Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gemodificeerde angstconditionering voor het induceren van vlieggedrag bij muizen

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66266

⸱

15 december 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Om vluchtgedrag in een angstige context te bestuderen, introduceren we een aangepast angstconditioneringsprotocol. Dit protocol zorgt ervoor dat muizen consequent vluchtgedrag vertonen tijdens cue-presentatie in de angstconditionering.

Samenvatting

De juiste manifestatie van defensief gedrag in een bedreigende situatie is van cruciaal belang om te overleven. De heersende theorie suggereert dat actief defensief gedrag, zoals springen of snel schieten, tot uiting komt bij een hoge dreiging of daadwerkelijke dreiging, terwijl passief defensief gedrag, zoals bevriezing, wordt uitgedrukt wanneer de dreiging wordt voorspeld, maar de dreiging relatief laag is. Bij klassieke angstconditionering vertonen proefpersonen doorgaans bevriezing als een geconditioneerde defensieve reactie, met in de meeste gevallen weinig uiting van actief defensief gedrag. Hier introduceren we een aangepaste angstconditioneringsprocedure voor muizen om de overgang van bevriezing naar vlucht te observeren en vice versa, met vijf repetitieve paren van geconditioneerde stimuli (CS; continue toon, 8 kHz, 95 dB SPL (geluidsdrukniveaus)) en ongeconditioneerde stimuli (VS; voetschok, 0,9 mA, 1,0 s) gedurende twee dagen. Deze aangepaste angstconditioneringsprocedure vereist een relatief groot aantal conditioneringssessies en conditioneringsdagen, maar vereist geen voetschok met hoge intensiteit voor een bescheiden uiting van vlieggedrag. Het gebruik van dezelfde context voor conditionering en opvallende CS-presentaties is essentieel om vluchtgedrag uit te lokken. Deze aangepaste angstconditioneringsprocedure is een betrouwbare methode voor het observeren van actief defensief gedrag bij muizen, en biedt de mogelijkheid om de fijne mechanismen en kenmerken van dergelijk gedrag in een angstige context op te helderen.

Inleiding

De juiste selectie van defensief gedrag onder bedreigende omstandigheden is cruciaal voor het voortbestaan van alle dieren. Defensief gedrag verschuift geleidelijk van het ene naar het andere op basis van de nabijheid van de dreiging, zoals de overgang tussen bevriezings- en vluchtgedrag 1,2,3. Ontregeling van dit gedrag wordt vaak waargenomen bij verschillende psychische stoornissen4. Posttraumatische stressstoornis (PTSS) is zo'n stoornis die wordt gekenmerkt door overdreven defensief gedrag, zoals paniekreacties op niet-bedreigende stimuli4.

Klassieke angstconditionering bij knaagdieren wordt vaak gebruikt als model voor PTSS 5,6,7, maar knaagdieren vertonen geen vluchtgedrag (paniekachtig) in dit model8. Bijgevolg mist het klassieke angstconditioneringsmodel, vaak aangeduid als het 'knaagdier-PTSS-model', gezichtsvaliditeit voor PTSS bij mensen, met name bij het vastleggen van vlucht- of paniekachtige symptomen, die niet goed zijn bestudeerd.

Onlangs hebben verschillende aangepaste angstconditioneringsprotocollen met succes aangetoond dat knaagdierproefpersonen tijdens deze procedures vluchtgedrag vertonen. Bijvoorbeeld, herhaalde associaties van een geconditioneerde stimulus (CS) en een ongeconditioneerde stimulus (US) zeven keer per dag zorgden ervoor dat vrouwelijke ratten dartelgedrag vertoonden dat vergelijkbaar was met vluchtgedrag9. In tweedaagse angstconditioneringen met behulp van seriële samengestelde stimuli (SCS; samengesteld uit toon gevolgd door geluid), begonnen muizen vluchtgedrag te vertonen tijdens het lawaaigedeelte van SCS-presentaties 10,11,12. De gedetailleerde beschrijving van de SCS-methode is opgenomen in een protocolrapport13. Een driedaagse angstconditionering met SCS werkte ook voor ratten om vluchtgedrag op te wekken14. Deze nieuwe protocollen hebben echter enkele beperkingen. Het gebruik van seriële cue-presentatie laat bijvoorbeeld niet toe om de invloed van nabijheidsschatting op defensief gedrag uit te sluiten. In het geval van zeven keer associatie van CS-US bij ratten, werd de meerderheid van de vluchtreacties waargenomen bij vrouwtjes in plaats van bij mannetjes.

In het licht van deze overwegingen introduceren we een aangepast angstconditioneringsprotocol voor muizen om vluchtgedrag in een angstige context te onderzoeken. Mannelijke muizen vertonen consequent vluchtgedrag tijdens onze aangepaste angstconditionering. In dit protocol wordt de saillante toon gebruikt als de CS in plaats van SCS. Bovendien is een minimum van vijf paringen van CS-US op een dag gedurende ten minste twee dagen, samen met angstpotentiëring door de geconditioneerde context, vereist. Het protocol biedt een andere optie voor het onderzoeken van vlieggedrag, als aanvulling op eerdere protocollen, afhankelijk van het onderzoeksdoel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is uitgevoerd in overeenstemming met de leidende principes van de Physiological Society of Japan en heeft goedkeuring gekregen van het Animal Care Committee van de Kanazawa Medical University (2021-32). Alle procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen. Volwassen mannelijke C57BL/6J-muizen (3-6 maanden oud) werden gebruikt voor het onderzoek en eerder werd bevestigd dat deze muizen het vlieggedrag vertoonden dat in dit manuscript wordt beschreven15.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Groepsmuizen (3-4 per kooi; gehouden op 23-27 °C; in een licht/donker-cyclus van 12 uur; ad libitum toegang tot voedsel en water) tot het begin van de experimenten.
  2. Huisvest elke muis individueel in een kooi van plexiglas (14 cm × 21 cm × 12 cm) gedurende ten minste 3 dagen voordat u deze aangepaste angstconditionering ondergaat.

2. Instellen van de gereedschappen/apparatuur

  1. Angstconditioneringsbox (Figuur 1A)
    1. Gebruik een angstconditioneringskamer (25 cm × 25 cm × 25 cm) die is ingesloten in een geluiddempende doos (67 cm × 53 cm × 55 cm) (zie Tabel met materialen).
    2. Er zijn twee contexten (A en B) vereist. Maak voor context A zwart-witte strepen op de muren door wit plastic karton te bevestigen met zwarte tapes (3 cm breed, 4 op een bord). Gebruik een witte gladde plastic plaat voor de vloer.
    3. Veeg de muren en vloer voor elke sessie af met heptanol (1%).
      NOTITIE: Er wordt geen actief ventilatiesysteem gebruikt. Reiniging met alcohol aan het einde van de sessie vermindert de heptanolgeur.
    4. Maak voor context B het uiterlijk van muren volledig zwart door het bord te verwijderen dat in context A wordt gebruikt. De vloer is een roostervloer.
      NOTITIE: Er wordt geen specifieke geur gepresenteerd, behalve een lichte alcoholgeur voor reiniging.
    5. Verlicht de experimentele box met behulp van een witte lichtdiode (LED, 240 lux) (zie Materiaaltabel).
  2. Shocker
    1. Sluit een scramble shocker (zie Materiaaltabel) aan op een roostervloer die bestaat uit roestvrijstalen staven. Dit wordt gebruikt om voetschokken te geven. De intensiteit van de voetschok werd vastgesteld op 0,9 mA volgens de gebruikelijke methoden van angstconditionering 10,11,12,13.
  3. Audio-generator
    1. Plaats een luidspreker (zie Materiaaltabel) aan het plafond. Alle akoestische prikkels worden versterkt.
    2. Wijzig en kalibreer digitaal de totale amplitudes van elke stimulus om geluidsdrukniveaus (SPL, re: 20 μ Pa) aan de voorkant van 5 cm te verkrijgen met een 1/4 inch microfoon. Presenteer een continue toonuitbarsting door deze luidspreker.
      OPMERKING: Het kalibreren van de geluidsluidspreker is cruciaal om de fijne impact van geluidsprikkels op defensief gedrag tijdens deze gemodificeerde angstconditionering te onderzoeken.
  4. Transducer
    1. Plaats de bodem van de testkamer op een transducer (zie Tabel met materialen) voor de detectie van trillingen. Het signaal van de transducer wordt verzonden naar een geluidskaart met een bemonsteringsfrequentie van 8 kHz om de gedragstrillingen op te nemen.
  5. Videocamera
    1. Plaats een CMOS-camera (zie Materiaaltabel) aan het plafond om de bewegingen van het onderwerp te volgen en het geluid in de conditioneringsbox op te nemen.
  6. Triggering systeem
    1. Gebruik geluidssoftware (zie Materiaaltabel) voor het activeren van tonen of voetschokken op geplande tijdstippen.
      OPMERKING: Elke in de handel verkrijgbare stimulator werkt hiervoor.

3. Gedragsexperiment

  1. Plan vier dagen angstconditioneringsprocedures: gewenning (1 dag, 5 proeven), conditionering (2 dagen, elk 5 proeven) en test-/uitdovingssessies (1 dag, 5 of 15 proeven). De intertriale intervallen varieerden tussen 60-75 s (Figuur 1B).
    OPMERKING: Neem bij voorkeur tien of meer proefpersonen in een groep op om betrouwbare gedragsneigingen te verkrijgen. Er zijn twee of drie groepen nodig, afhankelijk van het doel van het onderzoek.
    1. Presenteer tijdens de conditioneringssessie de ongeconditioneerde stimulus (US) (1 s, 0,9 mA) onmiddellijk na het beëindigen van de geconditioneerde stimulus (CS) (continue toonburst, 8 kHz, 20 s, 95 dB SPL) zoals weergegeven in figuur 1B. Lever vijf CS-US-paren in een conditioneringsdag.
    2. Laat na het beëindigen van de 5e voetschok het onderwerp 1 minuut in de context voordat u het terugplaatst in de thuiskooi. Veeg de kamer schoon met 70% alcohol voor reiniging na elke gedragstest.
      OPMERKING: CS en VS-intensiteit kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van het doel van het onderzoek. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat een sterkere CS-intensiteit leidt tot actiever defensief gedrag dan zachtere15. Conditioneringsdagen kunnen ook worden verlengd.
  2. Vlieggedrag induceren tijdens CS-presentaties volgens het onderstaande schema.
    OPMERKING: IN DIT EXPERIMENT WORDEN EEN CS (95 dB SPL) en een US (0,9 mA) gebruikt.
    1. Stel proefpersonen op dag 1 bloot aan 5 CS alleen-onderzoeken in context A.
    2. Op dag 2 en 3 conditioneert u proefpersonen met 5 CS-US-associatieonderzoeken in context B.
    3. Stel proefpersonen op dag 4 bloot aan 5 CS alone-onderzoeken voor de recall-sessie in context B. In het geval van het testen van het uitsterven van het geheugen, stelt u proefpersonen bloot aan 15 CS-onderzoeken alleen.
      OPMERKING: Om de stabiliteit van het geheugen te testen, zal het helpen om extinctiesessies met 2-3 dagen te verlengen. Ook kan het testen van het geheugen een week later in plaats van op dag 4 een extra bevestiging van de geheugenstabiliteit opleveren.

4. Analyse van defensief gedrag

OPMERKING: Beweging, bevriezingspercentage en het aantal sprongen tijdens CS-presentaties worden geanalyseerd. Details worden hieronder beschreven. Indien mogelijk zou het beter zijn om dubbelblind te analyseren.

  1. Synchroniseer de timing van gebeurtenissen in de video en de timing van stimuli (CS en US) met behulp van het toonbegin dat in de video is opgenomen.
  2. Gebruik een op maat gemaakte code om zowel de gemiddelde als de totale bewegingen van muizen te berekenen op basis van het verschil in het zwaartepunt van het silhouet van het onderwerp in verschillende frames.
    OPMERKING: Voor deze meting wordt een willekeurige eenheid gebruikt, aangezien de bewegingssnelheid afhangt van de bemonsteringsfrequentie van de film.
  3. Om het bevriezingspercentage te meten, gebruikt u het transducersignaal in de tijd.
    1. Voorproces transducersignalen met behulp van een 20-500 Hz banddoorlaatfilter.
    2. Bereken de gemiddelde kwadratische amplitude van het transducersignaal in de tijd voor elke bak van 50 ms.
    3. Stel een drempelwaarde in voor de signaalamplitude om de immobiliteitsperiode te detecteren. De duur van immobiliteit is de signaalperiode lager dan de drempel voor meer dan 1 s.
    4. Meet handmatig de duur van het invriezen door de video te bekijken.
    5. Pas de drempel van de signaalamplitude voor bevriezing aan door het handmatig gemeten bevriezingspercentage te vergelijken met het percentage dat wordt berekend op basis van het transducersignaal.
  4. Tel handmatig het aantal sprongen uit videobestanden.
    OPMERKING: Het tellen van het aantal darts is ook nuttig bij het beoordelen van de vluchtreactie.

5. Statistische analyse

  1. Stel de statistische significantie in op p < 0,05.
  2. Voor vergelijkingen tussen meerdere groepen en meerdere factoren, voer een multiway ANOVA uit, gevolgd door post-hoc tests. Als een specifieke dag van het conditioneringsschema wordt getest, voer dan meerdere vergelijkingstests of permutatietests uit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Resultaten verkregen met de gemodificeerde angstconditionering bij mannelijke muizen (C57BL/6J; 3-6 maanden oud) worden gepresenteerd, volgens het schema dat wordt weergegeven in figuur 1C. Het experiment was bedoeld om te onderzoeken hoe de geconditioneerde context de expressie van vluchtgedrag beïnvloedt. Er werden twee groepen ingedeeld: groep 1 (n = 10) en groep 2 (n = 10). In dit experiment werden een CS (95 dB SPL) en een US (0,9 mA) gebruikt.

Op dag 1 onder...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het aangepaste angstconditioneringsprotocol dat in dit artikel wordt geïntroduceerd, is een stabiele methode voor het onderzoeken van vluchtgedrag in een angstige context. Door dit protocol toe te passen, hebben we ontdekt dat het vluchtgedrag van muizen in de angstige context wordt veroorzaakt door opvallende stimuli en afhankelijk is van de context. De kenmerken van vlieggedrag waren niet goed onderzocht, omdat er geen geschikt protocol was om vlieggedrag te observeren. Dit protocol zal een van de geschikte methoden zi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door KAKENHI Grants JP22K15795 (aan T.F.), JP22K09734 (aan N.K.), JP21K07489 (aan R.Y.), Kanazawa Medical University (C2022-3, D2021-4, aan R.Y.) en The Naito Foundation (aan T.F.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Audio speakerFostexFT17H
AmplifierSonyTA-F500
CMOS cameraSanwa Supply Inc.CMS-V43BK
Fear conditioning chamberPanlab S.L.U.LE116
Food pelletsNosanLabo MR standard
LEDYamazenLT-B05N
MicrophoneACOtype 4156N
Scramble shockerPanlab S.L.U.LE 100-26
Sound cardBehringerUMC202
Sound softwareSyntrillium SoftwareCool Edit 2000
TransducerPanlab S.L.U.LE 111

Referenties

  1. Fanselow, M. S., Lester, L. S. Evolution and learning. , Psychology Press. 185-212 (1988).
  2. Fanselow, M. S. Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear. Psychonomic Bulletin & Review. 1 (4), 429-438 (1994).
  3. Mobbs, D., Headley, D. B., Ding, W., Dayan, P. Space, time, and fear: Survival computations along defensive circuits. Trends in Cognitive Sciences. 24 (3), 228-241 (2020).
  4. Black, D. W., Grant, J. E. Dsm-5 guidebook: The essential companion to the diagnostic and statistical manual of mental disorders. American Psychiatric Pub. , (2014).
  5. Bienvenu, T. C., et al. The advent of fear conditioning as an animal model of post-traumatic stress disorder: Learning from the past to shape the future of ptsd research. Neuron. 109 (15), 2380-2397 (2021).
  6. Johnson, L. R., Mcguire, J., Lazarus, R., Palmer, A. A. Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of ptsd. Neuropharmacology. 62 (2), 638-646 (2012).
  7. Yehuda, R., Ledoux, J. Response variation following trauma: A translational neuroscience approach to understanding ptsd. Neuron. 56 (1), 19-32 (2007).
  8. Ledoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23 (1), 155-184 (2000).
  9. Gruene, T. M., Flick, K., Stefano, A., Shea, S. D., Shansky, R. M. Sexually divergent expression of active and passive conditioned fear responses in rats. Elife. 4, e11352(2015).
  10. Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-100 (2017).
  11. Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. Elife. 9, e53803(2020).
  12. Trott, J. M., Hoffman, A. N., Zhuravka, I., Fanselow, M. S. Conditional and unconditional components of aversively motivated freezing, flight and darting in mice. Elife. 11, e75663(2022).
  13. Borkar, C. D., Fadok, J. P. A novel pavlovian fear conditioning paradigm to study freezing and flight behavior. Journal of Visualized Experiments. 167, e61536(2021).
  14. Totty, M. S., et al. Behavioral and brain mechanisms mediating conditioned flight behavior in rats. Scientific Reports. 11 (1), 8215(2021).
  15. Furuyama, T., et al. Multiple factors contribute to flight behaviors during fear conditioning. Scientific Reports. 13 (1), 10402(2023).
  16. Cain, C. K. Avoidance problems reconsidered. Current Opinion in Behavioral Sciences. 26, 9-17 (2019).
  17. Ledoux, J. E., Moscarello, J., Sears, R., Campese, V. The birth, death and resurrection of avoidance: A reconceptualization of a troubled paradigm. Molecular Psychiatry. 22 (1), 24-36 (2017).
  18. Bouchekioua, Y., et al. Serotonin 5-ht2c receptor knockout in mice attenuates fear responses in contextual or cued but not compound context-cue fear conditioning. Translational Psychiatry. 12 (1), 58(2022).
  19. Bouchekioua, Y., Nishitani, N., Ohmura, Y. Conditioned lick suppression: Assessing contextual, cued, and context-cue compound fear responses independently of locomotor activity in mice. Bio-Protocol. 12 (23), e4568(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66266

Tags

Defensief gedragfreezengedraggedrag van muizengeconditioneerde stimuliongeconditioneerde stimuliangststoornisPTSD modelgedragsneurowetenschappen
Gemodificeerde angstconditionering voor het induceren van vlieggedrag bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.