Methodenartikel

Profilering van oppervlakte-eiwitepitopen op virale deeltjes door multiplex dual-reporter-strategie

DOI:

10.3791/66230

⸱

12 januari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Affinity Proteomics-Stockholm Unit, SciLifeLab, Division of Affinity Proteomics, Department of Protein Science, School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH), KTH Royal Institute of Technology, 2Human Antibody Therapeutics Unit, SciLifeLab, Division of Drug Discovery and Development, Department of Protein Science, School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH), KTH Royal Institute of Technology, 3Center for Infectious Medicine, Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet, 4Public Health Agency of Sweden, 5Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde multiplex fluorescerende immunoassay die gebruikmaakt van een dual-reporter flowcytometrisch systeem om tegelijkertijd twee unieke spike-eiwitepitopen te detecteren op intacte virale deeltjes van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) die waren opgevangen door angiotensine-converterend enzym-2-gekoppelde magnetische microsferen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membraaneiwitten op omhulde virussen spelen een belangrijke rol in veel biologische functies, waaronder virushechting aan doelcelreceptoren, fusie van virale deeltjes met gastheercellen, gastheer-virusinteracties en pathogenese van ziekten. Bovendien zijn virale membraaneiwitten op virusdeeltjes en gepresenteerd op het oppervlak van gastheercellen uitstekende doelwitten gebleken voor antivirale middelen en vaccins. Hier beschrijven we een protocol om oppervlakte-eiwitten op intacte deeltjes van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) te onderzoeken met behulp van het dual-reporter flowcytometrische systeem. De test maakt gebruik van multiplextechnologie om een drievoudige detectie van virale deeltjes te verkrijgen door middel van drie onafhankelijke affiniteitsreacties. Magnetische kralen geconjugeerd aan recombinant humaan angiotensine-converterend enzym-2 (ACE2) werden gebruikt om virale deeltjes op te vangen van het supernatans van cellen geïnfecteerd met SARS-CoV-2. Vervolgens werden twee detectiereagentia gelabeld met R-phycoerythrin (PE) of Brilliant Violet 421 (BV421) tegelijkertijd aangebracht. Als proof-of-concept werden antilichaamfragmenten gebruikt die gericht zijn op verschillende epitopen van het SARS-CoV-2-oppervlakte-eiwit Spike (S1). De detectie van virale deeltjes door drie onafhankelijke affiniteitsreacties zorgt voor een sterke specificiteit en bevestigt de vangst van intacte virusdeeltjes. Dosisafhankelijkheidscurves van met SARS-CoV-2 geïnfecteerde celsupernatans werden gegenereerd met replicatiecoëfficiëntvariaties (gemiddelde/SD) ˂14%. Goede testprestaties in beide kanalen bevestigden dat twee epitopen van het doeleiwit van het virusoppervlak parallel detecteerbaar zijn. Het hier beschreven protocol zou kunnen worden toegepast voor (i) high-multiplex, high-throughput profilering van oppervlakte-eiwitten die tot expressie worden gebracht op omhulde virussen; ii) detectie van actieve intacte virale deeltjes; en (iii) beoordeling van specificiteit en affiniteit van antilichamen en antivirale geneesmiddelen voor oppervlakte-epitopen van virale antigenen. De toepassing kan mogelijk worden uitgebreid tot elk type extracellulaire blaasjes en biodeeltjes, waardoor oppervlakteantigenen in lichaamsvloeistoffen of andere vloeibare matrices worden blootgesteld.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meest voorkomende pathogene virussen, zoals griep, HIV, humaan cytomegalovirus en SARS-CoV-stammen, zijn omhulde virussen. Celinfectie door omhulde virussen vereist de fusie van virale en gastheercelmembranen, wat resulteert in de afgifte van het virale genoom in het cytoplasma. Viraal RNA zal zich dan repliceren voordat het wordt verpakt in een nieuw viraal deeltje 1,2. Tijdens deze processen kunnen niet alleen virale eiwitten, maar ook gastheermembraaneiwitten in de envelop worden opgenomen en een integraal onderdeel worden van het nieuwe virale deeltje. Gastheercelmembraaneiwitten die in de virusenvelop zijn opgenomen, kunnen het binnendringen van het virus in een nieuwe gastheercel vergemakkelijken, waarbij gebruik wordt gemaakt van de mechanismen van cel-celinteracties, homing en ontsnapping aan het immuunsysteem 3,4.

Ondanks het belang van het onderzoeken van virus-geassocieerde eiwitten, ondersteunen de meeste van de momenteel beschikbare technieken voor virusanalyse5 geen high-throughput en high-multiplex karakterisering van virusoppervlakte-antigeen. Ze zijn ook niet in staat om individuele virale deeltjes te detecteren of om onderscheid te maken tussen infectieuze intacte virusdeeltjes, niet-infectieus RNA, virale eiwitten en virussubpopulaties die verschillende antigenen tot expressie brengen. Onlangs is flowcytometrie gewijzigd en aangepast tot een nieuwe methode voor de analyse van virale deeltjes, namelijk flowvirometrie. Flowvirometrie maakt het onderzoek van afzonderlijke virale deeltjes en hun oppervlakte-antigenen mogelijk. Beperkingen zoals een lage doorvoer, een lage multiplexcapaciteit, gecompliceerde experimentele opzet en gegevensanalyse, en beperkte detecteerbaarheid van kleine virale deeltjes blijven echter 6,7.

Op microsferen gebaseerde multiplexed kwantificering van eiwitten en nucleïnezuur is een gevestigde technologie met tal van toepassingen, variërend van eiwitkwantificering in lichaamsvloeistoffen, eiwit-eiwitinteractiestudies en diagnose van virale infecties 8,9,10,11,12,13 . Een onlangs geïntroduceerd stroomanalyse-instrument is voorzien van een dubbel reporterkanaal, waardoor twee fluorescerende reportermoleculen in dezelfde reactieput kunnen worden gemeten. Deze nieuwe mogelijkheid is bijzonder nuttig gebleken voor de parallelle profilering van verschillende immunoglobuline-isotypen14. Hier wordt beschreven hoe het dubbele reportersysteem kan worden gebruikt om intacte virale deeltjes te detecteren, waarbij meerdere oppervlakte-antigenen parallel worden gericht.

Als proof of concept beschrijft dit rapport de ontwikkeling van een drievoudig detectiesysteem voor SARS-CoV-2-virusdeeltjes. SARS-CoV-2 bestaat uit vier hoofdeiwitten, één is het spike-eiwit (S), dat uit twee subeenheden bestaat. De eerste subeenheid, S1, vormt de primaire binding aan de ACE2 die tot expressie komt in menselijke celmembranen. De tweede subeenheid, S2, vergemakkelijkt de toegang tot de doelcel door een fusiepeptide, waardoor een porie in het doelcelmembraan ontstaat waar het virion doorheen kan komen15. De drie resterende bouwstenen van SARS-CoV-2 zijn het nucleocapside (N), het membraaneiwit (M) en het envelopeiwit (E). Het nucleocapside is verantwoordelijk voor de verpakking van het virale genoom door ribonucleoproteïnestructuren te vormen met RNA, terwijl de membraan- en envelopeiwitten een centrale rol spelen bij de assemblage van het virus.

De hier beschreven test richt zich op drie onafhankelijke epitopen van de S1-subeenheid die tot expressie komen op het envelopoppervlak van SARS-CoV-2. Seriële verdunningen van zowel SARS-CoV-2-geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde celsupernatanten worden gebruikt. Virale deeltjes worden opgevangen via ACE2-geconjugeerde microsferen die de S1-subeenheid aan het virus binden. S-eiwit van het oppervlaktevirus wordt vervolgens parallel gedetecteerd met een in de handel verkrijgbaar gelabeld immunoglobuline enkelketenvariabel fragment (scFv) en een humaan monoklonaal anti-S1-antilichaam (Hu-anti-S1) samen met een in eigen huis ontwikkeld FLAG-gelabeld scFv. De Hu-anti-S1 wordt gedetecteerd door het eerste kanaal (RP1) in het dual-reporter-systeem met oranje R-phycoerythrin (PE)-geconjugeerd anti-humaan IgG-Fc secundair antilichaam, en de scFv wordt gedetecteerd door het tweede kanaal (RP2) met een blauw Brilliant Violet 421 (BV421)-geconjugeerd secundair anti-FLAG-antilichaam. De virusdeeltjestest is weergegeven in figuur 1.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Conjugatie van neutravidine en controle-antilichamen tegen magnetische microsferen

OPMERKING: Fluorescerend geverfde magnetische kralen (polystyreenmicrosferen met een diameter van 6,5 μm met ingebed magnetiet) met verschillende fluorescerende labels, vermeld in de materiaaltabel , worden gebruikt om de volgende kralenconjugaten en controles te genereren: (1) Gebiotinyleerde recombinante humane ACE2 gebonden aan kralen gekoppeld aan een neutravidine-linker; (2) Biotine gebonden aan kralen in combinatie met een neutravidine-linker; (3) Geit IgG direct gekoppeld aan kralen; en (4) Ongeconjugeerde kralen. Het eiwit dat aan kralen moet worden gekoppeld, moet vrij zijn van natriumazide, runderserumalbumine (BSA), glycine, tris(hydroxy)aminomethaan (Tris), glycerol of aminebevattende additieven. De activeringsbuffer is 0,1 M natriumfosfaat monobasisch, watervrij (NaH2PO4), pH 6. 2-morfolino-ethaansulfonzuur (MES; 50 mM) Buffer van pH 5 wordt gebruikt voor het verdunnen van conjugaten. Wasbuffer is PBS-T (1x PBS [fosfaatgebufferde zoutoplossing], pH 7,4 + 0,05 % (v/v) Tween-20). Opslagbuffer is 2,7 mg/ml blokkerend reagens voor ELISA (BRE) + 0,1% antibiotica (hier ProClin 300).

  1. Haal Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) poeder uit de koelkast en 65 mg voorgealiquoteerd 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride (EDC) uit de vriezer en laat gedurende 30 minuten op kamertemperatuur komen (RT; 18-22 °C). Bewaar tijdens deze stap zowel NHS als EDC in een envelop met silicakorrels om hydrolyse door atmosferisch vocht te voorkomen.
  2. Bereid microsferen voor op activering en koppeling.
    OPMERKING: De fluorescerende kleurstoffen in microsferen zijn gevoelig voor licht en parels moeten in het donker en bij koelkasttemperaturen (4-8 °C) worden bewaard wanneer ze niet actief worden gebruikt.
    1. Resuspendeer 4 verschillende voorraden van de kleur-ID-gecodeerde microsferen (12,5 x 106/ml) (materiaaltabel) door kort te vortexen, te soniceren of te roteren (15 min bij 15-30 tpm), volgens het productinformatieblad.
    2. Breng 40 μl van elke kralensuspensie (5 x 105 microbolletjes) over naar de toegewezen putjes van een halfwells, platte bodem en 96-wells microtiterplaat (Materiaaltabel).
    3. Was de magnetische kralen.
      NOTITIE: Wasstappen kunnen handmatig of met behulp van een geautomatiseerde platenwasser worden uitgevoerd.
      1. Voeg 80 μL/well Activation Buffer toe aan de kralen en immobiliseer de kralen gedurende 30 s op een magnetische platenscheider. Zuig het supernatans uit de microsferen terwijl de kralen worden geïmmobiliseerd op de magnetische plaatscheider.
      2. Verwijder de microtiterplaat van de magnetische platenscheider en resuspendeer de korrels in 50 μL activeringsbuffer.
  3. Activeer de kralen met Sulfo-NHS en EDC.
    1. Bereid Sulfo-NHS-werkoplossing voor in een dosis van 50 mg/ml in activeringsbuffer in een microfuge-buisje van 1,5 ml. Breng de voorraad NHS-poeder terug naar de koelkast (4-8 °C), beschermd tegen vocht.
    2. Bereid EDC-werkoplossing in een dosis van 50 mg/ml in activeringsbuffer in de 1,5 ml microfuge-buis. Los de kant-en-klare hoeveelheid EDC-poeder van 65 mg op in 1,3 ml activeringsbuffer.
      OPMERKING: Sulfo-NHS en EDC beginnen te hydrolyseren en verliezen activiteit wanneer ze zijn opgelost. Onderbreek de koppelingsprocedure niet totdat NHS en EDC aan de kralen zijn toegevoegd. Bewaar opgeloste NHS- of EDC-oplossingen niet voor later gebruik.
    3. Bereid de activeringsoplossing voor op de activering van de parel door volumetrisch 20% Sulfo-NHS-voorraadoplossing (50 mg/ml), 20% EDC-voorraadoplossing (50 mg/ml) en 60% activeringsbuffer te combineren. Er is een activeringsoplossing van 50 μl nodig voor elke druppelactiveringsreactie (met 5 × 105 korrels/reactie), plus voldoende extra volume om pipetteerverliezen op te vangen.
    4. Voeg 50 μl volledige activeringsoplossing toe aan elk putje met gewassen kralen. Met het reeds bestaande volume van 50 μL parelsuspensie in de activeringsbuffer zal de uiteindelijke concentratie van Sulfo-NHS per put 5 mg/ml zijn en de uiteindelijke concentratie EDC ook 5 mg/ml.
    5. Sluit de reactieplaat van de microsfeer af met een zelfklevende plastic of folieplaatsealer voor eenmalig gebruik en incubeer gedurende 20 minuten op een orbitale shaker (650 tpm) bij kamertemperatuur (18-22 °C) in het donker.
  4. Was overtollige activeringsoplossing van de korrels.
    1. Centrifugeer de microtiterplaat bij 233 × g gedurende 1 min.
    2. Immobiliseer geactiveerde kralen gedurende 30 s op een magnetische platenscheider. Verwijder de plaatafdichter en zuig het supernatans op uit met magneten geïmmobiliseerde kralen terwijl de microtiterplaat nog op de magnetische scheider is geplaatst.
    3. Verwijder de microtiterplaat van de magnetische scheider en voeg 100 μL MES Buffer toe aan elk putje.
    4. Herhaal de stappen 1.4.2-1.4.3 nog een keer voor in totaal twee wasbeurten.
  5. Koppel neutravidine en geit IgG (controle) aan de juiste kralensets. Bereid voldoende neutravidine- en geiten-IgG-werkoplossingen voor, plan 100 μL/reactie en voldoende extra om pipetteerverliezen als volgt op te vangen:
    OPMERKING: Neutravidine-eiwitpoeder wordt gereconstitueerd met ultrapuur water en vervolgens verdund tot een 1 mg/ml bouillonoplossing met PBS voordat het wordt gealiquoteerd voor opslag/gebruik (neutravidine-eiwit is niet direct oplosbaar in PBS, maar is oplosbaar in water tot ~10 mg/ml).
    1. Bereid neutravidine-werkoplossing in een concentratie van 125 μg/ml in MES Buffer in een 1,5 ml laag eiwitbindende microfuge-buisje.
    2. Bereid geit IgG-controle-antilichaamoplossing voor de werkoplossing in een concentratie van 17,5 μg/ml in MES-buffer.
    3. Bereid de microtiterplaat met geactiveerde kralen voor. Immobiliseer de kralen gedurende 30 s op een magnetische platenscheider. Terwijl de microtiterplaat nog op de magnetische scheider is geplaatst, zuigt u het supernatans op uit de met magneten geïmmobiliseerde korrels.
    4. Voeg 100 μl neutravidine-werkoplossing (125 μg/ml) toe aan de daarvoor bestemde putjes die bolletjes bevatten (voor neutravidine-biotine en neutravidine-ACE2-koppeling).
    5. Voeg 100 μl geiten-IgG-werkoplossing (17,5 μg/ml) toe aan het kuiltje met korrels dat is aangewezen als controles voor alleen geiten-IgG.
    6. Voeg 100 μL MES Buffer toe aan het putje dat is toegewezen als controle ongeconjugeerde kralen.
    7. Sluit de microtiterplaat af en incubeer gedurende 2 uur op een orbitale schudder (650 tpm) bij RT (18-22 °C) in het donker. Draai de plaat kort na 1 uur incubatie om ervoor te zorgen dat de kralen in suspensie blijven.
  6. Was de kralen met PBS-T.
    1. Centrifugeer de microtiterplaat bij 233 × g gedurende 1 min.
    2. Gekoppelde kralen immobiliseren op een magnetische platenscheider gedurende 30 s. Terwijl de microtiterplaat nog op de magnetische scheider is geplaatst, zuigt u het supernatans op uit de met magneten geïmmobiliseerde korrels.
    3. Verwijder de microtiterplaat van de magnetische scheider.
    4. Voeg 100 μL PBS-T toe aan elk putje met korrels.
    5. Herhaal de wasstappen 1.6.2-1.6.4 één keer voor in totaal twee wasbeurten met PBS-T.
  7. Bereid geconjugeerde kralen voor op opslag.
    1. Gekoppelde kralen immobiliseren op een magnetische platenscheider gedurende 30 s. Terwijl de microtiterplaat nog op de magnetische scheider is geplaatst, zuigt u het supernatans op uit de met magneten geïmmobiliseerde korrels. Verwijder de microtiterplaat van de magnetische scheider.
    2. Voeg 50 μL opslagbuffer toe aan elke microbollet-ID om de resterende parelactiviteit te doven.
    3. Incubeer de microtiterplaat bij koelkasttemperaturen (4-8 °C) in het donker 's nachts (16-22 uur).
    4. Breng ongeconjugeerde en geit-IgG-geconjugeerde kralensuspensies (50 μl) over naar correct geëtiketteerde 1,5 ml laag-eiwitbindende microfuge-buisjes, gecombineerd met twee 100-μL opslagbufferspoelingen van de putjes om maximaal parelherstel te garanderen.
      OPMERKING: Ongeconjugeerde en geiten IgG-geconjugeerde kralen zullen beide nummer 5 × 105 hebben in een eindvolume van 250 μL (d.w.z. 2 × 103 kralen/μL). Bewaar de microfuge-buizen bij koelkasttemperaturen (4-8 °C) tot gebruik.
  8. Bind gebiotinyleerd ACE2 en biotine aan neutravidine-geconjugeerde korrels.
    1. Bereid de recombinante humane gebiotinyleerde ACE2-werkoplossing in een dosis van 18 μg/ml ACE2 in 10 mM PBS. Per reactie is 100 μL nodig. Bereid de biotine-werkoplossing voor in 2,4 mg/ml biotine in 10 mM PBS. Per reactie is 100 μL nodig.
    2. Bereid de microtiterplaat voor die neutravidine-geconjugeerde microsferen bevat.
      1. Immobiliseer de microsferen gedurende 30 s op een magnetische platenscheider. Terwijl de microtiterplaat nog op de magnetische scheider is geplaatst, verwijdert u de plaatafdichter en zuigt u het supernatans op uit met magneten geïmmobiliseerde microsferen.
      2. Verwijder de microtiterplaat van de magnetische scheider en voeg 50 μL 10 mM PBS/putje toe.
      3. Herhaal stap 1.8.2.1-1.8.2.2 één keer.
    3. Voeg 100 μl van de gebiotinyleerde-ACE2-werkoplossing toe aan geschikte putjes die neutravidine-geconjugeerde microsferen bevatten. Voeg 100 μl van de biotine-werkoplossing toe aan geschikte putjes die neutravidine-geconjugeerde microsferen bevatten.
    4. Sluit de microtiterplaat af en incubeer gedurende 1 uur op een orbitale schudder (650 tpm) bij RT (18-22 °C) in het donker.
  9. Was de microsferen zoals beschreven in de stappen 1.6.1-1.6.5.
  10. Bereid de met ACE2 en biotine geconjugeerde microsferen voor en bewaar ze zoals beschreven in de stappen 1.7.1-1.7.4.
    OPMERKING: Gebiotinyleerde ACE2- en biotine-geconjugeerde parels zullen beide nummer 5 × 105 hebben in een eindvolume van 250 μL (d.w.z. 2 × 103 kralen/μL).

2. Conjugatie test

  1. Bereid een kralenmengsel voor door alle vier de soorten microsferen die in sectie 1 zijn gemaakt te combineren (d.w.z. neutravidine-geconjugeerd gebiotinyleerd ACE2, neutravidine-geconjugeerd biotine, geit IgG-geconjugeerd en niet-geconjugeerd).
    OPMERKING: Voorraad microsferen werden bewaard bij 2 × 103 kralen/μL en zodanig gecombineerd dat de uiteindelijke parelconcentratie in het werkende kralenmengsel 40 kralen van elke set/μL is.
    1. Bereken het volume van het werkparelmengsel dat nodig is voor het testen (5 μl/reactie), zodat het extra volume de pipetteerverliezen kan opvangen. Draai elke buis kort een draairol en combineer gelijke berekende volumes van elke parelsuspensie in een nieuwe microfuge-buis met een laag eiwitgehalte. De parelconcentratie is nu 400 kralen van elke set/μL.
    2. Maak het werkparelmengsel door de gecombineerde kralensuspensie nog eens 10 keer te verdunnen met opslagbuffer (40 van elke set/μL werkconcentratie).
      OPMERKING: Maak eerst een kleine hoeveelheid werkparelmengsel om het aantal microbolletjes/μL voor elke ID te schatten.
  2. Incubeer de microsferen met anti-ACE2-antilichaam van geiten.
    1. Pipetteer 5 μl van het werkende parelmengsel in 3 putjes van een microtiterplaat met platte bodem en een halfputje en 96 putjes.
    2. Voeg 50 μL geitenanti-ACE2 (0,4 μg/ml verdund in PBS-T, Materiaaltabel) elk toe aan de 3 putjes met parels in de microtiterplaat. Sluit de microtiterplaat, vortex af en incubeer op een orbitale shaker (650 rpm) bij RT (18-22 °C) gedurende 1 uur in het donker.
  3. Pulseer gedurende 1 minuut op 233 × g langs de microtiterplaat en was de microsferen driemaal met PBS-T zoals beschreven in 1.6.2-1.6.4.
  4. Incubeer microsferen met detectie-antilichamen.
    1. Pipetteer 5 μL van het werkende parelmengsel in 6 nieuwe putjes van de microtiterplaat.
    2. Bereid 1 μg/ml elk van de werkende detectiemengsels: anti-geit IgG PE, anti-muis IgG PE en anti-konijn IgG PE in 3 afzonderlijke buisjes van 1,5 ml, met PBS-T als verdunningsmiddel.
    3. Voeg 50 μL van de detectiemengsels toe aan elk 3 putjes, en het anti-geiten IgG wordt toegevoegd aan dezelfde putjes als het anti-ACE2 uit stap 2.2.
    4. Afdichten, vortexen en incuberen op een orbitale shaker (650 tpm) bij RT (18-22 °C) gedurende 30 minuten.
  5. Pulseer gedurende 1 minuut op de plaat bij 233 × g en was de microsferen driemaal met PBS-T zoals beschreven in 1.6.2-1.6.4.
  6. Voeg 100 μL PBS-T toe en voer uit op het flowanalyse-instrument met dubbele verslaggever met de volgende instellingen:
    Modus: Dubbele verslaggever; Time-out: 45 s; DD-gating: 7500-17500; Minimaal aantal microbolletjes: 100 microsferen/set (laagste QC-cut-off: 35 microsferen/set).

3. Productie van met SARS-CoV-2 geïnfecteerde celsupernatans

Het SARS-CoV-2-virus wordt vermeerderd in gastheer Vero E6-cellen (apennierepitheelcellijn; ATCC; Tabel met materialen). Vero E6-cellen worden gekweekt in Modified Eagles medium (MEM) bij 37°C in een atmosfeer van 5% CO2 en 95% relatieve vochtigheid. Elke liter MEM wordt aangevuld met 10 ml L-glutamine (200 mM), 38 ml NaHCO3 (7,5%), 5 ml penicilline/streptomycine-oplossing en 50 ml foetaal runderserum (FCS); Tabel met materialen.

LET OP: Gebruik de juiste bioveiligheidsprocedures en -apparatuur bij het hanteren van SARS-CoV-2.

  1. Vero E6-cellen worden tot samenvloeiing gekweekt in twee weefselkweekkolven van 150 cm2 . Infecteer een fles met het SARS-CoV-2-virus en gebruik de andere nep-geïnfecteerde als controle.
  2. Meng ongeveer 100.000 wildtype (WT) SARS-CoV-2 infectieuze deeltjes met 5 ml Eagles MEM medium.
  3. Zuig het medium op uit een kolf van 150 cm2 en voeg 55 ml volledige MEM toe om niet-geïnfecteerde controlesupernatanten te genereren. Zuig het medium uit de andere kolf van 150 cm2 op en voeg het virusmengsel toe aan de cellen. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 °C. Schud de kolf elke 15 minuten lichtjes om het virus te verspreiden.
  4. Voeg 50 ml volledig MEM-medium toe aan de kolf met SARS-CoV-2 toegevoegd en incubeer de cellen totdat cytopathische effecten worden waargenomen, waarbij de kolven elke 24 uur visueel worden geëvalueerd.
    OPMERKING: Het duurt ongeveer 3-4 dagen na infectie voordat cytopathie optreedt. Cytopathische effecten op de monolaagstructuur van de Vero E6-cel (bijv. celretractie, crenatie, afronding, de-adhesie, verlies van intracytoplasmatische granulariteit, openlijke lysis) worden kwalitatief beoordeeld door de cellen te observeren met behulp van een omgekeerd lichtmicroscoop, volgens de richtlijnen van de International Standardization Organization voor in vitro cytotoxiciteitstesten16.
  5. Verzamel het celsupernatans uit beide kolven en draai gedurende 6 minuten bij 253 × g om celresten te bezinken.
  6. UV-inactief SARS-CoV-2-virus in celsupernatans
    1. Pipetteer 0,5 ml supernatans per putje op 12 putjes in een microtiterplaat met 24 putjes. UV-bestraal de microtiterplaat, zonder deksel, gedurende 30 s onder een geschikte ultraviolette lamp (Materiaaltabel).
      OPMERKING: Virale inactivatie in celsupernatans moet worden vastgesteld door te proberen het virus te vermeerderen in Vero E6-celculturen.
  7. Doe het celsupernatans in buisjes van 1,5 ml en bewaar het bij -20 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Het celsupernatans kan worden bewaard bij -80 °C.

4. Analyse: Detectie van SARS-CoV-2-virale deeltjes in celsupernatans

  1. Bereid Assays Buffer voor door 0,1% caseïne, 0,5% polyvinylalcohol, 0,8% polyvinylpyrrolidon en 1% BSA (alle w/v) (pH 7) te mengen. Bereid de monsterverdunningsbuffer voor door 10% konijn IgG in assaybuffer te bereiden.
  2. Bereken en bereid het volume van het werkende parelmengsel (stap 2.1) voor dat nodig is voor het testen (5 μL/reactie), waarbij u rekening houdt met het overtollige volume om pipetteerverliezen op te vangen.
  3. Bereid bovendrijvende verdunningsreeksen voor. Bereken de benodigde bovendrijvende volumes. Test elk verdunningspunt in drievoud putjes voor elk van de vijf scFv's, wat resulteert in 15 putjes per verdunningspunt en monstertype. Gebruik 45 μl verdunde supernatanten in elk putje, voor een totaal van 675 μl dat nodig is; een enkele microfuge-tube van 1.5 ml voor elk van SARS-CoV-2 en controle-supernatanten is voldoende.
    1. Ontdooi SARS-CoV-2-supernatanten en controle-supernatanten bij 4 °C gedurende ten minste 1 uur. Bewaar de supernatanten en hun verdunningen koud (2-8 °C) tot gebruik. Label en rangschik acht microfuge-buisjes van 1.5 ml elk voor SARS-CoV-2 en controlesupernatanten.
      OPMERKING: De hoogste geteste concentratie is een 1:1 (2-voudige) supernatansverdunning, waaruit een reeks 1:2 (3-voudige) verdunningen zal worden gemaakt met behulp van monsterverdunningsbuffer, waarbij de hoogste verdunning een verdunning van 1:1458 is. Blanco's die monsterverdunningsbuffer bevatten, dienen alleen als niet-aanvullende controles. Zo zullen geteste verdunningen van elk type supernatans (SARS-CoV-2 of controle) 2, 6, 18, 54, 162, 486 en 1458 keer zijn, met een controle met alleen buffers.
    2. Voeg Sample Dilution Buffer toe aan de geëtiketteerde microfuge-buizen. De 1:1 (2-voudige) verdunningsbuisjes hebben 600 μL buffer nodig en de overige buisjes hebben 800 μL buffer nodig. Creëer de hoogste verdunning (1:1; 2-voudig) van elk supernatans door 600 μL van het supernatans te combineren met 600 μL monsterverdunningsbuffer in correct geëtiketteerde buisjes, gevolgd door de buis kort te vortexen om te mengen.
    3. Vervolg de reeks door achtereenvolgens 400 μl van de 1:1 (2-voudige) verdunde supernatanten over te brengen naar de volgende verdunningsbuis (d.w.z. 6-voudige verdunning) en ga door met 3-voudige verdunningen totdat de laagste verdunning (1458-voudig) is gecreëerd. Draai kort elk verdund supernatans voordat u verder gaat met de volgende verdunning.
  4. Incubeer de microsferen met de supernatant.
    1. Draai het vooraf bereide werkende kralenmengsel gedurende 30 s om de microbolletjes te resuspenderen en voeg 5 μl van het kralenmengsel toe aan elk toegewezen putje van een microtiterplaat met platte bodem van 384 putjes.
      OPMERKING: er kunnen ook platen met 96 putjes worden gebruikt.
    2. Voeg 45 μl van de bereide bovendrijvende verdunningen toe aan de toegewezen putjes met microsferen in de plaat met 384 putjes. Sluit de plaat af en incubeer een nacht (16-22 uur) op een orbitale schudder (650 tpm) bij RT (18-22°C) in het donker.
  5. Was overtollig supernatans van kralen.
    1. Verwijder de microtiterplaat van de orbitale shaker en verwijder de plaatsealer. Centrifugeer de plaat op 931 x g gedurende 1 min.
    2. Immobiliseer de kralen door de microtiterplaat gedurende 30 s op een magnetische plaatscheider te plaatsen. Terwijl de microtiterplaat nog op de magnetische scheider is geplaatst, verwijdert u de plaatafdichter en zuigt u het supernatans op uit de met magneten geïmmobiliseerde korrels.
    3. Verwijder de microtiterplaat van de magnetische scheider.
    4. Voeg 60 μL PBS-T toe aan elk putje met korrels.
    5. Herhaal de wasstappen 4.5.2-4.5.4 twee keer voor in totaal drie PBS-T-wasbeurten.
  6. Bereid de verschillende detectiemengsels in aparte buisjes van 1,5 ml. Elke detectiemix bestaat uit een commercieel humaan monoklonaal anti-S1 (Hu-anti-S1) antilichaam (1 μg/ml) en een van de vijf verschillende FLAG-gelabelde scFv's (1 μg/ml) (aanvullend bestand 1, aanvullende tabel 1 en aanvullende tabel 2) gericht op het spike-eiwit op het SARS-CoV-2-deeltje, verdund in Assay Buffer (stap 4.1), wat resulteert in in totaal vijf verschillende detectiemixen.
  7. Herhaal de stappen 4.5.2-4.5.3. Resuspendeer de gewassen microsferen in 50 μl/putje van de juiste scFv-specifieke Spike Detection Mix. Sluit de microtiterplaat af en incubeer gedurende 1 uur op een orbitale schudder (650 tpm) bij RT (18-22 °C) in het donker.
  8. Centrifugeer de microtiterplaat bij 931 × g gedurende 1 min. Was overtollig Spike Detection Reagens van de kralen. Voer drie wasstappen uit met 60 μL PBS-T volgens de stappen 4.5.2-4.5.5.
  9. Incubeer microsferen met een fluorescerend detectie-antilichaammengsel.
    1. Bereid een fluorescerende oplossingsmix bestaande uit in de handel verkrijgbaar PE-geconjugeerd anti-humaan IgG samen met BV421-geconjugeerd anti-FLAG-antilichaam verdund in de analysebuffer, met werkconcentraties van respectievelijk 0,2 μg/ml en 1 μg/ml. Per reactie is 50 μL fluorescerend detectiereagens nodig.
    2. Herhaal de stappen 4.5.2-4.5.3. Resuspendeer de microsferen in 50 μl/putje Fluorescent Solution Mix. Sluit de microtiterplaat af en incubeer gedurende 30 minuten op een orbitale schudder (650 tpm) bij RT (18-22 °C) in het donker.
  10. Draai de microtiterplaat af bij 931 × g gedurende 1 min. Was overtollige fluorescerende oplossingsmix van de microbolletjes. Voer drie wasstappen uit met 60 μL PBS-T volgens de stappen 4.5.2-4.5.5.
  11. Suspendeer de microsferen in 60 μL PBS-T vanaf de laatste wasstap. Analyseer de plaat op een flowanalysesysteem met twee reporters met de instellingen die worden beschreven in stap 2.6.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conjugatie test
De conjugatietest toonde aan dat geit-IgG en neutravidine-gebiotinyleerd ACE2 met succes waren geconjugeerd aan de microsferen. De specificiteit van de testdetectie werd bevestigd door ACE2-geconjugeerde microsferen te testen met PE-gelabelde secundaire antilichamen die in verschillende diersoorten werden gegenereerd (Figuur 2). Er werd geen kruisreactiviteit waargenomen tussen de verschillende detectie-antilichamen. Wanneer de korrelmengsels werden gesondeerd met geitenanti-ACE2 + anti-geiten IgG PE, werd een mediane fluorescentie-intensiteit (MFI; willekeurige eenheden) boven de achtergrond gedetecteerd voor zowel ACE2 als geiten-IgG-geconjugeerde microsferen, maar niet voor de niet-geconjugeerde microsfeer (kaal) of voor de met biotine beklede microsferen. Anti-muis IgG PE en anti-konijn IgG PE werden gebruikt als negatieve controles om te controleren op vals-positieve signalen. Een verwaarloosbaar fluorescentiesignaal werd gegenereerd bij incubatie met de microsferen, wat aangeeft dat de positieve signalen voor de ACE2 en het geit IgG specifiek waren.

Detecteerbaarheid van virale deeltjes in celsupernatanten
Magnetische kralen gekoppeld aan recombinant humaan ACE2 werden gebruikt om SARS-CoV-2-virale deeltjes van geïnfecteerde en controle- (geen virus) VeroE6-celcultuursupernatanten op te vangen en vervolgens tegelijkertijd te onderzoeken op twee verschillende virale spike-regio's met behulp van een monoklonaal antilichaam en een van de vijf verschillende scFvs. Een concentratieafhankelijk signaal in de verdunningen van met SARS-Cov-2 geïnfecteerde celsupernatanten werd waargenomen in beide reporterkanalen (RP1 en RP2) (Figuur 3), wat aangeeft dat zowel het commerciële Hu-anti-S1-antilichaam als de verschillende scFvs het virale deeltje detecteerden dat aan de ACE2-geconjugeerde microsfeer was gebonden. Bij drie van de vijf scVv's is het virus detecteerbaar in verdunningen tot 1:18 (scFv2, scFv3, scFv5); voor de overige twee scVV's (scFv7 en scFv9) is het detecteerbaar tot 1:6 verdunningen. Dit kan te wijten zijn aan een andere affiniteit voor het doelwit. Zoals te zien is in figuur 3 en tabel 1, biedt scFv3 de hoogste MFI-intensiteit, gevolgd door respectievelijk scFv5, scFv2, scFv7 en scFv9.

Wereldwijd resulteert scFvs-detectie in een lagere MFI in vergelijking met de Hu-anti-S1. Dit kan duiden op een lagere affiniteit, maar het kan ook een artefact zijn vanwege de etikettering met verschillende fluorescerende kleurstoffen (PE en BV421). Een andere trend die te zien is voor scFv7 en scFv9 is dat de MFI-waarden ook iets lager zijn voor het RP1-kanaal (anti-spike) in vergelijking met de andere drie configuraties. Dit zou erop kunnen duiden dat de scFv's ofwel kruisreageren of op een andere manier interfereren met de ACE2-Hu-anti-S1-interactie, wat ook het lagere signaal in het RP2-kanaal zou kunnen verklaren. Er werden geen virale deeltjes gedetecteerd in het supernatans van de niet-geïnfecteerde Vero E6-cellen in het RP1- of het RP2-kanaal.

De neutravidine-biotine geconjugeerde microsfere, de geit-IgG-microsfeer en de niet-geconjugeerde microsferen worden gebruikt als negatieve controlekorrels. De virale deeltjes werden gevangen met magnetische microsferen gekoppeld aan ACE2 en getest met commerciële menselijke anti-spike in het RP1-reporterkanaal en met verschillende scFvs in het RP2-reporterkanaal (scFv wordt aangegeven in de linkerbovenhoek van elk paneel). Er werden geen virusdeeltjes gedetecteerd in een van de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde monsters.

Precisie en robuustheid van de test
Om de nauwkeurigheid van de test te beoordelen, werden alle voorwaarden in drievoud uitgevoerd. Voor elk verdunningspunt werd een variantiecoëfficiënt (CV) voor de ACE2-microsfeer berekend. Alle berekende CV's voor de test waren lager dan 15%, waarbij de hoogst gemeten CV 13% was en de laagste CV 1% (tabel 2). Zoals te zien is in de dichtheidsgrafiek (figuur 4) van het RP1-kanaal, vertoont PE-detectie van de commerciële Hu-anti-S1 een hogere precisie, voornamelijk geconcentreerd rond een CV van 3%. Het RP2-kanaal, BV-detectie van scFV's, laat hogere CV's zien. Zoals te zien is in tabel 2, wordt het hogere bereik van CV's echter bepaald door de monsters met lage concentraties virale deeltjes, zoals de blanco. Om de robuustheid van het protocol te testen, werd de test twee keer herhaald door verschillende operatoren, met behulp van korrelmengsels die op verschillende dagen waren gegenereerd en een lager monstervolume (72% lager). Een zeer goede Pearson-correlatie, variërend tussen 0,98 en 1, werd waargenomen voor zowel de RP1- als de RP2-kanalen (p-waarde < 0,01), wat de robuustheid van de test bevestigt en de mogelijkheid om de test toe te passen wanneer er minder monster beschikbaar is (figuur 5). Deze flowanalysetechnologie volgt de "ambient analyte theory"17, waardoor de test gevoelig is voor concentratie, maar niet voor volume.

figure-results-1
Figuur 1: De virusdeeltjesanalyse. (A) Celsupernatans van zowel geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde Vero E6-cellen wordt in een seriële verdunning toegevoegd aan een plaat met 96 putjes of 384 putjes, samen met magnetische microsferen geconjugeerd met neutravidine, en vervolgens gekoppeld aan gebiotinyleerd humaan ACE2 of biotine. Niet-geconjugeerde microsferen in combinatie met geiten-IgG en kale microsferen worden gebruikt als negatieve controles, samen met de met neutravidine-biotine geconjugeerde microsferen. (B) Gevormde microsfeer-virusdeeltjescomplexen worden gedetecteerd met een detectiecocktail bestaande uit Hu-anti-S1 en een van de verschillende scFv's met FLAG-tag. Vervolgens wordt een fluorescerende mix toegevoegd met anti-humaan IgG PE gericht op de Hu-anti-S1 en anti-FLAG Brilliant Violet 421 gericht op de scFvs. (C) Het dubbele detectiesysteem met drie lasers zendt een rode, groene en violette laser uit om het microdeeltjescomplex te detecteren. De rode laser detecteert het kleurstoflabel van de microsfeer, terwijl de groene en violette lasers respectievelijk de anti-S1 en de scFvs detecteren. De gegenereerde gegevens worden vervolgens geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Grafiek ter bevestiging van de vervoeging. De kralenmengsels bestonden uit vier verschillende microsferen-ID's, elk geconjugeerd met een ander eiwit: neutravidine-biotine-ACE2 (ACE2), ongeconjugeerde microsfeer (Bare Bead), neutravidine-biotine (Biotine) en geit-IgG (Goat IgG). In de conjugatietest werden drie verschillende configuraties van detectiefluoroforen gebruikt. Namelijk geit anti-ACE2 + anti-geit IgG PE, anti-muis IgG PE en anti-konijn IgG PE. De Y-as toont het gemiddeld gemeten MFI-signaal (mediane fluorescentie-intensiteit; willekeurige eenheden) van elke microbol met de drie verschillende omstandigheden. De X-as toont de verschillende aangebrachte antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Meervoudige detectie van oppervlakte-eiwitten. Y-as: Gemiddelde MFI (mediane fluorescentie-intensiteit; willekeurige eenheden ± standaarddeviatie) voor elk monster, geanalyseerd in drievoud per toestand. X-as: Seriële verdunningspunten van celsupernatant. Oranje: Virusdeeltjes in supernatans van Vero E6 geïnfecteerd met SARS-CoV-2 WT gedetecteerd met menselijke anti-spike + anti-menselijke PE (fycoerythrin). Blauw: Supernatans van Vero E6 geïnfecteerd met SARS-CoV-2 WT gedetecteerd met de verschillende scFvs + anti-FLAG Brilliant Violet 421. Grijs: Niet-geïnfecteerd celsupernatans gedetecteerd met humane anti-spike + anti-humane PE. Zwart: Niet-geïnfecteerd celsupernatant gedetecteerd met de vijf verschillende scFvs + anti-FLAG Brilliant Violet 421. De virale deeltjes werden gevangen met magnetische microsferen gekoppeld aan ACE2 en getest met commerciële menselijke anti-spike-antilichamen in het RP1-reporterkanaal en met verschillende scFv's in het RP2-reporterkanaal (scFv wordt aangegeven in de linkerbovenhoek van elk paneel). Er werden geen virusdeeltjes gedetecteerd in een van de niet-geïnfecteerde monsters. Het epitoop waarop scFv3 zich richtte, had de hoogste affiniteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Variatie dispersie plot. De Y-as is de frequentie van gebeurtenissen en de X-as toont de variantiecoëfficiënt (CV) in percentage voor elke replicatie van de verschillende monsters. RP1 en RP2 zijn de eerste en tweede reporterkanalen die fluorescentie detecteren die verband houden met respectievelijk phycoerythrin en Brilliant Violet 421. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Correlatiematrix voor runs. (A,B) Y-as: Pearson-correlatiematrix op log10-schaal tussen drie afzonderlijke runs, uitgevoerd door drie verschillende operators en met verschillende kraalmengsels. In de derde run werd een lager monstervolume aangebracht. De histogrammen tonen de verdeling van de verschillende variabele clusters op basis van gemeten MFI. (A) Correlatie voor het RP1-reporterkanaal tussen de verschillende runs. (B) Correlatie voor het RP2-reporterkanaal tussen de verschillende runs. MFI = mediane fluorescentie-intensiteit in willekeurige eenheden. p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OpsporingReactiviteit
scFv2++
scFv3+++
scFv5++
scFv7 zei:+
scFv9 zei:+
Menselijke anti-Spike IgG++++

Tabel 1: Rangschikking van scFv's in detectie op basis van de MFI-intensiteit verkregen in de standaardcurves.

RP1 (PE)RP2 (BV421)
Monster verdunningCV-bereik [%]CV-bereik [%]
Blanco3–112–13
1:14581–72–7
1:4564–63–8
1:1623–63–7
1:542–42–4
1:182–41–4
1:62–61–6
1:21–51–3

Tabel 2: CV% (gemiddelde/standaarddeviatie × 100) van elk verdunningspunt van het met SARS-CoV-2 geïnfecteerde supernatans voor zowel de RP1- als de RP2-reporterkanalen.

Aanvullend bestand 1: Immunoglobuline single-chain variable fragment (scFv) generatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 1: Screening van scFv's in paren met Fabs tegen seriële verdunning van recombinant Spike (RBD). Om de prestaties van verschillende detectiepeptiden te evalueren, werden 12 combinaties van spike-eiwit, Fab, gebruikt als vangst in buffer verrijkt met recombinant RBD. Tien (10) scFv's gericht op verschillende epitopen van het spike-eiwit werden toegepast als detectie. Afhankelijk van de prestaties van het opname-detectiepaar werden ze gemarkeerd als mislukt (-) of succesvol (+). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Screening van scFvs in paren met Fabs tegen seriële verdunning van met SARS-Cov-2 geïnfecteerde Calu-3-celsupernatant. Voor de evaluatie van de prestaties van verschillende detectiepeptiden werden 12 combinaties van spike-eiwit, Fab, gebruikt als vangst in SARS-Cov-2-geïnfecteerde Calu-3-celsupernatant. Tien (10) scFv's gericht op verschillende epitopen van het spike-eiwit werden toegepast als detectie. Afhankelijk van de prestaties van het opname-detectiepaar werden ze gemarkeerd als mislukt (-) of succesvol (+). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is gebleken dat multiplextechnologie op basis van kralen een waardevol platform is voor de detectie van pathogenen met een hoge doorvoer in een aantal klinische toepassingen. De hoge flexibiliteit van het platform, gebaseerd op flowcytometrieprincipes, maakt het mogelijk om antilichamen, eiwitten en nucleïnezuren 18,19,20,21,22 te targeten, waarbij honderden analyten tegelijkertijd worden gemultiplext. Voor zover wij weten, is deze technologie echter nog niet eerder toegepast om intacte virale deeltjes te detecteren. In dit rapport werd de technologie toegepast voor de detectie van intacte virale deeltjes door zich te richten op drie onafhankelijke oppervlakte-epitopen van SARS-CoV-2.

Omhulde RNA-virussen vertonen een hoge structurele gelijkenis met extracellulaire vesikels (EV's), kleine fosfolipidemembranen die viraal RNA en eiwitten dragen, samen met gastheereiwitten23. Sandwich-immunoassays zijn eerder toegepast op de detectie van EV's, met behulp van een antilichaampaar gericht op twee verschillende oppervlakte-eiwitten24,25. De beperking van sandwichtests om tegelijkertijd slechts twee eiwitten te detecteren, wordt opgeheven met multiplexbenaderingen die de gelijktijdige detectie van meer dan twee eiwitten per reactie mogelijk maken.

Het detectiesysteem met drie lasers en dubbele reporters dat hier wordt beschreven, is tot nu toe het meest geavanceerde op kralen gebaseerde stroomanalyse-instrument. Met betrekking tot uitleessystemen met één verslaggever maakt de dubbele verslaggever (RP1- en RP2-kanalen) de detectie van drie oppervlakte-eiwitten/epitopen parallel mogelijk. Het richten op meerdere virale oppervlakte-eiwitten en epitopen biedt een nauwkeurigere weergave van de virale eiwitbelasting, wat, naast de bevestiging dat het virus in feite intact is, ook de mogelijkheid biedt om virale oppervlakte-antigenen en de mechanismen van de interacties tussen virussen en gastheereiwitten verder te onderzoeken.

Tijdens de COVID-19-pandemie was het belang van het snel identificeren van personen die actieve virale deeltjes bij zich droegen belangrijk bij de inspanningen om de verspreiding van het virus in te dammen. Genoom-RNA wordt gedetecteerd door kwantitatieve RT-PCR, ongeacht de oorsprong ervan (intacte virusdeeltjes of vrij). Alleen een intact omhulsel met toegankelijk S-eiwit kan echter het binnendringen van cellen en de daaropvolgende virusreplicatie bemiddelen. Eerdere studies met microfluïdische chips in patiëntmonsters hebben aangetoond hoe de detectie van intacte virale deeltjes in combinatie met point-of-care-testen frequent testen en verbeterd toezicht op de verspreiding van ziekten mogelijk zou maken, inclusief een beter geïnformeerde keuze van personen die in quarantaine moeten worden geplaatst26. De toepassing van een gemultiplexte test op basis van microsferen zou het mogelijk maken om assays te ontwerpen die gericht zijn op het screenen van meerdere virussen en hun oppervlakte-antigeenvarianten, waardoor een nauwkeuriger beeld wordt verkregen van de verspreiding van het virus in de populatie.

Flowvirometrie is een recente ontwikkeling van flowcytometrie gericht op de analyse van virale deeltjes. Ondanks dat ze in staat zijn om discrete virale deeltjes te detecteren, vormt de analyse van kleine virussen een actueel probleem voor flowvirometrie27,28. Net als bij de hier beschreven methode, omvat flowvirometrie het vangen van intacte virionen door gouden nanodeeltjes gekoppeld aan antilichamen. Beperkingen voor beide methoden zijn onder meer (i) de afhankelijkheid van reagentia voor het opvangen en detecteren van hoge affiniteit voor aan het oppervlak tot expressie gebracht antigeen waarop de microsferen of nanodeeltjes zich richten, (ii) beperkt vermogen om onderscheid te maken tussen virusdeeltjes en extracellulaire blaasjes, en (iii) gebrek aan normen voor de juiste kwantificering van deeltjes.

Cellen scheiden EV's af in hun omgeving, en wanneer ze worden geïnfecteerd door een virus, kunnen ze ook virionen afscheiden die even groot zijn als de EV's en uiteindelijk dezelfde antigenen tot expressie brengen29. Omdat de EV's een vergelijkbare membraansamenstelling hebben als het virus, kan het moeilijk zijn om ze van elkaar te onderscheiden met alleen op affiniteit gebaseerde methoden, zoals de dual laser single-reporter-benadering. De hier beschreven strategieën hebben echter een hogere multiplexcapaciteit, waardoor een breder en dieper onderzoek naar de eiwitsamenstelling van deeltjes mogelijk is. Op stroming gebaseerde methoden maken het mogelijk om discrete deeltjes te volgen, wat mogelijkheden biedt voor digitale kwantificering. Een strategie om het kwantificeringsprobleem in onze methode aan te pakken, zou zijn om goed gekarakteriseerde synthetische blaasjes te gebruiken die antigenen tot expressie brengen die van belang zijn als virusachtige deeltjes (VLP's) voor het opstellen van standaardcurves.

Een veel voorkomende route van in- en uitgang van SARS-CoV-2 uit de gastheercellen is door de interactie van het virus en het gastheercelmembraan 2,15. In dit proces is de kans groot dat gastheermembraaneiwitten in het virusoppervlak worden opgenomen. Door opgenomen gastheereiwitten te screenen, kan men de route van de infectie volgen en mogelijk het ziekteverloop voor verschillende risicopatiënten voorspellen, waardoor eerdere behandelingsbeslissingen kunnen worden genomen. Het maakt ook de karakterisering van de virussen over verschillende monsterbatches in onderzoekslaboratoria mogelijk. Dit kan verder worden onderzocht door te testen of verschillende kenmerken verband houden met verschillende niveaus van virale besmettelijkheid en voor het screenen van antilichamen en geneesmiddelmoleculen die zich richten op virale oppervlakte-eiwitten.

Een belangrijk aspect van de beschreven methode is dat deze berust op de affiniteit van de vangst- en detectiereagentia tegen hun doeleiwitten op het virus. De keuze van affiniteitsreagentia is daarom een bepalende factor voor de prestaties van de test. Mogelijk moeten meerdere affiniteitsreagentia worden gescreend en getest op vangst en detectie om de reagentia met de hoogste affiniteit te selecteren. Hier werden de prestaties van tien scFv's en twaalf Fab-fragmenten voorlopig beoordeeld met behulp van recombinant RBD en op virale deeltjes van het supernatans van SARS-Cov-2-geïnfecteerde Calu-3-longepitheelcellen (VeroE6-cellen werden gebruikt om cytotoxiciteit te kweken/beoordelen in alle daaropvolgende onderzoeken). Anti-FLAG PE werd gebruikt om de FLAG-gelabelde scFvs te detecteren (aanvullende tabel 1 en aanvullende tabel 2). De vijf best presterende scFv's werden vervolgens geselecteerd om te worden toegepast in de dual-reporter-test, samen met commercieel Hu-anti-S1 (tabel 1), op supernatanten van geïnfecteerde VeroE6 Afrikaanse groene apennierepitheelcellen.

Een andere kritische factor voor het succes van het protocol is de procedure die is gekozen voor microsferenkoppeling. De koppelingsmethode moet efficiënt zijn en tegelijkertijd conformationele epitopen of aminozuurresiduen die betrokken zijn bij de eiwitbinding intact en ongewijzigd houden. Hier werd de EDC-NHS-reactie toegepast om neutravidine rechtstreeks aan microsferen te koppelen, waarbij een eerder beschreven protocol30 en een neutravidine + biotine-systeem werden aangepast om recombinant ACE2 aan de gekoppelde microsferen te binden. Alternatieve koppelingsmethoden en hun efficiëntie kunnen worden getest en vergeleken. Ten slotte werd waargenomen dat verschillende fluorescerend gelabelde detectiereagentia (bijv. anti-FLAG PE (fycoerythrin) en anti-FLAG Brilliant Violet 421) kunnen resulteren in verschillende MFI-niveaus die de testgevoeligheid kunnen beïnvloeden.

Concluderend maakt de beschreven methode de detectie van intacte virale deeltjes in oplossing mogelijk, waarbij een dual-reporter-strategie wordt toegepast. De analyse van drie parallelle oppervlaktedeterminanten biedt een specifieker hulpmiddel om virale deeltjes te karakteriseren en ze uiteindelijk te onderscheiden van andere EV's (bijv. die geen virale antigenen bevatten). Deze strategie is een alternatief voor flowvirometrie. Hoewel de huidige aanpak geen onderscheid maakt tussen deeltjesgroottes, bieden magnetische parelstrategieën met behulp van kleurgecodeerde microsferen een breder vermogen bij het profileren van oppervlakte-antigeenprofielen en experimenteel ontwerp door middel van high-multiplex en high-throughput-analyse. De test vertoont een hoge precisie en robuustheid en kan worden uitgebreid tot de analyse van elk type extracellulair blaasje en elk ander type biopdeeltje dat oppervlakteantigenen blootstelt in lichaamsvloeistoffen of andere vloeibare matrices. Dit was een proof-of-concept-studie die het nut aantoonde van het gebruik van scFvs als één detectiereagens in een multiplexanalyse van meerdere eiwitepitopen op virale deeltjes. Toekomstige studies zijn nodig om de specifieke kenmerken van scFv's te bepalen (bijv. bindingsaffiniteiten, kruisreactiviteit met andere reagentia en doelen) als ze voor kwantitatieve of klinische doeleinden moeten worden gebruikt.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij SciLifeLab, Zweden, erkennen we het Affinity Proteomics-Stockholm Scilifelab Unit-team voor het ontwikkelen en toepassen van de hier beschreven methode, de Human Antibody Therapeutics Unit voor het leveren van scFvs en Fab-reagentia, en Jonas Klingström voor de VeroE6-cellen die zijn geïnfecteerd met SARS-CoV-2-isolaten afkomstig van klinische monsters. De auteurs bedanken Sherry Dunbar, PhD, MBA van Luminex Corporation (Austin, TX), voor onderzoeksondersteuning, en Matt Silverman MSci, PhD van Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) voor wetenschappelijke en schriftelijke hulp. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Knut en Alice Wallenberg Foundation en Science for Life Laboratory (SciLifeLab) (VC2020-0015 aan Claudia Fredolini en Francesca Chiodi en VC-2022-0028 aan Claudia Fredolini).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ACE2-BiotinAcro Biosystems (Newark, DE)AC2-H82E6-25 ugConc: 340 µg/mL, LOT#BV35376-203HFI-2128
Anti-Goat IgG, PE-conjugatedJackson ImmunoResearch (West Grove, PA) 705-116-147Host species: Donkey 
Anti-Human IgG R-PE Life Technologies/Thermo Fisher (Waltham, MA)H10104Conc: 0.15 mg/mL, LOT#2079224, Host species: Goat
Anti-Mouse IgG, PE-conjugatedJackson ImmunoResearch (West Grove, PA) 115-116-146Host species: Goat 
Anti-Rabbit IgG, PE-conjugated Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) 111-116-144Host species: Goat 
BiotinThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)20RUO100 mM, pH 10 Conc. 1 mg/mL
Blocker Casein in PBSThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)37528LOT#VD301372
Blocker reagent for ELISA (BRE)Roche (Basel, Switzerland)11112589001
Brilliant Violet 421 anti-DYKDDDDK Tag Antibody (Anti-FLAG) 0.2 mg/ml, rat IgG2a, λBioLegend (Amsterdam, The Netherlands)637321
Bovine serum albumin (BSA)Saveen & Werner (Limhamn, Sweden)B2000-500LOT#04D5865
EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)Proteochem (Hurricane, UT)C1100-custom (65 mg)LOT# MK3857
Fetal calf serum (FCS)Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)10270-106
Goat anti-ACE2 polyclonal antibodyR&D Systems/Bio-Techne (Minneapolis, MN)AF933Host species: Goat 
Goat IgGBethyl Labs (Montgomery, TX)P50-200LOT#P50-200-6
L-glutamineThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)25030024
Low-bind 1.5 mL microfuge tubes VWR (Radnor, PA)525-0133
MagPlex-C MicrospheresLuminex Corporation (Austin, TX)MC10XXX-01
MEM tissue cuture mediaGibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)21430-020
Microplate, 96-Well, Polystyrene, Half-area, ClearGreiner Bio-One (Kremsmünster, Austria)675101
NaHCO3Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)25080-060
Neutravidin Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)31000LOT#UK292857
PBS tabletsMedicago AB (Uppsala, Sweden)09-9400-100LOT#272320-01
Penicillin/StreptomycinGibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)15140122
Poly(vinyl alcohol)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 360627
PolyvinylpyrrolidoneSigma-Aldrich (St. Louis, MO) 437190
ProClin 300Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 48915-U
Rabbit IgGBethyl Labs (Montgomery, TX)P120-301LOT#12
scFv-FAb1In-house productionHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc: 0.12 mg/mL.
scFv-FAb2In-house productionHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc batch1: 0.38 mg/mL. Conc batch2: 0.45 mg/mL
scFv-FAb3In-house productionHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc: 0.34 mg/mL.
scFv-FAb4In-house productionHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc: 2.85 mg/mL.
scFv-FAb5In-house productionHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Sweden. Monoclonal scFv. Conc:2.7mg/mL.
SARS-CoV-2 infectious particles, Swedish isolateIn-house production The Public Health Agency of Sweden
SARS-CoV-2 Spike Antibody (Hu-anti-S1)Novus Biologicals (Centennial, CO)NBP2-90980 Monoclonal antibody. Conc: 1 mg/mL. Host: Human. Clone: CR3022. Isotype: IgG1 Kappa. LOT#T201B06
Sodium phosphate monobasic, anhydrousSigma-Aldrich (St. Louis, MO) S3139
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)24510LOT# XH321563
TweenThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)BP337-50LOT#194435
Ultraviolet lampVilber Lourmat GmbH (Eberhardzell, Germany)VL-215.GWavelength = 254 nm; 2 × 15-watt bulbs
Vero E6 cellsATCC (Manassus, VA)CRL-1586
xMAP INTELLIFLEX DR-SE (dual-reporter flow instrument)Luminex Corporation (Austin, TX)INTELLIFLEX-DRSE-RUO

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rey, F. A., Lok, S. M. Common features of enveloped viruses and implications for immunogen design for next-generation vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
  2. V'kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  3. Burnie, J., et al. Flow virometry quantification of host proteins on the surface of HIV-1 pseudovirus particles. Viruses. 12 (11), 1296(2020).
  4. Gentili, M., et al. Transmission of innate immune signaling by packaging of cGAMP in viral particles. Science. 349 (6253), 1232-1236 (2015).
  5. Modrow, S., Falke, D., Truyen, U., Schätzl, H. Viruses: Definition, Structure, Classification. In Molecular Virology. , Springer. Berlin, Heidelberg. 163-181 (2013).
  6. Trinh, K. T. L., Do, H. D. K., Lee, N. Y. Recent advances in molecular and immunological diagnostic platform for virus detection: A review. Biosensors. 13 (4), 490(2023).
  7. Zamora, J. L. R., Aguilar, H. C. Flow virometry as a tool to study viruses. Methods. 134-135, 87-97 (2018).
  8. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  9. Byström, S., et al. Affinity proteomic profiling of plasma for proteins associated to area-based mammographic breast density. Breast Cancer Research. 20 (1), 14(2018).
  10. Rudberg, A. -S., et al. SARS-CoV-2 exposure, symptoms and seroprevalence in healthcare workers in Sweden. Nature Communications. 11 (1), 5064(2020).
  11. Liu, J., et al. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. Journal of Clinical Virology. 50 (4), 308-313 (2011).
  12. Gadsby, N. J., Hardie, A., Claas, E. C. J., Templeton, K. E. Comparison of the Luminex respiratory virus panel fast assay with in-house real-time PCR for respiratory viral infection diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 48 (6), 2213-2216 (2010).
  13. Lorenzen, E., et al. Multiplexed analysis of the secretin-like GPCR-RAMP interactome. Science Advances. 5 (9), (2019).
  14. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62487(2021).
  15. Jackson, C. B., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
  16. International Standardization Organization. ISO10993-5 Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. International Standardization Organization. , Geneva, Switzerland. Available from: https://nhiso.com/wp-content/uploads/2018/05/ISO-10993-5-2009.pdf (2009).
  17. Poetz, O., et al. Sequential multiplex analyte capturing for phosphoprotein profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (11), 2474-2481 (2010).
  18. Dunbar, S. A., Vander Zee, C. A., Oliver, K. G., Karem, K. L., Jacobson, J. W. Quantitative, multiplexed detection of bacterial pathogens: DNA and protein applications of the Luminex LabMAP system. Journal of Microbiological Methods. 53 (2), 245-252 (2003).
  19. Taniuchi, M., et al. Multiplex polymerase chain reaction method to detect Cyclospora, Cystoisospora, and Microsporidia in stool samples. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 71 (4), 386-390 (2011).
  20. Wu, M., et al. High-throughput Luminex xMAP assay for simultaneous detection of antibodies against rabbit hemorrhagic disease virus, Sendai virus, and rabbit rotavirus. Archives of Virology. 164 (6), 1639-1646 (2019).
  21. Dias, D., et al. Optimization and validation of a multiplexed Luminex assay to quantify antibodies to neutralizing epitopes on human papillomaviruses 6, 11, 16, and 18. Clinical and Vaccine Immunology. 12 (8), 959-969 (2005).
  22. Opalka, D., et al. Simultaneous quantitation of antibodies to neutralizing epitopes on virus-like particles for human papillomavirus types 6, 11, 16, and 18 by a multiplexes lumina assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 108-115 (2003).
  23. Nolte-'T Hoen, E., Cremer, T., Gallo, R. C., Margolis, L. B. Extracellular vesicles and viruses: Are they close relatives. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (33), 9155-9161 (2016).
  24. Ohmichi, T., et al. Quantification of brain-derived extracellular vesicles in plasma as a biomarker to diagnose Parkinson's and related diseases. Parkinsonism & Related Disorders. 61, 82-87 (2019).
  25. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. Elife. 10, e70725(2021).
  26. Gamage, S. S. T., et al. Microfluidic affinity selection of active SARS-CoV-2 virus particles. Science Advances. 8 (39), (2022).
  27. Renner, T. M., Tang, V. A., Burger, D., Langlois, M. -A. Intact viral particle counts measured by flow virometry provide insight into the infectivity and genome packaging efficiency of moloney murine leukemia virus. Journal of Virology. 94 (2), e01600-01619 (2020).
  28. Niraja, S., et al. A flow virometry process proposed for detection of SARS-CoV-2 and large-scale screening of COVID-19 cases. Future Virology. 15 (8), 525-532 (2020).
  29. Lippé, R. Flow virometry: A powerful tool to functionally characterize viruses. Journal of Virology. 92 (3), e01765(2018).
  30. Drobin, K., Nilsson, P., Schwenk, J. M. Highly multiplexed antibody suspension bead arrays for plasma protein profiling. Methods in Molecular Biology. 1023, 137-145 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Oppervlakte eiwitprofileringvirale partikelepitopenmultiplex flowcytometrieSARS CoV 2 partikelsimmunocapture met magnetische kralendetectie van spike eiwitantibody epitope mappinginteractie tussen gastheer en virushigh throughput screening

Gerelateerde artikelen