Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Muizen linker pulmonale hilarische klemmodel van longischemie reperfusieletsel

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66232

⸱

12 april 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Het protocol schetst een haalbare, betrouwbare en reproduceerbare methode van linker pulmonale hilarische klemming die kan worden gebruikt om longischemie-reperfusieletsel in muismodellen te bestuderen.

Samenvatting

Ischemie-reperfusieletsel (IRI) tijdens longtransplantatie is een belangrijke risicofactor voor complicaties na transplantatie, waaronder disfunctie van het primaire transplantaat, acute en chronische afstoting en mortaliteit. Inspanningen om de onderbouwing van IRI te bestuderen leidden tot de ontwikkeling van een betrouwbaar en reproduceerbaar muismodel van linkerlong hilarische klemming. Dit model omvat een chirurgische ingreep die wordt uitgevoerd bij een verdoofde en geïntubeerde muis. Een linker thoracotomie wordt uitgevoerd, gevolgd door zorgvuldige longmobilisatie en dissectie van het linker longhilum. De hilarische klem omvat omkeerbare hechtingsligatie van het pulmonale hilum met een schuifknoop, die de arteriële instroom, veneuze uitstroom en luchtstroom door de linker bronchus van de hoofdstam stopt. Reperfusie wordt geïnitieerd door zorgvuldige verwijdering van de hechtdraad. Ons laboratorium gebruikt 30 minuten ischemie en 1 uur reperfusie voor het experimentele model in de huidige onderzoeken. Deze tijdsperioden kunnen echter worden gewijzigd, afhankelijk van de specifieke experimentele vraag. Onmiddellijk voorafgaand aan het offeren kan arteriële bloedgas uit de linkerventrikel worden verkregen na een periode van 4 minuten van rechter hilarische klemming om ervoor te zorgen dat de verkregen PaO2-waarden alleen aan de gewonde linkerlong worden toegeschreven. We beschrijven ook een methode om celextravasatie te meten met flowcytometrie, waarbij intraveneus een fluorochroom-gelabeld antilichaam wordt geïnjecteerd dat specifiek is voor de cel(len) die moeten worden bestudeerd voordat ze worden opgeofferd. De linkerlong kan vervolgens worden geoogst voor flowcytometrie, bevroren of gefixeerd, in paraffine ingebedde immunohistochemie en kwantitatieve polymerasekettingreactie. Deze hilarische klemtechniek maakt een gedetailleerde studie mogelijk van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan IRI. Representatieve resultaten tonen verminderde oxygenatie van de linkerlong en histologisch bewijs van longbeschadiging na hilarische klemming. Deze techniek kan gemakkelijk worden geleerd en gereproduceerd door personeel met en zonder microchirurgische ervaring, wat leidt tot betrouwbare en consistente resultaten en dient als een algemeen aanvaardbaar model voor het bestuderen van long-IRI.

Inleiding

IRI tijdens orgaantransplantatie is een belangrijke risicofactor voor primaire transplantaatdisfunctie en latere episodes van transplantaatafstoting 1,2. Tijdens transplantatie wordt de tijd van warme ischemie gedefinieerd als de periode vanaf de kruisklem van de donoraorta tot het begin van koude perfusie en van het verwijderen van organen van ijs tot orgaanimplantatie. Koude opslagtijd wordt gedefinieerd als de periode vanaf het begin van de koude perfusie tot de verwijdering van het orgaan uit ijs3. Warme ischemie is schadelijker voor de latere orgaanfunctie dan koude ischemie 4,5,6, en de onderliggende mechanismen rechtvaardigen verder onderzoek in preklinische modellen. Bovendien wordt orgaantransplantatie na donatie na hartdood (DCD) in verband gebracht met langere warme ischemische tijden dan traditionele donatie na hersendood (DBD)7. Hoewel het gebruik van DCD-donoren de donorpool kan vergroten en het longgebruik kan verhogen, zijn verdere preklinische studies nodig om de effecten van warme ischemie op de longfunctie na transplantatie te evalueren. Hieronder beschrijven we een model van warme IRI bij muizen via de linker pulmonale hilarische klem.

In de afgelopen jaren zijn verschillende diermodellen van longhilarische klemmen ontwikkeld en aangepast en kunnen het gebruik van een atraumatische microvasculaire klem 8,9,10,11,12,13, een Rumel-tourniquet14,15 of hechtdraadligatie16 omvatten als de hilarische klem. De crux van de hilarische klem is dat deze omkeerbaar moet zijn en minimale of geen schade aan de hilarische structuren moet veroorzaken, zodat reperfusie kan worden bereikt. Hier beschrijven we onze hilarische klemtechniek bij muizen waarbij het linker longhilum omkeerbaar wordt afgebonden met een schuifknoop. Deze methode sluit de pulmonale arteriële instroom, veneuze uitstroom en luchtstroom in en uit de bronchus van de hoofdstam af. Het belangrijkste voordeel van een slipknot over een vaatklem, clip of tourniquet is dat de borstkas kan worden gesloten tijdens langdurige perioden van ischemie, waardoor ongevoelig vocht- en warmteverlies bij de muis tot een minimum wordt beperkt. We bieden een protocol voor het verkrijgen van betrouwbare arteriële bloedgasmetingen (ABG) en voor het meten van celextravasatie na hilarische klemming.

Deze hilarische klemtechniek neemt een belangrijke plaats in in de bredere studie van longtransplantatie. Vergeleken met kleine diermodellen van orthotope longtransplantatie, kan de hilarische klemtechniek de effecten van IRI isoleren zonder de toevoeging van chirurgisch anastomosetrauma of allogeniciteit17. Bovendien kan de hilarische klemtechniek gemakkelijker en sneller onder de knie worden gekregen dan de longtransplantatie van muizen. In feite zijn in het afgelopen decennium met behulp van hilarische klemtechnieken verschillende belangrijke mechanismen in de pathogenese van IRI geïdentificeerd, zoals TLR4, NADPH-oxidase en adenosine A2A-receptor 14,18,19,20. In het volgende protocol presenteren we een betrouwbare, leerbare en reproduceerbare methode van hilarische klemming als hulpmiddel voor het bestuderen van long-IRI.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle studies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Washington University School of Medicine. Dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, 8eeditie 21 opgesteld door de National Academy of Sciences en gepubliceerd door de National Institutes of Health, en de principes van proefdierverzorging geformuleerd door de National Society for Medical Research.

1. Anesthesie en intubatie

  1. Kies een muis die minimaal 25 g weegt. Dit vergemakkelijkt de intubatie door de grotere opening tussen de stembanden.
  2. Injecteer de muis intraperitoneaal met een mengsel van ketamine (dosis 100 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (dosis 10 mg/kg lichaamsgewicht). Dit mengsel moet met een naald van 1/2 inch 29G in een spuit van 1/2 cc worden geladen. Wacht ongeveer 5 minuten totdat ketamine effect heeft - de muis mag geen spontane bewegingen vertonen en reageert niet op een teenknijp, wat voldoende anesthesie bevestigt.
  3. Injecteer buprenorfine (dosis 0,05 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan voorafgaand aan de operatie voor aanvullende pijnbestrijding.
  4. Breng niet-medicinale oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens de operatie te voorkomen.
  5. Scheer de muis met een tondeuse over de linkerborst en rug (zie figuur 1A) en strek deze uit tot op de buik als laparotomie is gepland (zie stap 5.3).
  6. Zodra de muis is verdoofd, voert u de intubatie uit met behulp van een voorkeursintubatie-opstelling en de rest van de procedure onder een microscoop op een verwarmde mat bij ~37 °C (om normothermie bij de muis te behouden).
  7. Nadat u een goed zicht op de stembanden heeft verkregen, plaatst u een zelfgemaakte introducer (zie aanvullende afbeelding 1) met een kromming aan het uiteinde in een 1-inch 20G-angiokatheter, die wordt gebruikt als endotracheale tube (ETT). Leid de punt van de introducer en vervolgens de ETT tussen en langs de stembanden.
    OPMERKING: Het is belangrijk om te visualiseren dat de ETT door de stembanden gaat om valse intubatie in de slokdarm te voorkomen. Er moet voor worden gezorgd dat letsel aan de stembanden tijdens intubatie wordt voorkomen (d.w.z. het aantal intubatiepogingen moet worden beperkt tot 5 en de ETT mag niet worden vervroegd als er weerstand wordt geboden).
  8. Zodra de ETT is ingebracht, verwijdert u de introducer en sluit u de ETT aan op een ventilator voor kleine dieren. Let op symmetrische borstverhoging om de juiste endotracheale intubatie te bevestigen. De ventilatorinstellingen moeten 100-105 ademhalingen per minuut zijn en een fractie van de ingeademde zuurstof van 100%. Het teugvolume is 0,35 ml en de positieve eind-expiratoire druk is 1 cm H2O.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de borstkas in plaats van de buik omhoog komt, aangezien onbedoelde slokdarmintubatie tot de dood zal leiden als deze niet onmiddellijk wordt gecorrigeerd.
  9. Zodra is bevestigd dat deze op zijn plaats zit, bevestigt u de ETT met een strook van 5 cm zijden tape van 1 inch rond de neus van de muis, waarbij u zorgt voor voldoende contact met de ETT en de neus zodat de ETT niet uit de mond glijdt (zie afbeelding 1B-C).
  10. Om tijdens de operatie voldoende anesthesie te behouden, dient u 1%-1,5% isofluraan toe in lijn met de zuurstofstroom.

2. Thoracotomie

  1. Plaats de muis in de rechter laterale decubituspositie, met beide voorpoten vastgeplakt aan de linkerbovenhoek, de rechterachterpoot vastgeplakt aan de linkerbenedenhoek en de linkerachterpoot vastgeplakt aan de rechterbenedenhoek (zie afbeelding 2G voor taping).
  2. Desinfecteer met huid over de linkerborst met ten minste 3 afwisselende rondes povidonjodium gevolgd door 70% alcoholtoepassing.
  3. Maak een incisie over de4e intercostale ruimte van de voorste oksellijn naar de achterste oksellijn, gebruik een schaar om de bovenliggende huid te openen (zie figuur 2A). De 4eintercostale ruimte bevindt zich ongeveer 1 cm onder de oksel in het midden van de oksellijn.
  4. Om bloedverlies tot een minimum te beperken, coaguleert u zichtbare bloedvaten in de onderhuidse en spierlagen met behulp van een draagbare cauterisatiepen.
  5. Verdeel de spieren latissimus dorsi en serratus anterior scherp met een schaar over de lengte van de huidincisie (zie figuur 2B).
  6. Til met een fijngebogen pincet voorzichtig de 4erib op (zorg ervoor dat u de onderliggende long niet verwondt) en knip met een fijne schaar net boven de 5erib om de 4eintercostale ruimte binnen te gaan (zie figuur 2C). Voer de thoracotomie uit boven de 5erib in plaats van onder de 4erib om te voorkomen dat de intercostale neurovasculaire bundel wordt verwond.
  7. Zodra de negatieve druk in de pleuraholte verloren is gegaan en de long zich terugtrekt van de borstwand, verlengt u de thoracotomie anterieur en posterieur in de4e intercostale ruimte net boven de 5erib (zie figuur 2D-E). De gehele lengte van de incisie moet lang genoeg zijn om de hele long bloot te leggen, meestal ~1 cm.
    OPMERKING: Bloedingen in de interne borstslagader kunnen optreden als de thoracotomie te ver naar voren wordt verlengd - als deze wordt aangetroffen, moet deze worden dichtgeschroeid om overmatig bloedverlies te voorkomen.
  8. Breng twee ribretractors aan om de ribruimte open te spreiden, zodat er een werkvenster van ten minste 1cm2 beschikbaar is voor een adequate visualisatie (zie figuur 2F-G).

3. Toepassing van de hilarische klem

  1. Gebruik tweepuntige applicators met katoenen punt om de linkerlong te mobiliseren door deze op te tillen en vervolgens het doorschijnende inferieure longligament botweg te verdelen (zie figuur 3A-B).
    OPMERKING: Als dit een uitdaging is om uit te voeren zonder de long te scheuren, kan het inferieure longligament ook scherp worden gedeeld met een fijne schaar.
  2. Reflecteer de long naar voren, zodat het achterste linker pulmonale hilum kan worden gevisualiseerd. Knip een stuk 6-0 zijden stropdas af tot ~10 cm en plaats het middelpunt van deze stropdas posterieur van het hilum (zie figuur 3C).
  3. Draai vervolgens de linkerlong naar achteren om over de stropdas te leggen en trek beide uiteinden van de stropdas naar voren (zie afbeelding 3D).
  4. Met de twee vrije uiteinden (A en B) van de stropdas bindt u een omkeerbare schuifknoop met een tang en een gebogen muggenklem. Zie de gedetailleerde beschrijving in de stappen 3.4.1 en 3.4.2. De warme ischemische tijd begint bij het knopen van de schuifknoop. De linkerlong mag niet langer worden opgeblazen bij elke beademingsademhaling als de knoop eenmaal is gelegd. Het moet bleekwit worden, wat betekent dat de perfusie stopt.
    OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat de knoop in het midden van het hilum zit, zodat het linker atrium niet per ongeluk centraal en het longparenchym lateraal verstrikt raakt (zie figuur 3F).
    1. Met de klem in de dominante hand en een pincet in de niet-dominante hand, houdt u het uiteinde van A met een pincet vast en lust u het middelpunt van A eenmaal rond de gesloten klem (zie figuur 3E).
    2. Pak het middelpunt van B vast met de klem en trek met beide handen om de schuifknoop vast te maken. Laat het uiteinde van B niet door de knoop trekken, dit zou de knoop onomkeerbaar maken. Na het leggen van de knoop moet B een lus hebben die uit de knoop komt, terwijl A recht moet zijn (zie figuur 3F). De knoop kan worden losgemaakt door aan het uiteinde van B te trekken.
  5. Bevestig een adequate afsluiting van de bronchus door de uitstroomslang van de ETT naar het beademingsapparaat handmatig af te sluiten, waardoor de linkerlong niet wordt opgeblazen (zie figuur 3G). Vasculaire occlusie wordt verondersteld met bronchiale occlusie gezien de verhoogde inklapbaarheid van de longslagader en aders in vergelijking met de kraakbeenachtige bronchiën.
  6. Sluit na het aanbrengen van de hilarische klem de huidincisie met één eenvoudige onderbroken hechting met behulp van 6-0 nylon hechtdraad, om onmerkbaar vochtverlies tijdens de periode van warme ischemie te minimaliseren.

4. Loslaten van de hilarische klem

  1. Na de gewenste periode van warme ischemie maakt u de slipknot los door voorzichtig aan het korte vrije uiteinde van de zijden stropdas te trekken (B uit figuur 3F en stap 3.4). Start de reperfusietijd bij het loslaten van de slipknoop.
    OPMERKING: Na het loslaten van de band kan de longventilatie worden bevestigd door opnieuw handmatige occlusie van de uitstroom van de ETT, die nu expansie van de linkerlong zou moeten veroorzaken. Nogmaals, perfusie wordt geïmpliceerd met het opblazen van de long, maar het kan ook worden bevestigd door het roze worden van de long (zie figuur 4A).
  2. Sluit tijdens de reperfusieperiode de kist in drie lagen om onmerkbare verliezen tot een minimum te beperken. Sluit eerst de 4eribruimte met een enkele steek met 6-0 nylon hechtdraad, met één hap net boven de 4erib en één hap net boven de 6erib (zie figuur 4B-C). Bind dit vast bij maximale longinflatie om het risico op een iatrogene pneumothorax te minimaliseren (zie figuur 4D-E).
  3. Sluit vervolgens de spierlaag met een eenvoudige rijgsteek met 6-0 nylon hechtdraad.
  4. Sluit ten slotte de huidincisie met een eenvoudige onderbroken hechting met 6-0 nylon hechting (zie figuur 4F). Vermijd het uitvoeren van hechtingen op de huid vanwege het risico dat wakkere dieren aan hun incisie plukken en leiden tot volledige wonddehiscentie.
  5. Vanaf dit punt kan de long direct worden geoogst aan het einde van de gewenste reperfusietijd. Als ABG-evaluatie gewenst is, zie stap 5. Als een extra intraveneuze injectie gewenst is voorafgaand aan het offeren, zie stap 6. Dit is een terminale operatie.
  6. Als de reperfusietijd langer dan een paar uur moet zijn, schakel dan de isofluraan uit zodat de muis uit de narcose kan ontwaken en kan extuberen. Extubatiecriteria zijn onder meer spiertrekkingen met pootknijpen en spontane ademhaling en beweging. Het wakker maken van een muis uit ketamine- en isofluraan-anesthesie duurt meestal 30-45 minuten. Dit is een overlevingsoperatie.
    1. Injecteer voor een overlevingsoperatie 1 ml warme zoutoplossing subcutaan om rekening te houden met vochtverlies door de operatie. Injecteer buprenorfine (dosis 0,05 - 0,1 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan voorafgaand aan de operatie voor pijnbestrijding. Herhaal de anesthesie elke 4-6 uur gedurende ten minste 3 dagen na de operatie. Overweeg een bupivacaïneblokkade langs de incisie voor extra pijnbestrijding.

5. ABG-evaluatie

OPMERKING: Als ABG-meting gewenst is, kan dit het beste worden verkregen via arteriële bloedaspiratie uit de linker hartkamer. Om er zeker van te zijn dat de ABG alleen de functie van de linkerlong weerspiegelt, moet dit arteriële bloed worden verkregen na ongeveer 4 minuten van het rechterhilum dat wordt vastgeklemd22,23, gedurende welke tijd alleen de linkerlong oxygenatie en ventilatie uitvoert.

  1. Als de muis na de hilarische klem uit de narcose is gewekt, verdoof en intubeer de muis dan opnieuw volgens stap 1.
  2. Ongeveer 15-20 minuten voor het einde van de gewenste reperfusietijd plaatst u de muis op uw rug en zet u alle vier de ledematen vast met tape.
    OPMERKING: Er moet voldoende tijd worden uitgetrokken voor de volgende stappen die moeten worden uitgevoerd vóór het einde van de reperfusie. De specifieke timing om de buik en borstkas te openen is afhankelijk van de chirurg en zijn ervaring.
  3. Voer een laparotomie op de middellijn uit van het schaambeen tot het baarmoederbeen, waarbij u met een schaar de huid insnijdt, gevolgd door de buikwand langs de linea alba (zie figuur 5A-B).
  4. Verleng bij de xiphoid de laparotomie naar links en rechts tot aan de voorste oksellijn, waarbij u de ronding van de onderste rib volgt (zie figuur 5C).
  5. Snijd vanuit de buik het voorste middenrif in de middellijn in om de borstkas binnen te gaan, zorg ervoor dat u niet te diep gaat om te voorkomen dat het hart wordt verwond (zie figuur 5D-E). Verleng vervolgens de incisie in het voorste diafragma naar links en rechts tot aan de voorste oksellijn, langs de onderste rib (zie witte stippellijn in figuur 5D).
  6. Verdeel de bilaterale ribben langs de voorste oksellijn en strek zich naar boven uit in de richting van de oksel, om een clamshell thoracotomie te creëren. Reflecteer vervolgens de voorste borstwand (borstbeen en bilaterale voorste ribben) cephalad, waardoor het hart en de bilaterale longen volledig kunnen worden blootgesteld (zie witte stippellijnen in figuur 5F).
  7. Breng een klem aan op de voorste borstwand die is omgedraaid om het terugtrekken te vergemakkelijken. Trek het diafragma naar beneden in met een gebogen muggenklem in de middellijn om de visualisatie van de borstkas te verbeteren (zie figuur 5F).
  8. Om de rechterlong (die 4 lobben heeft) volledig te mobiliseren, brengt u de accessoirekwab die voorbij de middellijn in de linkerborst uitsteekt terug in de rechterborst (zie figuur 5G-H). Er is een dun ligament dat deze lob aan de linkerborst bevestigt - verdeel dit ofwel botweg met applicators met katoenen punt of scherp met een schaar.
    OPMERKING: Deze accessoirekwab kruist de middellijn achter de inferieure vena cava (IVC), dus er moet voor worden gezorgd dat de IVC tijdens deze manoeuvre niet wordt verwond.
  9. Zodra alle lobben zijn teruggekeerd naar de rechterborst, reflecteert u de hele rechterlong naar voren en plaatst u nog een 6-0 zijden stropdas (gesneden tot ~ 10 cm) achter het rechterhilum. Plaats vervolgens de rechterlong terug in de borstkas over de stropdas.
  10. Bind nog een slipknot rond het rechter hilum met dezelfde techniek als beschreven in stap 3.4, en zorg ervoor dat alle vier de lobben van de rechterlong worden omcirkeld. Deze rechter hilarische klemstap moet ongeveer 4 minuten voor het einde van de reperfusie worden getimed.
  11. Smeer een 1/2 inch 31G-naald op een tuberculinespuit van 1 cc met ongeveer 200 μL heparine 1000 eenheid/ml. Om dit te doen, zuigt u het volume heparine op en trekt u de zuiger herhaaldelijk 3-4 keer heen en weer zodat de heparine de hele binnenkant van de spuit bedekt. Dit wordt gedaan om het risico te minimaliseren dat opgezogen bloed stolt tijdens het transport van het operatiestation naar de ABG-machine.
  12. Na 4 minuten rechter hilarische klemming aspireert arterieel bloed uit de linkerventrikel in de met heparine beklede spuit (zie figuur 5I). Zorg ervoor dat u het ventrikel septum niet doorboort en dat er per ongeluk veneus rechterventrikelbloed wordt opgezogen. Er is een duidelijk kleurverschil tussen de donkerdere rechterventrikel en de helderdere linkerventrikel (zie figuur 5I). Richt de naald in de richting van de linkernek. Er kunnen meerdere puncties nodig zijn om voldoende bloed te verkrijgen om een ABG (~150 μL) uit te voeren.
    OPMERKING: Tijdens de 4 minuten van de rechter hilarische klem kan de muis agonale ademhaling gaan vertonen die een naderende dood aankondigt. Als dit gebeurt, moet arterieel bloed snel worden opgezogen voorafgaand aan een hartstilstand. Het is niet mogelijk om bloed op te zuigen van een niet-kloppend hart.
  13. Laat het arteriële bloed op een ABG-machine lopen om onder andere zuurstofverzadiging, gedeeltelijke zuurstofdruk, gedeeltelijke druk van kooldioxide te verkrijgen. Euthanaseer de muis na ABG-afname en/of antilichaambehandeling (zie stap 6).

6. Intraveneuze antilichaaminjectie voor het meten van celextravasatie

OPMERKING: Deze techniek kan worden gebruikt om celextravasatie te bepalen via injectie van fluorochroom-gelabelde antilichamen intraveneus in de IVC voorafgaand aan het offeren, gevolgd door flowcytometrische analyse, zoals eerder gepubliceerd18. Kortom, intravasculaire neutrofielen kunnen worden onderscheiden van interstitiële neutrofielen met behulp van neutrofielspecifieke anti-Ly6G-antilichamen. Fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld (FITC-gelabeld) anti-Ly6G (kloon 1A8) wordt 5 minuten voor het offeren intraveneus geïnjecteerd, waardoor de circulerende intravasculaire neutrofielen worden gelabeld. De gebruikte concentratie van het FITC-Ly6G-antilichaam is 100 ng verdund in 200 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing. Vervolgens, na bereiding van eencellige suspensie uit de linkerlong voor flowcytometrie, worden alle neutrofielen gelabeld met allofycocyanine-gelabeld (APC-gelabeld) anti-Ly6G (kloon 1A8). APC-Ly6G+FITC-Ly6G+ neutrofielen zijn dus intravasculair, terwijl APC-Ly6G+FITC-Ly6G- extravasculair of interstitiële neutrofielen zijn. Deze techniek kan worden aangepast aan monocyten met anti-Ly6C-antilichamen, B-cellen met anti-CD19-antilichamen, bijvoorbeeld.

  1. Plaats het gewenste antilichaam in een spuit van 3/10 cc met een naald van 5/16 inch 31G en zorg ervoor dat er zo min mogelijk luchtbellen in de spuit komen. Gebruik dit voor intraveneuze injectie in de IVC in stap 6.5.
  2. Voer een laparotomie uit volgens de stappen 5.3-5.4.
  3. Voer na laparotomie botweg de rechter mediale viscerale rotatie uit met behulp van twee applicators met puntige katoenen punt. Bij een muis wordt dit gedaan door de hele darm links van de buik te verwijderen, waardoor een duidelijk zicht op de IVC mogelijk is (zie figuur 6A).
  4. Verwijder het vet dat over de IVC ligt botweg met applicators met katoenen punt.
  5. Injecteer de antilichaamoplossing in de IVC via venapunctie (zie figuur 6B). Oefen na extractie van de naald onmiddellijk lichte druk uit met een wattenstaafje op de plaats van de venapunctie totdat deze hemostatisch is (meestal ongeveer 2-3 minuten).
  6. Plaats de ingewanden terug in de buik over het wattenstaafje om druk te blijven uitoefenen op de IVC (zie figuur 6C).
  7. Voer clamshell-thoracotomie uit volgens stap 5.5-5.7 om de linkerlong te oogsten. Laat de antilichamen ten minste 5 minuten systemisch circuleren voordat ze worden geofferd en geoogst. Euthanaseer de muis na ABG-afname en/of behandeling met antilichamen.

7. Histologie (H&E) kleuring

  1. Na formalinefixatie en paraffine-inbedding van de linkerlong en doorsnede tot een dikte van 5 μm, deparaffiniseert u het objectglaasje in xyleen (twee wasbeurten van 10 minuten).
  2. Uitdrogen in opeenvolgende wasbeurten met ethanol: 2x 5 min wasbeurten met 100%, 1x 2 min wassen met 95% en 1x 2 min wassen met 70% ethanol. Spoel vervolgens af in gedeïoniseerd water.
  3. Vlek het objectglaasje 2-4 minuten met hematoxyline en was het vervolgens 5 minuten met gedeïoniseerd water of totdat het helder is. De precieze duur van hematoxylinekleuring moet worden geoptimaliseerd voor het weefsel en de gewenste intensiteit van de nucleaire kleuring.
  4. Was in definiërende oplossing gedurende 30 s om vlekken te onderscheiden en was vervolgens 2 minuten in water. Was gedurende 30 s in blauwe kleurvormende oplossing en was vervolgens 2 minuten in water.
  5. Dehydrateer verder door 15x in 95% ethanol te dippen. Vlek eosine gedurende 1 min.
  6. Dehydrateer met 2 minuten ethanol wasbeurten (2x), gevolgd door 2 minuten xyleen wasbeurten (2x). Montagemedia en afdekglaasje aanbrengen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na linker hilarische klemming is de partiële zuurstofdruk in het arteriële bloed (PaO2) toegeschreven aan de linkerlong ~100 mmHg, significant lager in vergelijking met de ~500 mmHg na schijnthoracotomie (Figuur 7A, n=6-7). Merk op dat schijnthoracotomieën werden uitgevoerd bij B6-muizen met ABG-meting na 4 minuten rechter hilarische klemming, wat waarden vertegenwoordigt die alleen aan de linkerlong worden toegeschreven. H&E-kleuring van de hilarische afgeklemde linkerlong toonde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We beschrijven een hilarische klemtechniek waarbij een slipknot op het linker hilum wordt aangebracht die de longslagader en aders en bronchus afsluit om warme ischemie te induceren, gevolgd door reperfusie. Na hilarische klemming kan de linkerlong worden geoogst voor een verscheidenheid aan experimentele technieken zoals histologie, flowcytometrie, bulk- of single cell sequencing en kwantitatieve polymerasekettingreactie. Bovendien kunnen het bloed en de milt worden gebruikt om systemische effecten te bestuderen, terwij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs rapporteren geen relevante openbaarmakingen.

Dankbetuigingen

Dit werk ontving geen specifieke subsidie van een financieringsinstantie in de publieke, commerciële of non-profitsector.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Medicijnen
10% povidon-jodiumoplossingAplicareNDC 52380-0126-2Voor desinfectie
Buprenorfine 1,3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Voor pijnbestrijding
CarprofenCronus PharmaNDC 69043-027-18Voor pijnbestrijding
Heparine 1000 eenheden/mLSagentNDC 25021-404-01Voor het verkrijgen van arterieel bloed
Isofluraan 1%-1,5%Sigma Aldrich26675-46-7Voor anesthesie
Ketaminehydrochloride 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Voor anesthesie
Puralube Vet oogzalfMedi-Vet.com11897Om ooguitdroging te voorkomen
Xylazin 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20Voor pijnbestrijding
Gereedschappen en instrumenten
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231Om bloedvaten te coagularen
Gebogen muggenklemFine Science Tools13009-12Voor chirurgische procedure
Fijne gebogen pincettenFine Science Tools11274-20Voor chirurgische procedure
Fijne schaarFine Science Tools15040-11Voor chirurgische procedure
Intubatieklem set-upFine Science Tools18374-44, 18144-30Om muis verticaal vast te houden aan de tong tijdens intubatie. Zie Aanvullende Figuur 1A. 
Magnetische ribbenretractorenFine Science Tools18200-01, 18200-10Voor retractie van thoracotomie. Magnetische fixator en retractor moeten onderaan door micro latex buisjes worden verbonden.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μmEdmund Optics02-532Om de introducer voor de endotracheale buis te maken. Zie Aanvullend Figuur 1B. Een 1,5-inch lengte van deze optische vezel moet een stuk zijden tape op een van de uiteinden hebben. Het kan vervolgens worden gebruikt als een introducer voor de endotracheale buis. Het uiteinde van de introducer moet lichtjes gebogen zijn.
Power Pro Ultra clipperOster078400-020-001Om haar te knippen
SchaarFine Science Tools14370-22Voor chirurgische procedure
Verwarmingskussen voor kleine dierenK&H Pet ProductsThermo-Peep verwarmd kussenOm normothermie te handhaven
Kleine dieren ventilatorHarvard Apparatus55-0000Voor ventilatie (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 inch buitendiameter, 1/16 inch binnendiameter)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1Voor retractie van thoracotomie
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas AnalyzerNova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB  		Voor retractie van thoracotomie
Rechte klemFine Science Tools13008-12Voor chirurgische procedure
Rechte pincettenFine Science Tools91113-10Voor chirurgische procedure
Chirurgisch microscoopWild Heerbruggniet langer geproduceerdVoor intubatie en chirurgische procedure; aanbevolen vervanging door Leica chirurgische microscopen
Benodigdheden
1/2 cc spuit met 1/2 inch 29G naaldMcKesson942665Voor intraperitoneaal injecteren van ketamine/xylazine
1/2 inch 31G naald op een 1 cc tuberculine spuitMcKesson16-SNT1C2705Voor aspiratie van arterieel bloed uit de linker ventrikel
1-inch 20G IV katheterTerumoSROX2025CAVoor endotracheale buis (ETT)
1-inch zijden tapeDurapore3M ID 7100057168Om ETT aan de neus vast te plakken en om ledematen te beveiligen
3/10 cc spuit met 5/16 inch 31G naaldMcKesson102-SN310C31516PVoor injectie van antilichamen in de inferieure vena cava
6-0 monofilamentnaad op een P-10 naaldMcKessonS697GXVoor sluiting van thoracotomie, spierlaag en huid
6-0 zijden knoopSurgical Specialties LookSP102Om een slipknoop te maken voor hilar klem
Gespitsde wattenstaafjesSolon56225Om de long te manipuleren en voor blinde dissectie

Referenties

  1. Bharat, A., et al. Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection. Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).
  2. Daud, S. A. Impact of immediate primary lung allograft dysfunction on bronchiolitis obliterans syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 175 (5), 507-513 (2007).
  3. Halazun, K. J., Al-Mukhtar, A., Aldouri, A., Willis, S., Ahmad, N. Warm ischemia in transplantation: search for a consensus definition. Transplant Proc. 39 (5), 1329-1331 (2007).
  4. Warnecke, G., et al. Warm or cold ischemia in animal models of lung ischemia-reperfusion injury: is there a difference . Thorac Cardiovasc Surg. 52 (3), 174-179 (2004).
  5. Hasenauer, A., et al. Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).
  6. Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  7. Santos, P., Teixeira, P. J. Z., Moraes Neto, D. M., Cypel, M. Donation after circulatory death and lung transplantation. J Bras Pneumol. 48 (2), e20210369(2022).
  8. Moskowitzova, K., et al. Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (1), L78-L88 (2020).
  9. Nakata, K., et al. Functional blockage of S100A8/A9 ameliorates ischemia-reperfusion injury in the lung. Bioengineering (Basel). 9 (11), 673(2022).
  10. Nakata, K., et al. Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice. Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).
  11. Wang, Q., Li, Y., Wu, C., Wang, T., Wu, M. Aquaporin-1 inhibition exacerbates ischemia-reperfusion-induced lung injury in mouse. Am J Med Sci. 365 (1), 84-92 (2023).
  12. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. J Surg Res. 194 (2), 659-666 (2015).
  13. Zhang, X., et al. Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (4), L815-L829 (2002).
  14. Sharma, A. K., et al. Adenosine A2A receptor activation on CD4+ T lymphocytes and neutrophils attenuates lung ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 139 (2), 474-482 (2010).
  15. Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), discussion 702 695-702 (2009).
  16. Sayah, D. M., et al. Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).
  17. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 6 (7), 1672-1679 (2007).
  18. Hsiao, H. M. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  19. Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).
  20. Zanotti, G., et al. Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).
  21. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  22. Saito, M., et al. Pirfenidone alleviates lung ischemia-reperfusion injury in a rat model. J Thorac Cardiovasc Surg. 158 (1), 289-296 (2019).
  23. Tanaka, S., et al. Protective effects of Imatinib on ischemia/reperfusion injury in rat lung. Ann Thorac Surg. 102 (5), 1717-1724 (2016).
  24. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  25. Koletsis, E., et al. In situ cooling in a lung hilar clamping model of ischemia-reperfusion injury. Exp Biol Med (Maywood). 231 (8), 1410-1420 (2006).
  26. Hermsen, R., et al. Genomic landscape of rat strain and substrain variation. BMC Genomics. 16 (1), 357(2015).
  27. Beck, J. A., et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 24 (1), 23-25 (2000).
  28. Liao, W. I., et al. A mouse model of orotracheal intubation and ventilated lung ischemia reperfusion surgery. J Vis Exp. (187), 64383(2022).
  29. Murata, T., Nakazawa, H., Mori, I., Ohta, Y., Yamabayashi, H. Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis. Am Rev Respir Dis. 146 (4), 1048-1053 (1992).
  30. Ukita, R., et al. A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep. J Vis Exp. (173), 62694(2021).
  31. Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. J Vis Exp. (147), 59431(2019).
  32. Welbourn, C. R., et al. Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br J Surg. 78 (6), 651-655 (1991).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66232

Meer artikelen verkennen

Klemmen van het pulmonale hilumlongletsel bij muizenextravasatie van neutrofielenrekrutering van B-cellenflowcytometriethoracotomieprocedurearterieel bloedgaslongtransplantatiemodel
Muizen linker pulmonale hilarische klemmodel van longischemie reperfusieletsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.