Dit protocol maakt gebruik van light-sheet beeldvorming om de contractiele functie van het hart bij zebravislarven te onderzoeken en inzicht te krijgen in de hartmechanica door middel van celtracking en interactieve analyse.
Methodenartikel
4D Light-sheet beeldvorming van hartcontractie van zebravissen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zebravis is een intrigerend modelorganisme dat bekend staat om zijn opmerkelijke cardiale regeneratiecapaciteit. Het bestuderen van het samentrekkende hart in vivo is essentieel om inzicht te krijgen in structurele en functionele veranderingen als reactie op blessures. Het verkrijgen van 4-dimensionale (4D, 3D ruimtelijke + 1D tijdelijke) beelden met hoge resolutie en hoge snelheid van het hart van de zebravis om de hartarchitectuur en contractiliteit van het hart te beoordelen, blijft echter een uitdaging. In deze context worden een in-house light-sheet microscoop (LSM) en op maat gemaakte computationele analyse gebruikt om deze technische beperkingen te overwinnen. Deze strategie, die LSM-systeemconstructie, retrospectieve synchronisatie, single cell tracking en gebruikersgerichte analyse omvat, maakt het mogelijk om de microstructuur en contractiele functie over het hele hart te onderzoeken bij de single-cell resolutie in de transgene Tg (myl7:nucGFP) zebravislarven. Bovendien zijn we in staat om micro-injectie van kleine molecuulverbindingen verder op te nemen om hartletsel op een nauwkeurige en gecontroleerde manier te induceren. Over het algemeen maakt dit raamwerk het mogelijk om fysiologische en pathofysiologische veranderingen te volgen, evenals de regionale mechanica op het niveau van één cel tijdens cardiale morfogenese en regeneratie.
Inleiding
De zebravis (Danio rerio) is een veelgebruikt modelorganisme voor het bestuderen van cardiale ontwikkeling, fysiologie en herstel vanwege zijn optische transparantie, genetische handelbaarheid en regeneratieve capaciteit 1,2,3,4. Bij een hartinfarct, terwijl structurele en functionele veranderingen van invloed zijn op de cardiale ejectie en hemodynamica, blijven technische beperkingen het vermogen belemmeren om het dynamische proces tijdens hartregeneratie te onderzoeken met de hoge spatiotemporele resolutie. Conventionele beeldvormingsmethoden, zoals confocale microscopie, hebben bijvoorbeeld beperkingen op het gebied van beeldvormingsdiepte, temporele resolutie of fototoxiciteit voor het vastleggen van de dynamische veranderingen en het beoordelen van de contractiele functie van het hart tijdens meerdere hartcycli5.
Light-sheet microscopie vertegenwoordigt een state-of-the-art beeldvormingsmethode die deze problemen met succes aanpakt door de laser snel over het ventrikel en atrium van het hart te vegen, waardoor gedetailleerde beelden worden verkregen met een verbeterde spatiotemporele resolutie en verwaarloosbare fotobleken en fototoxische effecten 6,7,8,9,10,11.
Dit protocol introduceert een uitgebreide beeldvormingsstrategie die LSM-systeemconstructie, 4D-beeldreconstructie, 3D-celtracking en interactieve analyse omvat om de dynamiek van cardiomyocyten over het hele hart tijdens meerdere hartcycli vast te leggen en te analyseren12. Het op maat gemaakte beeldvormingssysteem en de computationele methodologie maken het mogelijk om de myocardiale microstructuur en contractiele functie op het niveau van één cel te volgen in transgene Tg (myl7: nucGFP) zebravislarven. Bovendien werden kleine molecuulverbindingen in de embryo's afgeleverd met behulp van micro-injectie om door geneesmiddelen veroorzaakt hartletsel en daaropvolgende regeneratie te beoordelen. Deze holistische strategie biedt een ingang om in vivo structurele, functionele en mechanische eigenschappen van myocardium op eencellig niveau te onderzoeken tijdens de ontwikkeling en regeneratie van het hart.
Protocol
Goedkeuring voor deze studie werd verleend door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Texas in Dallas, onder protocolnummer #20-07. Tg(myl7:nucGFP) transgene zebravislarven12 werden gebruikt voor de huidige studie. Alle data-acquisitie en beeldnabewerking werden uitgevoerd met behulp van open-source software of platforms met onderzoeks- of onderwijslicenties. De bronnen zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de auteurs.
1. Zebraviskweek en micro-injectie van embryo's
timing: 2 dagen
- Onderhouden en kweken van volwassen zebravissen door middel van standaard verzorging en kweekprocedures. Voor gedetailleerde methoden, zie vorig rapport13.
- Voer een micro-injectie uit volgens het vastgestelde protocol14. Voor de huidige studie werd micro-injectie uitgevoerd in het 1-2-cel (zygote) stadium.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om deze fase nauwkeurig te identificeren voor effectieve micro-injectie en om de consistentie van de ontwikkeling te waarborgen. Tijdens het eencellige stadium vormt zich een kleine koepel bovenop de dooier, en deze fase duurt meestal ongeveer 12 minuten. Bij het overgaan naar het tweecellige stadium worden twee aangrenzende koepels zichtbaar, en dit stadium duurt ongeveer 45 minuten na de bevruchting15. Meer gedetailleerde informatie over de systeemconstructie is te vinden in andere rapporten of protocollen 12,16,17.
2. Embryo's/larven van zebravissen voorbereiden en monteren
timing: 7 dagen
- Breng embryo's 1 dag na de bevruchting (dpf) over naar E3-water met 0,2 mM 1-fenyl-2-thioureum (PTU) (zie materiaaltabel) om pigmentvorming te voorkomen.
- Vervang het medium elke dag door vers E3-water met PTU tot LSM-beeldvorming.
- Beeldembryo's of larven af met de stereomicroscoop om hun ontwikkeling vast te leggen op de gewenste tijdstippen tussen 0 en 7 dpf.
- Maak gesegmenteerde buizen van gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP) met een binnendiameter van 2 mm voor het inbedden van zebravislarven onder het LSM-systeem12.
NOTITIE: De FEP-buis wordt gebruikt om het monster vast te zetten met materialen die overeenkomen met de brekingsindex en die sterk lijken op het omringende medium, zoals water. - Breng vissen vanaf 3 dpf over in een 150 mg/L tricaïne (MS-222)-oplossing (zie Materiaaltabel) om de vis te immobiliseren voordat de beeldvorming plaatsvindt.
- Bereid 0,8 % agarose met een laag smeltlaag gehalte met 150 mg/l tricaïne en gebruik een transferpipet om de verdoofde vis naar de agarose te verplaatsen zodra deze is afgekoeld tot kamertemperatuur18.
- Gebruik een andere transferpipet om de vis met agarose in FEP-buisjes te monteren (Figuur 1).
OPMERKING: Om de minimale stress in de zich ontwikkelende embryo's vast te stellen, werden pre- en postfixatieonderzoeken van hartactiviteit, zoals hartslag, uitgevoerd onder microscopische observatie. Deze beoordelingen waren bedoeld om eventuele significante verschillen voor en na tricaïne-anesthesie te identificeren. Een aanvullend onderzoek van de huid en het spierstelsel op onregelmatigheden in de hartstructuur, zoals oedeem, kan ook na fixatie worden uitgevoerd. De concentratie van tricaïne speelt ook een cruciale rol bij cardiale beeldvorming19, en daarom werd de 150 mg/L concentratie tricaïne-oplossing gebruikt voor de beeldvorming van contractie in zebravislarven in dit project. Hoewel de huidige retrospectieve synchronisatie ons in staat stelt om de onregelmatige hartslagen aan te pakken20, is een uitgebreide oplossing voor de 4D-beeldvorming van hartritmestoornissen en langetermijnbeeldvorming bij zebravissen nog in ontwikkeling.
3. Instelling en configuratie van het Light-sheet beeldvormingssysteem
timing: 3-14 dagen
- Bouw een intern LSM-systeem op basis van een cilindrische lens met behulp van DPSS-lasersystemen (Continuous-Wave Diode-Pumped Solid-State) op specifieke golflengten zoals 473 nm en 532 nm als verlichtingsbronnen (Figuur 2A).
- Pas LabVIEW-besturingscodes aan (zie Materiaaltabel) voor de synchronisatie van de translationele monsterfase, de verlichting van de lichtplaat en de belichting van de sCMOS-camera om beeldsequenties vast te leggen.
OPMERKING: Meer gedetailleerde informatie over de constructie van het systeem is te vinden in andere rapporten of protocollen 12,16,17. We moedigen onderzoeksgroepen aan om samenwerkingsmogelijkheden te zoeken met laboratoria die beschikken over gevestigde expertise op het gebied van optische beeldvorming tijdens de bouw van systemen.
4. Beeldvorming van zebravissen en gegevensverzameling
timing: 1 dag
- Kalibreer de ruimtelijke resolutie van het LSM-systeem en minimaliseer de variatie in de opaciteit op verschillende diepten door fluorescentieparels te meten.
- Verdun eerst fluorescerende korrels (zie materiaaltabel) met een diameter van 0,53 μm tot een concentratie van 1: 1,5 x 10,55 met behulp van 0,8 % agarose met een laag smeltpercentage en breng de oplossing over in de gesegmenteerde FEP-buis.
- Ten tweede, gebruik het LSM-systeem om de kralen af te beelden en meet de puntspreidingsfunctie (PSF) over het hele monster, waarbij de ruimtelijke resolutie en systeemuitlijning12 worden gevalideerd.
OPMERKING: In dit systeem geeft de analyse van representatieve resultaten voor de volledige breedte op de helft van het maximum (FWHM) laterale en axiale resoluties van respectievelijk 1,26 ± 0,15 en 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 kralen). Dit suggereert een consistente ruimtelijke resolutie over de hele beelddiepte.
- Bevestig de FEP-buis met gemonteerde zebravislarve stevig aan de 6-assige (x, y, z, pitch, yaw en roll) gemotoriseerde monstertafel en dompel de buizen onder in de monsterkamer gevuld met E3-water. Om de lichtverstrooiing door de dooierzak te voorkomen en de positie van het hart beter te lokaliseren, draait u de zebravislarve om een foto te maken vanaf de ventrale zijde (Figuur 2B). In dit geval zouden de meeste vastgelegde beelden zowel het ventrikel als het atrium omvatten (Figuur 2C).
OPMERKING: Gezien het feit dat de huidige beeldvormingsprocedures doorgaans minder dan een uur per vis duurden en werden uitgevoerd in een omgeving met gecontroleerde kamertemperatuur, worden de temperatuurregeling van de kamer en de regeling van het zuurstofniveau voor dit project als optioneel beschouwd. Voor time-lapse-beeldvormingsonderzoeken op langere termijn, met name die gericht op ontwikkelingsprocessen, wordt echter aanbevolen de temperatuur continu te bewaken en te regelen bij 27 °C in de monsterkamer om de fysiologische omgeving van de zebravis te waarborgen en mogelijke ontwikkelingsafwijkingen te voorkomen. - Sluit de gemotoriseerde monstertafel aan op het werkstation en configureer alle benodigde parameters, inclusief de gewenste bewegingsmodus.
- Breng een verbinding tot stand tussen de sCMOS-camera en het werkstation. Pas alle essentiële instellingen aan, zoals een belichtingstijd van 5 ms en het gewenste interessegebied.
- Configureer het aantal beeldsequenties en frames binnen het aangepaste LabVIEW-besturingsprogramma.
- Schakel de laser in en start LSM-beeldvorming van het monster. Houd het proces vol totdat alle beeldsequenties met succes zijn opgenomen.
- Neem 300 frames op als een 2D-beeldsequentie om 3-5 hartcycli van de larve te dekken met een framerate van 200 frames/seconde. De opname legt de cardiale contractiliteit vast op het selectieve vlak dat wordt verlicht door de lichtplaat.
- Beweeg de larve met een stapgrootte van 1 μm over de verlichting van de lichtplaat om het monster virtueel in plakjes te snijden.
OPMERKING: De stapgrootte van de monstertrap moet worden ingesteld op basis van de axiale resolutie van het light-sheet-systeem, volgens de Nyquist-Shannon-bemonsteringsstelling12. - Herhaal stap 7 om nog een beeldsequentie van het nieuwe monstersegment op te nemen totdat het hele hart bedekt is. Over het algemeen zorgen 100-200 beeldsequenties met een stapgrootte van 1 μm ervoor dat het hele hart van een zebravislarve wordt bestreken (Figuur 2D).
OPMERKING: Stap 4.7-4.9 worden bestuurd door het LabVIEW-programma en automatisch uitgevoerd door het LSM-systeem (Figuur 3). Gezien de grote hoeveelheid beeldgegevens die worden gegenereerd, wordt een gestandaardiseerde naamgevingsconventie aanbevolen voor beeldreeksen. Wijs bijvoorbeeld mappen aan met namen als 'z-1', 'z-2', enz. om gegevens over verschillende afbeeldingsreeksen te categoriseren. Binnen elke sequentie moeten de afbeeldingen opeenvolgend worden genoemd (bijv. "1", "2", ...) om verschillende tijdstippen aan te duiden. De totale tijd voor het monteren van vissen, het aanpassen van de beeldhoek en het verzamelen van alle gegevens voor één zebravislarve is ongeveer 1 uur.
5. 4D-beeldreconstructie met parallelle berekening
timing: 1 dag
OPMERKING: Het 4D-reconstructiealgoritme dat door onze groep is ontwikkeld en de voorbeeldgegevens zijn openbaar toegankelijk21. Met deze methode kan het 4D-hartbeeld worden gereconstrueerd aan de hand van de beeldsequenties die in eerdere stappen zijn verzameld (tabel 1).
- Open het bestand test_Parallel.m in MATLAB (zie Tabel met materialen). Geef de maplocatie op waar de RAW-afbeeldingsreeksen worden opgeslagen in de variabele "baseDir".
- Wijs de variabele "numOfSlice" toe met het totale aantal afbeeldingsreeksen (meestal 100-150) en de variabele "numOfImage" met het aantal afbeeldingen (meestal 300-500) in elke reeks.
- Inspecteer de beeldreeks die het middelste vlak van het hart van de zebravis laat zien (bijvoorbeeld de 51ereeks van in totaal 101 reeksen). Identificeer de framenummers van de eerste en vierde systolen in deze reeks en wijs ze toe aan de variabelen systolicPoint_1st en systolicPoint_4th.
- Klik op Uitvoeren om het proces te starten.
NOTITIE: De lengte van de hartcyclus in elke beeldsequentie wordt eerst geïdentificeerd door het MATLAB-programma door middel van een vergelijking van de gelijkenis (som van gekwadrateerde verschillen) tussen beelden op verschillende tijdstippen. Vervolgens wordt de hartcyclus geschat aan de hand van het gemiddelde van de cycluslengtes van alle beeldsequenties. Vervolgens worden de uitgangspunten van beeldsequenties op verschillende axiale locaties door het programma uitgelijnd door middel van een iteratieve vergelijking van de beeldgelijkenis van de eerste beeldsequentie tot de laatste beeldsequentie. - Controleer de resultaten in de uitvoermap. Het programma slaat de afbeeldingen op als ".tif"-bestanden met tijdstempels. Elk ".tif"-bestand is een 3D-hartafbeelding op een specifiek tijdstip. Het tijdsinterval tussen twee 3D-beelden is gelijk aan de belichtingstijd die is ingesteld.
OPMERKING: Reconstrueer de verkregen beelden van de vorige stappen om de 4D (3D ruimtelijk + 1D temporaal) hartcontracties weer te geven. Om de vaardigheid in high-throughput-onderzoeken tijdens de retrospectieve synchronisatie te verbeteren, maakt deze aanpak gelijktijdige rekenbewerkingen op een GPU mogelijk door gebruik te maken van meerdere CPU-kernen via de MATLAB parallelle computertoolbox en afbeeldingen om te zetten in het gpuArray-formaat.
6. 3D celsegmentatie en celtracering
timing: 1 dag
- Download het 3DeeCellTracker-pakket (zie Materiaaltabel) en stel de Python-omgeving in22.
- Download ITK-SNAP-annotatiesoftware23 (zie Materiaaltabel) en gebruik deze om het 3D-hartbeeld handmatig te labelen op twee geselecteerde tijdstippen, één bij de ventriculaire diastole en de andere bij de ventriculaire systole, om de trainings- en validatiedatasets te maken.
OPMERKING: Andere etiketteringssoftware kan ook van toepassing zijn. - Voer in Python het trainingsprogramma 3DeeCellTracker uit en initialiseer de noise_level(100 in dit geval), folder_path en modelparameters in de functie TrainingUNet3D om het vooraf gedefinieerde 3D U-Net-model in te stellen.
- Gebruik in MATLAB het programma imageDimConverter.m om de trainings- en validatiegegevensset te converteren en te hernoemen naar het juiste formaat voor laden.
- Laad in Python de trainings- en validatiegegevenssets met behulp van de functies trainer.load_dataset() en trainer.draw_dataset().
- Voer in Python het eerste deel van het 3DeeCellTracker-trackingprogramma uit en initialiseer de parameters.
OPMERKING: Dit omvat het definiëren van afbeeldingsparameters om afbeeldingsdimensies te karakteriseren, segmentatieparameters om het machine learning-model te selecteren dat wordt toegepast voor celsegmentatie en trackingparameters om de vooraf getrainde diepe neurale netwerkmodellen te selecteren die worden gebruikt voor celregistratie. Voor het eerste gebruik wordt het gebruik van het U-Net-model voor celsegmentatie en FFN+ PR-GLS voor celregistratie aanbevolen. Het is nodig om gegevens, modellen en resultaten op te slaan in mappen die in deze stap automatisch worden gemaakt. - Gebruik in MATLAB het programma imageDimConverter.m om alle 3D-hartafbeeldingen te converteren en te hernoemen naar het juiste formaat en ze over te brengen naar de gegevensmap die in de laatste stap is gemaakt.
- Voer in Python het tweede deel van het 3DeeCellTracker-programma uit om segmentatie te starten.
- Zodra de eerste 3D-afbeelding is gesegmenteerd, vergelijkt u het segmentatieresultaat met de RAW-afbeelding en voert u handmatige correctie uit als er een onjuiste segmentatie wordt gevonden. Verplaats de gecorrigeerde segmentatie naar de aangemaakte map "/manual_vol1".
- Voer in Python het derde deel van het 3DeeCellTracker-programma uit om alle afbeeldingen te segmenteren.
- Gebruik Amira (zie Tabel met materialen) om een visuele beoordeling van trackingresultaten uit te voeren door de posities van gevolgde cellen te vergelijken met de bijbehorende onbewerkte afbeeldingen. Als de testresultaten niet bevredigend zijn, start u de procedure opnieuw vanaf stap 6.6, gebruikt u een alternatief machine learning-model voor segmentatie of celregistratie en start u het trackingproces opnieuw.
OPMERKING: Na de segmentatie worden de gegevens van cellabels standaard opgeslagen als een 8-bits afbeelding (0 tot 255), wat betekent dat er slechts 256 schalen worden geleverd als labels voor celclassificatie. Er zijn twee oplossingen om dit probleem aan te pakken wanneer extra lessen nodig zijn. Een oplossing is om het formaat van gegevens van cellabels in te stellen als een 16-bits afbeelding in het trackingprogramma, wat een exponentiële toename van de verwerkingstijd zal veroorzaken, in dit geval meer dan twee dagen. De andere oplossing is om het programma "separateTrackingResults.py" te gebruiken om de cellabels na te bewerken, waarbij cellen met dezelfde labels worden gescheiden op basis van hun fysieke locatie en elke cel een ander label wordt toegewezen. Dit proces duurt in dit geval ongeveer 10 minuten.
7. Cardiale contractiliteitsanalyse in de virtual reality-modus
timing: 1 dag
- Verkrijg het resultaat van het volgen van cellen uit de vorige stappen.
- Valideer de gegevens handmatig en selecteer cellen met een consistente beeldintensiteit voor alle volumes (ongeveer 500 cellen van de ongeveer 600).
- Gebruik cellLabelsToObj.ipynb script21 om een oppervlaktenet te genereren voor elke afzonderlijke cel via 3D Slicer-software24 (zie Tabel met materialen) en wijs een unieke kleurcode toe aan elke cel.
- Exporteer elk 3D-model, bestaande uit alle cellen op één tijdstip, als één .obj bestand dat bestaat uit meerdere subobjecten, vergezeld van een .mtl-bestand om het cellabel te beschrijven.
- Importeer de modellen in Unity met behulp van de educatieve licentie, een ontwikkelingsengine die wordt gebruikt voor extended reality.
- Pas de aangepaste scripts bestaande uit functies die in C# zijn geschreven toe op de modellen en gebruikersinterface-elementen om 4D-visualisatie en interactieve analyse mogelijk te maken. Voer VR-interactie uit volgens stap 7.7.
- Communiceer met de modellen in virtual reality (VR) met behulp van de volgende functies (Afbeelding 4):
- Celselectie: selecteer maximaal twee cellen tegelijk en bekijk hun trajecten, snelheden, volumes, oppervlakten en relatieve afstanden.
- Tijdpuntselectie: Kies een specifiek tijdstip in de gegevens om de uitvoer van de geselecteerde cellen te analyseren, zoals op t = 0 ms tijdens diastole, of op t = 200 ms tijdens systole.
- Tijdpauze: Bevries het dynamische model om de focus te leggen op de geselecteerde cellen en hun uitvoer.
- Contrast: Moduleer het contrast tussen de geselecteerde cellen en de omringende cellen in het model.
Resultaten
Het huidige protocol bestaat uit drie hoofdstappen: voorbereiding en micro-injectie van zebravissen, light-sheet beeldvorming en 4D-beeldreconstructie, en celtracking en VR-interactie. Volwassen zebravissen mochten paren, de bevruchte eieren werden verzameld en voerden micro-injecties uit als dat nodig was voor de voorgestelde experimenten (Figuur 1). Deze stap biedt een startpunt om zebravistoepassingen te verkennen in het onderzoek naar cardiale ontwikkeling en regeneratie, en het speelt ook een cruciale rol in de daaropvolgende beeldvorming en analyse. Het samentrekkende hart werd in verschillende stadia (van 3 dpf tot 7 dpf) in beeld gebracht met behulp van het op maat gemaakte LSM-systeem en de beeldsequenties langs de z-as uitgelijnd om het 4D-zebravishartmodel te reconstrueren (Figuur 2 en Figuur 3). Deze modellen bieden een basis voor diepgaande fenotypische karakteriseringen en zijn cruciaal bij het onthullen van de dynamiek van de hartmorfologie en -functie over ontwikkelingstijdlijnen. De individuele cellen in het hart van de zebravis werden gevolgd en hun beweging en interactie werden gekwantificeerd met behulp van het aangepaste VR-platform. De snelheids- en relatieve afstandsveranderingen van geselecteerde cellen werden ook vergeleken tijdens één hartcyclus in het atrium en ventrikel om de regionale contractiliteit te beoordelen en lokale spanning te onderzoeken (Figuur 4). De regionale stam werd bepaald op basis van de variatie in verplaatsing tussen twee aangrenzende myocardcellen in het interessegebied. De fractionele verkorting (FS) en ejectiefractie (EF) werden geschat met behulp van methodologieën die in de gepubliceerde literatuur worden beschreven25. De vergelijkingen voor FS en EF zijn als volgt:
waarbij Dd en Ds de ventrikeldiameters (korte as, gemeten aan de hand van afstanden tussen verschillende ventrikelcellen) zijn in respectievelijk de einddiastolische en eindsystolische stadia, en Vd en Vs de ventriculaire volumes zijn (berekend op basis van de lange en korte asdiameters van het ventrikel) in respectievelijk de einddiastolische en eindsystolische stadia.
Gezamenlijk laten deze resultaten een nieuwe strategie zien die zowel fysiologie als techniek integreert om volumetrische beeldvorming en gegevensinterpretatie in zebravismodellen te vergemakkelijken, wat veelbelovend is voor het bevorderen van de verkenning van cardiale morfogenese en mechanica.
Figuur 1: Verzameling van zebraviseieren en micro-injectieproces. Het proces omvat het paren van volwassen zebravissen, het verzamelen van bevruchte eieren en het uitvoeren van de optionele micro-injectie. Tijdens de micro-injectie wordt de voorgetrokken glazen pipet geladen met de gewenste materialen. Bevruchte eieren worden in rechte rijen uitgelijnd in agarose-schimmelspleten en loodrecht op de naald geplaatst. De micro-injectie wordt uitgevoerd onder constante microscopische observatie van zowel de eieren als de naaldpunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Light-sheet beeldvormingsproces en 4D-beeldreconstructie. (A) Schema van de interne structuur van het lichtbladbeeldvormingssysteem. CL: cilindrische lens. EO: excitatie objectief. DO: detectie doelstelling. TL: buis lens. FL: filteren. CAM: sCMOS-camera. (B) Schema van een zebravis gemonteerd in de FEP-buis en ingebed door agarose. (C) Ruwe 2D-beeldsequentie vastgelegd van een zebravislarve van 4 dpf. De klok linksboven in elk frame geeft de hartfase aan vanaf de eindsystole. (D) Illustratie van retrospectieve synchronisatie voor 4D-beeldregistratie van zebravissen. Beeldsequentie geeft een continue opname aan op een bepaalde diepte langs de z-as. Elk frame in de beeldreeks wordt weergegeven door een rode stip en de begin- en eindfasen van einddiastole tot eindsystole worden gemarkeerd in het gele vak. (E) 4D gereconstrueerde hartmodellen op basis van de 2D-beeldsequenties. Dpf: dagen na de bevruchting. Deze figuur is een bewerking van Zhang et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: LabVIEW-bedieningspaneel. (A) De instellingen die in het bedieningspaneel worden gebruikt, omvatten de configuratie van de laser, de camera, het beeldpad en het motorpatroon. (B) Een voorbeeld van een ruwe afbeelding van een zebravishart die is vastgelegd door het LabVIEW-programma. Schaalbalk: 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Celtracking en VR-interactie helpen bij het onthullen van de contractiliteit van het hart van zebravissen. (A) Getraceerde cellen van Tg(myl7:nucGFP) zebravishart bij 3 dpf. (B) Het VR-platform biedt gebruikers een meeslepende kijk- en interactieve ervaring van een 4D-zebravishartmodel, waardoor de hartfunctie in de loop van de tijd kan worden gevisualiseerd door middel van door de gebruiker gedefinieerde analyse. (C) Na het verzamelen van metingen van het VR-platform werden snelheids- en relatieve afstandsveranderingen vergeleken tijdens één hartcyclus tussen geselecteerde cellen bij 3 dpf en 7 dpf. De eerste twee figuren tonen de gemiddelde snelheidsveranderingen in vijf ventriculaire cellen en vijf atriale cellen, en de andere illustreren de relatieve afstandsveranderingen tussen drie groepen cellen, d.w.z. twee ventriculaire cellen, een ventriculaire cel en een atriale cel, en twee atriale cellen. (D) Hartfunctiebeoordelingen van 3 dpf en 7 dpf zebravisharten. In totaal werden 370 cellen gevolgd in zebravisharten bij 3 dpf en 580 cellen bij 7 dpf. Deze figuur is een bewerking van Zhang et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| NAAM | GEBRUIK | ID | |
| Aangepaste programma's en algoritmen | |||
| PSF.m | Om PSF te berekenen op basis van FWHM-meetresultaten van fluorescentieparels. | MATLAB-programma | |
| 4D Zebravis Imaging.vi | Om de hardware in het LSM-systeem te bedienen en te synchroniseren. | LabVIEW programma | |
| test_Parallel.m., enz. | 4D-beelden reconstrueren uit 2D-beeldreeksen. | MATLAB-programma | |
| imageDimConverter.m | Om afbeeldingsgegevens te verbergen naar een opgegeven indeling voor het volgen van cellen. | MATLAB-programma | |
| separateTrackingResults.py | Om de resultaten van het volgen van cellen te posten voor het scheiden van cellen met dezelfde labels. | Python programma | |
| cellTracking_All.py | Om cellen te selecteren met een consistente beeldintensiteit voor alle volumes. | Python programma | |
| cellLabelsToObj.ipynb | Om een oppervlaktegaas te genereren voor elke individuele cel door middel van een 3D-slicer. | Python programma | |
| DynamicHeartModel.cs, enz. | Om een VR-omgeving te creëren en interactie te hebben met objecten. | C# programma | |
| Hardware-ontwerp op maat | |||
| 3D-geprinte monsterkamer | Te gebruiken met onderdompelingsobjectieven in water. | SolidWorks-ontwerp | |
| 3D-geprinte monsterhouder | Om aan te passen aan de monsterfase en de steekproef vast te houden. | SolidWorks-ontwerp | |
Tabel 1: Tabel met aangepaste bronnen. De voorbeeldcodes en -gegevens worden geüpload naar Zenodo21.
Discussie
De integratie van het zebravismodel met technische methoden biedt een enorm potentieel voor de in vivo exploratie van myocardinfarct, aritmieën en aangeboren hartafwijkingen. Door gebruik te maken van de optische transparantie, het regeneratieve vermogen en de genetische en fysiologische overeenkomsten met mensen, zijn zebravisembryo's en -larven op grote schaal gebruikt in onderzoek 1,2,4. De superieure spatiotemporele resolutie, minimale fotoschade en optische sectiemogelijkheden van light-sheet beeldvorming onderscheiden het voor het 4D-onderzoek van hartmorfologie en contractiele functie in zebravislarven 12,26,27,28. Dit protocol introduceert een alomvattende aanpak die light-sheet beeldvorming, retrospectieve synchronisatie, 3D-celtracking en een interactief virtual reality (VR)-platform voor kwantitatieve beoordelingen integreert. Het biedt een toegangspunt om cardiale contractie vast te leggen en te reconstrueren, de cellulaire dynamiek te volgen en te kwantificeren en de structurele, functionele en mechanische veranderingen tijdens de ontwikkeling en regeneratie van het hart te beoordelen. Deze methode kan ook worden ondersteund door meerkanaals fluorescentiebeeldvorming om verschillende celtypen en -lijnen te volgen voor het onderzoeken van cellulaire heterogeniteit en intercellulaire interactie. Hoewel de dichotomie van het zebravismodel ten opzichte van zoogdiersystemen en de beperking ervan als een acuut model een zorgvuldige overweging rechtvaardigen, kan vooruitgang in genetische manipulatie de ontwikkeling van transgene zebravislijnen mogelijk maken die meer lijken op menselijke ziektetoestanden, waardoor de translationele waarde van bevindingen die zijn afgeleid van zebravisstudies wordt vergroot.
Deze retrospectieve synchronisatie op basis van de aanname van een periodieke hartcyclus wordt gebruikt om de lichtbladbeelden van het samentrekkende zebravishart te reconstrueren. De implementatie van deze methode in light-sheet beeldvorming stelt iemand in staat om het samentrekkende hart te visualiseren en te analyseren met meer dan 200 volumes per seconde. Om de uitdaging van de grote hoeveelheid gegevens in de huidige analyse aan te gaan, werd parallelle berekening met multi-core CPU en GPU gebruikt, wat resulteerde in een meer dan tienvoudige verbetering van de efficiëntie van beeldreconstructie. Tijdens de retrospectieve synchronisatie werd verondersteld dat de cardiomyocyten bij elke hartslag terugkeren naar hun basisposities. Hoewel deze aanname relatief veilig is gezien de lage variabiliteit in hartslag die wordt waargenomen bij zebravis26 , zoals aangetoond in figuur 4C, blijft het een vereenvoudiging die mogelijk niet alle biologische nuances verklaart. Innovaties op het gebied van beeldvorming, zoals compressiefluorescentie en lichtveldmicroscopie, kunnen de effecten die voortvloeien uit deze aanname verzachten door de redundantie van de slice te verminderen.
Om de diepgaande analyse in het ingewikkelde 4D-hartmodel mogelijk te maken, werd een computationeel raamwerk ontwikkeld met zowel 3DeeCellTracker-gebaseerde celsegmentatie als een VR-platform voor gebruikersgericht onderzoek. De inherente mogelijkheden van dit raamwerk, inclusief de hoge efficiëntie en interactieve manipulatie, stellen iemand in staat om de verandering van de cellulaire snelheid te kwantificeren, de cel-celinteracties te onderzoeken en de regionale en globale myocardiale mechanica te beoordelen, zoals fractionele verkorting, ejectiefractie en regionale belasting30 (Figuur 4). Er wordt gewezen op het ontbreken van voorafgaande beoordelingen van de hartfunctie van zebravissen bij 7 dpf in de bestaande literatuur. In vergelijking met gegevens bij 3 dpf die door andere onderzoekers zijn verstrekt, komen de huidige resultaten echter overeen met eerdere indicaties van een afname van zowel de ejectiefractie (EF) als de fractionele verkorting (FS) tijdens het interval van 3 dpf tot 7 dpf 25,31. Deze analysemethoden hebben een aanzienlijk potentieel voor het ophelderen van cardiale dynamiek in modellen voor hartletsel van zebravissen12,25.
Omdat VR-technologie en -software unieke functies bevatten, zoals stereoscopisch zicht en automatische registratie van celposities, maakt dit platform een meeslepende en gestroomlijnde methode mogelijk om specifieke cellen te selecteren en hun traject gedurende de hartcyclus te analyseren. Het gebruik van VR biedt een intuïtieve manier om complexe taken zoals celsegmentatie en annotatie efficiënter en nauwkeuriger uit te voeren 32,33,34. Het ondersteunt ook meerdere gebruikers om unieke tools te gebruiken bij het samenwerken aan grote, gecompliceerde datasets34. Hoewel langdurig gebruik van VR bijwerkingen zoals duizeligheid kan veroorzaken, kan dit worden verzacht door verbeterde ergonomische ontwerpen en ongebonden headsets. Om de aanzienlijke rekenkracht aan te pakken die nodig is voor het in realtime weergeven van complexe biologische structuren, zou het optimaliseren van software voor onmiddellijke verwerking en het gebruik van cloudgebaseerde computeroplossingen bovendien het vermogen van het systeem om ingewikkelde visualisaties te beheren kunnen verbeteren.
Nu hardwareapparaten en rekenkracht zich blijven ontwikkelen, kan deze strategie worden uitgebreid om hartritmestoornissen in het myocardium op zowel cellulair als weefselniveau te onderzoeken, wat uiteindelijk het potentieel heeft om het onderliggende mechanisme van cardiale morfogenese te ontrafelen en de ontwikkeling van therapeutische interventies te bevorderen.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflict om bekend te maken.
Dankbetuigingen
We spreken onze dankbaarheid uit aan Dr. Caroline Burns van het Boston Children's Hospital voor het genereus delen van de transgene zebravis. We danken mevrouw Elizabeth Ibanez voor haar hulp bij het verzorgen van zebravissen aan de UT Dallas. We waarderen ook alle constructieve opmerkingen van D-incubator-leden van UT Dallas. Dit werk werd ondersteund door NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) en UT Dallas STARS-programma (Y.D.).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RESOURCE | SOURCE/Referentie | IDENTIFICATIE | |
| Diermodellen | |||
| Tg(myl7:nucGFP) transgene zebravis | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Software en algoritmen | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Light-sheet systeem | |||
| Cyllindrische lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Verlichting objectief | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Detectie objectief | Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Gemotoriseerde XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| Twee-as kanteling stage | Thorlabs | GN2/M | |
| Rotatie stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Fluorescente kralen | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
| Microinjector en vacuümpomp | |||
| Microinjector | WPI | PV850 | |
| Vacuümpomp | Welch | 2522B-01 | |
| Voor-getrokken glazen pipetten | WPI | TIP10LT | |
| Capillaire tip voor gel laden | Bio-Rad | 2239912 | |
| Virtual reality hardware | |||
| VR-bril | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L PTU oplossing | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 werkoplossing | - | - | |
| 1% Agarose | - | - | |
| Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| De-ioniseerd water | - | - | |
| 10g/L Tricaine stockoplossing | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| De-ioniseerd water | - | - | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 150mg/L Tricaine werkoplossing | |||
| 10g/L Tricaine stockoplossing | - | - | |
| De-ioniseerd water | - | - | |
| 60X E3 stockoplossing | |||
| Natriumchloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl | |
| Kaliumchloride | - | KCL | |
| Calciumchloride Dihydraat | - | CaCL2 x 2H2O | |
| Magnesiumsulfaat Heptahydraat | - | MgSO4 x 7H2O | |
| RO Water | - | - | |
| 1X E3 werkoplossing | |||
| 60X E3 stockoplossing | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | - | |
| RO Water | - | - | |
| 1% Methyleen Blauw (optioneel) | - | C16H18ClN3S |
Referenties
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, H., Xu, X. Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine. Front. Physiol. 11, 599244(2020).
- Giardoglou, P., Beis, D. On zebrafish disease models and matters of the heart. Biomedicines. 7 (1), 15(2019).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational analysis of cardiac contractile function. Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227(2015).
- Vedula, V., et al. A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling. PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828(2017).
- Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).
- Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J. Biophotonics. 16 (5), e202200278(2023).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7 (2), 026112(2023).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. Eugene. , University of Oregon Press. (2000).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. 25, e1115(2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J. Opt. 20 (5), 053002(2018).
- Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart. J Vis Exp. 138, e57763(2018).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae. Zenodo. , (2023).
- Wen, C., et al. 3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images. Elife. 10, e59187(2021).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Naderi, A. M., et al. Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos. Comput. Biol. Med. 135, 104565(2021).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3 (16), e121396(2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).
- Coelho-Filho, O. R., et al. Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling. Circulation. 128 (11), 1225(2013).
- Zhang, B., et al. Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning. Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291(2021).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), e97180(2017).
- Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. Virtual reality for interactive medical analysis. Front. Virtual Real. 3, 782854(2022).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).
Herprints en machtigingen
