Real-time polymerasekettingreactie-gebaseerde detectie en kwantificering van hepatitis B-virus-DNA

Summary

Real-time polymerasekettingreactie (PCR)-gebaseerde detectie en kwantificering van hepatitis B-virus (HBV)-DNA is een gevoelige en nauwkeurige methode voor het diagnosticeren en bewaken van HBV-infectie. Hier presenteren we een protocol voor HBV-DNA-detectie en de viral load-meting van een monster.

Abstract

Het hepatitis B-virus (HBV) is wereldwijd een belangrijke oorzaak van leveraandoeningen. Het kan leiden tot acute of chronische infecties, waardoor personen zeer vatbaar zijn voor fatale cirrose en leverkanker. Nauwkeurige detectie en kwantificering van HBV-DNA in het bloed zijn essentieel voor het diagnosticeren en bewaken van HBV-infectie. De meest gebruikelijke methode voor het detecteren van HBV-DNA is real-time PCR, die kan worden gebruikt om het virus te detecteren en de virale lading te beoordelen om de respons op antivirale therapie te volgen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de detectie en kwantificering van HBV-DNA in menselijk serum of plasma met behulp van een IVD-gemarkeerde real-time PCR-gebaseerde kit. De kit maakt gebruik van primers en sondes die zich richten op het sterk geconserveerde kerngebied van het HBV-genoom en kan alle HBV-genotypen (A, B, C, D, E, F, G, H, I en J) nauwkeurig kwantificeren. De kit bevat ook een endogene interne controle om mogelijke PCR-remming te monitoren. Deze test duurt 40 cycli en de grenswaarde is 38 Ct. Voor de kwantificering van HBV-DNA in klinische monsters wordt een set van 5 kwantificeringsstandaarden bij de kit geleverd. De standaarden bevatten bekende concentraties HBV-specifiek DNA die zijn gekalibreerd tegen de 4e internationale WHO-standaard voor HBV-DNA voor de nucleïnezuurtest (NIBSC-code 10/266). De standaarden worden gebruikt om de functionaliteit van de HBV-specifieke DNA-amplificatie te valideren en om een standaardcurve te genereren, waardoor HBV-DNA in een monster kan worden gekwantificeerd. HBV-DNA van slechts 2,5 IE/ml werd gedetecteerd met behulp van de PCR-kit. De hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de kit maken het een krachtig hulpmiddel in klinische laboratoria en helpt beroepsbeoefenaren in de gezondheidszorg bij het effectief diagnosticeren en beheersen van HBV-infecties.

Introduction

Hepatitis B-virus (HBV) is een gedeeltelijk dubbelstrengs DNA-virus uit het geslacht Orthohepadnavirus en de familie Hepadnaviridae ¹. Het kan een chronische infectie veroorzaken die het hele leven aanhoudt, wat mogelijk kan leiden tot levercirrose en hepatocellulair carcinoom ^2,3,4. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) leefden in 2019 naar schatting 296 miljoen mensen met een chronische hepatitis B-infectie en werden elk jaar 1,5 miljoen mensen nieuw besmet⁵.

De identificatie en meting van HBV-DNA in serum- of plasmamonsters dienen als een waardevolle methode voor het detecteren van personen met een aanhoudende hepatitis B-infectie, het beoordelen van de werkzaamheid van antivirale behandeling en het voorspellen van de waarschijnlijkheid van succes van de behandeling 6,7,8,9,10,11. Een hoge virale lading wordt in verband gebracht met een verhoogd risico op progressie van leverziekte, waaronder cirrose en leverkanker^12,13. Daarom is nauwkeurige meting van de virale lading cruciaal voor het volgen van de progressie van HBV-infectie en het informeren van beslissingen over behandeling.

Kwantitatieve real-time PCR-assays hebben een hogere gevoeligheid, een breder dynamisch bereik en een nauwkeurigere kwantificering van HBV-DNA dan conventionele PCR-technieken 14,15,16,17. Er zijn verschillende commerciële real-time PCR-gebaseerde moleculaire diagnostische kits op de markt voor de kwantificering van HBV-DNA in serum- of plasmamonsters. Hier beschrijven we een gedetailleerde workflow voor de detectie en kwantificering van HBV-DNA in menselijk serum of plasma met behulp van een in de handel verkrijgbare, IVD-gemarkeerde real-time PCR-gebaseerde kit. De kit is een veelgebruikte ^18,19, goedkope, maar zeer gevoelige test, en de prestatiekenmerken zijn vergelijkbaar met andere in de handel verkrijgbare CE-gemarkeerde kit(s)¹⁸. Afgezien van de amplificatie van het HBV-doelgebied, is ook een endogeen intern controlegen in de kit opgenomen om de kwaliteit van monsters, de kwaliteit van geëxtraheerd DNA, PCR-amplificatie en mogelijke PCR-remming te verifiëren.

Protocol

Bij deze studie waren geen menselijke deelnemers of klinische monsters betrokken. Het enige biologische materiaal dat werd gebruikt, was de 4e internationale norm van de WHO voor HBV-DNA voor nucleïnezuurtest (NIBSC-code 10/266). Deze norm is een openbaar beschikbaar referentiemateriaal dat geen persoonlijke informatie of identificeerbare gegevens bevat. Als zodanig was er geen ethische goedkeuring vereist voor deze studie.

1. DNA-extractie

1. Extraheer het virale DNA uit menselijk serum of plasmamonster. Bewaar het geëxtraheerde DNA bij -20 °C tot verder gebruik in PCR.
   OPMERKING: Het aanbevolen volume serum of plasma voor DNA-extractie is 500 μL en het elutievolume is 50 μL. In deze studie werd het virale DNA geëxtraheerd met behulp van een virale nucleïnezuurextractiekit (Tabel met materialen).

2. PCR in real time

1. Ontdooi alle reagentia (tabel 1) van de real-time PCR-kit bij kamertemperatuur (RT; 15-25 °C) voordat u met de PCR begint. Na ontdooiing mengt u de componenten gedurende 10 s pulserend met een gematigde snelheid en centrifugeert u de componenten gedurende 15 s bij RT op 8.000 × g . Bewaar alle ontdooide componenten op een koelblok.
2. Reactie voorbereiding
   1. Bereid een PCR-mix volgens tabel 2. Bereken het volume van de toe te voegen reagentia op basis van het aantal monsters, standaarden en geen sjablooncontrole.
      OPMERKING: Bij de bereiding van het PCR-mengsel moet ten minste 10% extra volume van elk reagens worden toegevoegd (bijv. als er 10 reacties nodig zijn, reken dan voor 11 reacties).
   2. Pipetteer 15 μL van het hierboven bereide PCR-mengsel in elk PCR-buisje. Voeg vervolgens 15 μL van het geëxtraheerde monster-DNA toe. Voeg 15 μL van ten minste één van de standaarden voor HBV (HBV-standaard 1-5) toe als positieve controle (PC) voor het detecteren van HBV-DNA en 15 μL nucleasevrij water van PCR-kwaliteit als negatieve controle (NC). Om een standaardcurve te genereren die nodig is voor de kwantificering van het HBV-DNA, gebruikt u alle 5 kwantificeringsstandaarden die bij de kit zijn geleverd (HBV-standaard 1-5) voor elke PCR-run.
   3. Sluit de buizen, meng de componenten door pulsvortexen gedurende 10 s met een matige snelheid en centrifugeer gedurende 15 s bij RT bij 8.000 × g voordat u doorgaat naar de thermische cycler. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het reactiemengsel zitten, omdat dit de fluorescentiedetectie kan verstoren.
3. Programma instellen
   1. Programmeer de thermische cycler met behulp van de fietsomstandigheden zoals aanbevolen in tabel 3.
4. Kanaal/fluorofoor selectie
   1. Selecteer de fluorescerende kleurstoffen voor veelgebruikte real-time PCR-platforms, zoals vermeld in tabel 4.
5. Data-analyse
   1. Nadat de run is voltooid, analyseert u de versterkingsplot op lineaire schaal.
   2. Drempel instelling
      1. Stel de drempel in binnen de exponentiële fase van een PCR-reactie. Aanbevolen drempelwaarden voor de kit staan vermeld in tabel 5. Wees consistent met de drempelinstelling. Zodra de optimale drempel voor de test is bepaald, gebruikt u deze consequent voor alle monsters voor een bepaalde PCR-machine. Dit zal helpen om ervoor te zorgen dat de resultaten nauwkeurig en reproduceerbaar zijn.
         NOTITIE: Als de drempel te laag is ingesteld, kan het signaal onder het ruisniveau liggen en is de Ct-waarde onbetrouwbaar. Als de drempel te hoog is ingesteld, kan het signaal zich in de plateaufase van de reactie bevinden, waar de versterking niet zo efficiënt is en de Ct-waarde onnauwkeurig kan zijn.
   3. Cutoff
      1. Laat de kit 40 versterkingscycli draaien. Overweeg geen enkele versterking na 38 cycli voor welke interpretatie dan ook.
   4. Kwalitatieve resultaatanalyse
      1. Gebruik de kit voor kwalitatieve detectie van HBV-DNA. Gebruik standaard 2 als pc met verwachte Ct-waarden van 20 ± 2 voor HBV en 24 ± 3 voor IC.
      2. Zorg ervoor dat geen enkele sjablooncontrole (NTC) geen versterking vertoont voor zowel HBV- als interne controledoelen (IC). Als er een amplificatiereactie optreedt in de NTC-reactie, kan er sprake zijn van monsterbesmetting.
      3. Aangezien de testgrens 38 is, moet elke amplificatie vóór 38 Ct voor het HBV-doel als een HBV-positief monster worden beschouwd. Wanneer alle bedieningsorganen aan de bovengenoemde eisen voldoen, moet een model worden gebruikt volgens de in tabel 6 vermelde interpretaties.
   5. Kwantitatieve resultaatanalyse
      1. Gebruik de set van 5 kwantificeringsstandaarden van bekende concentraties voor HBV-specifiek DNA die zijn gekalibreerd aan de hand van de 4e internationale WHO-standaard voor HBV-DNA voor nucleïnezuuramplificatietechnieken (NAT)²⁰ (tabel 7).
      2. Gebruik deze standaarden om een standaardcurve te genereren. Gebruik de standaardcurve om het HBV-DNA van een onbekend monster te kwantificeren.
         OPMERKING: De real-time PCR-software genereert een standaardcurve met behulp van de Ct-waarden die zijn verkregen voor de HBV-doelen van alle 5 normen en hun overeenkomstige concentraties in internationale eenheden per microliter (IU/μL).
      3. Interpreteer de waarden voor onbekende monsters alleen als de helling van de normen tussen -3,1 en -3,6 ligt, de R^2-waarde tussen 0,99 en 1,0 ligt, de PCR-efficiëntie tussen 90%-110% (0,9-1,1) ligt en er geen versterking is in de negatieve controle.
      4. De software berekent de concentratie van elk HBV-positief monster in internationale eenheden per microliter (IE/μL). Gebruik de volgende vergelijking om de virale lading te berekenen (conversie van IU/μL naar internationale eenheden per milliliter [IU/ml]):
         Resultaat (IE/ml) = (Resultaat [IE/μL] x elutievolume [μL])/ Monstervolume (ml)
         OPMERKING: De 4e internationale norm van de WHO voor HBV-DNA, NIBSC-code 10/266, werd geëxtraheerd voor virale DNA-zuivering uit 0.5 ml plasma, elueerde het gezuiverde virale DNA in 50 μL elutiebuffer en werd gebruikt met de PCR-kit als referentiemonster, samen met de 5 HBV-normen en NTC. De HBV-virale lading van het referentiemonster (NIBSC-code 10/266) werd berekend als (6659 IE/μL x 50 μL)/0,5 ml = 6,65,900 IE/ml.

Results

Figuur 1 toont een schematisch diagram van de workflow voor het detecteren en kwantificeren van HBV-DNA uit humaan plasma/serum. Figuur 2 toont een versterkingsgrafiek van Standaard 2 (gebruikt als PC) en NTC voor zowel HBV als IC. Figuur 3 toont de amplificatiecurven voor een HBV-positief monster, een HBV-negatief monster en een monster met PCR-remming. De amplificatiecurve, de Ct-waarde voor HBV en de verkregen HBV-concentratie in...

Discussion

NIBSC-code 10/266 heeft een eenheid toegewezen gekregen van 9,55,000 IE/ml wanneer deze wordt gereconstitueerd in 0.5 ml nucleasevrij water volgens de leveranciersinformatie²¹. Dit kan worden beschouwd als een HBV-positief monster met hoge belasting. De HBV-virale lading bepaald door de virale belastingskit die in deze studie werd gebruikt, was 6,65,900 IE/ml (Figuur 4). Omdat de DNA-extractie-efficiëntie van een DNA-extractiekit niet 100% is, gaat er vaak wat DNA ver...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	De 4e WHO International Standard voor hepatitis B-virus (HBV) DNA, NIBSC-code 10/266, is bedoeld voor gebruik bij de kalibratie van secundaire referentie-reagentia die worden gebruikt in HBV-nucleïnezuurversterkingstechnieken (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	Dit is een real-time PCR-machine
HBV, HCV en HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	Dit is een zeer lage positieve triplex-reagens voor NAT-assays die hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) en humaan immunodeficiëntievirus-1 (HIV-1) bevat
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	Dit is een real-time PCR-machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	Dit is een real-time PCR-kit die in dit onderzoek wordt gebruikt voor de detectie van HBV-DNA en de bepaling van de virale lading
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	Dit is een DNA-extractiekit die wordt gebruikt voor de extractie van HBV-viraal DNA uit NIBSC:10/266 en NIBSC:14/198