De focus van dit artikel ligt op het beschrijven van best practices voor het maken van media voor veeleisende anaërobe micro-organismen die uit een omgeving zijn verkregen. Deze methoden helpen bij het beheren van anaërobe culturen en kunnen worden toegepast om de groei van ongrijpbare niet-gekweekte micro-organismen, de 'microbiële donkere materie', te ondersteunen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een set van in situ geïnformeerde gesimuleerde mediumformaten voor het kweken van milieuvriendelijke anaërobe micro-organismen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cultuurafhankelijk onderzoek van anaërobe micro-organismen berust op methodologische competentie. Deze methoden moeten geschikte groeiomstandigheden (bijv. pH en koolstofbronnen) voor anaërobe micro-organismen creëren en handhaven, terwijl ook monsters kunnen worden geëxtraheerd zonder de kunstmatige omgeving in gevaar te brengen. Daartoe kunnen methoden die zijn gebaseerd op en een in situ-omgeving simuleren, een grote hulp zijn bij het kweken van micro-organismen uit die omgeving. Hier schetsen we een in situ geïnformeerde en gesimuleerde anaërobe methode voor het kweken van terrestrische oppervlakte- en ondergrondse micro-organismen, met de nadruk op anaërobe monsterverzameling met minimale verstoring. Dit protocol beschrijft de productie van een aanpasbaar anaëroob vloeibaar medium en de omgevingsverwerving en in vitro groei van anaërobe micro-organismen. Het protocol heeft ook betrekking op kritieke componenten van een anaërobe bioreactor die wordt gebruikt voor omgevingssimulaties van sediment en anaërobe vloeibare media voor milieuvriendelijke culturen. We hebben voorlopige Next Generation Sequencing-gegevens opgenomen van een gehandhaafd microbioom gedurende de levensduur van een bioreactor waarbij de actieve cultuur zich dynamisch aanpaste als reactie op een experimentele koolstofbron.
Inleiding
De meeste micro-organismen blijven ongekweekt; Dit wordt ondersteund door de grote ongelijkheid tussen cellen die door microscopie wordt waargenomen, in tegenstelling tot de weinige micro-organismen die met succes zijn gekweekt met behulp van agarplaten. Staley en Konopka noemden deze ongelijkheid de "Great Plate Count Anomaly"1. De geschatte niet-verantwoorde diversiteit wordt ondersteund door metagenomische en metatranscriptomische gegevens die veel nieuwe geslachten laten zien, verdeeld in rangovervloedscurven uit verschillende omgevingen2. Micro-organismen die zijn waargenomen (meestal door willekeurige shotgun-sequencing van een microbiële gemeenschap) maar niet zijn gekweekt, worden "microbiële donkere materie" genoemd3,4.
In het tijdperk van -omics blijft het kweken van micro-organismen noodzakelijk om genomische gegevens volledig te evalueren en de functie/het fenotype van de aanwezige genen te verifiëren. Het sequencen van gekweekte micro-organismen is nog steeds de enige manier om met vertrouwen volledige genomen te verkrijgen totdat technologieën zoals shotgun-metagenomica en metagenoom-geassembleerde genomen uit de omgeving toelaatbaar onfeilbaar worden5. Genomische evaluaties in combinatie met gekweekte micro-organismen bieden sterke gevolgtrekkingen voor het begrijpen van 'microbiële donkere materie'. Veel leden van de "microbiële donkere materie" vervullen cruciale functies die van invloed zijn op de kringloop van voedingsstoffen en andere elementen en de productie van waardevolle natuurlijke producten, ecologische systemen ondersteunen en ecologische diensten verlenen. Vanuit medisch oogpunt zijn ongeveer de helft van alle momenteel op de markt gebrachte geneesmiddelen producten en derivaten van producten van bacteriën, en het profileren van niet-gekweekte soorten wordt vermoed de antibiotica van de toekomst te onthullen. Om toegang te krijgen tot deze onbeschaafde meerderheid, moet een verscheidenheid aan teeltmethoden worden uitgebreid6. Onder de leden van de "microbiële donkere materie" worden anaërobe oligotrofe micro-organismen grotendeels ondergerapporteerd en bevatten ze waarschijnlijk ecologisch en industrieel waardevolle biochemische routes7, waardoor ze belangrijke doelen van kweek zijn. Anaërobe oligotrofe micro-organismen zijn echter moeilijker te kweken dan hun aërobe en copiotage tegenhangers vanwege de vaak vereiste langere incubatietijden, veeleisende omstandigheden (bijv. bepaalde niet-standaard in-vitrotemperaturen ) en het gebruik van gespecialiseerde mediarecepten.
De huidige ontwikkelingstechnieken om leden van de "microbiële donkere materie" te kweken, waaronder nieuwe anaërobe oligotrofe micro-organismen, hebben ons begrip aanzienlijk verbeterd en de vertegenwoordiging van deze micro-organismen in de fylogenetische boom vergroot. De huidige technieken die gebruik maken van geïnformeerde media voor het kweken van nieuwe micro-organismen (d.w.z. media die zijn afgeleid met behulp van kennis van het (de) micro-organisme(n) van belang) kunnen worden onderverdeeld in drie verschillende methoden. De eerste van de methoden omvat de directe verwijdering van een discreet deel van de omgeving voor overdracht naar een in-vitrogroeikamer die al de micro-organismen van belang in een membraan bevat. Het discrete gedeelte (bijv. zeewater) fungeert om de micro-organismen van belang te voorzien van de geochemische habitat die ze in situ gebruiken, terwijl het membraan de beweging van cellen over de streep stopt (cellen van belang blijven binnen; vreemde cellen die met het discrete gedeelte zijn aangekomen, blijven zonder). Door verbindingen op te nemen die van nature beschikbaar zijn voor micro-organismen in hun natuurlijke habitat, kunnen dergelijke micro-organismen worden gekweekt8. De tweede methode maakt gebruik van metatranscriptomics of genomica om metabolische mogelijkheden op te helderen, waardoor aanwijzingen worden gegeven voor smalle kweekparameters voor een gericht mediumontwerp. Deze aanpak levert een ecofysiologisch profiel op dat kan worden gebruikt om de verrijking van specifieke soorten micro-organismen uit een omgeving te richten. De voorzieningen van het medium zijn afgestemd op de geïdentificeerde aanwezige genen waarvan wordt aangenomen dat ze het (de) beoogde micro-organisme(n) ondersteunen om de verrijkingsdiversiteit te verminderen,9,10. Een voorbehoud is dat genomische informatie niet direct de expressie van genen afleidt, terwijl transcriptomische informatie dat wel doet.
De derde methode omvat milieuvriendelijke en gesimuleerde media, die verschilt van de eerste methode, waarbij de media niet worden gesimuleerd, maar de omgeving rechtstreeks als mediabron wordt gebruikt. Deze derde methode vereist milieuverkenning van de geochemie van een veldlocatie die interessante micro-organismen bevat. Met deze kennis worden primaire componenten en fysische parameters geïdentificeerd om een milieuvriendelijk gesimuleerd medium te produceren. Het medium ontvangt vervolgens een directe infusie van micro-organisme-bevattend sediment of vloeistof uit de omgeving in het medium. Deze methode is met name van belang in gevallen waarin de kweekmicrobioloog geen toegang heeft tot voldoende hoeveelheden bronmilieu (zoals nodig voor de eerste methode) noch tot geschikte metatranscriptomische of genomische gegevens (zoals nodig voor de tweede).
Het volgende protocol is een voorbeeld van de derde methode; Het is geïnformeerd door en heeft tot doel interessante omgevingen te simuleren. Drie naïeve mediarecepten die gericht zijn op verschillende anaërobe micro-organismeculturen die in het veld zijn verworven, worden parallel gepresenteerd in het protocol. De drie vertegenwoordigde culturen zijn gemengde culturen afkomstig van de bodem (hierna "gemengde bodemcultuur"), gemengde culturen afkomstig van een boorgat (hierna "gemengde cultuur van boorgaten" genoemd) en een geïsoleerd methanogeen afkomstig van een boorgat (hierna "boorgatgeïsoleerd methaanogeen"). De samengestelde identiteiten en hoeveelheden in de mediarecepten die hier worden gedeeld, zijn bedoeld als een begingids; Ze kunnen en worden aangemoedigd om te worden aangepast aan de omgeving van de lezer en de micro-organismen die van belang zijn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Productie van aanpasbaar anaëroob vloeibaar medium
- Medium voor kweekflessen (productie van 500 ml)
- Meet verbindingen af en voeg ze toe aan een fles van 1 liter en pas de pH aan met behulp van de kolom in tabel 1 die overeenkomt met de interessecultuur van de lezer (de hoeveelheden in tabel 1 zijn geregistreerd voor de productie van 1.000 ml, dienovereenkomstig aanpassen). Meng verbindingen tot homogeniteit door de fles rond te draaien.
- Verwarm de vloeistof tot het kookpunt door de fles 5-6 minuten in de magnetron te zetten. Open de magnetron vaak en draai de vloeistof voorzichtig rond met een hittebestendige handschoen. Open de magnetron snel als de vloeistof na het borrelen stil komt te staan; Anders kan de vloeistof snel uitzetten en de fles overlopen.
- Bevestig een steriele glazen pipet van 10 ml aan een N 2-gasverdeelstuk (gebaseerd op het ontwerp van Balch et al.11, maar zonder een verwarmde koperen kolom voor N2-gas van zuiverheid; zie aanvullend bestand 1 voor meer informatie over het gasverdeelstuk). Open het spruitstuk om O2 te ontluchten en laat N2-gas naar buiten stromen.
- Plaats de pipetpunt in de vloeistof en pas de gasstroom aan zodat de bellen matig krachtig zijn. Spoel de vloeistof met N2 totdat de fles niet meer te heet is om aan te raken.
OPMERKING: Dit is afhankelijk van de inhoud van de media, maar duurt over het algemeen ~20 minuten. - Terwijl u wacht tot de fles is afgekoeld, zet u 10 steriele kweekflessen van 100 ml neer; of als u media voorbereidt voor het verzamelen van gemengde grondcultuur, zet dan twee steriele flessen van 500 ml neer.
- Zodra de mediafles koel aanvoelt, trekt u de pipetpunt omhoog in de hoofdruimte van de fles. Voeg 0,125 g NaHCO3 en 0,300 g Na2S∙9 H2O toe en wacht tot resazurine kleurloos wordt.
LET OP: Na2S∙9 H2O is bijtend, giftig en irriterend. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van metalen gereedschap en spoel het na contact grondig af. - Terwijl u wacht tot resazurin van kleur verandert, bevestigt u metalen canules aan de opstelling van het gasspruitstuk en plaatst u de canuletips in kweekflessen. Stel de stroom van N2 in de flessen in op een gematigde snelheid, zodat de vloeistof die in de volgende stap wordt toegevoegd, niet klotst door de gasstroom.
- Zodra resazurine kleurloos is, doet u 50 ml vloeistof in elke kweekfles of 250 ml vloeistof in elke fles van 500 ml.
- Sluit elke fles onmiddellijk na het verwijderen van de canules af met een rubberen stop van dezelfde maat. Zet de stop vast met een aluminium afdichting (voor kweekflessen) of een GL45 schroefdop met open bovenkant (voor flessen van 500 ml).
- Plaats de flessen in een autoclaveerbare bak en vul de bak met kraanwater totdat het waterniveau overeenkomt met dat in de flessen.
NOTITIE: Dit zorgt ervoor dat de flessen niet scheuren als gevolg van spanning veroorzaakt door temperatuurverschillen op het glas tijdens het autoclaveren. - Autoclaaf de flessen op 121 °C gedurende 30 min.
- Medium voor bioreactor (productie van 8 L)
- Bereiding van de fles
- Open de klep van een 1/4" (6.4 mm) slangpilaarkogelkraan. Bevestig twee siliconenslangen van 6 cm met een binnendiameter (ID) van 1/4" (6.4 mm) en een buitendiameter (OD) van 1/2" (12.7 mm) aan beide uiteinden van de kogelkraan met slangpilaar.
- Bevestig aan het ene uiteinde van het geheel een 5/16"-1/4" (7.9 mm-6.4 mm) slangpilaaradapterfitting. Bevestig het andere uiteinde van het geheel aan de slangpilaar van een fles van 8 liter.
- Gebruik een kabelbinder om de verbinding tussen de slangpilaar van de fles en de slang en de verbinding tussen de adapterfitting van de slangpilaar en de slang vast te zetten.
- Autoclaaf de fles met montage bij 121 °C gedurende 30 min.
- Gemiddelde productie
- Sluit het ventiel van de kogelkraan van de slangpilaar op de 8 L mandaathouder.
- Meet verbindingen af en voeg deze toe aan de 8 L fles en pas de pH aan met behulp van de kolom in tabel 1 die overeenkomt met de cultuur van de lezer die van belang is (de hoeveelheden in tabel 1 zijn geregistreerd voor de productie van 1.000 ml, dienovereenkomstig aanpassen). Voeg een roerstaaf toe en gebruik een roerhete plaat om de verbindingen tot homogeniteit te mengen.
- Verwarm de vloeistof tot het kookpunt met de roerhete plaat. Laat de vloeistof 30 minuten koken.
NOTITIE: Het opwarmen van de vloeistof tot het kookpunt is afhankelijk van de inhoud van het medium, maar kan 2-3 uur duren. - Bevestig een steriele glazen pipet van 10 ml aan een N 2-gasverdeelstuk (gebaseerd op het ontwerp van Balch et al.11, maar zonder een verwarmde koperen kolom voor N2-gas van zuiverheid; zie aanvullend bestand 1 voor meer informatie over het gasverdeelstuk). Open het spruitstuk om O2 te ontluchten en laat N2-gas naar buiten stromen.
- Zet het vuur uit, plaats de pipetpunt in de vloeistof en pas de gasstroom aan zodat de bellen matig krachtig zijn maar niet overlopen. Spoel de vloeistof gedurende 30 minuten met N2 .
- Trek de pipetpunt omhoog in de hoofdruimte van de fles. Voeg 2,0 g NaHCO3 en 4,8 g Na2S∙9 H2O toe en wacht tot resazurine kleurloos wordt.
LET OP: Na2S∙9 H2O is bijtend, giftig en irriterend. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van metalen gereedschap en spoel het na contact grondig af. - Zodra resazurine kleurloos is, verwijdert u de glazen pipet en sluit u de fles onmiddellijk af met een #10-stop. Draai een draad over de stop en rond de lip van de fles om de stop vast te zetten.
- Bereiding van de fles
2. In-situ verwerving van anaërobe micro-organismen in het milieu
- Oppervlakte-anaërobe monsterverwerving (bodemmengcultuur)
- Breng de fles(sen) met gemengde bodemcultuurmedia gemaakt zoals hierboven en een boor het veld in.
OPMERKING: Een Giddings 2 5/8" standaard conische grondboor wordt gebruikt door de auteurs (Materiaaltabel). Er mag echter elke grondboor of troffel worden gebruikt die tot de gewenste diepte kan bemonsteren. - Duw (heien) de boor in het sediment totdat de bovenkant van de monsterafnamecilinder gelijk ligt met het oppervlak van het sediment.
- Draai de boor 90° om de kern vrij te maken en trek omhoog totdat het monster uit de omgeving is gehaald.
- Bedek in losse sedimenten (zoals wat kan worden aangetroffen bij het bemonsteren van wetlands) de basis van de kern met een nieuwe gehandschoende hand van nitril terwijl deze wordt geëxtraheerd om te voorkomen dat het monster eruit valt of zich bij extractie in het water verspreidt.
- Snel met het oog benaderen 6-7 cm vanaf de basis van de kern. Gebruik een nieuwe gehandschoende hand van nitril om in de kern te snijden en de onderste 6-7 cm te scheiden.
- Breng de bodem van de kern onmiddellijk over in de kweekfles. Als de grond/het sediment te groot is, vorm het dan snel zodat het gemakkelijker in de fles past, waarbij de blootstelling aan de aërobe atmosfeer zoveel mogelijk wordt beperkt.
- Zodra het monster is overgebracht, plaatst u de stop onmiddellijk terug en houdt u deze op zijn plaats met een schroefdop.
- Houd het monster koel. Koel de opvangfles bij 4 °C bij terugkomst in het laboratorium.
- Breng de fles(sen) met gemengde bodemcultuurmedia gemaakt zoals hierboven en een boor het veld in.
- Ondergrondse anaërobe monsterverwerving (boorgat gemengde cultuur)
- Zet een steriele fles van 1 liter bij het gasverdeelstuk. Sluit de fles af met een rubberen stop. Druppel 100% ethanol op de stop en steek deze in brand met een aansteker.
- Bevestig een steriele naald van 23 G aan de N2 gasverdeelstukopstelling. Open het spruitstuk om O2 te ontluchten en laat N2 (of Ar) gas met een gematigde snelheid naar buiten stromen.
- Zodra de stop niet meer in brand staat, steekt u de naald in de fles. Steek een tweede steriele naald van 23 G die niet aan het gasspruitstuk is bevestigd in de fles. Spoel de fles 1-2 minuten door.
- Verwijder de naald die niet aan het gasspruitstuk is bevestigd. Zet de fles 1 minuut onder druk. Haal de resterende naald eruit.
- Breng de fles onder druk en een gesteriliseerde naald van 23 G naar de plaats van het boorgat. Zuig vloeistof op uit het boorgat volgens de methoden van Merino et al.12.
OPMERKING: Afhankelijk van de methode, aansluiting en stroomsnelheid van het boorgat, verandert dit de strategie voor het verkrijgen van een watermonster. Als er een continue waterstroom is, moet het water worden opgevangen zoals beschreven in stap 2.2.6. zal voldoende zijn. Als de waterstroom batchgewijs wordt opgevangen of een laag debiet heeft, kan een alternatieve inlaat-/uitlaatmethode worden gebruikt. Minimaliseer in alle situaties besmetting en probeer ervoor te zorgen dat het verzamelde monster representatief is voor de omgeving die u wilt bemonsteren. Dit is een algemeen gegeneraliseerde verklaring, omdat het de ervaring van de auteurs is dat elke monsterverzameling van overheids- of particuliere sites in hoge mate moest kunnen worden aangepast aan de beschikbare toegankelijkheid. - Open snel de fles, pomp er vloeistof in om de fles volledig te vullen en sluit de fles.
- Steek de naald van 23 G die naar de plaats is gebracht in de rubberen stop van de fles om de druk in de fles te verlichten. Haal de naald eruit.
- Houd het monster koel. Koel de opvangfles bij 4 °C bij terugkomst in het laboratorium.
3. In vitro kweek van in het veld verworven anaërobe micro-organismen
- Groei door kweekfles
- Zet een steriele fles met stop van N2 en de kweekflessen en de opvangfles klaar zoals hierboven. Druppel 100% ethanol op de stoppen en steek ze in brand met een aansteker.
- Monteer een naald van 23 G op een spuit van 1 ml. Zodra de stoppers niet meer in brand staan, steekt u de naald in de N2-fles en zuigt u ~ 1 ml N2 op. Haal de naald eruit.
- Druk langzaam op de zuiger om de N2 los te maken. Zodra de spuit leeg is, steekt u de naald in de opvangfles en zuigt u 0,5 ml van het omgevingsmonster op. Haal de naald eruit.
- Steek de naald in de kweekfles en injecteer het monster. Haal de naald eruit.
- Draai de fles rond en plaats deze in een incubator op temperatuur, zoals aangegeven in tabel 1 of de omgeving van de lezer die van belang is.
OPMERKING: De voortgang van de kweek (fles of bioreactor) wordt gevolgd met behulp van een 0,02 mm diepe Petroff-Hauser-hemocytometer. Verrijkingen van anaërobe of kieskeurige micro-organismen bereiken doorgaans geen celdichtheden waar OD600 bruikbaar is, en andere detectiemethoden zijn onpraktisch voor routinematige en herhaalde monitoring. Detectielimieten, kwaliteitscontrole en statistische berekeningen zijn afhankelijk van het type celtelkamer en de behoeften van de gebruiker.
- Groei door bioreactor
- Voorbereiding van een ballon met een aangepaste spuit
- Verwijder de zuiger uit drie luer lock-spuiten van 10 ml (één voor elke eindmontage). Snijd de flens van elke spuit af en vijl het afgehakte uiteinde zodat het de ballonnen niet doorboort. Reinig alle gevijlde chips uit de aangepaste spuit.
- Bereid een verdubbelde ballon voor door de ene ballon in de andere te plaatsen.
- Span het uiteinde van de verdubbelde ballon over de gemodificeerde spuit van 10 ml.
- Scheid het uiteinde van de buitenste ballon enigszins van de binnenste ballon. Knijp alle lucht eruit die tussen de ballonnen zit.
- Trek een kabelbinder rond de basis van de ballonnen aan om de ballonnen aan de spuit te bevestigen.
- Bereiding van een gemodificeerde stop
- Verwijder de zuigers uit tien luer lock-spuiten van 1 ml (twee voor elke stop die moet worden aangepast). Snijd de flens van de spuiten af.
- Zet twee rubberen stoppers maat #10 (voor 8 L flessen) en drie maten voor flessen met GL45 draadafwerking (voor vangflessen) klaar. Boor met een boor van 1/4" (6.4 mm) twee gaten door de bovenkant van elke rubberen stop, breed genoeg om de aangepaste spuiten te laten passen en smal genoeg om de pasvorm luchtdicht te maken.
- Steek de aangepaste spuiten door de gaten van de rubberen stop.
- Reinig en autoclaaf de gemodificeerde stop bij 121 °C gedurende 30 minuten.
- Voorbereiding van de bioreactor
- Desinfecteer met 70% ethanol alle afsluitkranen, vrouwelijke luer-lock-adapterconnectoren en andere niet-autoclaveerbare bioreactormaterialen, en autoclaaf bij 121 °C gedurende 30 minuten alle slangen (na het op lengte knippen), stoppers, glaswol en andere autoclaveerbare bioreactormaterialen.
- Plaats een steriele bioreactor (Figuur 1 en Figuur 2) op een ringstandaard en zet deze vast met een kettingriem. Zet ook een waterbad, een peristaltische pomp, de afgesloten fles van 8 liter met medium (uit protocolstap 1.2), een fles van 3,5 liter (niet-bemonsterende vangfles) en een fles van 500 ml (bemonsteringsfles).
- Het stoppen van de fles
- Zet een ballon uit met een aangepaste spuit. Sluit een driewegkraan aan op de luer-lock-punt van de spuit.
- Neem de ballonconstructie en sluit de driewegkraan aan op de slang van een tank van N2. Draai aan de driewegkraan om het uiteinde open naar de atmosfeer af te sluiten.
- Open de gastank en vul de ballon met N2. Eenmaal vol, draait u aan de driewegkraan om het uiteinde van de ballon af te sluiten. Sluit de gastank en koppel de tankslang los van de driewegkraan.
- Sluit achtereenvolgens het volgende aan: een driewegkraan (van de ballon met de aangepaste spuit), een tweewegkraan, een vrouwelijke luer-lock-adapterkoppeling en de luer-lock-tip van een van de spuiten van de gemodificeerde stopper.
- Sluit op de luer-lock-tip van de andere spuit een tweewegkraan aan. Sluit beide kleppen van de tweewegkranen op de gewijzigde stopconstructie.
- Draai de draad los die de ongewijzigde maat #10-stop van de fles vasthoudt. Vervang snel de ongewijzigde stop door de gewijzigde stopper en draai de draad zoals voorheen om de gewijzigde stopper aan de fles te bevestigen.
OPMERKING: Indien zeker en voorbereid, kan de gewijzigde stopeenheid worden gebruikt om de fles te stoppen in de laatste stap van de mediumbereiding (stap 1.2.2.7). - Draai aan de driewegkraan om het uiteinde open naar de atmosfeer af te sluiten. Open de in volgorde geplaatste tweerichtingskraan. Het gas van de ballon en de headspace van de 8 L fles zijn nu met elkaar verbonden.
- Stoppen van de niet-bemonsterings- en bemonsteringsflessen
- Stop: de 3,5 L niet-bemonsteringsfles met een aangepaste stop voor flessen met GL45-draadafwerking, waarbij 70% ethanol op de basis van de stop wordt aangebracht om deze in de fles te laten passen. Sluit de fles af met een GL45 schroefdop met open bovenkant.
- Sluit achtereenvolgens het volgende aan: een ballon met de luerlock-tip van de gemodificeerde spuit, een driewegafsluitkraan, een vrouwelijke luerlock-adapterkoppeling en de luerlock-tip van een van de spuiten van de gemodificeerde stopper. Draai aan de driewegkraan om het uiteinde direct naar de atmosfeer te blokkeren.
- Sluit op de luerlock-tip van de andere spuit een vrouwelijke luerlock-adapterkoppeling aan.
- Herhaal de bovenstaande drie stappen voor de bemonsteringsfles van 500 ml.
- Opzetten van slangen
- Meet de afstand tussen de poorten van de watermantel van de bioreactor en de weerhaken van de waterbadslang. Knip twee lengtes van 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD siliconenslang om deze afstand te overbruggen.
- Monteer twee rechte slangaansluitingen met GL14 schroefdoppen met open bovenkant. Bevestig elk aan het ene uiteinde van de twee slangstukken.
- Draai de schroefdoppen op de poorten van de watermantel van de bioreactor. Bevestig de andere uiteinden van de slang aan de weerhaken van de waterbadslang zodat het water uit het waterbad stroomt, aan de onderkant van de watermantel van de bioreactor binnenkomt, aan de bovenkant van de watermantel naar buiten komt en terugkeert naar het waterbad. Span de kabelbinders rond de uiteinden van de slang om de slang aan de weerhaken van de waterbadslang te bevestigen.
- Voor pompen die vergelijkbaar zijn met de VWR Ultra Low Flow minipomp met variabel debiet, haalt u de bijbehorende 3/16" (4,8 mm) OD-slang met sleuf door de pomp.
- Meet de afstand tussen de flessenslang en de slangen van de peristaltische pomp. Knip een lengte van 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD siliconenslang om deze afstand te overbruggen.
- Bevestig het ene uiteinde van de slang aan de slangpilaar van de flessenslangconstructie en het andere aan de slangpilaar van de peristaltische pompslang, zo georiënteerd dat het medium uit de fles en door de peristaltische pomp stroomt.
- Meet de afstand tussen de peristaltische pompslang en de onderste poort van de bioreactor. Knip een lengte van 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD siliconenslang om deze afstand te overbruggen.
- Bevestig het ene uiteinde van deze slang aan de slangpilaar van de peristaltische pompslang en bevestig het andere voorzichtig aan de onderste poort van de bioreactor. Zorg ervoor dat het glas niet barst, maar ook om de verbinding vast te zetten, en trek een kabelbinder rond het uiteinde van de slang aan om de slang aan de onderste poort van de bioreactor te bevestigen.
- Meet en knip ongeveer 5" (127 mm) lengte van 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD siliconenslang.
- Bevestig een vrouwelijke luerlock-adapterconnector aan een driewegkraan. Bevestig elk uiteinde van de driewegkraan aan de slang.
- Monteer een schuine slangaansluiting met GL14 schroefdop met open bovenkant. Bevestig het aan het andere uiteinde van de slang.
- Draai de schroefdop op de bovenste verticale poort van de bioreactor. Draai aan de driewegkraan om het uiteinde dat naar de bioreactor wijst af te sluiten.
- Meet de afstand tussen de bovenste verticale poort en de niet-bemonsterende vangfles. Knip een lengte van 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD siliconenslang om deze afstand te overbruggen. Snijd de flenzen van twee luer lock-spuiten van 1 ml af en steek ze in de uiteinden van de slang.
- Bevestig het ene uiteinde van deze slangconstructie aan de driewegkraan van de bovenste verticale poortconstructie en bevestig het andere uiteinde aan de vrouwelijke luer lock-adapterconnector op de niet-bemonsteringsvergrendelingsfles.
- Meet de afstand tussen de bovenste verticale poort en de bemonsteringsfles. Knip een lengte van 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD siliconenslang om deze afstand te overbruggen. Snijd de flenzen van twee luer lock-spuiten van 1 ml af en steek ze in de uiteinden van de slang.
- Bevestig het ene uiteinde van deze slangconstructie aan de driewegkraan van de bovenste verticale poortconstructie en bevestig het andere aan de vrouwelijke luerlock-adapterconnector op de bemonsteringsvangstfles.
- Vullen van de bioreactor
- Sluit een van de GL18-poorten van de bioreactor af met een wit rubberen septum. Sluit de andere GL18-poort en de resterende verticaal blootgestelde GL14-poorten af met GL18/GL14-formaat PTFE-siliconensepta (PTFE naar het glas gericht) en schroefdoppen met open bovenkant.
- Pak met een staaf van 50 cm lengte 0,9 g glaswol in de bodem van de bioreactor.
- Autoclaaf 1,3 L zand bij 121 °C gedurende 30 min. Vul de bioreactor met het zand met behulp van een trechter.
OPMERKING: Andere sedimenttypen die zijn geïnformeerd door de omgeving van de lezer en micro-organismen die van belang zijn, kunnen hier worden vervangen. - Plaats de slang in een tank met N2 in de bovenkant van de bioreactor en spoel de vrije ruimte van de bioreactor gedurende 2 minuten door met N2 . Sluit de bioreactor onmiddellijk af met een stop van #7-formaat en een GL45 schroefdop met open bovenkant.
- Koppel de slang los van de niet-bemonsteringsfles en draai aan de driewegkraan om het uiteinde dat naar de ballon wijst te blokkeren. Sluit de slang aan op een tank van N2 op de vrouwelijke luer lock-adapterconnector en spoel de bioreactorruimte gedurende 2 minuten door met N2 . Sluit de slang onmiddellijk weer aan en plaats de driewegkraan terug om het uiteinde open naar de atmosfeer af te sluiten.
- Herhaal de bovenstaande stap voor de bemonsteringsfles met vangst.
- Draai aan de driewegkraan van de bovenste verticale poort van de bioreactor om het uiteinde dat naar de bemonsteringsfles wijst af te sluiten. Pomp vloeistof uit de fles in de bioreactor. Pauzeer de pomp en ontlucht de ballon van de monsterfles en vul de ballon van de fles indien nodig metN2 .
- Zodra de bioreactor met het medium is gevuld, stelt u het pompdebiet in op 0,6 ml/min (digitale waarde van 40 op de minipomp).
NOTITIE: Andere door de lezer gewenste stroomsnelheden kunnen hier worden vervangen. - Stel de temperatuur van het waterbad in, zoals aangegeven in tabel 1 of in de omgeving van de lezer.
OPMERKING: Inoculum kan op dit punt of later worden toegevoegd, afhankelijk van de specifieke kenmerken van het onderzoek. Als u op dit punt inent, gaat u verder met stap 3.2.4.10. Als u later inent, gaat u verder met stap 3.2.5. - Zet een opvangfles of geïnoculeerde kweekfles en een steriele fles met stop van N2 klaar. Druppel 100% ethanol op de stoppen en steek ze in brand met een aansteker.
- Monteer een naald van 23 G op een spuit van 60 ml. Zodra de stoppers niet meer in brand staan, steekt u de naald in de N2-fles en zuigt u ~ 50 ml N2 op. Haal de naald eruit.
- Druk langzaam op de zuiger om de N2 los te maken. Zodra de spuit leeg is, steekt u de naald in de opvangfles en zuigt u 50 ml van het milieumonster op. Haal de naald eruit.
- Vervang de naald van 23 G door een steriele lange metalen naald (canule, lengte 31,5 cm). Steek de lange metalen naald door het witte rubberen septum op de GL18-poort van de bioreactor.
- Duw de naald in het bezinksel en injecteer het entmateriaal. Haal de naald eruit.
- Onderhoud van bioreactoren uitvoeren
- Voer elke dag dat de bioreactor draait het volgende uit:
- Controleer het niveau van het waterbad. Als het bijna leeg is, voeg dan meer water toe (gebruik gedestilleerd water voor een lange levensduur van de apparatuur door corrosie en ophoping van mineralen te verminderen).
- Controleer de ballon van de niet-bemonsterende vangfles; Een volle ballon remt de doorstroming van het medium. Als deze vol is, draait u aan de driewegkraan om het uiteinde dat naar de opvangfles wijst af te sluiten. Knijp in de ballon om hem te legen; draai vervolgens de driewegkraan terug om het uiteinde open naar de atmosfeer te blokkeren; Herhaal dit totdat de ballon leeg is.
- Controleer de ballon van de 8 L fles. Indien laag, sluit u de in volgorde geplaatste tweewegkraan en koppelt u de driewegkraan los van de tweewegkraan. Vul de ballon opnieuw en bevestig deze opnieuw volgens de stappen 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 en 3.2.3.3.7.
- Controleer het niveau van het medium in de fles van 8 L. Als de fles bijna leeg is, stel dan nog een fles van 8 liter samen en bereid meer medium voor volgens protocolstap 1.2. en 3.2.3.3. Pauzeer de pomp, sluit de kogelkraan van de slangpilaar, koppel snel de oude fles los en sluit de nieuwe fles aan.
NOTITIE: Voor een debiet van 0.6 ml/min is elke 9 dagen nieuw medium nodig. - Controleer het niveau van het medium in de niet-bemonsterende vangfles. Als de opvangfles vol is, monteer dan een andere niet-bemonsteringsfles overeenkomstig stap 3.2.3.4.1. Spoel de nieuwe fles door met N2, koppel de ballon met de aangepaste spuit en slang snel los van de oude fles en sluit deze aan op de nieuwe fles.
- Verwijder de gewijzigde stop van een volle niet-bemonsteringsfles. Autoclaaf de vloeistof bij 121 °C gedurende 30 minuten; Gooi de vloeistof vervolgens weg volgens het institutionele beleid van de lezer. Reinig en autoclaaf alle onderdelen van de niet-bemonsterende opvangfles om ze voor te bereiden op het volgende gebruik.
- Voer elke 7 (of door de lezer gewenste aantal) dagen een steekproef uit door het volgende te doen:
- Draai aan de driewegkraan van de bovenste verticale poort van de bioreactor om het uiteinde af te sluiten dat naar de niet-bemonsterende opvangfles wijst. Verzamel 250 ml vloeistof.
NOTITIE: Voor een debiet van 0.6 ml/min duurt het verzamelen van 250 ml ~7 uur. - Draai de driewegkraan van de bovenste verticale poort van de bioreactor terug om het uiteinde dat naar de bemonsteringsfles wijst af te sluiten. Koppel de slang en de bemonsteringsfles los van de driewegkraan van de bovenste verticale poort van de bioreactor.
- Reinig na het testen, opslaan en/of op de juiste manier verwijderen van de bemonsteringsvloeistof alle onderdelen van de bemonsteringsfles behalve de ballon met de aangepaste spuit. Autoclaaf alle onderdelen bij 121 °C gedurende 30 minuten, behalve de ballon met de aangepaste spuit en vrouwelijke luerlock-adapterconnectoren. Zet weer in elkaar voor de volgende bemonsteringsdag.
NOTITIE: Het wordt ten zeerste aanbevolen om dubbele of drievoudige redundantie van onderdelen, doppen, slangen en septa te hebben voor snelle reparatie en vervanging indien nodig.
- Draai aan de driewegkraan van de bovenste verticale poort van de bioreactor om het uiteinde af te sluiten dat naar de niet-bemonsterende opvangfles wijst. Verzamel 250 ml vloeistof.
- Voer elke dag dat de bioreactor draait het volgende uit:
- Voorbereiding van een ballon met een aangepaste spuit
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier tonen we de resultaten van een bioreactorstudie met behulp van een bereidingsmethode voor boorgatmengcultuurmedium en een methode voor het opzetten van een bioreactor zoals hierin beschreven. Het boorgat mengcultuurmedium werd gemodificeerd om als koolstofbron een suspensie van maïskolven te bevatten die zijn verwerkt door middel van oxidatieve hydrothermale oplossing (OHD)13,14. Gemodificeerd boorgat mengcultuurmedium werd gedurende 44 dagen in de bioreacto...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het medium productie gedeelte van dit protocol (sectie 1) dankt zijn structuur aan de gemodificeerde Hungate-techniek van Miller en Wolin17, die sinds de publicatie ervan op grote schaal is gebruikt. De bruikbaarheid van dit uitgebreide protocol komt voort uit het beschrijvende karakter en de combinatie met de in situ verwerving van micro-organismen. Kweekflessen met milieuvriendelijke en gesimuleerde media zijn gebruikt om met succes de volgende in situ verworven voormalige lede...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag de afstamming van informatie en mentorschap erkennen die deze technieken in de loop der jaren heeft beïnvloed/ontwikkeld. Dr. Hamilton-Brehm is als voormalig afgestudeerde student, postdoc en huidige professor veel dank verschuldigd aan degenen die de tijd hebben genomen om anaërobe technieken te onderwijzen: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser en Dr. Brian Hedlund. De Nature Conservancy en American Rivers ondersteunden dit werk door middel van subsidies G21-026-CON-P en AR-CE21GOS373, respectievelijk. Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen in dit artikel zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de mening van de Nature Conservancy of American Rivers. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het SIU Advanced Energy Institute, dat dankbaar is voor financiering die is toegekend via de Advanced Energy Resource Board. NGS werd uitgevoerd door LC Sciences.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Algemene materialen | |||
| 1 L borosilicaatfles | Fisher Scientific | ||
| 1 mL spuit met slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glazen pipet | Fisher Scientific | ||
| 100 mL kweekfles | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G naald | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicaatfles | Fisher Scientific | ||
| Aluminium afdichting | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31,5 cm lengte | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm lengte | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Geassembleerd uit bedrijfsonderdelen | |
| Gas manifold | Swagelok | Geassembleerd uit veel verschillende onderdelen | |
| Aansteker | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrilvaten | Fisher Scientific | ||
| Rubberstopper (voor GL45 flessen) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubberstopper (voor kweekflessen) | Ace Glass | ||
| Rolplaat met verwarming | Corning | ||
| Spoorelementen | ATCC | ||
| Vitaminen | ATCC | ||
| Bioreactorspecifieke materialen | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL spuit met luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" slangenaanluiting kogelkraan | Amazon | ||
| 10 mL spuit met luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3,5 L borosilicaatfles | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" slangenaanluiting adapter | Amazon | ||
| 60 mL spuit met luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosilicaat carboy | Allen Glass | ||
| Hoekverbinding slang voor GL14 open topdop | Ace Glass | 7623-20 | |
| Ballon | Party City | ||
| Borosilicaat bioreactor | Allen Scientific Glass | Op maat gemaakt op aanvraag | |
| Boor | Lowe's | ||
| Luer lock adapter koppelstuk vrouwelijk | Amazon | ||
| GL14 open topdop | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open topdop | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open topdop | Ace Glass | ||
| PTFE-zijde siliconen septum voor GL14 open topdop | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE-zijde siliconen septum voor GL18 open topdop | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ringstand | Fisher Scientific | ||
| Ringstand kettingklem | Amazon | ||
| Ringstandklem | Fisher Scientific | ||
| Siliconeslang; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Siliconeslang; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Rechte slangverbinding voor GL14 open topdop | Ace Glass | 7623-22 | |
| Drieweg stopcock | Amazon | ||
| Tweeweg stopcock | Amazon | ||
| Ultra lage flow variabele flow mini-pomp | VWR | ||
| Waterbad | Fisher Scientifc | ||
| Witte rubber septum voor 13-18 mm od buizen | Ace Glass | 9096-49 | |
| Draad | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
Referenties
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055(2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184(2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012(2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768(2022).
- Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
- Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535(2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224(2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
