Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Optimalisatie van visualisatie van axonaal transport van endogene lading door fluorescentiemicroscopie in levende Caenorhabditis elegans

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66236

⸱

16 februari 2024

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Yale School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het artikel beschrijft de optimalisatie van de acquisitieparameters van fluorescentiemicroscopie om het axonale transport van endogene gelabelde ladingen met een resolutie van één neuron in een levende nematode te visualiseren.

Samenvatting

Axonaal transport is een voorwaarde om axonale eiwitten van hun syntheseplaats in het neuronale cellichaam naar hun bestemming in het axon te brengen. Bijgevolg schaadt verlies van axonaal transport de groei en functie van neuronen. Het bestuderen van axonaal transport verbetert daarom ons begrip van neuronale celbiologie. Met recente verbeteringen in CRISPR Cas9-genoombewerking is endogene etikettering van axonale ladingen toegankelijk geworden, waardoor het mogelijk is om verder te gaan dan op ectopische expressie gebaseerde visualisatie van transport. Endogene etikettering gaat echter vaak ten koste van een lage signaalintensiteit en vereist optimalisatiestrategieën om robuuste gegevens te verkrijgen. Hier beschrijven we een protocol om de visualisatie van axonaal transport te optimaliseren door acquisitieparameters te bespreken en een bleekbenadering om het signaal van endogene gelabelde lading over diffuse cytoplasmatische achtergrond te verbeteren. We passen ons protocol toe om de visualisatie van synaptische blaasjesprecursoren (SVP's) gelabeld door groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld RAB-3 te optimaliseren om te benadrukken hoe fijnafstemmingsacquisitieparameters de analyse van endogeen gelabelde axonale lading in Caenorhabditis elegans (C. elegans) kan verbeteren.

Inleiding

Gedurende het hele leven zijn neuronen afhankelijk van axonaal transport om eiwitten, lipiden en andere moleculen van het cellichaam naar hun eindbestemming in het axon te brengen. Bijgevolg wordt verslechtering van het axonale transport geassocieerd met een verlies van neuronale functie en is het vaak betrokken bij de pathologie van neurodegeneratieve aandoeningen 1,2. Daarom is het van groot belang om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan axonaal transport.

Decennialang onderzoek naar axonaal transport heeft veel belangrijke inzichten opgeleverd in de moleculaire machinerie die dit transport bemiddelt, hun samenstelling en regulerende mechanismen. Axonaal transport over lange afstand vindt plaats op het cytoskelet van de microtubuli, dat bestaat uit gedeeltelijk overlappende polymeren van microtubuli die typisch met hun plus-uiteinde in axonen zijn georiënteerd3. Bijgevolg wordt anterograde transport gemedieerd door motoreiwitten die naar het plus-uiteinde van microtubuli, kinesines, lopen, terwijl retrograde transport afhankelijk is van de min-end gerichte dyneïnemotor. Hoewel er veel aspecten van het transport zijn onthuld, blijft het voor veel axonale eiwitten nog steeds onduidelijk, hoe ze in de transportmachines worden geladen, hoe individuele transportpakketten zijn georganiseerd en hoe dit transport wordt gereguleerd3.

Axonaal transport werd aanvankelijk bestudeerd in experimenten met radiolabeling, waarbij radioactief gelabelde aminozuren in het somatische compartiment werden geïnjecteerd, waar ze werden opgenomen in ontluikende endogene eiwitten en in de loop van de tijd konden worden getraceerd in het axonale compartiment door autoradiografie4. Hoewel experimenten met radiolabeling de studie van axonaal transport van endogene eiwitten in vivo mogelijk maakten, maakt het geen directe follow-up van het gedrag van individuele vracht mogelijk om mechanistische inzichten te krijgen4. Deze beperking werd overwonnen met het gebruik van fluorescentiemicroscopie. axonaal transport wordt echter vaak niet gevisualiseerd op endogene eiwitten, maar in plaats daarvan door expressie van een fluorescerend gelabelde kopie. Vooral voor eiwitten met een lage expressie zorgt overexpressie voor hogere signaalintensiteiten die visualisatie mogelijk maken, bij voorkeur met een resolutie van één neuron. Bovendien omzeilt ectopische expressie van het fluorescerend gelabelde eiwit de noodzaak en uitdagingen van genoombewerking. Omgekeerd is betoogd dat het gedrag van ectopisch tot expressie gebrachte lading kan verschillen van het gedrag van de endogene lading5.

Recente verbeteringen in genoombewerking hebben endogene etiketteringsstrategieën gemakkelijker toegankelijk gemaakt. Vandaar dat een lagere signaalintensiteit de belangrijkste beperking is geworden om axonaal transport van een lading te bestuderen door ectopische expressie in plaats van endogene etikettering. Zorgvuldige overwegingen in de endogene etiketteringsstrategie in combinatie met een optimalisatie van de acquisitievoorwaarden kunnen deze uitdaging overwinnen.

Nematoden bieden een uitstekend onderzoeksmodel om axonaal transport in vivo te bestuderen vanwege hun transparantie en gemak bij genetische manipulaties. In dit protocol beschrijven we een onderzoeksstrategie om axonaal transport van endogene eiwitten met enkelvoudige neuronresolutie in levende Caenorhabditis elegans te visualiseren.We visualiseren het axonale transport van synaptische blaasjesprecursoren door gebruik te maken van een stam gegenereerd door het Jorgensen Lab6, waarin het blaasje geassocieerde RAB GTPase, RAB3, endogeen is gelabeld met GFP, in het motorneuron DA9. Door te vragen hoe kleine aanpassingen in verschillende acquisitieparameters en fotobleken de visualisatie van individuele transportgebeurtenissen kunnen verbeteren, geeft het protocol ideeën over hoe de beeldvormingsomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor een gedetailleerd protocol over het onderhouden en voorbereiden van nematoden voor beeldvorming van levende cellen, zie het werk van S.Niwa 7.

1. Generatie van wormstammen

Naast het genereren van nematodenstammen, bevat het Caenorhabditis Genetics Center (CGC)8 een groeiende verzameling nematodenstammen met endogeen fluorescerend gelabelde eiwitten die rechtstreeks van hun webpagina kunnen worden verkregen.

  1. Keuze van de fluorescentie-etiketteringsstrategie
    1. Gebruik de nematodenstam MTS1161, die het rab-3 (ox699) allel6 bevat, om endogene GFP met het label RAB-3 in het DA9-motorneuron te visualiseren (de stam wordt afgezet bij de CGC). Om andere axonale eiwitten te visualiseren, genereert u een nematodenstam met een endogeen gelabeld eiwit met behulp van het CRISPR Cas9-bewerkingsprotocol van het Mello Lab9.
      OPMERKING: MTS1161 maakt gebruik van een recombinatiebenadering om celspecifiek RAB-3 endogeen te labelen met een GFP-tag6. Een veelgebruikte alternatieve benadering is gebaseerd op de reconstitutie van een gesplitst fluorescerend eiwit, dat wordt aanbevolen voor eiwitten met een bijzonder lage expressie, omdat het het aantal fluorescerende kopieën per endogeen eiwit verhoogt door gebruik te maken van meerdere gesplitste fluorescerende kopieën10. Het aantal kopieën kan in eerste instantie worden geschat op basis van transcriptoomdatasets van de CenGen-webpagina (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) 11.
  2. Keuze van neuron om axonaal transport te visualiseren
    1. Visualiseer RAB-3 in het MTS1161 van de belasting in het motorneuron DA9 (zie figuur 1). Voor andere axonale ladingen, met name eiwitten met een lage expressie, identificeert u een neuron waarin de expressieniveaus van het geanalyseerde eiwit het hoogst zijn met behulp van de CenGen-webpagina.
      OPMERKING: Het CenGen-project (cengen.org) biedt een geweldige online bron om expressieniveaus te schatten voor een eiwit dat van belang is in veel neuronen van de nematode op basis van een grote transcriptomische dataset die alle 302 neuronen van het C. elegans-zenuwstelsel omvat12,13.

2. Hanteren van wormen en voorbereiding op beeldvorming

  1. Onderhoud nematoden op een gazon met bacteriën (stam: OP50) gezaaid op nematodengroeimediumplaten bij 20 °C en gekweekt tot een leeftijd van 1 dag tot in de volwassenheid voor beeldvorming.
    OPMERKING: Het meten van axonaal transport in een bepaald leeftijdsstadium is belangrijk omdat de transportsnelheden afnemen en de veroudering consistent verloopt tussen verschillende axonale ladingen, neuronklassen en organismen 14,15,16,17,18-Nematoden in larvale stadium L4 of 1 dag in de volwassenheid zijn in de meeste artikelen gebruikt en bieden dus de grootste datasets voor vergelijkingen.
  2. Bereid nematoden voor op live celbeeldvorming: Voer alle volgende stappen uit met een stereomicroscoop om de wormen te visualiseren en te hanteren.
    1. Breng de nematoden over in een druppel van 0,5 mM Levamisol met behulp van een platinadraadprikker en incubeer de nematoden gedurende 20 minuten in de druppel.
    2. Monteer voorzichtig 10-20 nematoden uit de Levamisol-druppel in een druppel van 12 μL M9-medium op een 10% agarosepleister (opgelost in M9-medium) op een glasplaatje met behulp van een haarprikker. Voor een gedetailleerde procedure voor het maken van een 10% agarosepleister, zie het protocol van S.Niwa7.
      OPMERKING: Het monteren van een laag aantal nematoden is voldoende, aangezien er slechts een paar dieren per dia worden afgebeeld voordat de dieren last krijgen van hypoxie.
    3. Plaats een afdekglaasje op de druppel (22 mm x 22 mm of 18 mm x 18 mm). Voor beeldvormingstransport in het DA9-axon, plaatst u het axon dicht bij het afdekglaasje. Draai hiervoor het dekglaasje 45° nadat u het op de agarpleister hebt geplaatst, om de dieren op hun rug te rollen.
    4. Dicht de ruimte tussen het afdekglaasje en het glasplaatje af met een stroperige gel zoals vaseline. Dit voorkomt dat de agarosepleister uitdroogt, waardoor de nematoden uit het beeldvormingsveld kunnen drijven.
      LET OP: Het is van cruciaal belang om de dieren zo voorzichtig mogelijk te behandelen. Te hoge concentraties levamisol of fysieke schade aan de worm kunnen het axonale transport belemmeren. Milde spiertrekkingen van de staart tijdens de beeldvormingssessie zijn een goed teken dat het dier in een gezonde toestand blijft. Dieren blijven gezond en kunnen na de beeldvorming zelfs herstellen van de agarosepleister.

3. Levende-cel Microscopie

OPMERKING: Exacte waarden van de acquisitieparameters kunnen verschillen tussen microscopen. Trends voor elke acquisitieparameter moeten echter onafhankelijk zijn van de gebruikte microscoop. In dit protocol werd een confocale microscoop met een draaiende schijf gebruikt die was uitgerust met een aparte laserlijn voor bleken (zie Materiaaltabel voor details over de microscoop). Groene fluorescentie werd geëxciteerd door een laser van 488 nm en de emissie werd gefilterd door een ET525/36-emissiefilter. Het bleken werd uitgevoerd met behulp van een laserlijn van 488 nm.

  1. Zorg ervoor dat de temperatuur van de kamer, of als er een temperatuurgecontroleerde fase beschikbaar is, op een constante temperatuur is ingesteld. Voor nematoden stelt u de temperatuur in op 20 °C.
  2. Monteer het objectglaasje en gebruik de objectieflens met een vergroting van 4x-20x om de nematoden op het objectglaasje te lokaliseren en posities te onthouden. Schakel over naar een lens met een vergroting van 63x voor beeldacquisitie.
  3. Maak een enkele afbeelding om de initiële acquisitieparameters te controleren. Volg de signaalintensiteiten in het gezichtsveld met het intensiteitshistogram van de acquisitiesoftware. Intensiteitswaarden moeten het laagste derde deel van het maximale signaal bestrijken dat de camera kan detecteren. Vermijd pixelverzadiging. Verhoog de intensiteit van de excitatielaser als de signaalintensiteit te laag is.
    OPMERKING: Gebruik geen te hoge excitatielaserintensiteiten, omdat het fluorescerende eiwit hierdoor tijdens de time-lapse wordt gebleekt.
  4. Wijzig hier de acquisitieparameter en stappen om de detectie van fluorescentiesignalen te optimaliseren.
    1. Implementatie van een bleekstap: Bleekt het gebied van het axon dat wordt geanalyseerd met behulp van een laserlijn van 488 nm (vermogen: 15 mW) voor de bleekstap. Streef naar een bleekefficiëntie van minimaal 90%. Bepaal de bleekefficiëntie door de signaalintensiteit van het gebied voor en na de bleekstap te vergelijken.
      OPMERKING: Bleken versterkt het signaal van bewegende deeltjes door het signaal dat afkomstig is van stilstaande deeltjes te verlagen, evenals van het signaal dat afkomstig is van de cytoplasmatische fractie van het eiwit op de achtergrond. Vliezige lading, zoals RAB-3 op voorlopers van synaptische blaasjes, heeft een lage cytoplasmatische fractie, zodat de bleekstap het signaal van het transportpakket over de cytoplasmatische achtergrond slechts in geringe mate verbetert (Figuur 2A,D). Bleken verbetert echter het traceren van individuele transportgebeurtenissen over langere afstanden en maakt het mogelijk om pauzetijden te kwantificeren (Figuur 2A).
    2. Binning: Gebruik 2 x 2 binning om de signaalintensiteit van individuele transportgebeurtenissen te verbeteren. Binning combineert pixelarrays tot één grotere pixel. Dit zal de ruimtelijke resolutie verminderen, maar de signaalintensiteit van individuele transportgebeurtenissen verbeteren en is vooral nuttig voor zwakke deeltjes (Figuur 2B,D).
    3. Belichtingstijd: Verbeter de belichtingstijd om de signaalintensiteit te verbeteren. Door de belichtingstijd te verbeteren, wordt de signaalintensiteit van het monster verhoogd ten koste van het verkrijgen van een lagere temporele resolutie voor de transportgebeurtenissen. Gebruik voor het experiment hier een temporele resolutie van 300 ms tot 700 ms tussen opeenvolgende tijdstippen (100-500 ms belichtingstijd) om individuele transportgebeurtenissen van RAB-3 te volgen. (Figuur 2C,D)
  5. Time-lapse-opname: Maak een time-lapse van ten minste 1-3 minuten, afhankelijk van de signaalintensiteit van het eiwit en de frequentie van individuele transportgebeurtenissen. Zodra een time-lapse is opgenomen, ga je naar het volgende dier. Dieren op een objectglaasje mogen niet langer dan 30 minuten worden afgebeeld om er zeker van te zijn dat de geregistreerde dieren in een gezonde toestand verkeren.
    OPMERKING: Milde spiertrekkingen van de staart van de dieren tijdens de opname zijn een indicatie dat het dier nog in leven is.

4. Analyse van axonale transportgegevens

OPMERKING: Gebruik ImageJ/Fiji19 voor de volgende stappen voor beeldanalyse. Fiji is in staat om gegevens uit te lezen door alle gangbare microscopie softwarepakketten.

  1. Kymograaf generatie
    1. Gegevens importeren: Importeer het time-lapse-gegevensbestand in Fiji. Als het de gegevens niet in Fiji kan importeren, exporteer dan de tijdregistratie als een tiff-bestand uit het softwarepakket en laad het vervolgens in Fiji.
    2. Driftcorrectie: Controleer of het dier/axonsegment is bewogen of licht is afgedreven tijdens de beeldacquisitie. Corrigeer voor bewegingen of driften van dieren door de plug-in StackReg20 uit te voeren. Kies bij het uitvoeren van de plug-in voor de Rigid Body-transformatie .
    3. Handmatig genereren van een kymograaf: Een gedetailleerde stapsgewijze procedure is weergegeven in figuur 3. Gebruik de driftgecorrigeerde film om de kymograaf te genereren. Gebruik het gereedschap Gesegmenteerde lijn en pas de lijndikte aan zodat deze overeenkomt met de axondiameter door met de linkermuisknop te dubbelklikken op het pictogram voor de gesegmenteerde lijn om een lijn langs het axonsegment te tekenen die zal worden geanalyseerd. Voer de ImageJ/Fiji-plug-in Kymoreslicewide uit om de kymograaf te genereren en gebruik de maximale intensiteitswaarde over de breedte van de lijn in de parameterinstellingen.
      OPMERKING: Door consistentie in de lijntrekrichting te behouden (bijv. altijd proximaal ten opzichte van het distale axon of omgekeerd) wordt het traceren van de terugbewegingsrichting in de kymografen vereenvoudigd.
  2. Analyse van de transportparameter
    1. Bereken de transportparameter: gebeurtenisnummer, snelheid, looplengte en pauzeduur van de kymograaf door de volgende stappen te volgen.
      1. Transportgebeurtenissen traceren in de kymograaf: Gebruik het gereedschap Rechte lijn om afzonderlijke transportgebeurtenissen op de kymograaf te traceren. Sla elke regel op in de ROI-manager en traceer alle transportgebeurtenissen in de kymograaf. Kies de volgende meetparameters in ImageJ/Fiji: Gebied, Begrenzingsrechthoek, Gemiddelde grijswaarde, Feret's diameter.
      2. Transportparameter berekenen: Plak de resultatentabel in een spreadsheet en gebruik de volgende kolommen van de resultaatsecties om te berekenen:
        Looplengte: Vermenigvuldig de breedte (in pixels) met de resolutie van de camera (bijv. x μm/pxl) om de looplengte in μm te bepalen.
        Snelheid: Duur van de looptijd/duur van de looptijd. Om de duur van een bewegingsgebeurtenis in seconden te bepalen, vermenigvuldigt u de hoogte (in pixel) met de acquisitietijd tussen opeenvolgende tijdstippen (bijv. x s/pixel).
        Pauzetijd: Duur van de run tussen twee opeenvolgende bewegingen waarbij de snelheid 0 is.
        Gebeurtenisnummer: Het totale aantal gebeurtenissen kan worden genormaliseerd naar de totale lengte van de kymograaf om het gebeurtenisnummer per minuut en het axonlengtesegment te bepalen. Gebeurtenissen kunnen verder worden onderverdeeld in anterograde en retrograde transportgebeurtenissen. Om de richting van elke bewegingsgebeurtenis te bepalen, gebruikt u het gereedschap Feret Angle. In kymografen die oorspronkelijk werden gegenereerd door de gesegmenteerde lijn van proximaal naar distaal te trekken en de anterograde transportgebeurtenissen in de kymograaf van rechts naar links wijzen, zal een Feret-hoek < 90° een anterograde en >90° een retrograde gebeurtenis aangeven, anders zal het het omgekeerde zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Overzicht van het modelsysteem en de meetprocedure
Om axonaal transport van voorlopers van synaptische blaasjes te visualiseren, hebben we endogeen GFP-gelabeld RAB-3 getraceerd. Hier maken we gebruik van een recent gegenereerde GFP::Flip-on::RAB-3 stam6, waarin expressie van de recombinase Flippase onder een celspecifieke promotor (glr-4p) endogene RAB-3 labelt in het DA9 motorneuron. DA9 is een bipolair motorneuron, waarvan het celli...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Beperkingen van de methode en alternatieve methoden
In dit protocol hebben we acquisitieparameters geoptimaliseerd om het axonale transport van endogeen gelabeld RAB-3 te visualiseren, dat geassocieerd is met voorlopers van synaptische blaasjes. Om RAB-3 te visualiseren, hebben we gebruik gemaakt van een recent gepubliceerde FLIP-on::GFP::RAB-3 stam6 en de recombinase Flippase tot expressie gebracht onder een celspecifieke promotor (glr-4p)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende of financiële belangen die van invloed zouden kunnen zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de laboratoria van Yogev en Hammarlund bedanken voor hun technische hulp, feedback en discussies. We willen in het bijzonder Grace Swaim bedanken voor haar begeleiding bij live celbeeldvorming en Grace en Brian Swaim voor het in eerste instantie opzetten van de handmatige kymograafanalyse in het laboratorium. OG wordt ondersteund door een Walter-Benjamin Scholarship gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) -Project# 465611822. SY wordt gefinancierd door de NIH-subsidie R35-GM131744.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseSigma-AldrichA9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover GlassThomas Scientific6672A14
LevamisoleChemCruzsc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filterNikonSpinning Disc Confocal Microscope
 NIS-elements ARNikonSoftware voor de Nikon Ti2 
Plain precleaned microscopy slidesThermo Scientific420-004T
Nematode strainIdentifierBron
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161 Zal worden gedeponeerd bij CGC (https://cgc.umn.edu/)

Referenties

  1. Millecamps, S., Julien, J. P. Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).
  2. Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).
  3. Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. The axonal cytoskeleton: from organization to function. Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).
  4. Roy, S. Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport. Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).
  5. Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons. Elife. 12, e82568(2023).
  6. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  7. Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons. J Vis Exp. (128), e56690(2017).
  8. Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: https://cgc.umn.edu/ (2023).
  9. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).
  10. He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
  11. Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  12. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  13. Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  14. Takihara, Y. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  15. Li, L. B. The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory. Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).
  16. Viancour, T. A., Kreiter, N. A. Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons. Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).
  17. Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo. Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).
  18. Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  21. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  22. Hall, D. H., Russell, R. L. The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions. J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).
  24. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).
  25. Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles. Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).
  26. Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Goudeau, J., et al. Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 217 (4), (2021).
  29. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  30. Fan, X., et al. SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors. G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).
  31. Glomb, O., et al. A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans. Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Precursoren van synaptische blaasjesGFP RAB-3kymograafanalysetime-lapse imagingCRISPR-Cas9-labelingaxon-imaging
Optimalisatie van visualisatie van axonaal transport van endogene lading door fluorescentiemicroscopie in levende Caenorhabditis elegans
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.