Kwantificering van Acanthamoeba spp. Motility

Samenvatting

In deze procedure wordt beschreven hoe u Acanthamoeba spp. kunt visualiseren, volgen en kwantificeren.Motility.

Samenvatting

Acanthamoeba keratitis is een ernstige ooginfectie die behandelingsproblemen met zich meebrengt en tot blindheid kan leiden. Ondanks de alomtegenwoordigheid en mogelijke besmetting van contactlenzen na blootstelling aan water, blijft het natuurlijke gedrag van deze ziekteverwekker ongrijpbaar. Inzicht in de bewegingspatronen van Acanthamoeba kan ons informeren over hoe het contactlenzen koloniseert en het hoornvlies van de patiënt besmet. Het is een geluk dat Acanthamoeba spp. zijn zichtbaar via helderveldmicroscopie vanaf 4x vergroting. Eerdere technieken zijn ontwikkeld om de beweeglijkheid van Acanthamoeba te kwantificeren met betrekking tot cytopathische effecten of te weinig blootstelling aan het elektrische veld. Hier beschrijven we een methode om Acanthamoeba spp. te volgen en te kwantificeren.beweeglijkheid op lange termijn (uren tot dagen), een protocol dat van toepassing is op meerdere amoebestammen, oppervlakken en voedingsstatus van amoeben. Deze procedure is relevant voor het bepalen van veel kwantificeringen van de kernmotiliteit, zoals afstand, snelheid, opsluiting en richting, die nodig zijn om verschillende stadia van infectie, proliferatie of gedragsverandering te volgen.

Inleiding

Het onderzoek naar acanthamoeba is de afgelopen jaren dramatisch toegenomen als gevolg van de verhoogde prevalentie van Acanthamoeba keratitis (AK), een parasitaire infectie na de aanhechting van Acanthamoeba aan het hoornvlies^. Hoewel uitbraken van AK kunnen worden toegeschreven aan ongepaste contactlensverzorging of ineffectieve contactlensverzorgingsoplossingen 2,3,4,5, zijn er momenteel geen vereisten om de werkzaamheid van Acanthamoeba-desinfectie aan te tonen voor enig product op de markt. Er is echter een voortdurende inspanning in de wetenschappelijke gemeenschap en binnen normalisatie-organisaties om de protocollen te onderzoeken die nodig zijn voor het kwantificeren van de desinfecterende werkzaamheid van contactlensverzorgingsproducten ^6,7. Verder is opgemerkt dat Acanthamoeba, vanwege zijn gelijkenis in cellulaire en functionele aspecten met menselijke macrofagen, een belangrijke rol speelt bij het hosten en verspreiden van andere menselijke pathogenen⁸, naast de pathogeniteit die de amoebe zelf met zich meebrengt.

Er zijn recente technieken beschreven die in staat zijn geweest om de beweeglijkheid van Acanthamoeba - die over het algemeen niet sterk onderhevig is aan Brownse beweging ^9,10 - te kwantificeren met betrekking tot cytopathische effecten of onderblootstelling aan het elektrische veld ^9,11, evenals vooruitgang in motiliteitsanalyse in onderzoek naar gigantische virussen met behulp van Acanthamoeba als de traceerbare virale vector ^{12, 13}. okt. In de afgelopen 20 jaar zijn er ook constante en aanzienlijke verbeteringen opgetreden in het volgen van cellen en deeltjes met behulp van nieuwe softwareprogramma's zoals de beeldvormingssoftware die hier wordt gebruikt, en nieuwe algoritmen en deep learning-technologieën¹⁴. Dit is echter een relatief nieuw en groeiend wetenschapsgebied met betrekking tot benchtop-onderzoek, klinische toepassing en industriële normen, en er is een gebrek aan gegevens gepubliceerd over methoden om deze amoebe te visualiseren en te volgen, met name om gedragsveranderingen te kwantificeren na het dragen van contactlenzen of tijdens of na desinfectie van contactlenzen. Andere gebieden die zich uitstrekken tot visuele monitoring op lange termijn hebben deze inspanning ondersteund 15,16,17. Vanwege de inherent uitdagende aard van Acanthamoeba - waaronder een algemene resistentie tegen plasmiden (die fluorescentie zouden kunnen verlenen), het vermogen van de amoebe om standaard celkleurstoffen te consumeren en te vernietigen, en een unieke buitenste eiwitsamenstelling - waardoor het labelen van antilichamen moeilijk wordt - zijn methoden die beschikbaar zijn voor andere cellen die ze zichtbaar maken in andere instellingen dan helderveldbeeldvorming onbruikbaar geweest in dit organisme. Het kwantificeren van de beweeglijkheid van deze amoebe heeft dus een significante toevoeging aan het veld aangetoond. Met behulp van de hier beschreven methode hebben we kunnen vaststellen dat amoeben minstens 12 uur beweeglijk blijven zonder voedingsstoffen¹⁸ en dat amoeben die worden uitgedaagd met een desinfectieproces en tijdens de desinfectie niet meer bewegen, hun beweeglijkheid na desinfectie kunnen herstellen als ze niet volledig zijn gelyseerd¹⁹.

Dit protocol beschrijft hoe de beweeglijkheid van amoeben microscopisch kan worden gevolgd en gekwantificeerd. De primaire stappen zijn het opnemen van amoebe in helderveld met behulp van de juiste focus en timing tussen beelden, het omzetten van de afbeeldingen in binair met behulp van beeldvormingssoftware en vervolgens het gebruik van de tracking-plug-in van een beeldvormingssoftware om de experimentele parameters in te stellen en elke amoebe te volgen om de vereiste metingen te bepalen, zoals snelheid, afstand en opsluiting. Hierna is het mogelijk om de chemotaxis van een amoebe of een amoebepopulatie te kwantificeren om directionaliteit te definiëren. De belangrijkste bijdrage van deze methode is het visualiseren en kwantificeren van amoebegedrag tijdens verschillende toestanden van voedingsondersteuning, oppervlaktehechting, desinfectie-uitdaging of andere veranderingen in de omgeving, zoals samenleven met zoogdiercelcultuur.

Protocol

1. Acanthamoeba-bereiding

OPMERKING: Dit protocol is geverifieerd voor ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 en PRA-411. Dit is een BSL2-ziekteverwekker en moet worden bewerkt in een BSL2-kap en laboratorium.

1. Maak een mastercultuur van een monsterflacon of voorbereide plug²⁰ door een T75-kolf te vullen met 30 ml AC6-medium en voeg er aseptisch één plug of de inhoud van een monsterflacon aan toe. Incubeer de kolf gedurende 3-5 dagen bij 26-30 °C tot de kolf voor 50% tot 80% samenvloeit.
2. Passage de cellen de dag voordat ze nodig zijn om een homogene populatie trofozoïeten te creëren.
   1. Afhankelijk van de behoeften van de stam, schudt en/of slaat u 2x stevig op de mastercultuur om aanhangende trofozoïeten los te maken.
   2. Vul een T75-kolf met 30 ml AC6-medium. Voeg 2 ml van de mastercultuur toe aan de passage. Incubeer de kolf gedurende 18-24 uur bij 26-30 °C.
3. Inspecteer vóór de oogst de trofozoietpopulatie visueel onder een vergroting van 4x in de microscoop. Zorg ervoor dat trofozoïeten hechtend en uniform zijn.
4. Sla 2x stevig op de kolf om vastzittende trofozoïeten los te maken. Giet de inhoud in een conische buis van 50 ml.
5. Draai de buis 5 minuten rond op 500 x g in een uitgebalanceerde centrifuge om de amoebe te pelleteren. Giet of pipetteer de bovendrijvende media af en gooi ze weg. Verdun de pellet in 2-10 ml 1/4 Ringer's oplossing.
6. Draaikolk het monster. Voeg 10 μL monster toe aan een wegwerphemocytometer en tel de kve/ml van de Acanthamoeba.
7. Verdun op basis van het aantal hemocytometers de amoebepellet tot een concentratie van 7,5 x 10³ cellen/ml in 1/4 Ringer's oplossing.
8. Zaad amoebe op een oppervlak, dat glas, plastic of niet-voedende agar kan zijn, en een verscheidenheid aan putvormen, afhankelijk van de experimentele behoeften zoals hieronder beschreven.
   1. Plaat met 96 putjes: Zaai elk putje met 200 μL Acanthamoeba suspensie en omsluit het bakje met het deksel.
   2. Bord met 48 putjes: Zaai elk putje met 1 ml Acanthamoeba suspensie en omsluit het bord met het deksel.
   3. Flowcel: Voeg langzaam 4 ml Acanthamoeba-suspensie toe via de steriele poorten van een steriele aluminium flowcel, vermijd luchtbellen in de kamer. Klem de poorten dicht nadat de suspensie is toegevoegd.
9. Laat de amoebe vóór de beeldvorming ten minste 30 minuten aan het oppervlak hechten voordat u met microscopische opname begint.

2. Acanthamoeba visualiseren en vastleggen

1. Visualiseer de amoebe met een vergroting van 4x in het heldere veld. De achtergrond moet lichtgrijs lijken en de amoebe moet zwart zijn. Pas het licht en de focus zo aan dat de amoebe effen donkere cirkels zijn in plaats van doorschijnend (dus iets onscherp, Figuur 1.).
   OPMERKING: De optimale vergroting is 4x voor tracking om verschillende redenen: Amoeben die tijdens het volgen het gezichtsveld verlaten of binnenkomen, mogen niet worden opgenomen in de gegevensanalyse, dus de lagere vergroting ondersteunt het beste het maximale aantal amoeben dat in een bepaalde periode in de analyse is opgenomen. Amoeben moeten verschijnen als effen zwarte cirkels in het heldere veld om ze om te zetten in binair voor trackinganalyse. Dit is het gemakkelijkst te bereiken bij een lagere vergroting, omdat hogere vergrotingen gemakkelijk de doorschijnende aard en interne structuren van de amoebe onthullen. Over het algemeen kunnen meer amoeben worden vastgelegd in een enkel gezichtsveld met een lagere vergroting, wat een robuustere gegevensanalyse ondersteunt.
2. Stel de opnameprogramma's in de beeldvormingssoftware in om met regelmatige tussenpozen een beeld op te nemen om de amoebe te volgen. De langste tijd tussen afbeeldingen die nauwkeurige tracking mogelijk maakt, is 30 s, de optimale tijd voor bestandsgrootte en trackingdetail wordt voorgesteld op 12 s of 24 s.
3. Amoeben kunnen meerdere dagen achter elkaar worden gevolgd, maar houd er rekening mee dat dit soort opnames een bestandsgrootte zal creëren en dat het inherent moeilijk is om extreem grote bestanden te manipuleren. Om dit te voorkomen, registreert u amoeben gedurende delen van de tijd met bepaalde tussenpozen. Neem bijvoorbeeld gedurende 5 dagen elke 12 uur 1 uur op.
4. Als de microscoop en het programma het toelaten, neem dan meerdere putten op in één sessie met behulp van de XY-coördinaten van de plaatputten of meerdere locaties van een stroomcel. Naai indien nodig meerdere secties van één put- of stroomcel aan elkaar om een groter gezichtsveld te creëren bij een vergroting van 4x.
   OPMERKING: De enige beperking voor het aantal locaties dat kan worden vastgelegd, is hoe snel de microscooptafel tussen locaties kan bewegen binnen de intervaltijd van het beeld (bijv. elke 12 s, 24 s, enz. een foto maken.). Dit is echter niet vereist en trackingvideo's die vanaf één locatie zijn gemaakt, kunnen nog steeds voldoende sporen hebben voor robuuste statistische analyse. In dit onderzoek werd een Nikon Eclipse Ti-U-microscoop gebruikt en de geautomatiseerde beweegbare tafel werd gebruikt om beelden in meerdere putten tegelijk op te nemen. Elke microscoop met een programmeerbare opnamemogelijkheid zal echter werken. De microscoop moet worden aangesloten op een computer en beelden kunnen opnemen op een programma of harde schijf.

3. Analyse van de grootte van de amoebe

1. Open het microscoopbestand in de beeldvormingssoftware. De importopties voor bio-formaten worden geopend. Controleer in het dialoogvenster of het volgende waar is: Stapelweergave; Weergave met: Selection-Hyperstack; Geheugenbeheer: vink Gebruik virtuele stapel aan; Kleurmodus: Standaard.
2. Zorg ervoor dat geen van de andere vervolgkeuzemenu's of selectievakjes is geactiveerd. Klik op OK.
3. Open de opties voor bio-formaten. Kies welke serie nodig is. Als er slechts één locatie tegelijk wordt geregistreerd, is er hier waarschijnlijk maar één optie. Klik op OK.
4. Kies Afbeelding > Dupliceren om het enkele putje waarmee tegelijk wordt gewerkt te dupliceren door slechts één C-kanaal en slechts één Z-kanaal te kiezen.
5. Werk vanaf nu alleen met de gedupliceerde afbeelding voor manipulatie en analyse, niet met het origineel. Kies Afbeelding > Type > 8-bits. Kies Verwerken > Achtergrond aftrekken.
6. Zet de rollende bal op 10.0. Controleer de lichte achtergrond. Controleer de glijdende paraboloïde.
7. Kies Proces > contrast verbeteren. Stel verzadigde pixels in op 0,1% voor trofozoïeten of 0,3% voor een groep cellen en aggregaten.
8. Kies Afbeelding > pas > drempelwaarde aan (standaard > zwart-wit). Het binaire proces maken wordt geopend. Selecteer Standaard en vink Zwarte achtergrond (van binaire maskers) aan.
9. Selecteer de drempel agressief zodat de meeste achtergrondvlekken niet zichtbaar zijn, maar een deel van elke amoebe zichtbaar is.
10. Als de beeldvormingssoftware de afbeelding heeft omgekeerd en de achtergrond wit is en de amoebe zwart is, ga dan naar Bewerken > Omkeren om deze te herstellen naar een zwarte achtergrond en witte amoebe.
11. Kies Proces> Binair > Sluiten, in het geval dat de cellen een kleine ruimte in het buitenmembraan hebben omdat ze onscherp zijn of beweeglijkheid van de cel.
12. Kies Proces > binaire > vulgaten op. Verwijder niet-amoebe-artefacten met behulp van de vormtekengereedschappen en Bewerken > vulling. Als de achtergrond op dat moment wit is en de amoebe zwart, kies dan Bewerken > Omkeren. Op dit punt zou de afbeelding de binaire afbeeldingen in figuur 2 moeten vertegenwoordigen.
13. Om de grootte van elke amoebe vast te leggen, kiest u 'Analyseer' > 'Analyseer deeltjes'. Setgrootte: 10-oneindig, Circulariteit: 0-1, Show: Niets. Vink alleen Resultaten weergeven aan en Samenvatten.
14. Sla de CSV-bestanden op die verschijnen. Kies Bestand > Opslaan als > Tiff en bewerk de naam naar de gewenste specificatie.

4. Voorbereiding van microscoopbestanden voor tracking (motiliteitsanalyse)

1. Open het microscoopbestand in de beeldvormingssoftware. Importopties voor bio-formaten worden geopend.
2. Controleer in het dialoogvenster of het volgende waar is: Stapelweergave; Weergave met: Selection-Hyperstack. Voor geheugenbeheer vinkt u Virtual Stack gebruiken aan. Klik op OK.
3. De opties van de Bio-Formats-serie worden geopend. Kies welke serie nodig is. Als er slechts één locatie tegelijk wordt geregistreerd, is er hier waarschijnlijk maar één optie. Klik op OK.
4. Kies Afbeelding > Dupliceren. Werk vanaf hier alleen aan het gedupliceerde gedeelte van de video in plaats van aan het originele bestand.
   OPMERKING: Dupliceer het gedeelte van de video dat op dat moment wordt gevolgd. Om dit te doen, moet men de frames kennen die overeenkomen met de minuten die nodig zijn voor het experiment. Als men bijvoorbeeld het 1e^{uur wil} volgen en elke 24 s foto's maakt, moeten er 150 frames in het 1e^{uur zijn} . Daarom zal het 1e^{uur frames} 1-150 zijn, het^2e uur 151-300, enzovoort.
5. Kies Afbeelding > Type > 8-bits. Kies Verwerken > Achtergrond aftrekken. Stel de rollende bal in op 10.0.
6. Controleer de lichte achtergrond. Controleer de glijdende paraboloïde. Kies Proces > Contrast verbeteren en stel deze in op 0,1%.
7. Controleer Alle x# Plakjes (bijvoorbeeld alle 150 plakjes). Haal het vinkje weg bij Normaliseren. Kies Afbeelding > pas > drempelwaarde aan (standaard > zwart-wit).
8. Het binaire proces maken wordt geopend. Selecteer Standaard. Controleer de zwarte achtergrond (van binaire maskers).
9. Drempel agressief, dus de meeste achtergrondvlekken zijn niet zichtbaar, maar sommige delen van de amoebe zijn zichtbaar. Als bij deze stap de achtergrond wit is en de amoebe zwart, kiest u Bewerken > Omkeren. De achtergrond moet zwart zijn en de amoebe moet wit zijn.
10. Kies Verwerken > binair > sluiten. Kies Proces > binaire > vulgaten op. Kies Bestand > Opslaan als > Tiff en bewerk de naam naar de gewenste specificatie. Het bestand is nu klaar om te worden gevolgd.

5. Analyse van beweeglijkheid door middel van tracking

1. Ga vanuit de beeldvormingssoftware met het tiff-bestand dat nodig is om te volgen naar Plugins > Tracking > Trackmate. De versie van Trackmate wordt geopend.
2. Kies Volgende. Selecteer de LoG-detector in het vervolgkeuzemenu van de detector. Stel de geschatte blobdiameter in: 35,0 micron, drempel 1,0. Haal het vinkje weg voor Mediaanfilter gebruiken en Subpixellokalisatie uitvoeren.
3. Klik op Voorbeeld bij het eerste, middelste en eindsegment. Zorg ervoor dat alle amoeben worden vastgelegd door een paarse cirkel en dat achtergronddefecten of artefacten niet worden opgenomen.
4. Kies Volgende. Het zal beginnen met verwerken en deze stap kan een paar minuten duren. Een detectiebalk bovenaan het scherm geeft aan hoeveel van het proces is voltooid.
5. Kies Volgende wanneer daarom wordt gevraagd. Kies in de eerste drempel opnieuw Volgende zonder iets te selecteren. Selecteer Hyperstack Displayer bij het selecteren van een weergave. Kies Volgende.
6. Stel filter in op spots en kies Volgende zonder iets te selecteren. Selecteer een tracker; selecteer hiervoor LAP Tracker (in plaats van Simple LAP Tracker). Kies Volgende.
7. Stel bij frame-to-frame-koppeling de maximale afstand in op 40 μm. Controle op het sluiten van de spleet op het spoorsegment Spleet dichten toestaan. Stel de maximale afstand hiervoor in op 100 μm en de maximale frameafstand op 4. Selecteer niets voor het splitsen van spoorsegmenten of het samenvoegen van spoorsegmenten.
8. Kies Volgende. Het volgen kan veel tijd in beslag nemen. Wanneer het is voltooid, zou het venster moeten zeggen: Tracking gedaan in x s onderaan. Kies Volgende.
9. Kies opnieuw Volgende wanneer het volgen is voltooid. Filters instellen op tracks: Selecteer het +-teken linksonder om een filter toe te voegen voor het aantal spots in tracks. Stel het filter in op Boven voor ten minste 93% van de frames (bijv. 150 frames zou minimaal 140 plekken nodig hebben).
   OPMERKING: Voor sommige versies van deze software moet het tegenovergestelde equivalent worden geselecteerd, zoals Onder ten minste 7%, wat kan worden gedaan door een lijn naar links of rechts te slepen om het gewenste aantal te bereiken.
10. Kies Volgende. Weergaveopties verschijnen. Zorg ervoor dat de sporen in elk frame niet vervormd of vreemd zijn op de manier waarop de amoebe beweegt voordat u het Trackmate XML-bestand of het Tracks CSV-bestand opslaat.
11. Als een track verwijderd moet worden, klik dan op TrackScheme. TrackScheme toont alle sporen en contactpunten voor de amoebe over alle frames.
    OPMERKING: Mogelijke redenen om een spoor te verwijderen zijn dat een amoebe op/uit het gezichtsveld heeft gelopen tijdens de opname, dat een spoor onjuist is gevormd in vergelijking met het werkelijke pad van de amoebe, of dat om de een of andere reden het spoor of de amoebe een uitbijter is in de gegevens volgens de experimentele parameters, enz.
12. Klik op de amoebe om de plek groen op het scherm te markeren en in Trackscheme heeft de plek een groen vierkant eromheen. Deze geeft aan welke track of spot verwijderd moet worden.
13. Klik met de rechtermuisknop op de track die moet worden verwijderd en selecteer Hele track. Druk op de Delete-knop .
14. Nadat u alle nummers hebt bekeken, slaat u het trackingbestand op door linksonder in de pop-up van de trackingsoftware op Opslaan te klikken. Sla het XML-bestand op met de naam van de video. Klik op Hervatten om terug te gaan naar de pop-up van de trackingsoftware.
15. Klik op Tracks en selecteer Tracks aan de linkerkant. Klik op Exporteren naar CSV en sla het CSV-bestand op.
16. Als de spreadsheet het resulterende CSV-bestand niet herkent, voert u de volgende stappen uit.
    1. Open het opgeslagen CSV-bestand in Kladblok. Klik op Controle + A en Controle + C om alle inhoud te kopiëren.
    2. Open de spreadsheet en klik op Control + V om deze in de spreadsheet te plakken. Alle gegevens bevinden zich in één cel.
    3. Terwijl de cellen met de gegevens nog steeds zijn geselecteerd, gaat u naar Gegevens > Tekst naar kolommen. Kies Gescheiden > Volgende. Kies Komma > volgende > eindig. Sla dit bestand op als het nieuwe CSV-bestand.
17. De tracking CSV heeft veel parameters beschikbaar voor analyse (Figuur 3). Kopieer en plak de gewenste parameters in een nieuw CSV-bestand (Figuur 4) om te analyseren. De parameters die hier worden gebruikt, worden hieronder beschreven.
    1. Totale afgelegde afstand: totale afstand die een amoebe heeft afgelegd in μm.
    2. Maximale afgelegde afstand: de maximale afstand op het pad van een amoebe vanaf het startpunt - dit hoeft niet noodzakelijkerwijs het eindpunt te zijn
       
       Waarbij dij de afstand is tot elke plek I tot elke plek j op de baan.
    3. Opsluitingsratio: De opsluitingsratio geeft aan hoe efficiënt een amoebe was in het wegkomen van zijn startpunt: reisde hij in een rechte lijn weg van zijn startpunt (een waarde dicht bij 1), of bleef hij relatief dicht bij zijn startpunt (een waarde dicht bij 0).
       
    4. Gemiddelde snelheid van het spoor: Gemiddelde snelheid van de amoebe over de totale afgelegde afstand in micron per seconde.
       
    5. Spoorverplaatsing: De afstand tussen het beginpunt van een amoebe en het eindpunt in microns.
       OPMERKING: Alle analyseparameters van de beeldvormingssoftware en hun definities zijn hier te vinden: https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/. Onthoud dat elk opgeslagen bestand een samenvatting is van de tracks die op dat moment zijn geanalyseerd. Om een robuuste data-analyse te produceren, zal men de resultaten van meerdere replicaten, uren, enz. op de juiste manier moeten combineren, afhankelijk van wat geschikt is voor de gegevens (Figuur 5 en Figuur 6).

Resultaten

Om succes te behalen met deze methode, zijn er verschillende cruciale algemene onderdelen waarmee u rekening moet houden. De eerste is de fysieke opstelling van de amoebe en de microscoop, de tweede is het juiste gebruik van de beeldvormingssoftware en de derde is het op een zinvolle manier exporteren en analyseren van de beeldvormingsgegevens.

Voordat de microscopische opname begint, is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat de amoebe goed is scherpgesteld op de microscooptafel (Figuur 1). In plaats van te focussen op de amoebe in het meest optimale Z-vlak voor individuele details, is het hier ideaal om ze heel licht onscherp te bekijken, zodat ze effen zwarte stippen worden in tegenstelling tot hun doorschijnende toestand wanneer ze in detail worden bekeken. Door ze op deze manier te bekijken, kunnen de beeldvormingssoftware en de trackingsoftware elke individuele amoebe veel gemakkelijker vinden wanneer het bestand wordt geconverteerd naar binair (Figuur 2). Weten wat het doel is in de beeldvormingssoftware - dat wil zeggen, dat elke amoebe verschijnt als een goed gedefinieerde witte cirkel, kan de lezer helpen de juiste focus te vinden bij het maken van de originele foto's in helderveld. Vervolgens, met elke cirkel duidelijk gedefinieerd, zal de trackingsoftware in staat zijn om de beweeglijkheid van elke amoebe goed te volgen en de individuele beweeglijkheidsstatistieken voor elke amoebe te verzamelen.

Na het volgen van de stapsgewijze instructies in het bovenstaande protocol voor de beeldvormingssoftware en de trackingsoftware en het verwijzen naar de bijbehorende video om te helpen bij de cruciale eerste stappen van het gebruik van beeldvormingssoftware, is het tijd om de gegevens van de beeldvormingssoftware te exporteren voor kwantificering en gegevensanalyse. De ruwe uitvoer van de trackingsoftware zal vergelijkbaar zijn met wat te zien is in figuur 3. Hier is het belangrijk om te controleren of het aantal plekken in de tracks die het heeft geëxporteerd correct is voor wat wordt verwacht (bijv. als men vraagt om 93% van de frames in elke track aanwezig te zijn en men heeft in totaal 100 frames in de video, moet elke geëxporteerde track meer dan of gelijk zijn aan 93 spots). Als de spots niet aan de vereisten voldoen, moet men mogelijk de stappen van de trackingsoftware doorlopen om er zeker van te zijn dat de vereiste parameters correct zijn ingesteld.

Begin vanuit de onbewerkte export met het samenstellen van het gegevensanalyseblad (Afbeelding 4). Het is belangrijk om te onthouden dat elk nummer een enkelvoudige amoebe vertegenwoordigt binnen een enkelvoudige replica. Daarom, zoals te zien is in Figuur 4, Figuur 5 en Figuur 6, moeten alle tracks voor een frameset of tijdstip worden gemiddeld (Figuur 4), en dit proces moet worden uitgevoerd voor elke frameset of elk tijdstip in een hele reeks (d.w.z. als er in totaal 3 uur video wordt gemaakt en de datapunten worden gedeeld door het uur, dan zijn er drie framesets/uren om per replica te analyseren, Figuur 5). Ten slotte moeten van deze combinatie van gemiddelden in elk frame dat in elke replicatie is ingesteld, de gemiddelde gegevens van elke replicaat in één ruimte worden gecombineerd, zodat de gegevens over meerdere replicaten kunnen worden geanalyseerd om het werkelijke gemiddelde en de standaarddeviatie per tijdstip te bepalen (Figuur 6).

De gemiddelden van elke replicatie worden gebruikt voor gegevensanalyse en het gecombineerde gemiddelde en de standaarddeviatie of standaardfout van alle replicaten worden gebruikt voor grafische weergave (zoals te zien is in een voorbeeld in figuur 7). Als u gegevens analyseert zoals we hier hebben gedaan, wat meerdere steekproeven zijn die op meerdere tijdstippen worden gevolgd, is het het meest geschikt om ze te analyseren met behulp van een 2-weg herhalingsmeting ANOVA met een post hoc Tukey's test. Dit stelt ons in staat om de verschillen tussen monsters op elk tijdstip te bepalen en ook om de verschillen binnen elk monster in de loop van de tijd te bepalen.

Figuur 1: Amoeben verschijnen als ondoorzichtige donkere vormen in helderveldmicroscopie. Ingezoomd representatief beeld van amoebe met een vergroting van 4x, iets onscherp om te verschijnen als effen donkere cirkels. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Amoebe afgebeeld in helderveldmicroscopie omgerekend naar binair en gevolgd. Amoebe met een vergroting van 4x, in helder veld (links), werd geconverteerd naar binair met verwijderde artefacten (midden) en, na tracking, met geselecteerde tracks (rechts). Bovenste rij: een hele put afgebeeld door 4 afbeeldingen aan elkaar te naaien, schaalbalk = 1000 μm. Onderste rij: de grootte van een enkele afbeelding vóór het naaien, schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 3: Onmiddellijke gegevensanalyse-output van de beeldvormings- en trackingsoftware bevat een breed scala aan gegevenstypen. De representatieve output van tracking wordt weergegeven in figuur 2, een enkelvoudige video. Let op de tracknummers (rode pijl) die nummers overslaan, wat aangeeft dat de trackingsoftware tracks die niet niet overeenkwamen met de parameters correct heeft verwijderd. In dit voorbeeld identificeerden slechts 71 van de 5385 geïdentificeerde sporen die waren uitgelijnd met de parameters. Deze verhouding is normaal, gezien zulke strikte richtlijnen. Dit aantal sporen komt ook overeen met het aantal amoeben dat in dit protocol wordt gebruikt (als een plaat met 96 putjes bijvoorbeeld wordt bezaaid met 200 μL 7,5 x 10³ kve/ml per putje, dan zou men ongeveer 1.500 amoeben in het putje moeten verwachten en ongeveer zoveel zichtbaar in een gezichtsveld van 4 steken. Er zullen waarschijnlijk veel meer sporen zijn dan amoeben, aangezien amoeben op en af het gezichtsveld lopen en nieuwe sporen genereren). Dit spoornummer is opnieuw te zien in figuur 2, waar slechts een paar sporen zichtbaar zijn in vergelijking met een groot aantal vlekken. Controleer altijd het aantal plekken in de baan (rood vak) om er zeker van te zijn dat alleen de juiste raillengtes zijn opgenomen. Hier nemen we bijvoorbeeld meer dan 93% van de frames op, en er waren 127 frames in deze sectie, dus alle nummers van spots moeten boven de 118 zijn. Geel gemarkeerd zijn de metingen die in het protocol werden genoemd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Gegevens zo nodig gereorganiseerd na de eerste gegevensuitvoer. Organisatie van gezochte gegevens na export. (A) De relevante metingen die zijn gekozen om te kwantificeren, zijn gekopieerd uit de export van de trackingsoftware (Figuur 3) en in een nieuwe spreadsheet geplakt. (B) Nadat de gewenste metingen in de nieuwe spreadsheet zijn georganiseerd, moet het gemiddelde van elke baan worden berekend. In dit representatieve voorbeeld zijn de totale afstand, maximale afstand, opsluiting, gemiddelde snelheid en verplaatsing van elk bruikbaar spoor in deze enkelvoudige video gemiddeld tot een enkelvoudig getal voor elke meting. Merk hier nogmaals op dat in totaal 71 sporen voldeden aan de parameters voor frames 1-127. Er zal waarschijnlijk een ander aantal geschikte tracks zijn van elke geanalyseerde video of frameset, zoals blijkt uit figuur 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 5: Sequentiële frames ingesteld voor de analyse van een volledige beeldreeks of video. Dit is een representatief beeld van de toevoeging van sequentiële video's aan data-analyse. Ervan uitgaande dat frames 1-127 uur 1 van de video vormen (hier bestaat 1 uur uit het maken van een foto eens in de 28 seconden). Frames 128-254 zijn uur 2 van de video en frames 255-381 zijn uur 3 van de video. Combineer de geëxporteerde gegevens (zoals geëxporteerd in figuur 3) van alle uren in één blad om in één keer mee te werken. Zoals in figuur 4 is gedaan, wordt het gemiddelde genomen van de gegevens van alle bruikbare sporen voor elke frameset/h. Alles in figuur 5 zijn de gegevens van één replicaat of één steekproef. Als er 3 replicaten zijn, zijn er 3 identiek ingedeelde afzonderlijke spreadsheettabbladen en worden de gegevens hiervan in een nieuw tabblad ingevoerd, zoals weergegeven in afbeelding 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Samengestelde gegevens van alle amoeben in elke frameset die worden gebruikt om een enkele replica weer te geven. (A) Alle gemiddelden van elk frame in figuur 5 moeten op een centrale locatie worden verzameld, zodat de definitieve gegevensanalyse kan worden voltooid. In deze representatieve afbeelding worden de gemiddelden van de totale afstand van de eerste drie framesets (of uren) weergegeven. Dit moet worden herhaald voor elk monster/voorwaarde/duplicaat dat wordt uitgevoerd. Vervolgens moet het gemiddelde worden genomen van de gemiddelden van elke steekproef uit elke frameset (geel vak). Dit is het laatste gegevenspunt op basis waarvan de standaarddeviatie en de standaardfout kunnen worden berekend. De individuele gemiddelden van elke steekproef (hier de getallen in B3, B4 en B5 voor Totale Afstand Steekproef 1; C3, C4 en C5 voor Totale Afstand Monster 2, enz.) zal worden gebruikt om de statistische analyse uit te voeren. Dit proces wordt herhaald voor alle vereiste metingen (maximale afstand, opsluiting, gemiddelde snelheid, verplaatsing, enz.) (B) Om een grafische weergave van de kwantificering te maken, gebruikt u de getallen in het gele vak als gegevenspunten die u voor de uiteindelijke grafiek wilt gebruiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Ruwe motiliteitsgegevens voor ATCC 30461 en ATCC 50370. Ruwe gegevens (hier weergegeven als gemiddelde ± SE voor elk uur) werden eerder verzameld en niet gepubliceerd voor eerdere onderzoeken^18,19. Deze kwantificering van de beweeglijkheid toont aan dat deze twee amoeben in hun eerste 6 uur van beweeglijkheid (gemeten aan de hand van de totale afstand in microns die in dat uur worden afgelegd) vergelijkbaar zijn in 1/4 Ringer's oplossing op een glazen oppervlak. Elk tijdstip vertegenwoordigt drie afzonderlijke replicaten, elk samengesteld uit 20-200 amoebesporen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het kunnen volgen en kwantificeren van de beweeglijkheid van amoeben zoals Acanthamoebe, aanhangende microscopische organismen die niet worden beïnvloed door Brownse beweging met lage snelheid ^9,10, onthult een aanzienlijke hoeveelheid informatie over het gedrag van amoeben en kan de verlichting met betrekking tot AK-preventiemethoden aanzienlijk verbeteren. Dit protocol is gedetailleerd beschreven in recente publicaties en de gegevens zijn bevestigd door of gecombineerd met andere vergelijkbare gegevensanalyses^18,19. We merken hier op dat de snelheid van amoeben die met deze methode worden beschreven, vergelijkbaar is met wat door andere groepen is gepubliceerd. Dit protocol is opmerkelijk vanwege zijn vermogen om te worden gebruikt op vrijwel elk oppervlak of amoebebehandeling, die transparant is voor licht, maar het is belangrijk op te merken dat hoewel dit protocol mogelijk kan worden aangepast om met andere organismen te werken, het tot nu toe alleen is geoptimaliseerd voor Acanthamoeba. Het bovenstaande protocol heeft consequent goed gewerkt in het laboratorium, maar de volgende wijzigingen voor het wijzigen van de methode om aan andere behoeften te voldoen of het oplossen van moeilijke situaties zijn beschikbaar.

Bepalen van trackingparameters: In het bovenstaande protocol zijn de frame-to-frame koppeling, het sluiten van de opening, de maximale frameafstand en het aantal plekken op de baan vermeld, die het meest van toepassing waren op recente publicaties. Het is echter mogelijk dat andere parameters meer geschikt zijn voor andere behoeften. Verder kunnen er parameters zijn die anderen graag zouden willen gebruiken, maar die hier niet zijn gebruikt (zoals de maximale afstand van een spoor onder spoorfilters). Meer informatie over elke parameter en wat ze beschrijven is hier te vinden op de website (zie referentie²¹). Wanneer u beslist welke parameters en filters het meest relevant zijn voor andere experimenten en hoe ze moeten worden ingesteld, moet u nadenken over wat statistisch rationeel is voor een specifiek project; Zou men bijvoorbeeld gegevens willen van een amoebe die wegloopt en vervolgens weer terug in het gezichtsveld? Of zou men de gegevens willen bewaren van een amoebe die helemaal niet veel bewoog, maar toch als een spoor werd gelabeld? En wat logisch is voor het aantal frames en de tijdsduur tussen frames wanneer de beelden zijn opgenomen.

Veranderende blobgrootte: We ontdekten dat het buitengewoon moeilijk is met software of een microscoopopstelling - op basis van de huidige technologieën en software die beschikbaar is voor standaardlaboratoria - om het aantal amoeben in een aggregaat nauwkeurig te volgen terwijl het in de loop van de tijd verandert. Als u de grootte van een klodder volgt en probeert die grootte te correleren met het aantal organismen erin, gebruik dan een standaardcurve die is gegenereerd na herhaalde experimenten om de grootte van een aggregaat wiskundig te voorspellen. Aggregaten werden bijvoorbeeld gemaakt door putjes te zaaien met een reeks aantallen amoeben, zoals 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1.000 en 2.000 cellen per put. Timelapse-beelden op verschillende tijdstippen van elke put gedurende 24 uur werden gegenereerd. Elke sferoïde (die een bekend aantal amoeben had) werd geanalyseerd voor een tweedimensionaal gebied en er werd een standaardcurve gegenereerd als functie van het aantal amoeben versus de sferoïde grootte in de loop van de tijd. Dit experiment werd ten minste in drievoud herhaald om ons een geschikte standaarddeviatie van elke gegenereerde curve te geven.

Het bepalen van de richtingsgevoeligheid van de amoebe: Hoewel dit misschien niet nodig is voor bepaalde onderzoeken, kan het nuttig zijn om de richtingsgevoeligheid van de amoebe te begrijpen. Dit zou gegevens opleveren over de chemotactische effecten van de behandeling of het experiment. Deze gegevens kunnen ook worden gebruikt om zowel visuele (grafische) als kwantitatieve gegevens te creëren. Dit is beschikbaar via de Chemotaxis and Migration Tool, een gratis plug-in voor beeldvormingssoftware. Het is beschikbaar op de website, samen met de toepassingsgids en voorbeeldafbeeldingen en -films (zie Materiaaltabel).

Gedetailleerde bewegingsdynamiek: andere groepen hebben de spreidingsdynamiek en diffuse trajecten onderzocht met zeer geavanceerde en ontwikkelde statistische analyses die verder gaan dan wat hier wordt besproken ^9,10,22. Deze kunnen worden overwogen op basis van de behoeften van de gebruiker.

Zoals met elke succesvolle methode, heeft het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, vele rondes van probleemoplossing doorlopen om consistentie te bereiken. Hoewel uitstekende traceerbare video's van hoge kwaliteit kunnen worden gemaakt door elke seconde een foto te maken (of zo snel als de microscoop kan, het kan minder dan een seconde zijn), ontstaan hierdoor extreem grote bestanden, die moeilijk kunnen zijn om mee te werken. Dit is realistisch gezien alleen geschikt voor zeer korte video's die maximaal een paar minuten zijn opgenomen. Omgekeerd, door om de paar seconden een foto te maken, hebben we ontdekt dat het gedrag van amoeben nog steeds zeer traceerbaar is op basis van de snelheid van deze soort, en dat het mogelijk is om werkbare video's te maken over uren of dagen. We hebben ontdekt dat de maximale hoeveelheid tijd tussen beelden 30 s is, wat de tijd is die nodig is om amoeben nauwkeurig te volgen door beeldvormingssoftware. Het tijdsinterval dat de gebruiker kiest, moet worden overwogen aan de hand van de bekende beperkingen van hoe snel de microscoop beelden kan opnemen, hoeveel beelden per putje nodig zijn en hoeveel putjes er bij elk interval worden opgenomen. Evenzo zijn de parameters die in dit protocol worden genoemd met betrekking tot maximale verplaatsing, toegestane frameopeningen, minimaal benodigde frames, enzovoort, door dit lab met vallen en opstaan bepaald om trackinformatie te creëren die de meest complete amoebe-tracks omvat en ruis negeert die wordt veroorzaakt door onvolledige tracks, amoeben die zich halverwege de video bij het podium voegen of het podium verlaten, of fouten die worden veroorzaakt door verwarring door beeldvormingssoftware, zoals wanneer twee amoeben elkaar halverwege de baan ontmoeten en vervolgens scheiden. Dit soort fouten en onvolledige sporen zijn begrijpelijkerwijs hoog bij het maken van extreem lange (uren tot dagen) video's van microscopisch kleine biologische organismen die constant met elkaar interageren en zijn de reden dat een zeer groot deel van de foutieve sporen moet worden afgewezen. Opgemerkt moet worden dat de stap voor het opvullen van gaten in het protocol, in de ervaring van dit lab, belangrijk is voor het verminderen van fouten in de manier waarop de beeldvormingssoftware amoeben opspoort. Door ervoor te zorgen dat elke amoebe een vaste cirkel is in plaats van soms een donut of een c-vorm, is de kans veel groter dat de software elke amoebe met succes kan volgen.

Verder zijn er, zoals besproken, veel parameters beschikbaar voor een gebruiker voor het analyseren van een afbeelding of video. Op basis van de experimentele behoeften hebben we consequent het meest geprofiteerd van het analyseren van de totale afstand, maximale afstand, snelheid en verplaatsing. Deze worden uitgebreid besproken (inclusief het gebruik van verschillende stammen en oppervlakken) met grafische interpretaties in eerdere publicaties^18,19. Deze vier parameters stellen een gebruiker in staat om het vermogen van een amoebe om lineaire afstanden af te leggen te extrapoleren en hoe lang het duurt om dit te doen, wat helpt bij het begrijpen van hun gedrag in relatie tot contactlensbesmetting. Het ophalen en analyseren van deze parameters is een grote klus, zoals beschreven in onze cijfers. Tijdens het werken met grote en talrijke spreadsheets uit de uitvoer van beeldvormingssoftware hebben we onbedoelde fouten beperkt door vergrendelde spreadsheetsjablonen te maken die alle vereiste analyses automatisch berekenden. Een mogelijke verbetering van deze methode zou echter zijn om een script te schrijven dat deze gegevens kan verwerken en sorteren en analyseren.

Tot slot wordt hier een toegankelijke en nauwkeurige methode beschreven om de grootte en beweeglijkheid van Acanthamoeba in veel verschillende omstandigheden te meten. We hebben aangetoond dat deze methode kan worden toegepast op veel verschillende stammen van amoeben en hebben uiteengezet dat, hoewel er eenvoudige parameters kunnen zijn voor het verkrijgen van informatie over beweeglijkheid, deze experimentele opzet in hoge mate kan worden afgestemd op specifieke behoeften.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
¼ Ringer’s oplossing	ThermoFisher Scientific	BR0052G	Oxoid Ringers Solution Tablets. Volg de aanwijzingen om een kwart sterkte te maken in plaats van volledige sterkte Ringers.
10 µL pipette	Eppendorf Research	3123000039	2 µL-20 µL enkelkanaals
10 µL pipette tips	Neptune Scientific, San Diego, CA, USA	BT10.N	10 µL Universal Barrier Tip
48 well plate	Millipore Sigma,	CLS3548	Corning Costar TC-Behandelde Meervoudige Well Plate: polystyreen plaat, platte bodem wells, steriel, met deksel
50 mL conische buizen (1 voor elk monster, 1 voor elke pas 2 monster)	Fisher Scientific	Falcon 352098	Falcon 50 mL High Clarity Conische Centrifugebuizen, polypropyleen
96-well plate	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	CLS3596	Corning Costar TC-Behandelde Meervoudige Well Plate: polystyreen plaat, platte bodem wells, steriel, met deksel
Acanthamoeba	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	ATCC 30461	Dit protocol is geverifieerd voor ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, en PRA-411
Axenic cultuur media (AC6)	Zelf gemaakt	n/a	Bevat 20 g biosate pepton, 5 g glucose, 0,3 g KH2PO4, 10 µg vitamine B12, en 1 glas5 mg l-methionine per liter gedestilleerd gedeïoniseerd water. Breng pH aan op 6,6-6,95 met 1 M NaOH en autoclaveer bij 121 °C gedurende 20 min, bewaar op kamertemperatuur tot 3 maanden.
Centrifuge en geschikte rotor	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Sorvall ST 40R	Elke equivalente centrifuge en rotor zijn acceptabel zolang het 50 mL conische buizen kan draaien bij 500 x g gedurende 5 min
Chemotaxie en migratie tool			Gratis software gebaseerd op ImageJ, beschikbaar op https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html
Wegwerp hemocytometer	Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA	DHC-N01	Neubauer Verbeterde 2-Chip Wegwerp Hemocytometer, Individueel verpakt, Nonpyrogeen
ImageJ software met Trackmate plugin (dit protocol geschreven met Trackmate versie 6.0.2.)			Gratis software ontwikkeld door de National Institutes of Health, beschikbaar op imagej.net. Trackmate plugin beschikbaar op https://imagej.net/plugins/trackmate/
Microscoop, bij voorkeur met geautomatiseerde beweegbare stage	Nikon, Tokyo, Japan		Een Nikon Eclipse Ti-U Microscoop werd gebruikt in deze studie en de geautomatiseerde beweegbare stage werd gebruikt om afbeeldingen in meerdere wells tegelijk op te nemen.
NIS-Elements software	Nikon
Serologische pipet	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	BrandTech 26331	BrandTech accu-jet pro Pipet Controller
Serologische pipet tips	VWR	5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088	VWR Serologische Pipet, Non-Pyrogen
Steriele aluminium transmissie flow cell	Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA	FC 81-AL	Geanodiseerde aluminium enkele kanaals transmissie flow cell met 96-well plate footprint voor gebruik met een omgekeerde microscoop
T75 Flessen	VWR, Radnor, PA, USA	734-2316	VWR Tissue Culture Flacon, 182,5 cm, Oppervlaktebehandeld, Plug seal dop, Steriele