Optimalisatie van visualisatie van axonaal transport van endogene lading door fluorescentiemicroscopie in levende Caenorhabditis elegans

Summary

Het artikel beschrijft de optimalisatie van de acquisitieparameters van fluorescentiemicroscopie om het axonale transport van endogene gelabelde ladingen met een resolutie van één neuron in een levende nematode te visualiseren.

Abstract

Axonaal transport is een voorwaarde om axonale eiwitten van hun syntheseplaats in het neuronale cellichaam naar hun bestemming in het axon te brengen. Bijgevolg schaadt verlies van axonaal transport de groei en functie van neuronen. Het bestuderen van axonaal transport verbetert daarom ons begrip van neuronale celbiologie. Met recente verbeteringen in CRISPR Cas9-genoombewerking is endogene etikettering van axonale ladingen toegankelijk geworden, waardoor het mogelijk is om verder te gaan dan op ectopische expressie gebaseerde visualisatie van transport. Endogene etikettering gaat echter vaak ten koste van een lage signaalintensiteit en vereist optimalisatiestrategieën om robuuste gegevens te verkrijgen. Hier beschrijven we een protocol om de visualisatie van axonaal transport te optimaliseren door acquisitieparameters te bespreken en een bleekbenadering om het signaal van endogene gelabelde lading over diffuse cytoplasmatische achtergrond te verbeteren. We passen ons protocol toe om de visualisatie van synaptische blaasjesprecursoren (SVP's) gelabeld door groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld RAB-3 te optimaliseren om te benadrukken hoe fijnafstemmingsacquisitieparameters de analyse van endogeen gelabelde axonale lading in Caenorhabditis elegans (C. elegans) kan verbeteren.

Introduction

Gedurende het hele leven zijn neuronen afhankelijk van axonaal transport om eiwitten, lipiden en andere moleculen van het cellichaam naar hun eindbestemming in het axon te brengen. Bijgevolg wordt verslechtering van het axonale transport geassocieerd met een verlies van neuronale functie en is het vaak betrokken bij de pathologie van neurodegeneratieve aandoeningen ^1,2. Daarom is het van groot belang om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan axonaal transport.

Decennialang onderzoek naar axonaal transport heeft veel belangrijke inzichten opgeleverd in de moleculaire machinerie die dit transport bemiddelt, hun samenstelling en regulerende mechanismen. Axonaal transport over lange afstand vindt plaats op het cytoskelet van de microtubuli, dat bestaat uit gedeeltelijk overlappende polymeren van microtubuli die typisch met hun plus-uiteinde in axonen zijn georiënteerd³. Bijgevolg wordt anterograde transport gemedieerd door motoreiwitten die naar het plus-uiteinde van microtubuli, kinesines, lopen, terwijl retrograde transport afhankelijk is van de min-end gerichte dyneïnemotor. Hoewel er veel aspecten van het transport zijn onthuld, blijft het voor veel axonale eiwitten nog steeds onduidelijk, hoe ze in de transportmachines worden geladen, hoe individuele transportpakketten zijn georganiseerd en hoe dit transport wordt gereguleerd³.

Axonaal transport werd aanvankelijk bestudeerd in experimenten met radiolabeling, waarbij radioactief gelabelde aminozuren in het somatische compartiment werden geïnjecteerd, waar ze werden opgenomen in ontluikende endogene eiwitten en in de loop van de tijd konden worden getraceerd in het axonale compartiment door autoradiografie⁴. Hoewel experimenten met radiolabeling de studie van axonaal transport van endogene eiwitten in vivo mogelijk maakten, maakt het geen directe follow-up van het gedrag van individuele vracht mogelijk om mechanistische inzichten te krijgen⁴. Deze beperking werd overwonnen met het gebruik van fluorescentiemicroscopie. axonaal transport wordt echter vaak niet gevisualiseerd op endogene eiwitten, maar in plaats daarvan door expressie van een fluorescerend gelabelde kopie. Vooral voor eiwitten met een lage expressie zorgt overexpressie voor hogere signaalintensiteiten die visualisatie mogelijk maken, bij voorkeur met een resolutie van één neuron. Bovendien omzeilt ectopische expressie van het fluorescerend gelabelde eiwit de noodzaak en uitdagingen van genoombewerking. Omgekeerd is betoogd dat het gedrag van ectopisch tot expressie gebrachte lading kan verschillen van het gedrag van de endogene lading⁵.

Recente verbeteringen in genoombewerking hebben endogene etiketteringsstrategieën gemakkelijker toegankelijk gemaakt. Vandaar dat een lagere signaalintensiteit de belangrijkste beperking is geworden om axonaal transport van een lading te bestuderen door ectopische expressie in plaats van endogene etikettering. Zorgvuldige overwegingen in de endogene etiketteringsstrategie in combinatie met een optimalisatie van de acquisitievoorwaarden kunnen deze uitdaging overwinnen.

Nematoden bieden een uitstekend onderzoeksmodel om axonaal transport in vivo te bestuderen vanwege hun transparantie en gemak bij genetische manipulaties. In dit protocol beschrijven we een onderzoeksstrategie om axonaal transport van endogene eiwitten met enkelvoudige neuronresolutie in levende Caenorhabditis elegans te visualiseren.We visualiseren het axonale transport van synaptische blaasjesprecursoren door gebruik te maken van een stam gegenereerd door het Jorgensen Lab⁶, waarin het blaasje geassocieerde RAB GTPase, RAB3, endogeen is gelabeld met GFP, in het motorneuron DA9. Door te vragen hoe kleine aanpassingen in verschillende acquisitieparameters en fotobleken de visualisatie van individuele transportgebeurtenissen kunnen verbeteren, geeft het protocol ideeën over hoe de beeldvormingsomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd.

Protocol

Voor een gedetailleerd protocol over het onderhouden en voorbereiden van nematoden voor beeldvorming van levende cellen, zie het werk van S.Niwa ⁷.

1. Generatie van wormstammen

Naast het genereren van nematodenstammen, bevat het Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ een groeiende verzameling nematodenstammen met endogeen fluorescerend gelabelde eiwitten die rechtstreeks van hun webpagina kunnen worden verkregen.

1. Keuze van de fluorescentie-etiketteringsstrategie
   1. Gebruik de nematodenstam MTS1161, die het rab-3 (ox699) allel⁶ bevat, om endogene GFP met het label RAB-3 in het DA9-motorneuron te visualiseren (de stam wordt afgezet bij de CGC). Om andere axonale eiwitten te visualiseren, genereert u een nematodenstam met een endogeen gelabeld eiwit met behulp van het CRISPR Cas9-bewerkingsprotocol van het Mello Lab⁹.
      OPMERKING: MTS1161 maakt gebruik van een recombinatiebenadering om celspecifiek RAB-3 endogeen te labelen met een GFP-tag⁶. Een veelgebruikte alternatieve benadering is gebaseerd op de reconstitutie van een gesplitst fluorescerend eiwit, dat wordt aanbevolen voor eiwitten met een bijzonder lage expressie, omdat het het aantal fluorescerende kopieën per endogeen eiwit verhoogt door gebruik te maken van meerdere gesplitste fluorescerende kopieën¹⁰. Het aantal kopieën kan in eerste instantie worden geschat op basis van transcriptoomdatasets van de CenGen-webpagina (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. Keuze van neuron om axonaal transport te visualiseren
   1. Visualiseer RAB-3 in het MTS1161 van de belasting in het motorneuron DA9 (zie figuur 1). Voor andere axonale ladingen, met name eiwitten met een lage expressie, identificeert u een neuron waarin de expressieniveaus van het geanalyseerde eiwit het hoogst zijn met behulp van de CenGen-webpagina.
      OPMERKING: Het CenGen-project (cengen.org) biedt een geweldige online bron om expressieniveaus te schatten voor een eiwit dat van belang is in veel neuronen van de nematode op basis van een grote transcriptomische dataset die alle 302 neuronen van het C. elegans-zenuwstelsel omvat^12,13.

2. Hanteren van wormen en voorbereiding op beeldvorming

1. Onderhoud nematoden op een gazon met bacteriën (stam: OP50) gezaaid op nematodengroeimediumplaten bij 20 °C en gekweekt tot een leeftijd van 1 dag tot in de volwassenheid voor beeldvorming.
   OPMERKING: Het meten van axonaal transport in een bepaald leeftijdsstadium is belangrijk omdat de transportsnelheden afnemen en de veroudering consistent verloopt tussen verschillende axonale ladingen, neuronklassen en organismen 14,15,16,17,18-Nematoden in larvale stadium L4 of 1 dag in de volwassenheid zijn in de meeste artikelen gebruikt en bieden dus de grootste datasets voor vergelijkingen.
2. Bereid nematoden voor op live celbeeldvorming: Voer alle volgende stappen uit met een stereomicroscoop om de wormen te visualiseren en te hanteren.
   1. Breng de nematoden over in een druppel van 0,5 mM Levamisol met behulp van een platinadraadprikker en incubeer de nematoden gedurende 20 minuten in de druppel.
   2. Monteer voorzichtig 10-20 nematoden uit de Levamisol-druppel in een druppel van 12 μL M9-medium op een 10% agarosepleister (opgelost in M9-medium) op een glasplaatje met behulp van een haarprikker. Voor een gedetailleerde procedure voor het maken van een 10% agarosepleister, zie het protocol van S.Niwa⁷.
      OPMERKING: Het monteren van een laag aantal nematoden is voldoende, aangezien er slechts een paar dieren per dia worden afgebeeld voordat de dieren last krijgen van hypoxie.
   3. Plaats een afdekglaasje op de druppel (22 mm x 22 mm of 18 mm x 18 mm). Voor beeldvormingstransport in het DA9-axon, plaatst u het axon dicht bij het afdekglaasje. Draai hiervoor het dekglaasje 45° nadat u het op de agarpleister hebt geplaatst, om de dieren op hun rug te rollen.
   4. Dicht de ruimte tussen het afdekglaasje en het glasplaatje af met een stroperige gel zoals vaseline. Dit voorkomt dat de agarosepleister uitdroogt, waardoor de nematoden uit het beeldvormingsveld kunnen drijven.
      LET OP: Het is van cruciaal belang om de dieren zo voorzichtig mogelijk te behandelen. Te hoge concentraties levamisol of fysieke schade aan de worm kunnen het axonale transport belemmeren. Milde spiertrekkingen van de staart tijdens de beeldvormingssessie zijn een goed teken dat het dier in een gezonde toestand blijft. Dieren blijven gezond en kunnen na de beeldvorming zelfs herstellen van de agarosepleister.

3. Levende-cel Microscopie

OPMERKING: Exacte waarden van de acquisitieparameters kunnen verschillen tussen microscopen. Trends voor elke acquisitieparameter moeten echter onafhankelijk zijn van de gebruikte microscoop. In dit protocol werd een confocale microscoop met een draaiende schijf gebruikt die was uitgerust met een aparte laserlijn voor bleken (zie Materiaaltabel voor details over de microscoop). Groene fluorescentie werd geëxciteerd door een laser van 488 nm en de emissie werd gefilterd door een ET525/36-emissiefilter. Het bleken werd uitgevoerd met behulp van een laserlijn van 488 nm.

1. Zorg ervoor dat de temperatuur van de kamer, of als er een temperatuurgecontroleerde fase beschikbaar is, op een constante temperatuur is ingesteld. Voor nematoden stelt u de temperatuur in op 20 °C.
2. Monteer het objectglaasje en gebruik de objectieflens met een vergroting van 4x-20x om de nematoden op het objectglaasje te lokaliseren en posities te onthouden. Schakel over naar een lens met een vergroting van 63x voor beeldacquisitie.
3. Maak een enkele afbeelding om de initiële acquisitieparameters te controleren. Volg de signaalintensiteiten in het gezichtsveld met het intensiteitshistogram van de acquisitiesoftware. Intensiteitswaarden moeten het laagste derde deel van het maximale signaal bestrijken dat de camera kan detecteren. Vermijd pixelverzadiging. Verhoog de intensiteit van de excitatielaser als de signaalintensiteit te laag is.
   OPMERKING: Gebruik geen te hoge excitatielaserintensiteiten, omdat het fluorescerende eiwit hierdoor tijdens de time-lapse wordt gebleekt.
4. Wijzig hier de acquisitieparameter en stappen om de detectie van fluorescentiesignalen te optimaliseren.
   1. Implementatie van een bleekstap: Bleekt het gebied van het axon dat wordt geanalyseerd met behulp van een laserlijn van 488 nm (vermogen: 15 mW) voor de bleekstap. Streef naar een bleekefficiëntie van minimaal 90%. Bepaal de bleekefficiëntie door de signaalintensiteit van het gebied voor en na de bleekstap te vergelijken.
      OPMERKING: Bleken versterkt het signaal van bewegende deeltjes door het signaal dat afkomstig is van stilstaande deeltjes te verlagen, evenals van het signaal dat afkomstig is van de cytoplasmatische fractie van het eiwit op de achtergrond. Vliezige lading, zoals RAB-3 op voorlopers van synaptische blaasjes, heeft een lage cytoplasmatische fractie, zodat de bleekstap het signaal van het transportpakket over de cytoplasmatische achtergrond slechts in geringe mate verbetert (Figuur 2A,D). Bleken verbetert echter het traceren van individuele transportgebeurtenissen over langere afstanden en maakt het mogelijk om pauzetijden te kwantificeren (Figuur 2A).
   2. Binning: Gebruik 2 x 2 binning om de signaalintensiteit van individuele transportgebeurtenissen te verbeteren. Binning combineert pixelarrays tot één grotere pixel. Dit zal de ruimtelijke resolutie verminderen, maar de signaalintensiteit van individuele transportgebeurtenissen verbeteren en is vooral nuttig voor zwakke deeltjes (Figuur 2B,D).
   3. Belichtingstijd: Verbeter de belichtingstijd om de signaalintensiteit te verbeteren. Door de belichtingstijd te verbeteren, wordt de signaalintensiteit van het monster verhoogd ten koste van het verkrijgen van een lagere temporele resolutie voor de transportgebeurtenissen. Gebruik voor het experiment hier een temporele resolutie van 300 ms tot 700 ms tussen opeenvolgende tijdstippen (100-500 ms belichtingstijd) om individuele transportgebeurtenissen van RAB-3 te volgen. (Figuur 2C,D)
5. Time-lapse-opname: Maak een time-lapse van ten minste 1-3 minuten, afhankelijk van de signaalintensiteit van het eiwit en de frequentie van individuele transportgebeurtenissen. Zodra een time-lapse is opgenomen, ga je naar het volgende dier. Dieren op een objectglaasje mogen niet langer dan 30 minuten worden afgebeeld om er zeker van te zijn dat de geregistreerde dieren in een gezonde toestand verkeren.
   OPMERKING: Milde spiertrekkingen van de staart van de dieren tijdens de opname zijn een indicatie dat het dier nog in leven is.

4. Analyse van axonale transportgegevens

OPMERKING: Gebruik ImageJ/Fiji¹⁹ voor de volgende stappen voor beeldanalyse. Fiji is in staat om gegevens uit te lezen door alle gangbare microscopie softwarepakketten.

1. Kymograaf generatie
   1. Gegevens importeren: Importeer het time-lapse-gegevensbestand in Fiji. Als het de gegevens niet in Fiji kan importeren, exporteer dan de tijdregistratie als een tiff-bestand uit het softwarepakket en laad het vervolgens in Fiji.
   2. Driftcorrectie: Controleer of het dier/axonsegment is bewogen of licht is afgedreven tijdens de beeldacquisitie. Corrigeer voor bewegingen of driften van dieren door de plug-in StackReg²⁰ uit te voeren. Kies bij het uitvoeren van de plug-in voor de Rigid Body-transformatie .
   3. Handmatig genereren van een kymograaf: Een gedetailleerde stapsgewijze procedure is weergegeven in figuur 3. Gebruik de driftgecorrigeerde film om de kymograaf te genereren. Gebruik het gereedschap Gesegmenteerde lijn en pas de lijndikte aan zodat deze overeenkomt met de axondiameter door met de linkermuisknop te dubbelklikken op het pictogram voor de gesegmenteerde lijn om een lijn langs het axonsegment te tekenen die zal worden geanalyseerd. Voer de ImageJ/Fiji-plug-in Kymoreslicewide uit om de kymograaf te genereren en gebruik de maximale intensiteitswaarde over de breedte van de lijn in de parameterinstellingen.
      OPMERKING: Door consistentie in de lijntrekrichting te behouden (bijv. altijd proximaal ten opzichte van het distale axon of omgekeerd) wordt het traceren van de terugbewegingsrichting in de kymografen vereenvoudigd.
2. Analyse van de transportparameter
   1. Bereken de transportparameter: gebeurtenisnummer, snelheid, looplengte en pauzeduur van de kymograaf door de volgende stappen te volgen.
      1. Transportgebeurtenissen traceren in de kymograaf: Gebruik het gereedschap Rechte lijn om afzonderlijke transportgebeurtenissen op de kymograaf te traceren. Sla elke regel op in de ROI-manager en traceer alle transportgebeurtenissen in de kymograaf. Kies de volgende meetparameters in ImageJ/Fiji: Gebied, Begrenzingsrechthoek, Gemiddelde grijswaarde, Feret's diameter.
      2. Transportparameter berekenen: Plak de resultatentabel in een spreadsheet en gebruik de volgende kolommen van de resultaatsecties om te berekenen:
         Looplengte: Vermenigvuldig de breedte (in pixels) met de resolutie van de camera (bijv. x μm/pxl) om de looplengte in μm te bepalen.
         Snelheid: Duur van de looptijd/duur van de looptijd. Om de duur van een bewegingsgebeurtenis in seconden te bepalen, vermenigvuldigt u de hoogte (in pixel) met de acquisitietijd tussen opeenvolgende tijdstippen (bijv. x s/pixel).
         Pauzetijd: Duur van de run tussen twee opeenvolgende bewegingen waarbij de snelheid 0 is.
         Gebeurtenisnummer: Het totale aantal gebeurtenissen kan worden genormaliseerd naar de totale lengte van de kymograaf om het gebeurtenisnummer per minuut en het axonlengtesegment te bepalen. Gebeurtenissen kunnen verder worden onderverdeeld in anterograde en retrograde transportgebeurtenissen. Om de richting van elke bewegingsgebeurtenis te bepalen, gebruikt u het gereedschap Feret Angle. In kymografen die oorspronkelijk werden gegenereerd door de gesegmenteerde lijn van proximaal naar distaal te trekken en de anterograde transportgebeurtenissen in de kymograaf van rechts naar links wijzen, zal een Feret-hoek < 90° een anterograde en >90° een retrograde gebeurtenis aangeven, anders zal het het omgekeerde zijn.

Results

Overzicht van het modelsysteem en de meetprocedure
Om axonaal transport van voorlopers van synaptische blaasjes te visualiseren, hebben we endogeen GFP-gelabeld RAB-3 getraceerd. Hier maken we gebruik van een recent gegenereerde GFP::Flip-on::RAB-3 stam⁶, waarin expressie van de recombinase Flippase onder een celspecifieke promotor (glr-4p) endogene RAB-3 labelt in het DA9 motorneuron. DA9 is een bipolair motorneuron, waarvan het cellichaam zich in het achterste deel van het dier aan de ventrale zijde bevindt, dicht bij de anus (Figuur 1A). Het bevat een korte dendriet die anterieur langs het ventrale zenuwkoord loopt en een lang axon dat naar achteren loopt, een commissuur vormt en vervolgens anterieur langs het dorsale zenuwkoord loopt, waar het en passant synapsen vormt die de dorsale spier en VD-neuron^{innerveren 22,23,24}. We visualiseren axonaal transport in het asynaptische gebied; de meeste transportgebeurtenissen kunnen worden vastgelegd met een enkel brandpuntsvlak (Figuur 1A). Een eerste stap voor fotobleken wordt uitgevoerd om de achtergrond van stationaire blaasjes in dit gebied te verminderen, die in dit gebied vaak de neiging hebben om te pauzeren (Figuur 1B). Time-lapse-video's worden gedurende 3 minuten opgenomen en het RAB-3-signaal langs het asynaptische gebied wordt uitgezet in een kymograaf om individuele transportgebeurtenissen te extraheren (Figuur 1C).

Aanpassing van de acquisitieparameter om de visualisatie van axonaal transport te optimaliseren
Om de lage signaalintensiteit van veel endogeen fluorescerend gelabelde eiwitten te overwinnen, moeten de acquisitieparameters van de microscoop worden geoptimaliseerd. Voor een robuuste kwantificering van transportgebeurtenissen moet de signaalintensiteit van individuele transportgebeurtenissen zo helder mogelijk zijn over de cytoplasmatische achtergrond of pauzerende, stationaire lading. Precursoren van synaptische blaasjes pauzeren vaak in het asynaptische gebied in verschillende blaasjespoelen, die de detectie van nieuwe binnenkomende blaasjes verstoren en het moeilijk maken om hun transportsporen te volgen⁷.

Een enkele initiële fluorescentiebleekstap kan het fluorescentiesignaal dat afkomstig is van de blaasjesbaden sterk verminderen om de bewegingsdetectie van nieuwe binnenkomende blaasjes te verbeteren (Figuur 2A). De bleekstap versterkte slechts licht het signaal van bewegende RAB-3-blaasjes boven de cytoplasmatische achtergrondintensiteit, waarschijnlijk omdat de cytoplasmatische fractie van RAB-3 erg laag is (Figuur 2D).

Het gebruik van binning biedt een extra laag om het signaal op de achtergrond van individuele transportgebeurtenissen te verbeteren door een reeks pixels te combineren tot een enkele pixel. Een 2 x 2 binning zal de ruimtelijke resolutie halveren (hier van 108,33 nm/pixel naar 216,7 nm/pixel), wat nog steeds voldoende is om individuele RAB-3-transportdeeltjes te traceren (Figuur 2B), maar de signaalintensiteit van individuele blaasjes sterk verbetert (Figuur 2D). Tenzij een zeer hoge ruimtelijke resolutie vereist is, kan binning ook worden toegepast om vele andere axonale ladingen te visualiseren.

Vervolgens vroegen we ons af hoe veranderingen in de belichtingstijd de signaalintensiteit van enkelvoudige transportgebeurtenissen kunnen verbeteren. We hebben vooral de belichtingstijd in de analyse opgenomen om ook aan te tonen dat een belichtingstijd tot 500 ms met 700 ms tussen de opeenvolgende beeldvormingstijdstippen nog steeds een temporele resolutie biedt waarbij de voorlopers van synaptische blaasjes kunnen worden gevolgd (Figuur 2C,D).

Kymografen genereren en analyseren met Fiji
Om een kymograaf te genereren en individuele transportgebeurtenissen te analyseren volgens de stappen in Figuur 3.

Figuur 1: Overzicht van het modelsysteem om axonaal transport van endogene fluorescerende RAB-3 te visualiseren. (A) Bovenste paneel: Overzicht van de nematode met aangegeven posterieure-anterieure en ventrale-dorsale as. Het motorneuron DA9 is blauw gelabeld. Middenpaneel: Inzoomen op het gebied in het kader dat in het bovenste paneel wordt weergegeven met de aangegeven DA9-compartimentering. En passant synapsen worden in groen geïllustreerd, * geeft de anus aan. Merk op dat het axon doorgaat in het dorsale zenuwkoord totdat het de vulva passeert. Het rode vak geeft het gebied van de asynaptische zone aan. Onderste paneel: confocaal microscopiebeeld van endogene GFP gelabeld RAB-3 in het proximale axon in een enkel brandpuntsvlak. Merk op dat er blaasjes zijn van langer pauzerende RAB-3 in het asynaptische gebied, hoewel de meeste RAB-3-signaalclusters in het synaptische gebied zijn. Het asynaptische gebied is rood omkaderd. Schaal: 20 μm. (B) Representatieve beelden van een time-lapse-opname om axonaal transport te visualiseren. Om de traceerbaarheid van individuele transportdeeltjes ten opzichte van stationaire deeltjes te verbeteren, wordt het asynaptische gebied in eerste instantie fotogebleekt. Onderste panelen in een paars omkaderd gebied tonen een voorbeeld van een anterograde (oranje pijlpunt) en retrograde (blauwe pijlpunt) bewegingsgebeurtenis. Deelvensters van boven naar beneden vertegenwoordigen opeenvolgende tijdstippen. (C) Time-lapse-opname in (B) werd uitgezet als een kymograaf (2D-weergave van tijd over positie). Diagonale lijnen staan voor bewegingsgebeurtenissen waarbij de helling de snelheid aangeeft. Verticale lijnen geven stilstaande gebeurtenissen weer. Paarse doos is een inzoomen op de kymograaf om de transportgebeurtenissen te markeren die ook in (B) worden weergegeven en de anterograde (oranje) en retrograde (blauwe) transportgebeurtenissen worden getraceerd. Verticale stippellijnen geven de pauzegebeurtenissen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Optimalisatie van acquisitiestappen en parameters om de visualisatie van endogene axonale lading te verbeteren. Endogene GFP::RAB-3 werden gevisualiseerd in de asynaptische zone van het DA9-axon, waarbij beelden werden gemaakt van een enkel brandvlak op een confocale draaiende schijfmicroscoop. Kymografen werden aangeschaft om individuele transportgebeurtenissen in anterograde (van rechts naar links) en retrograde (van links naar rechts) richting (A-C) te visualiseren. (A) Kymografen tonen RAB3-transportgebeurtenissen zonder (linker kymografen) of met een geïntegreerde bleekstap. Merk op dat de bleekstap de visualisatie van pauzegebeurtenissen (aangegeven door gele pijlpunten) tussen opeenvolgende transportgebeurtenissen (oranje pijlpunten) verbetert. (B) Het implementeren van 2 x 2 binning helpt om de signaalintensiteit van zwakke RAB3-transportgebeurtenissen te verbeteren. De beelden werden verkregen met een belichtingstijd van 300 ms en met (C) een stapsgewijze verhoging van de belichtingstijd (van 100 ms uiterst links tot 500 ms uiterst rechts) helpt dit om de signaalintensiteit van individuele transportgebeurtenissen te verbeteren. Beelden werden verkregen bij 2 x 2 binning en met behulp van een eerste fotobleekstap. Alle kymografen geven een totale duur van 3 minuten weer en zijn op dezelfde schaal getekend, zodat kymografen met minder verwervingstijdstippen als gevolg van een langere tijdspanne tussen opeenvolgende beeldvormingspunten een kortere totale lengte van de kymograaf hebben. (D) Kwantificering van de signaalintensiteit per transportgebeurtenis na aftrek van achtergrondfluorescentie van kymografen in (A-C). Merk op dat binning en de stap voor het bleken van foto's zijn verkregen bij een belichtingstijd van 300 ms. Statistische vergelijking met behulp van n gebeurtenissen gedurende 100 ms (n_{gebeurtenissen} = 27 in n_dieren = 2), 200 ms (n_{gebeurtenissen} = 30 in n_dieren = 2), 300 ms (n_{gebeurtenissen} = 88 in n_dieren = 6), 500 ms (n_{gebeurtenissen} = 12 in n_dieren = 1), 300 ms zonder (w.o.) binning (n_events = 31 in n_dieren= 3), 300 ms met (w) binning (n_events = 88 in n_dieren = 6) en 300 ms, 2 x 2 binningen met bleken (n_events = 88 in n_dieren= 6) en zonder bleken. Elk datapunt vertegenwoordigt de signaalintensiteit van een individuele RAB-3-transportgebeurtenis na achtergrondaftrekking (cytoplasma van het axon) op een enkel tijdstip langs het willekeurig gekozen spoor. De belichtingstijd werd vergeleken met behulp van een Kruskal-Wallis-test, gevolgd door Dunn's meervoudige vergelijking, binning en fotobleken werden vergeleken met behulp van een paarsgewijze Mann-Whitney-test. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Stapsgewijze procedure voor het genereren van een kymograaf en het meten van individuele transportgebeurtenissen. (A) Nadat de video-opname in Fiji is geladen, wordt de tool voor gesegmenteerde lijnen gebruikt om een lijn te traceren over de lengte van het axonale segment dat moet worden geanalyseerd. (B) Een kymograaf (rechterpaneel) wordt gegenereerd met behulp van de Kymoreslicewide-plug-in met de parameters die in het linkerpaneel worden weergegeven. (C) Individuele transportgebeurtenissen worden getraceerd met de lineaire lijntool en opgeslagen in de ROI-manager. Het rechterpaneel toont de meetinstellingen die worden gebruikt om de resultatentabel te genereren. (D) De resultaten in de tabel worden gebruikt om de transportparameter te berekenen. Vakjes geven belangrijke parameters aan die worden beschreven in de sectie methoden van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Beperkingen van de methode en alternatieve methoden
In dit protocol hebben we acquisitieparameters geoptimaliseerd om het axonale transport van endogeen gelabeld RAB-3 te visualiseren, dat geassocieerd is met voorlopers van synaptische blaasjes. Om RAB-3 te visualiseren, hebben we gebruik gemaakt van een recent gepubliceerde FLIP-on::GFP::RAB-3 stam⁶ en de recombinase Flippase tot expressie gebracht onder een celspecifieke promotor (glr-4p)²⁵. Deze strategie stelt ons in staat om RAB-3 te labelen met een enkele GFP-fluorofoor. RAB-3 is relatief gemakkelijk te visualiseren omdat het sterk tot expressie wordt gebracht en sterk verrijkt is op voorlopers van synaptische blaasjes, zodat individuele transportgebeurtenissen een heldere signaalintensiteit hebben ten opzichte van een laag signaal dat afkomstig is van de cytoplasmatische achtergrond. Andere axonale eiwitten kunnen aanvullende optimalisatiestrategieën vereisen buiten de microscopie-instellingen om de visualisatie van transportgebeurtenissen mogelijk te maken. Vooral voor eiwitten met een lage expressie biedt het split-GFP-systeem een prima alternatief. In dit systeem wordt GFP₁₁ ingebracht in de endogene locus van het betreffende eiwit en wordt GFP_1-10 tot expressie gebracht door een celspecifieke promotor. Een groot voordeel van dit systeem is de kleine omvang van het DNA-reparatiesjabloon (ongeveer 70 nucleotiden) dat genomisch moet worden ingebracht, waardoor homologe recombinatie efficiënter is in vergelijking met het inbrengen van de ORF van de gehele fluorescerende tag^26,27. Vanwege zijn kleine formaat kunnen meerdere GFP_{11-fragmenten} in het endogene eiwit worden ingebracht, waardoor het aantal gereconstitueerde GFP-fluoroforen per eiwit wordt versterkt en zo het fluorescerende signaal van het endogene eiwit en dus van het transportpakket wordt versterkt²⁸.

Naast het labelen van het eiwit met een split-GFP- of GFP-benadering, kunnen andere genetisch gecodeerde fluoroforen worden gebruikt die unieke voor- en nadelen hebben met betrekking tot hun fotochemische eigenschappen, die onlangs zijn vergeleken²⁹. Bovendien kunnen chemische fluoroforen met meer fotografische eigenschappen worden gebruikt door het betreffende eiwit endogeen te labelen met een HALO- of SNAP-tag³⁰.

Vooral voor cytoplasmatische eiwitten die overvloedig aanwezig zijn in het hele axon, kan een voorwaardelijke etiketteringsbenadering nodig zijn. We hebben onlangs zo'n lading, endogeen spectrine, gevisualiseerd door middel van fluorescentiemicroscopie met behulp van tijdelijk gecontroleerde etikettering om alleen nieuwe gesynthetiseerde spectrine-eiwitten te visualiseren. Voor voorwaardelijke labeling met een resolutie van één neuron, combineerden we door hitteschok aangedreven expressie van een recombinase met een split-GFP-systeem³¹.

Als het onderzoeksdoel gericht is op het begrijpen van het transport van organellen, kan expressie van een eiwitdomein dat associeert met de organel een alternatief bieden voor het ectopisch tot expressie brengen van het volledige eiwit.

Cruciale stappen in het protocol
Een zorgvuldige voorbereiding om de visualisatie van het eiwit te optimaliseren op basis van verwachte expressieniveaus en om de optimale etiketteringsstrategie te kiezen, is vooral van cruciaal belang voor de succesvolle visualisatie van endogene gelabelde eiwitten. Expressieniveaus voor het meeste eiwit in veel neuronen kunnen worden geschat op basis van de transcriptomische dataset van Cengen¹³. De verwachte lage signaalintensiteit van transportgebeurtenissen voor eiwitten met een lage expressie of cytoplasmatische eiwitten kan worden verbeterd door meerdere kopieën van de fluorofoor aan te sluiten. Merk echter op dat bij elk etiketteringsexperiment ervoor moet worden gezorgd dat de functie van het gelabelde eiwit niet wordt verstoord. Als er een bekend fenotype is voor de overeenkomstige mutant, is het belangrijk om te controleren of etikettering dit fenotype niet genereert. In gevallen waarin er geen fenotype bekend is, zijn alternatieve benaderingen nodig die van geval tot geval kunnen verschillen.

Een cruciale stap in de beeldvorming van axonale transportgebeurtenissen is de gezondheidstoestand van het dier. De dieren moeten zo voorzichtig mogelijk worden behandeld voor de voorbereiding van de beeldvorming en tijdens de beeldvorming (bijv. gebruik van een haarstoker in plaats van een metaaldraad om verlamde dieren over te brengen, minimalisering van de incubatietijd in het verlammende middel, minimaliseer de beeldvormingstijd om fototoxiciteit te voorkomen).

Wijzigingen en probleemoplossing
Hoewel we van plan zijn om de visualisatie van axonaal transport van endogene eiwitten te optimaliseren, zijn de optimalisatiestrategieën voor acquisitieparameters ook van toepassing op ectopische tot expressie gebrachte eiwitten. Vooral als de endogene expressieniveaus te laag zijn om transportgebeurtenissen te visualiseren, kan ectopische expressie van het eiwit een alternatief bieden.

Als er ondanks een sterke signaalintensiteit van het endogene gelabelde eiwit geen transportgebeurtenissen kunnen worden geregistreerd, kunnen de dieren in een ongezonde toestand verkeren. Dit kan worden opgelost door dieren voor te bereiden op microscopie volgens zachtere bereidingsprocedures (bijv. de incubatietijd in het verlammingsmiddel verkorten). Als alternatief kunnen transportgebeurtenissen zeldzaam zijn en is een video-opname van 3 minuten mogelijk niet voldoende om gebeurtenissen vast te leggen. Het vastleggen van zeldzame transportgebeurtenissen kan worden geoptimaliseerd door de duur van de video-opname te verlengen, door het aantal afgebeelde dieren te vergroten of door de dieren in een ander ontwikkelingsstadium af te beelden waarin transportgebeurtenissen frequenter kunnen zijn.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software voor de Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Bron
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Zal worden gedeponeerd bij CGC (https://cgc.umn.edu/)