuundemyelinisatie 5,6. Vanuit moleculair oogpunt kunnen B-cellen bijdragen aan ziekte via auto-antigeenpresentatie, pro-inflammatoire cytokinesecretie en autoreactieve productie van antilichamen.

Er zijn meerdere diermodellen ontwikkeld om specifieke kenmerken van het complexe MS-fenotype te recapituleren. Onder hen is experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) het meest gebruikte in vivo paradigma en berust op de immunisatie van proefdieren met korte peptiden afgeleid van myeline-eiwitten zoals myeline-oligodendrocytglycoproteïne (MOG) en myeline-basisch eiwit (MBP)7. EAE-geïmmuniseerde dieren ontwikkelen een demyeliniserende pathologie die in veel opzichten op MS lijkt, waaronder een robuuste humorale respons tegen het encefalitogene peptide8. Om deze reden hebben EAE-studies een belangrijke rol gespeeld bij het ontleden van de functie van B-cellen en auto-antilichamen in de context van ziekte. Zo werd bijvoorbeeld aangetoond dat MOG-specifieke antilichamen geïsoleerd uit MS-patiënten het klinische beloop kunnen verergeren in EAE-modellen9. Met name het prolineresidu op positie 42 in menselijke MOG bleek cruciaal te zijn voor het bepalen van de pathogeniteit van auto-antilichamen10. Meer recentelijk is gebleken dat MOG-specifieke auto-antilichamen de ziekte bevorderen, niet alleen door myelineverlies te mediëren, maar ook door de reactivering van autoreactieve T-cellen in het CZSte stimuleren 11.

Gezien het belang van antilichaamresponsen bij auto-immuniteit van het CZS, presenteert dit artikel een op ELISA gebaseerd protocol om de serumspiegels van autoreactieve antilichamen efficiënt te meten bij C57BL/6J-muizen EAE geïmmuniseerd met MOG35-55-peptide. In het eerste deel van het protocol wordt de methode beschreven om serum af te nemen via een intracardiale punctie. Vervolgens zullen de procedures voor het opzetten van de ELISA-test en het verkrijgen van de gegevens in detail worden beschreven. Tot slot komt de data-analyse en -interpretatie aan bod.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures waarbij muizen betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met de experimentele richtlijnen die zijn goedgekeurd door de East Carolina University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). In deze studie werden wildtype C57BL/6J vrouwelijke muizen tussen 8-10 weken oud gebruikt. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel). EAE werd geïnduceerd naar aanleiding van eerder gepubliceerde rapporten 12,13,14.

1. Serum collectie

  1. Euthanaseer de experimentele muis door CO2 -verstikking of een overdosis isofluraan op het vereiste tijdstip (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) na het induceren van EAE via MOG35-55-immunisatie.
    OPMERKING: Het totale aantal muizen en tijdstippen voor serumafname kan variëren afhankelijk van het specifieke experiment.
  2. Nadat de afwezigheid van vitale functies is bevestigd door teen- of staartknijpen, plaatst u de muis in een dorsale ligpositie op een dissectiebak en bevestigt u de ledematen op hun plaats met spelden of tape. Richt het muislichaam op de LED-lichtbron (zie Materiaaltabel) om de borstkas van het dier te verlichten.
  3. Spuit de muizenvacht in met 70% ethanol en maak een incisie in de middellijn van 3-4 cm langs de buik van het bekken tot de xiphoid met behulp van de dissectorschaar, waarbij u ervoor zorgt dat u geen organen en grote bloedvaten tegenkomt (Figuur 1A-C). Om de procedure te vergemakkelijken, gebruikt u de pincet om de huid over het xiphoid-proces vast te pakken.
  4. Snijd het middenrif zijdelings door en knip vervolgens de ribbenkast aan beide zijkanten naar voren af met behulp van de veerschaar, stop voordat u het borstbeen bij de middellijn bereikt (Figuur 1D). Vouw de ribflap die is gemaakt over het hoofd van de muis om het hart bloot te leggen (Figuur 1E).
    OPMERKING: Het doorsnijden van het borstbeen moet worden vermeden, omdat dit de belangrijkste thoracale slagaders die naast het bot liggen zal beschadigen en het bloedvolume dat kan worden verzameld zal verminderen.
  5. Steek een naald van 25 G die is aangesloten op een spuit van 1 ml in de linkerventrikel en verzamel het bloed door de zuiger voorzichtig terug te trekken (Figuur 1F). Om de naaldpunctie te vergemakkelijken, zet u het hart voorzichtig vast tegen een pincet.
    OPMERKING: Als het bloed niet onmiddellijk in de spuit verschijnt, moet de naald langzaam worden gedraaid en moet een andere hoek worden getest. Er moeten echter inspanningen worden geleverd om de naald bij de eerste poging goed te plaatsen om te voorkomen dat er onnodige gaten in het hart ontstaan waar bloed uit kan lekken.
  6. Breng het bloed over in een steriel buisje van 1,5 ml en laat het 30 minuten stollen bij kamertemperatuur. Verwijder het stolsel door centrifugeren bij 2000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatant, dat de serumfractie vertegenwoordigt, en bewaar aliquots voor eenmalig gebruik in cryogene buizen bij -80 °C voor toekomstige tests.

2. ELISA-test

  1. Resuspendeer het gevriesdroogde MOG35-55-peptide (zie materiaaltabel) in water om een voorraad van 10 mg/ml te verkrijgen. Voordat u met het experiment begint, verdunt u de bouillon tot 10 μg/ml in een coatingbuffer (zie materiaaltabel) en pipetteert u 100 μl/putje van de uiteindelijke oplossing tot een plaat met 96 putjes. Sluit de plaat af met een zelfklevende folie om verdamping te voorkomen en laat de plaat een nacht bij 4 °C incuberen.
    OPMERKING: Voor elk monster moeten ten minste 2 putjes worden berekend en er moeten ook 2 extra putjes worden opgenomen voor een blanco controle.
  2. Smeer tegelijkertijd hetzelfde aantal putjes in met 100 μl/putje runderserumalbumine (BSA) opgelost in coatingbuffer in een concentratie van 10 μg/ml. Deze extra putten zullen dienen als achtergrondcontroles.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de controleputten met BSA te coaten, aangezien de coating- en blokkeerbuffers verschillende samenstellingen hebben. Houd er rekening mee dat andere encefalitogene peptiden (zoals PLP139-151 of MBP84-104) kunnen worden gebruikt als irrelevante antigenen als alternatief voor BSA.
  3. Was de dag erna de plaat 3 keer met 200 μL/putje fosfaatbufferzoutoplossing aangevuld met 0,05% Tween 20 (PBS-T). Voeg vervolgens 100 μL/putje van een blokkeringsoplossing van 3% BSA in PBS (zonder Tween 20) toe en incubeer de plaat die gedurende 1 uur bij 37 °C is afgesloten in een hybridisatieoven.
  4. Was de plaat 3 keer met 200 μL/putje PBS-T. Verdun elk serummonster 1:100 in een blokoplossing en voeg 100 μl/putje toe aan zowel MOG35-55 als BSA-gecoate putjes. Voeg dezelfde hoeveelheid blokkerende oplossing toe aan de putjes die als blanco's zijn aangeduid. Incubeer de plaat verzegeld gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, met constant schudden (250 tpm).
  5. Was de plaat 3 keer met 200 μL/putje PBS-T. Verdun het HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam (1:2000, zie materiaaltabel) in een oplossing gemaakt van 0,2% BSA in PBS-T en voeg 100 μl/putje toe aan alle putjes. Incubeer de plaat verzegeld gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, met constant schudden (250 tpm).
  6. Was de plaat 3 keer met 200 μL/putje PBS-T. Voeg 100 μL/putje 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB) substraat (zie materiaaltabel) toe aan alle putjes en incubeer 1-5 minuten in het donker, waarbij de ontwikkeling van een blauwe kleur wordt gecontroleerd.
    1. Stop de reactie door 100 μL/putje stopoplossing toe te voegen (zie Materiaaltabel) en meet de optische dichtheid (OD) in elk putje met behulp van een plaatlezer die is ingesteld op een golflengte van 450 nm.
      OPMERKING: Het TMB-substraat moet 30-60 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht worden gebracht voordat het aan de putjes wordt toegevoegd.

3. Analyse van de gegevens

  1. Vul een Excel-spreadsheet met de OD-waarden die van de plaat worden gelezen. Gemiddeld het gemiddelde van de OD-waarden verkregen uit dubbele putjes (zowel MOG35-55 als BSA-gecoat) voor elk monster.
  2. Trek voor elk monster de gemiddelde waarde van de BSA-gecoate putjes af van die van MOG35-55 gecoate putjes. De resulterende achtergrondgecorrigeerde waarden zullen evenredig zijn met de concentratie van anti-MOG35-55-antilichamen in de verschillende serummonsters.
    OPMERKING: Lege putjes zouden moeten resulteren in gecorrigeerde waarden rond 0.
  3. Pas een niet-parametrische statistische test toe, zoals de Mann-Whitney U-test, om de gemiddelde OD-waarden tussen twee experimentele omstandigheden te vergelijken. Voeg ten minste 3 onafhankelijke monsters toe voor elke aandoening.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de robuustheid van de huidige ELISA-test aan te tonen, werd de methode getest op serummonsters geïsoleerd uit een cohort van C57BL/6J vrouwelijke muizen 20 dagen na immunisatie (dpi) met 100 μg MOG35-55-peptide in volledig Freund's adjuvans (CFA) volgens een gevalideerd EAE-inductieprotocol 12,13,14. De dieren kregen ook 400 ng kinkhoesttoxine op dag 0 en 2. Serummonsters van nep-geïmmuniseerde dieren met alles behalve zonder...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier werd een eenvoudig en efficiënt op ELISA gebaseerd protocol gerapporteerd om de humorale respons nauwkeurig te kwantificeren in een relevant diermodel van MS-pathologie. Deze methode is onlangs gebruikt om de nieuwe rol van het ataxine-1-eiwit te beschrijven bij het beheersen van de serumspiegels van auto-antilichamen in het MOG35-55/C57BL6J EAE-paradigma12. In dit opzicht moet met een aantal factoren rekening worden gehouden om consistente en biologisch zinvolle resultaten met deze methode t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (R03NS131908) en het ministerie van Defensie via het Multiple Sclerosis Research Program onder Award No. W81XWH-22-1-0517. Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van Defensie. Deze studie werd ook ondersteund door startup-fondsen van de East Carolina University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL spuitenBD Biosciences309628
1,5 mL microcentrifuge buizenFisher05-408-129
25 G naaldenBD Biosciences305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substraatThermo FisherN301Bewaar bij 4 °C
Zelfklevende verzegelingenThermo FisherAB0558
Bovine serum albumine (BSA)SigmaA7906Bewaar bij 4 °C
C57BL/6J vrouwelijke muizenThe Jackson Laboratory000664Dieren tussen 8-10 weken oud moeten worden gebruikt voor EAE-experimenten
Cryogene buizenFisher10-500-25
DissectieladeFisherS111022
Dissectie schaarFine Science Tools14082-09
ELISA coating bufferBioLegend421701Bewaar bij 4°C
Excel softwareMicrosoftAnalyse spreadsheet
PincetFine Science Tools11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRPSouthernBiotech1030-05Bewaar bij 4 °C
LED lichtbronFisherAMPSILED21
MicroplaatlezerFisher14-377-575 
Moleculair biologie kwaliteits waterCorning46-000-Cl
Muis MOG35-55 peptideEZBiolabcp7203Bewaar bij -80 °C
Multikanaals pipetAxygenAP-12-200-P
Noyes veer schaarFine Science Tools15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well platenBioLegend423501
Orbitale shakerFisher88-861-023
OvenVWR445-0024
Fosfaat buffer oplossing (PBS)Thermo Fisher14190144
Gekoelde tafelcentrifugeThermo Fisher75002441
Stop oplossingThermo FisherN600
Tween 20Bio-Rad1706531

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
  2. Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
  3. Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
  4. Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118(2021).
  5. Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
  6. Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
  7. Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
  8. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
  9. Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
  10. Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
  11. Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
  12. Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
  13. Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
  14. Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297(2020).
  15. Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Model voor multiple scleroseB celdysfunctiemyelinesubstantie peptide immunisatieELISA protocolserumafnameMOG35 55 peptideimmunoglobuline G responscentraal zenuwstelsel

Gerelateerde artikelen