Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van primaire müllercellen van de retinale glia van muizen

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66237

⸱

30 augustus 2024

 ,  ,  ,  , 
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het isoleren van retinale gliacellen Müller uit muizenogen. Het protocol begint met enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door isolatie, zaaien en kweken van Müller-cellen.

Samenvatting

De primaire ondersteunende cel van het netvlies is de retinale glia Müller-cel. Ze bedekken het gehele netvliesoppervlak en bevinden zich in de nabijheid van zowel de bloedvaten van het netvlies als de neuronen van het netvlies. Vanwege hun groei voeren Müller-cellen verschillende cruciale taken uit in een gezond netvlies, waaronder de opname en recycling van neurotransmitters, retinoïnezuurverbindingen en ionen (zoals kalium K+). Naast het reguleren van de bloedstroom en het onderhouden van de bloed-retinale barrière, reguleren ze ook de stofwisseling en de toevoer van voedingsstoffen naar het netvlies. Een gevestigde procedure voor het isoleren van primaire Müller-cellen van muizen wordt in dit manuscript gepresenteerd. Om de onderliggende moleculaire processen die betrokken zijn bij de verschillende muismodellen van oogaandoeningen beter te begrijpen, is Müller-celisolatie een uitstekende aanpak. Dit manuscript schetst een gedetailleerde procedure voor Müller-celisolatie van muizen. Van enucleatie tot zaaien, het hele proces duurt ongeveer een paar uur. Gedurende 5-7 dagen na het zaaien mogen de media niet worden veranderd om de geïsoleerde cellen ongehinderd te laten groeien. Celkarakterisering met behulp van morfologie en verschillende immunofluorescerende markers komt vervolgens in het proces. Maximale passages voor cellen zijn 3-4 keer.

Inleiding

Müller-cellen (MC's) zijn de belangrijkste en meest voorkomende gliacellen die in het netvliesweefsel worden aangetroffen. Zij zijn de belangrijkste spelers bij het bieden van structurele integriteit en metabolische functies in het netvlies1. De strategische structuur van MC's is verspreid over de gehele dikte van het netvlies en biedt zo ondersteuning aan het netvlies. Naast hun steigerachtige eigenschappen hebben ze metabolische functies voor retinale neuronen, die ze voorzien van energiesubstraten, waaronder glucose en lactaat. Deze functies zijn cruciaal om een gezonde neuronale functie te behouden. Van verminderde MC's is gemeld dat ze bijdragen aan verschillende netvliesaandoeningen, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, diabetische retinopathie en glaucoom 2,3. MC's kunnen endogene cellulaire bronnen zijn voor regeneratieve therapie in het netvlies1. Ze omvatten ook een aanzienlijk deel van het netvlies, en er zijn sterke aanwijzingen dat deze cellen bij verschillende soorten kunnen worden gestimuleerd om ontbrekende neuronen te vervangen2. Ze werken gunstig samen met neuronen, en de uiteinden van de conisch vertakkende Müller-cellen onthullen de bloedvaten dicht en verbinden de neurale componenten van het netvlies. Om de neuronale ontwikkeling en neuronale plasticiteit te behouden, fungeren Müller-cellen als een zacht substraat voor neuronen en beschermen ze tegen mechanisch trauma3. Bovendien kunnen Müller-cellen onder pathologische omstandigheden differentiëren tot neurale voorlopercellen of stamcellen die de verloren fotoreceptoren en neuronen repliceren of regenereren 2,3,4. Müller-cellen behouden de kenmerken van retinale stamcellen, waaronder verschillende niveaus van potentieel voor zelfvernieuwing en differentiatie 5,6. De Müller-gliacel heeft een aanzienlijke netvliesafstamming die neurotrofe factoren produceert, neurotransmitters opneemt en recyclet, ionen ruimtelijk buffert en de bloed-netvliesbarrière in stand houdt om het netvlies in homeostase te houden 7,8,9. Dit benadrukt het potentieel van Müller-cellen als een veelbelovend hulpmiddel in celgebaseerde therapieën voor de behandeling van ziekten die verband houden met degeneratie van het netvlies. Müller-cellen zijn de primaire glia die door het netvlies zijn verspreid en verbinding maken met zowel neuronen als bloedvaten. Ze spelen een cruciale beschermende rol en bieden essentiële structurele en metabolische ondersteuning om de levensvatbaarheid en stabiliteit van netvliescellen te behouden. Helaas zijn er in de literatuur maar heel weinig protocollen te vinden voor primaire Müller-celisolatie van het netvlies 10,11.

We presenteren een verbeterde aanpak voor het betrouwbaar isoleren en kweken van primaire Müller-cellen van muizen. Dit protocol werd in onze groep gebruikt om Müller-cellen te isoleren van de wildtype C57BL/6-muizen en transgene muizen12,13. Voor dit protocol worden muizen gebruikt tussen de 5 en 11 dagen oud, zonder geslachtsvoorkeur. Cellen zijn tot 4 keer gepasseerd; bij P4 hechten ze zich echter niet meer aan de kolf en wordt het moeilijk om een gezonde cultuur te laten groeien. De cultuur is vaak besmet met retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE), dus de cellen moeten minstens één keer worden gepasseerd voordat aanvullende experimenten op de cellijn worden uitgevoerd. Passeren zorgt voor verdere isolatie van verontreinigingen. Daarom biedt het gepresenteerde protocol een snelle en effectieve manier om Müller-muizencellen te isoleren, die vervolgens kunnen worden gebruikt als een betrouwbaar platform om therapeutische doelen te onderzoeken en mogelijke behandelingen voor netvliesaandoeningen teevalueren14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met dieren voldeden aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en oogheelkundig onderzoek en werden uitgevoerd volgens ons dierprotocol dat is goedgekeurd door het Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) en het beleid van Oakland University (protocolnummer 2022-1160)

1. Voorbereiding van media en oplossing

  1. Bereid Müller cell oogoplossing door het Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, details in de materiaaltabel) aan te vullen met penicilline/streptomycine in een verdunning van 1:1000. Voeg bijvoorbeeld voor 10 ml DMEM 10 μl penicilline/streptomycine toe.
    OPMERKING: Dit is een eenvoudig serumvrij medium dat is bereid. Verwarm ook het volledige medium in een waterbad van 37 °C voordat u het gebruikt voor celkweekwerk.
  2. Bereid volledige primaire Müller-celgroeimedia voor door DMEM aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS, warmte-geïnactiveerd) en 1% penicilline/streptomycine. Bijvoorbeeld (500 ml DMEM-media + 50 ml FBS + 5 ml penicilline/streptomycine).
  3. Bereid een 0,05% trypsine-EDTA-oplossing met collagenase IV in een concentratie van 200 E/ml (trypsine-EDTA wordt gebruikt om de berekende hoeveelheid collagenase IV-poeder op te lossen om de benodigde concentratie te bereiken).

2. Enucleatie

  1. Euthanaseer de muis ethisch door CO2 -inhalatie volgens de IACUC-richtlijnen.
    1. Plaats het dier of de dieren in de CO2 -kamer om 100% CO2 te introduceren met een vulsnelheid van 30-70% van de kamer vol/min met CO2 om het doel van snelle bewusteloosheid binnen 2-3 minuten te bereiken met minimaal ongemak voor de muizen.
    2. Aangezien muizen op jonge leeftijd zijn (~10 dagen), voert u cervicale dislocatie uit als secundaire methode om een goede euthanasie te garanderen.
  2. Nadat u het werkgebied met 70% ethanol hebt gesteriliseerd, plaatst u de muis op een steriel onderkussen.
  3. Trek de ogen door de armen van het pincet aan de achterkant van het oog te plaatsen, voorzichtig uit het ooggebied te trekken en de ogen te verwijderen door druk uit te oefenen met een pincet in 5/45-stijl op het oogkas om proptosis te veroorzaken.
    OPMERKING: Steriliseer de dissectie-instrumenten met 70% ethanol, gevolgd door fosfaatbufferzoutoplossing voorafgaand aan de dissectie.
  4. Zorg ervoor dat de oogzenuw nog steeds verbonden is met het oog door het oog langzaam te enucleeren. Zorg ervoor dat u de oogzenuw (visueel herkenbaar als een wit koord) achter het oog trekt.
    OPMERKING: Deze stap hoeft niet onder een microscoop te worden uitgevoerd en kan op een gesteriliseerde bank worden uitgevoerd.

3. Behandeling van de ontkernde ogen

  1. Dek een centrifugebuisje van 15 ml af met aluminiumfolie en vul het buisje met 10 ml van de Müller cell oogoplossing.
  2. Plaats de ontlede ogen in de tube van 15 ml met Müller-cel oogoplossing en laat ze een nacht, of ongeveer 18 uur, op kamertemperatuur staan.
  3. Decanteer na 18 uur de oogoplossing en spoel de ogen kort met 2-3 ml verwarmde (37 °C) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  4. Decanteer de PBS en verplaats de ogen naar een petrischaaltje van 100 mm met 10 ml trypsineoplossing. (opgesteld in stap 1.3).
    OPMERKING: Trypsine wordt gebruikt op het hele ontkernde oog en werkt als een dissociatief middel om de celscheiding van de retinale lagen tijdens dissectie te vergemakkelijken. Het ontlede netvlies heeft veel cellen, waaronder RPE-cellen, die plakkerig zijn en hoogstwaarschijnlijk de Müller-celcultuur besmetten14. Microscopisch onderzoek toonde duidelijk aan dat RPE-cellen na 5 dagen isolatie (tijdens de eerste mediawissel) loskwamen van de plaat en stierven13. Het medium dat wordt gebruikt voor RPE-isolatie is DMEM/F-12, met een andere samenstelling dan DMEM (gebruikt bij de isolatie van Müller-cellen), dat natriumpyruvaat en lage glucose bevat.
  5. Plaats de schaal in een broedmachine en incubeer gedurende 1,5 tot 2 uur bij 37 °C en 5% CO2 .
  6. Breng de ogen na het broeden over in een petrischaaltje van 60 mm met ongeveer 5 ml volledig primair Müller-celgroeimedium.

4. Ontleding

NOTITIE: Deze procedure moet worden uitgevoerd in de steriele omgeving van de kweekkap. Daarom is het essentieel om de kapoppervlakken grondig te steriliseren met 70% alcohol, samen met alle gereedschappen en de dissectiemicroscoop. Het is vermeldenswaard dat de video buiten de motorkap is opgenomen voor een betere zichtbaarheid en duidelijkere demonstratiedoeleinden.

  1. Plaats een klein stukje gesteriliseerd weefsel van laboratoriumkwaliteit in de schaal om de ogen tijdens de dissectie te helpen stabiliseren. Plaats de ogen onder een ontleedmicroscoop om de dissectie te starten.
    OPMERKING: Het gebruik van weefsel van laboratoriumkwaliteit vergemakkelijkt het manoeuvreren van de ogen in een met vloeistof gevulde schaal (volledige media), waardoor een nauwkeurige dissectie wordt gegarandeerd.
  2. Gebruik een Vannas-schaar en een pincet in M5S-stijl om het bindweefsel, de extraoculaire spieren en de oogzenuw te verwijderen.
    1. Pak het oog vast met een pincet in M5S-stijl en maak een incisie in het ora serrata-gedeelte met een Vannas-schaar of een naald van een spuit.
      OPMERKING: Er is een lichtblauwe cirkelvormige lijn tussen het voorste en achterste deel van het oog, ora serrata genaamd, die kan worden gebruikt als een oriëntatiepunt voor nauwkeurige richting tijdens dissectie.
    2. Pak de incisie vast met een pincet in M5S-stijl en trek of scheur het hoornvlies uit het achterste deel van het oog. Trek in kleine stappen om ervoor te zorgen dat de integriteit van het netvlies intact blijft.
      OPMERKING: Deze stappen zijn bedoeld om het voorste deel van het oog (hoornvlies, iris en lens) uit het achterste deel van de oogschelp (neurale en gepigmenteerde netvliezen) te verwijderen.
    3. Om de integriteit van de retinale lagen te behouden, trekt u voorzichtig en verwijdert u het retinaal gepigmenteerde epitheel van het neurale netvlies. Het neurale netvlies moet vrij zijn van zwarte stippen om de zuiverheid van de isolatie zoveel mogelijk te garanderen, aangezien de RPE-laag meestal plakkerig is en aan het neuronale netvlies vastzit.
    4. Snijd het ontlede neurale netvlies in kleine stukjes voordat u het op een plaat verzamelt om een homogene verspreiding van de cellen op de plaat te garanderen.
  3. Plaats de neurale netvliezen in een T25-kolf met 4 ml volledig primair Müller-celgroeimedium.
  4. Plaats de kolf ten slotte in een broedmachine en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 .

5. Kweek van primaire Müller-gliacellen

  1. Verplaats de kolf gedurende 3-5 dagen niet om de celgroei te bevorderen.
  2. Vervang de media na de vijfde dag en daarna om de dag totdat de cellen voor 90% samenvloeien.

6. Passatie van primaire Müller-gliacellen

  1. Zuig het Müller-celkweekmedium op, gevolgd door 2 ml wash in PBS, en zuig het PBS op. Voeg 2 ml 0,25% trypsine-EDTA (1x) toe, of genoeg om het bord te bedekken.
  2. Incubeer 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Zorg ervoor dat de cellen onder de microscoop loskomen van de plaat. Verzamel vervolgens de celsuspensie en voeg 4 ml voorverwarmd (37 °C) volledig primair Müller-celgroeimedium (bereid in stap 1.2) toe aan de verzamelbuis.
  4. Centrifugeer gedurende 7 minuten op 300 x g. Na het opzuigen van het supernatant, resuspendeert u de pellet in 10 ml volledige primaire Müller-celgroeimedia. Omdat het aantal cellen kan variëren afhankelijk van het aantal ontleedde ogen, is het daarom beter om de cellen te tellen voordat u gaat zaaien en incuberen. De aanbevolen zaaidichtheid is 3,0 x 106 cellen in een T75-kolf.
    OPMERKING: Cellen kunnen tot 4-5 keer worden gepasseerd. De meest consistente experimentresultaten worden echter gevonden na 1-2 passages.

7. Immunofluorescentie

OPMERKING: Gebruik het immunofluorescentieprotocol om de specificiteit van Müller-cellen te kleuren en te valideren. Hier is een kort overzicht van het immunofluorescerende protocol. Deze stap wordt uitgevoerd na de eerste passage12.

  1. Zaai de cellen in een Cell Culture Chamber Slide (30.000 cellen per putje voor een kamerglaasje met 8 putjes).
  2. Kweek de geïsoleerde cellen gedurende 24-48 uur in een volledig Müller-celkweekmedium (bereid in stap 1.2) bij 37 °C en 5% CO2 .
  3. Zuig de media op en was het kamerglaasje met 250-300 μL 1x PBS op elk putje wanneer de cellen voor 80-90% samenvloeien.
  4. Bevestig het glaasje gedurende 10 tot 15 minuten in 250-300 μL 4% paraformaldehyde op elk putje, gevolgd door wassen met PBS/TX-100 (elk 5 min/3x).
  5. Voeg een blokkeerbuffer toe gedurende 1 uur bij 37 °C (zie de Materiaaltabel).
  6. Aspireer de blokkerende oplossing op en voeg vervolgens de primaire antilichamen toe die specifiek zijn voor Müller-cellen om de zuiverheid van de geïsoleerde cellen te bevestigen met behulp van glutaminesynthetase en vimentine 5,12. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C (met een antilichaamconcentratie van 1:100-1:200 in de blokkeerbuffer in een volume van 150-200 μL/glaasje). Was de glijbaan met PBS/TX-100 wasbeurten (elk 5 en 10 minuten).
    OPMERKING: Deze antilichamen zijn gekozen omdat ze kenmerken zijn voor het identificeren van Müller-cellen en het waarborgen van het succes en de zuiverheid van de Müller-celcultuur.
  7. Voeg het secundaire antilichaam toe (met een antilichaamconcentratie variërend van 1:1000 in blokkeerbuffer in een 150-200 μL/objectglaasje) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Was vervolgens drie keer (elk 5-10 min) met PBS/Triton X-100.
  8. Breng een druppel DAPI-montagemedium aan om de kernen te labelen voordat u het glaasje afdekt met een dekglaasje. Vermijd luchtbellen bij het plaatsen van het dekbriefje.
  9. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om het objectglaasje te controleren en beelden vast te leggen (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: Cellen bevinden zich met DAPI op ex/em 359/461 bij een vergroting van 10x om cellen te lokaliseren; Een hogere vergroting kan cellen vastleggen. Andere golflengten zijn afhankelijk van de gekozen kleur. Groene kleur (GFP) - ex/em 488/510. Rode kleur (Cy3) - ex/em 555/569.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Validatie van de specificiteit, zuiverheid en barrièrefunctie van geïsoleerde Müller-cellen
Om de levensvatbaarheid, morfologie en onderscheidende eigenschappen van de geïsoleerde Müller-cellen te bevestigen, werden de cellen onder een lichtmicroscoop onderzocht. Er werden P0- en P1-beelden opgenomen (figuur 1A). Om de contaminatie van geïsoleerde Müller-cellen met RPE-cellen te controleren en de zuiverheid ervan te bevestigen, werd immunofluorescentiekleuring (IF) uitgev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De isolatie van primair retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE) uit muizen werd eerder gedocumenteerd door ons laboratorium. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd demonstratieprotocol voor de isolatie van primaire Müller-cellen. Deze procedure omvat enucleatie, behandeling, dissectie, verzameling, zaaien, kweken en karakteriseren van Müller-cellen geïsoleerd uit muizenogen. Het is gebaseerd op een eerder succesvol protocol dat in eerdere publicaties te vinden was en ons aangepaste protocol dat we in een recente publi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren die relevant zijn voor de inhoud van dit artikel.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Eye Institute (NEI), het National Eye Institute (NEI) fonds R01 EY029751-04. We willen graag Dr. Sylvia B. Smith erkennen, aangezien dit protocol een aangepaste versie is op basis van haar protocol van Müller-celisolatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Beaker : 100mLKIMAX14000
Collagenase IV Worthington LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile13-711-20
DMEM (1X) Thermo Scientific11885084Media om Müller cellen te kweken 
Fetal Bovine Serum (FBS)gibco26140079Voor compleet Muller cel kweekmedium
Glutamine synthaseCell signalling80636
Heracell VISO 160i CO2 IncubatorThermo Scientific50144906
KimwipesKimberly-Clark34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mLB-D309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mLGrainger11L819
Pen Strepgibco15140-122Voor compleet Müller cel kweekmedium
Phosphate Buffer saline (PBS)Thermo ScientificJ62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45Dumont72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cmGARANA INDUSTRIES2595
Sorvall St8 CentrifugeThermoScientific75007200
Stemi 305 MicroscopeZeissn/a
Surgical Blade, #11, Stainless SteelBard-Parker371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm StyleCorning430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm styleCorning353003
Tornado Tubes: 15mLMidsciC15B
Tornado Tubes: 50mLMidsciC50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm TipsDumont501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OALElectron Microscopy Sciences Dumont50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"McKesson4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting EdgeFST15000-08
Vimentin invitrogenMA5-11883
Zeiss AxioImager Z2Zeissn/a
Zeiss Zen Blue 2.6Zeissn/a

Referenties

  1. Liu, Y., Wang, C., Su, G. Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration. J Ophth. 2019, 5743109(2019).
  2. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).
  3. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).
  4. Kobat, S. G., Turgut, B. Importance of Müller cells. Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).
  5. Liu, X., Tang, L., Liu, Y. Mouse Müller cell isolation and culture. Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).
  6. Bringmann, A., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  7. de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).
  8. Fischer, A. J., Reh, T. A. Müller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina. Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).
  9. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  10. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. J of Vis Exp. (133), 56997(2018).
  11. Sarthy, P. V., Bunt, A. H. The ultrastructure of isolated glial (Müller) cells from the turtle retina. Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).
  12. Shanmugam, A. K., et al. Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina. Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).
  13. Moustafa, M., et al. 12-HETE activates Müller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29. Prostag Oth Lipid M. 171, 106805(2024).
  14. Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice müller glia in order to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 14, 7(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van Müllercellenretinale gliacellenmuisretinaprimaire Müllercellenmodellen voor retinale ziektenimmunofluorescente markerslaminaire flowkastdissectiemicroscoopneurale retinacelkweek
Isolatie van primaire müllercellen van de retinale glia van muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.