Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Stromale celisolatie van hematopoëtische organen

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66231

⸱

26 januari 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen die isolatie van stromale cellen uit muizenbot, beenmerg, thymus en menselijk thymusweefsel mogelijk maken die compatibel zijn met single-cell multiomics.

Samenvatting

Single-cell sequencing heeft het mogelijk gemaakt om heterogene celpopulaties in het stroma van hematopoëtische organen in kaart te brengen. Deze methodologieën bieden een lens waarmee eerder onopgeloste heterogeniteit bij steady state kan worden bestudeerd, evenals veranderingen in de representatie van celtypen veroorzaakt door extrinsieke spanningen of tijdens veroudering. Hier presenteren we stapsgewijze protocollen voor de isolatie van hoogwaardige stromale celpopulaties uit muizen en menselijke thymus, evenals muizenbot en beenmerg. Cellen die via deze protocollen zijn geïsoleerd, zijn geschikt voor het genereren van hoogwaardige single-cell multiomics-datasets. De effecten van monstervergisting, uitputting van hematopoëtische afstamming, FACS-analyse/sortering en hoe deze factoren de compatibiliteit met single-cell sequencing beïnvloeden, worden hier besproken. Met voorbeelden van FACS-profielen die wijzen op succesvolle en inefficiënte dissociatie en stroomafwaartse stromale celopbrengsten in post-sequencing-analyse, worden herkenbare aanwijzingen voor gebruikers gegeven. Het is van cruciaal belang om rekening te houden met de specifieke vereisten van stromale cellen voor het verkrijgen van hoogwaardige en reproduceerbare resultaten die de kennis in het veld kunnen bevorderen.

Inleiding

Bij de gezonde volwassene vindt de novo productie van bloedcellen plaats in het beenmerg en de thymus. Stromale cellen op deze plaatsen zijn essentieel voor het behoud van hematopoëse, maar stroma vormt minder dan 1% van het weefsel 1,2,3,4. Het verkrijgen van zuivere isolaten van hematopoëse-ondersteunend stroma vormt daarom een aanzienlijke uitdaging, met name voor eencellige multiomics die een snelle verwerking vereisen om monsters van hoge kwaliteit te verkrijgen. Componenten van verschillende spijsverteringscocktails kunnen bepaalde stappen in multiomics-analyse verstoren 5,6. De hier gepresenteerde protocollen beschrijven de isolatie van een grote verscheidenheid aan stromale cellen uit beenmerg- en thymusweefsel.

Verstoringen van stromale bestanddelen in zowel het beenmerg als de thymus leiden tot een ernstige verstoring van de ontwikkeling van bloedcellen en kunnen leiden tot maligniteiten 7,8,9. Hematopoëse-ondersteunend stroma is beschadigd na cytotoxische conditionering en beenmergtransplantatie, wat resulteert in verminderde secretie van cytokinen en groeifactoren die hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) ondersteunen2,10,11. Bovendien beïnvloedt veroudering de stromale cellen van het beenmerg en de thymus, wat waarschijnlijk bijdraagt aan verouderde hematopoëtische fenotypes. De thymus is het eerste orgaan dat uitgebreide leeftijdsgebonden involutie ondergaat. Vet en fibrotisch weefsel beginnen al bij het begin van de puberteit met het vervangen van T-celondersteunend stroma12,13. In het beenmerg neemt het gehalte aan adipocyten toe met de leeftijd en worden de vasculaire en endosteale niches aanzienlijk geremodelleerd 14,15,16.

Om studie van hematopoëse-ondersteunend stroma in meerdere stresstoestanden mogelijk te maken en in het geval van de thymus van zowel menselijk als muizenweefsel, hebben we eerder gepubliceerde spijsverteringsprotocollen geoptimaliseerd 1,2,8,17,18. Deze protocollen zorgen voor een efficiënte en reproduceerbare isolatie van cellen en zijn compatibel met single-cell RNAsequencing (scRNAseq) en andere soorten multiomics.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het werk met menselijk weefsel werd uitgevoerd na goedkeuring door de Massachusetts General Hospital Internal Review Board (IRB). Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). C57Bl/6 muizen, 8-10 weken oud, en zowel mannetjes als vrouwtjes, werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).

1. Bereiding van thymusweefsel bij muizen

  1. Bereid de volgende buffers en oplossingen voor.
    1. Medium 199 (M199) met 2% (v/v) foetaal runderserum (FBS) (zie materiaaltabel).
    2. Muizendissociatiecocktail: 0,5 WU/ml Liberase TM en 6,3 E/ml DNase I in M199 + 2% FBS (zie materiaaltabel).
    3. M199 met 2% (w/v) runderserumalbumine (BSA).
      OPMERKING: FBS-bevattend medium kan worden overgeschakeld naar BSA om de RNA-kwaliteit te verbeteren.
  2. Voer de dissectie van de muizenthymus uit
    1. Euthanaseer de muis door CO2 -verstikking (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) en leg hem op zijn rug. Maak de vacht op de borst nat door 70% ethanol te spuiten en ga verder met het openen van de borstholte.
    2. Ontleed de thymus voorzichtig door eerst met een chirurgische schaar een dwarse incisie te maken net onder de ribbenkast. Snijd de ribben aan weerszijden van de muis helemaal tot aan het sleutelbeen. Knip vervolgens het middenrif door zodat de borstwand kan worden losgemaakt. Til de ribben op met een pincet om de borstholte bloot te leggen.
      1. De thymus is een wit, bilobbulair orgaan, dat zich aan de bovenkant van de holte bevindt, net boven het hart. Houd de thymus vast met de tang en snijd voorzichtig door het bindweefsel dat de thymus op zijn plaats houdt. Doe het ontlede thymusweefsel in het putje van een 6-wells plaat met M199 + 2% FBS op ijs.
        OPMERKING: Bij het werken met verouderde of door straling geconditioneerde muizen of gemuteerde stammen met thymusdefecten, kan de thymus zo klein zijn dat een dissectiemicroscoop nodig is om het orgaan op betrouwbare wijze weg te snijden.
    3. Verwijder met behulp van een dissectiemicroscoop al het extrathymisch weefsel met een stompe pincet en een schaar met microveer.
  3. Voer enzymatische dissociatie van het thymusweefsel van muizen uit (30 minuten in stappen van 10 minuten)
    1. Plaats de schoongemaakte thymus in de dop van een tube van 15 ml en hak het weefsel fijn met een steriele chirurgische schaar.
      OPMERKING: Het fijnhakken van het weefsel in de dop van de buis die voor de spijsvertering moet worden gebruikt, minimaliseert weefselverlies als gevolg van overdracht van de ene container naar de andere. Dit is erg belangrijk bij het werken met verouderde of door straling geconditioneerde muizen of mutante stammen met thymusdefecten. De kleine thymus in deze omgevingen maakt het noodzakelijk om het verlies van materiaal waar mogelijk te verminderen.
    2. Voeg 2 ml muizendissociatiecocktail toe aan de buis van 15 ml, bevestig de dop met de stukjes thymus en keer 5 keer om ervoor te zorgen dat het weefsel opnieuw in de dissociatiecocktail wordt gesuspendeerd.
    3. Om lekkage te voorkomen, wikkelt u de dop van de buis in paraffinefolie. Plaats de buis vervolgens horizontaal in een waterbad van 37 °C met 250 tpm schudden. Incubeer gedurende 10 min.
      OPMERKING: Het succes van het verteringsprotocol hangt af van de incubatie die wordt uitgevoerd bij 37 °C en met agitatie. Het beschreven protocol is geoptimaliseerd met behulp van een schudwaterbad. Als dat niet beschikbaar is, kunnen andere benaderingen die agitatie in een verhitte omgeving mogelijk maken, werken, maar we raden aan om het protocol eerst voor deze instellingen te optimaliseren.
    4. Plaats de tube van 15 ml in een rek en laat de tissuestukjes bezinken. Verwijder het supernatans voorzichtig en giet het over een celzeef van 70 μm in een ijskoude tube van 50 ml.
    5. Herhaal stap 2-4 twee keer voor in totaal 3 verteringsrondes. Het weefsel moet aan het einde van de laatste incubatie min of meer volledig gedissocieerd zijn.
    6. Voeg 20 ml M199 + 2% FBS toe aan de verzamelde celsuspensie. Centrifugeren op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    7. Verwijder het supernatans en resuspendeer in een geschikte hoeveelheid M199 + 2% FBS. Ga dan verder met het tellen van cellen.
      OPMERKING: Het volume M199 + 2% FBS waarin moet worden geresuspendeerd, is afhankelijk van de toestand van de thymus. Voor muizen van 6-10 weken oud raden we aan om het weefsel te resuspenderen in 3-4 ml M199 + 2% FBS. Voor experimenten met verouderd of door straling geconditioneerd weefsel of mutante stammen met thymusdefecten, vereist de kleine thymusgrootte echter lagere volumes variërend van 0,1-1 ml.
    8. Tel de cellen door de celsuspensie 1:2 te verdunnen in 0,4% (w/v) trypanblauwe oplossing. Laad cellen op een hemocytometer en tel ze onder een helderveldmicroscoop. Tel ongekleurde cellen om het aantal levende cellen per milliliter en het aantal blauwgekleurde cellen te bepalen om de levensvatbaarheid van het monster te beoordelen.
  4. Voer fluorescentie-geactiveerde celsortering uit van het thymusstroma van muizen
    1. Draai de cellen rond bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer cellen in een concentratie van 5 x 107 cellen/ml in M199 + 2% FBS aangevuld met 25 E/ml Protector RNaseremmer (zie Materiaaltabel).
    2. Voeg muizen Fc Block toe (zie materiaaltabel) in een concentratie van 2 μg/ml en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    3. Kleurer de cellen met de volgende antilichamen: CD45-PE/Cy7 (4 μg/ml), Ter119-PE (4 μg/ml), CD31-BUV737 (2 μg/ml) en EpCam-BV711 (2 μg/ml) (zie materiaaltabel) gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    4. Was de monsters in M199 + 2% BSA en centrifugeer ze gedurende 5 minuten op 500 x g bij 4 °C.
    5. Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in M199 + 2% BSA die een levensvatbaarheidskleurstof bevatten, zoals DAPI (0,5 μg/ml) of 7-AAD (1 μg/ml) (zie materiaaltabel). Ga verder met FACS-isolatie van thymus stromale cellen volgens vastgestelde protocollen19.

2. Preparaat van menselijk thymusweefsel

  1. Bereid de volgende buffers en oplossingen voor.
    1. Medium 199 (M199) met 2% (v/v) FBS.
    2. M199 met 1,5% (w/v) BSA.
    3. Menselijke dissociatiecocktail: 1 mg/ml Collagenase IV en 2 mg/ml Dispase en 6,3 E/ml DNase I in M199 +1,5% BSA (zie materiaaltabel).
      OPMERKING: De laatste verteringsstap in de bereiding van menselijk thymusweefsel omvat trypsine. Het is daarom van essentieel belang dat alle stappen tot dat punt worden uitgevoerd in BSA-bevattende buffer, aangezien FBS de trypsine-activiteit zal remmen.
  2. Voer isolatie van menselijk thymusweefsel uit
    1. Plaats de menselijke thymus (verzameld volgens de eerder gepubliceerde methode19) in een geschikte hoeveelheid M199 + 1,5% BSA en bewaar deze op ijs totdat de verwerking begint.
    2. Terwijl u met menselijk thymisch weefsel werkt, behandel het dan alsof het mogelijk besmettelijk is door het werk uit te voeren in een weefselkweekkap en standaardvoorzorgsmaatregelen te gebruiken volgens de CDC-richtlijnen20.
    3. Doe het zakdoekje in een petrischaaltje van 10 cm met 10 ml ijskoud M199 + 1,5% BSA. Verwijder met een steriele tang en schaar voorzichtig extrathymisch vet of weefsel dat is beschadigd tijdens het extraheren van het orgaan.
    4. Knip de thymus met een chirurgische schaar en een tang in blokjes van 1 cm3 en gebruik de zuiger van een spuit van 10 ml om de stukjes voorzichtig naar beneden te duwen. Hierdoor komt een deel van de zich ontwikkelende thymocyten vrij, waardoor het volume van het te verteren weefsel wordt verminderd.
      OPMERKING: Bewaar de vrijgekomen hematopoëtische fractie als latere analyse van de ontwikkelingsstadia van thymocyten nodig is. Combineer deze fractie echter niet met de stromale celfractie die ontstaat tijdens de enzymatische vertering. Er werd waargenomen dat het samenvoegen van de twee fracties het risico op verstoppingen in de celsuspensie aanzienlijk verhoogt, waardoor uiteindelijk de opbrengst van stromale cellen wordt verminderd. Weinig stromale cellen gaan verloren tijdens het zachte verpletteren van het weefsel.
  3. Voer enzymatische dissociatie van menselijk thymusweefsel uit (90 min in stappen van 30 min)
    1. Breng ongeveer 5 mg van de licht geplette stukjes thymusweefsel over in de dop van een kegelvormig buisje van 50 ml. Knip het weefsel vervolgens fijn af met een steriele chirurgische schaar.
    2. Pipetteer 8 ml menselijke dissociatiecocktail in de buis van 50 ml, bevestig de dop met het fijngehakte menselijke thymusweefsel en keer de buis vervolgens voorzichtig 5 keer om om ervoor te zorgen dat al het weefsel wordt gemengd met de enzymcocktail.
    3. Zet de dop van de buis vast met paraffinefolie om lekkage te voorkomen. Incubeer de buis horizontaal in een schuddend (250 rpm) waterbad bij 37 °C gedurende 30 min.
    4. Plaats de tube van 50 ml in een rek en laat de stukjes menselijk thymusweefsel bezinken voordat u het supernatans verwijdert en over een celzeef van 70 μm in een nieuwe tube van 50 ml op ijs plaatst.
    5. Herhaal stap 2.3.2-1.3.4 voor in totaal twee verteringsrondes met de menselijke dissociatiecocktail.
    6. Nadat de tweede verteringsronde is voltooid, voegt u nog eens 8 ml van de menselijke dissociatiecocktail toe aan het resterende weefsel. Vervolgens wordt ook 2 ml 0,25% trypsine in de weefseldissociatiebuis gepipetteerd. Incubeer nog 30 minuten bij 37 °C, schudden bij 250 tpm.
      OPMERKING: Het is absoluut noodzakelijk dat de verteringstijd voor menselijk weefsel ten minste 90 minuten is, omdat kortere incubatietijden leiden tot drastisch verminderde stromale celopbrengsten.
    7. Zodra de laatste incubatiestap is voltooid, bundelt u de celsuspensie en de resterende weefselfragmenten met het supernatans dat in de vorige stappen is verzameld door over een celzeef van 70 μm te gaan. Voeg 3 ml FBS toe aan het monster om de trypsinereactie te doorbreken en plaats het op ijs.
    8. Ga verder met het tellen van de cellen zoals beschreven in stap 1.3.
  4. Voer fluorescentie-geactiveerde celsortering van menselijk thymusstroma uit
    1. Draai de celsuspensie van menselijke thymus af en resuspendeer in een concentratie van 5 x 107 cellen/ml in M199 + 2% FBS aangevuld met 25 E/ml Protector RNaseremmer.
    2. Incubeer met humaan Fc Block (5 μg/ml) (zie materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    3. Kleur het monster gedurende 30 minuten bij 4 °C met CD45-BV711 (2,5 μg/ml), CD235a-BV711 (2,5 μg/ml), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg/ml), CD66b-FITC (20 μl/100 μl monster), CD8-APC/Cy7 (5 μl/100 μl monster), CD4-BV605 (5 μl/100 μl monster), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/ml) en EpCam-BV421 (2,5 μg/ml) (zie materiaaltabel).
    4. Was de monsters in M199 + 1,5% BSA en centrifugeer ze gedurende 5 minuten op 500 x g bij 4 °C.
    5. Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in M199 + 1,5% BSA die een levensvatbaarheidskleurstof bevatten, zoals DAPI (0,5 μg/ml) of 7-AAD (1 μg/ml). Ga verder met FACS-isolatie van thymus stromale cellen volgens vastgestelde protocollen19.

3. Bereiding van muizen, bot- en beenmergweefsel

OPMERKING: Bot- en beenmergfracties worden bereid in twee afzonderlijke verteringsreacties om een maximale zuiverheid van stromale cellen en optimale dissociatie van weefsels te verkrijgen. De monsters kunnen na de verteringsstappen worden samengevoegd om te worden gesorteerd als één stromaal compartiment.

  1. Bereid de volgende buffers en oplossingen voor.
    1. M199 met 2% (v/v) FBS.
    2. Muizen B&M (been en merg) dissociatiecocktail: Stemxyme 2 mg/ml, dispase 1 mg/ml en 10 E/ml DNase I (zie materiaaltabel) in M199 +2% FBS.
      LET OP: Bereid B&M dissociatiemix vers voor en bewaar het mengsel op ijs tot gebruik.
    3. M199 met 0,5% (w/v) BSA.
    4. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,5% (w/v) BSA.
    5. M199 met 2% (w/v) runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA.
      OPMERKING: FBS-bevattend medium kan worden overgeschakeld naar BSA om de RNA-kwaliteit te verbeteren.
  2. Voer muizenbeenmergscheiding uit
    1. Euthanaseer de muis door CO2 -verstikking (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Spuit met 70% ethanol om de vacht nat te maken.
    2. Verwijder voorzichtig het dijbeen, het scheenbeen, het bekken en het opperarmbeen aan elke kant en plaats ze in een kuiltje met M199 + 2% FBS op ijs21,22.
    3. Verwijder al het spier-, ligament- en kraakbeenweefsel met weefseldoekjes om schade aan het bot te minimaliseren en de periostale laag te behouden. Plaats ze in een nieuw putje met M199 + 2% FBS op ijs.
    4. Gebruik een scalpel en snijd de groeischijven van de pijpbeenderen door om de epifyse te verwijderen en plaats deze in een schaal van 10 cm met M199 + 2% FBS op ijs.
    5. Spoel het beenmerg uit de botten tot het bleekwit is. Gebruik een naald van 28 g en een spuit van 10 ml gevuld met 10 ml M199 + 2% FBS om het merg in een tube van 15 ml op ijs te spoelen. Plaats het gespoelde bot in de schaal van 10 cm met de epifyse.
      OPMERKING: Volledige spoeling van het beenmerg voor volledige scheiding van weefsels zal resulteren in een betere monstervoorbereiding.
  3. Voer enzymatische dissociatie van het beenmergweefsel van muizen uit (totaal 30 minuten in stappen van 10 minuten)
    1. Laat de tube van 15 ml rechtop op het ijs staan totdat het merg naar de bodem van de tube zakt. Verwijder langzaam de 10 ml M199 + 2% FBS door te pipetteren.
    2. Voeg 4 ml B&M-dissociatiecocktail toe aan de tube van 15 ml en plaats deze gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C (niet schudden).
    3. Keer de tube na 5 minuten drie keer om en plaats deze terug in het waterbad.
    4. Zorg er na de eerste 10 minuten voor dat de pellet op de bodem ligt en verzamel het supernatans terwijl u door een celzeef van 70 μm in een ijskoude buis van 50 ml filtert. Voeg 2 ml verse B&M dissociatiecocktail toe aan de resterende BM-pellet en plaats deze terug in het waterbad.
    5. Dissocieer eventuele resterende stukjes beenmerg door krachtig te pipetteren met behulp van een pipet van 1 ml. Verzamel alle resulterende celsuspensie in dezelfde buis als in de vorige stappen. Voeg 20 ml M199 + 0,5% BSA + 2 mM EDTA toe aan de verzamelde celsuspensie.
      OPMERKING: In stap 3.3.5 bevat de buffer die na het laatste verteerde monster wordt toegevoegd, EDTA om verdere enzymatische activiteit te helpen remmen.
  4. Voer hematopoëtische celdepletie van muizenbeenmergweefsel uit.
    1. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspenderen in 500 μL PBS + 0,5% BSA met biotine-antilichamen (5 mg/ml) gericht op CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 en CD3 (zie materiaaltabel). Breng over naar een buis met ronde bodem en een dop.
    2. Incubeer op een orbitale shaker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    3. Draai de magnetische kralen grondig door en voeg 25 μL magnetische kralen toe aan de buis.
    4. Incubeer op een orbitale shaker gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    5. Plaats de buis 2-3 minuten in de bijpassende magneet en vang het supernatans op in een verse buis.
      OPMERKING: Het beenmerg kan na deze stap worden samengevoegd of gescheiden worden gehouden van de botfractie. Als de uitputting van de afstamming succesvol is, moet de resulterende celsuspensie vrij zijn van rode bloedcellen.
  5. Voer enzymatische dissociatie van botweefsel van muizen uit.
    1. Breek de botten in kleinere stukken in de schaal van 10 cm met de platte dop van een tube van 50 ml. Filtreer het supernatans door een celzeef van 70 μm om botfragmenten in het filter te isoleren.
      OPMERKING: Als alternatief kan een vijzel en stamper worden gebruikt voor botfragmentatie. Deze optie heeft echter de neiging om meer puin te genereren en de levensvatbaarheid van stromale cellen te verlagen wanneer het bot wordt geslepen in plaats van gebroken. De stromacellen zitten nog steeds vast aan en in het bot en het supernatans dat hematopoëtische cellen bevat, moet worden weggegooid.
    2. Gebruik een schaar om de botfragmenten in de celzeef af te knippen. Dit zal het oppervlak vergroten voor een efficiëntere enzymatische dissociatie. Was het bot met 5 ml M199 + 2% FBS.
    3. Plaats de botfractie in 5 ml muizen B&M-dissociatie (zie Materiaaltabel) mengsel in een nieuw buisje van 50 ml.
    4. Om lekkage te voorkomen, wikkelt u de dop van de buis in paraffinefolie. Plaats de buis vervolgens horizontaal in een waterbad van 37 °C met 120 tpm schudden gedurende 30 minuten.
    5. Voeg na de digestie 25 ml M199 + 0,5% BSA + 2 mM EDTA toe en filtreer het supernatans met de stromale cellen door een celzeef van 70 μm in een ijskoud buisje van 50 ml.
      OPMERKING: Controleer of de resulterende botfragmenten zichtbaar zijn verminderd door de spijsvertering. In stap 3.5.5 bevat de buffer die na het laatste verteerde monster wordt toegevoegd, EDTA om verdere enzymatische activiteit te helpen remmen.
  6. Voer fluorescentie-geactiveerde celsortering uit van muizen, bot- en beenmergstroma.
    1. Draai de cellen rond bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    2. Resuspenderen in muizen Fc Block in een concentratie van 10 μg/ml in PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA en gedurende 10 minuten incuberen bij 4 °C.
    3. Kleuring de cellen (tot 10 miljoen cellen/100 μL totaal kleuringsvolume) met de volgende antilichamen: CD45-PE/Cy7 (1 μg/ml), Ter119-PE/Cy7 (1 μg/ml), CD31-BV421 (0,66 μg/ml), CD140a-APC (2 μg/ml), Sca1-AF700 (0,66 μg/ml), CD51-PE (2 μg/ml), CD105-PE/dazzle (2 μg/ml) (zie materiaaltabel).
    4. Laat Calcein-AM in evenwicht komen tot kamertemperatuur en resuspendeer in 50 μL DMSO. Bereid vers voor elk gebruik. Na resuspensie op kamertemperatuur bewaren. Verdun de calceïne vooraf in PBS (0,1 mg/ml) voordat u het aan het monster toevoegt (20 μg/ml) dat al is geresuspendeerd in de antilichaamkleuringscocktail en incubeer gedurende 20-30 minuten bij 4 °C in het donker.
    5. Was de monsters in PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA en centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    6. Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA. Ga verder met FACS-isolatie van bot- en beenmergstromale cellen volgens vastgestelde protocollen19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze protocollen leveren reproduceerbare stromale celvariëteiten op uit de thymus en het beenmerg die geschikt zijn voor flowcytometrische analyse, evenals single-cell multiomics, zoals scRNA-sequencing. Thymusweefsel van muizen ondergaat een aanzienlijke remodellering als reactie op stressoren, zoals de cytotoxische conditionering die voorafgaat aan beenmergtransplantatie of het natuurlijke verouderingsproces. Als gevolg hiervan wordt de cellulariteit van de thymus in beide instellingen drastisch verminderd (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Stromale cellen in hematopoëtische organen zijn van cruciaal belang voor een normale bloedproductie en hematopoëtische stromaverstoringen kunnen leiden tot ernstige stoornissen in het hematopoëtisch onderhoud en de reactie op stress 9,23,24. Inzicht in hematopoëtische stromale cellen is essentieel voor het begrijpen van hematologische ziekten 7,9,10,24 en voor het vermogen om therapieën te

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

D.T.S. is bestuurder en aandeelhouder van Agios Therapeutics en Editas Medicines; een oprichter, directeur, aandeelhouder en lid van de wetenschappelijke adviesraad voor Magenta Therapeutics en LifeVault Bio, een aandeelhouder en oprichter van Fate Therapeutics en Garuda Therapeutics, en een directeur, oprichter en aandeelhouder voor Clear Creek Bio, een consultant voor FOG Pharma, Inzen Therapeutics en VCanBio, en een ontvanger van gesponsorde onderzoeksfinanciering van Sumitomo Dianippon. D.T.S en K.G zijn uitvinders van patent US20220143099A1.

Dankbetuigingen

We werden ondersteund met deskundige technische assistentie door de HSCI-CRM flowcytometrie-faciliteit in het Massachusetts General Hospital en de Bauer Core Facility van de Harvard University. T.K. en K.G werden gesteund door de Zweedse Onderzoeksraad en C.M. door de Duitse Stichting voor Onderzoek. We danken Sergey Isaev en I-Hsiu Lee voor hun hulp bij de analyse van single-cell RNA-sequencinggegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITCBD Biosciences643510
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 miceJackson664Mannen of vrouwen, 8-12 weken oud
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µmFisher Scientific08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083 2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kitStemCell Technologies19860
Fetal Bovine SerumGibcoA31605-01Qualified One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
Mouse anti-human CD235a-BV77BD Biosciences740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Mouse anti-human CD45-BV77Biolegend304050
Mouse anti-human CD4-BV605BD Biosciences562658
Mouse anti-human CD66b-FITCBD Biosciences555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Mouse anti-human EpCam-BV421Biolegend324220
Protector RNase InhibitorMillipore Sigma3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rat anti-mouse CD11b-BiotinBiolegend101204
Rat anti-mouse CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rat anti-mouse CD31-BV421Biolegend102424
Rat anti-mouse CD3-BiotinBiolegend100244
Rat anti-mouse CD45.2-BiotinBiolegend109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Rat anti-mouse CD51-PEBiolegend104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend108404
Rat anti-mouse Ter119-BiotinBiolegend116204
Rat anti-mouse Ter119-PEBiolegend116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiochemicalLS004107

Referenties

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
  3. Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
  4. Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
  5. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  6. Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830(2023).
  7. Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
  8. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  9. Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  10. Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
  11. Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
  12. Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
  13. Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
  14. Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
  15. Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
  16. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  17. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  18. Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951(2013).
  19. Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
  20. Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html (2023).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936(2016).
  22. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  23. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  24. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  25. Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
  26. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  27. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).
  28. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Single-cellsequencingdissociatie van de thymusisolatie van beenmergfiltratie met celzeefjesscheiding met magnetische beadsFACS-analysemurine stromale cellenheterogeniteit van celpopulaties
Stromale celisolatie van hematopoëtische organen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.