Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een sleutelrol bij de regulatie van het cellulaire metabolisme in fysiologische en pathologische processen. Fysiologische ROS-productie speelt een centrale rol in de ruimtelijke en temporele modulatie van normale cellulaire functies zoals proliferatie, signalering, apoptose en senescentie. Chronische ROS-overproductie daarentegen is verantwoordelijk voor een breed spectrum aan ziekten, zoals onder andere kanker, hart- en vaatziekten en diabetes. Het kwantificeren van ROS-niveaus op een nauwkeurige en reproduceerbare manier is dus essentieel voor het begrijpen van de normale cellulaire functionaliteit. Op fluorescentiebeeldvorming gebaseerde methoden om intracellulaire ROS-soorten te karakteriseren is een veelgebruikte benadering. Veel van de ROS-protocollen voor beeldvorming in de literatuur gebruiken 2'-7'-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) kleurstof. Deze kleurstof heeft echter aanzienlijke beperkingen in het gebruik en de interpreteerbaarheid. Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een dihydroethidium (DHE) fluorescentiesonde als een alternatieve methode om de totale ROS-productie in een high-throughput omgeving te kwantificeren. Het high throughput imaging platform, CX7 Cellomics, werd gebruikt om de ROS-productie te meten en te kwantificeren. Deze studie werd uitgevoerd in drie hepatocellulaire kankercellijnen - HepG2, JHH4 en HUH-7. Dit protocol geeft een diepgaande beschrijving van de verschillende procedures die betrokken zijn bij de beoordeling van ROS in de cellen, waaronder: bereiding van DHE-oplossing, incubatie van cellen met DHE-oplossing en meting van DHE-intensiteit die nodig is om de ROS-productie te karakteriseren. Dit protocol toont aan dat DHE fluorescerende kleurstof een robuuste en reproduceerbare keuze is om intracellulaire ROS-productie op een high-throughput manier te karakteriseren. Benaderingen met een hoge doorvoer om de ROS-productie te meten, zijn waarschijnlijk nuttig in een verscheidenheid aan onderzoeken, zoals toxicologie, drugsscreening en kankerbiologie.
Inleiding
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn een groep van natuurlijk voorkomende, zeer reactieve en tijdelijk onstabiele chemische radicalen die worden gevormd als onderdeel van het normale cellulaire metabolisme in cellen. ROS speelt een belangrijke en essentiële rol bij de modulatie van normale fysiologische en biochemische processen die plaatsvinden in cellen 1,2. De belangrijkste bron van ROS-productie in cellen is afkomstig van de mitochondriale elektronentransportketen (ETC)-route als onderdeel van de normale bio-energetische cyclus. Belangrijke aanvullende bronnen van ROS-productie zijn enzymatische reacties z....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Celkweek
- Zaai de testcellen (HepG2-, HUH7- en JHH4-hepatocellulaire carcinoomcellen) in een plaat met 96 putjes met een zaaidichtheid van 10.000 cellen/putje in een uiteindelijk zaaivolume van 200 μL per putje.
- Voordat u de HepG2-cellen kweekt, smeer u de 96 plaatputjes in met type IV collageen (50 μg/ml) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT). Om stolling van het collageen te voorkomen, plaatst u de stockoplossing in ijs en start u vervolgens het verdunningsproces tot de gewenste concentratie.
- Na een incubatietijd van 2 uur het overtollige collageen afzuigen en de putjes drie keer wassen met de 1x PBS.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dihydroethidium (DHE) is een superoxide-responsieve fluorescentiekleurstof die specifieke informatie geeft over de intracellulaire ROS-toestanden. DHE-kleurstof zendt intrinsiek blauwe fluorescentie uit in het cytoplasma. Bij interactie met superoxideradicalen wordt het echter omgezet in 2-hydroxyethidium, dat fluorescentie uitzendt in de rode golflengten (>550 nm) (Figuur 1). DHE-kleurstof wordt gemakkelijk naar de cellen en de kern getransporteerd. De uitgezonden fluorescentie kan worden g.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie werd een protocol opgesteld om de productie van superoxide-gedreven intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te beoordelen met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof op een screeningsysteem met een hoog gehalte. Een meerderheid van de huidige protocollen die in de literatuur beschikbaar zijn, gebruiken de DCFH-DA als een fluorescentiebeeldvormingssonde om ROS-soorten te kwantificeren. Meerdere onderzoeken hebben echter aangetoond dat de DCFH-DA geen ideale sonde is voor het meten va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.
Dankbetuigingen
RK en RRG werden ondersteund door een subsidie van het UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) via NIH NIGMS-subsidie P20 GM130422. RRG werd ondersteund door een pilotprijs van de NM-INSPIRES P30-subsidie 1P30ES032755. De ondersteuning van de beeldvormingskern voor het CX7 Cellomics-instrument werd geleverd via de AIM-centrumkernen die werden gefinancierd door NIH-subsidie P20GM121176. We willen Dr. Sharina Desai en Dr. Li Chen bedanken voor hun onschatbare hulp bij technische problemen met betrekking tot het gebruik van het CX7 Cellomics-beeldvormingsplatform.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Versie 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
Referenties
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642(2021).
- Magnani, F., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
