Aanpassing aan de uitersten van het leven: experimentele evolutie met de extremofiele Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Samenvatting

Hier presenteren we een experimenteel evolutieprotocol voor aanpassing bij thermofielen met behulp van goedkope, energiezuinige bench-top thermomixers als incubatoren. De techniek wordt gedemonstreerd door de karakterisering van temperatuuraanpassing in Sulfolobus acidocaldarius, een archaeon met een optimale groeitemperatuur van 75 °C.

Samenvatting

Het archaeon Sulfolobus acidocaldarius heeft zich ontpopt als een veelbelovend thermofiel modelsysteem. Onderzoek naar hoe thermofielen zich aanpassen aan veranderende temperaturen is een belangrijke vereiste, niet alleen voor het begrijpen van fundamentele evolutionaire processen, maar ook voor het ontwikkelen van S. acidocaldarius als een chassis voor bio-engineering. Een groot obstakel voor het uitvoeren van experimentele evolutie met thermofielen zijn de kosten van het onderhoud van de apparatuur en het energieverbruik van traditionele incubatoren voor groei bij hoge temperaturen. Om deze uitdaging aan te gaan, wordt een uitgebreid experimenteel protocol gepresenteerd voor het uitvoeren van experimentele evolutie in S. acidocaldarius , waarbij gebruik wordt gemaakt van goedkope en energiezuinige bench-top thermomixers. Het protocol omvat een batchcultuurtechniek met relatief kleine volumes (1,5 ml), waardoor aanpassing in meerdere onafhankelijke afstammingslijnen kan worden gevolgd. Deze methode is gemakkelijk schaalbaar door het gebruik van extra thermomixers. Een dergelijke benadering vergroot de toegankelijkheid van S. acidocaldarius als modelsysteem door zowel de initiële investering als de lopende kosten in verband met experimenteel onderzoek te verminderen. Bovendien is de techniek overdraagbaar naar andere microbiële systemen voor het onderzoeken van aanpassing aan diverse omgevingsomstandigheden.

Inleiding

Het vroege leven op aarde is mogelijk ontstaan in extreme omgevingen, zoals hydrothermale bronnen, die worden gekenmerkt door extreem hoge temperaturen en^zuurgraad1. Microben blijven extreme omgevingen bewonen, waaronder warmwaterbronnen en vulkanische solfatara. Het karakteriseren van de evolutionaire dynamiek die zich onder deze extreme omstandigheden voordoet, kan licht werpen op de gespecialiseerde fysiologische processen die overleving onder deze omstandigheden mogelijk maken. Dit kan verstrekkende implicaties hebben, van ons begrip van de oorsprong van biologische diversiteit tot de ontwikkeling van nieuwe hoge-temperatuurenzymen met biotechnologische toepassingen.

Het begrip van microbiële evolutionaire dynamiek in extreme omgevingen blijft beperkt, ondanks het cruciale belang ervan. Daarentegen is een aanzienlijke hoeveelheid kennis over evolutie in mesofiele omgevingen verworven door de toepassing van een techniek die bekend staat als experimentele evolutie. Experimentele evolutie omvat het observeren van evolutionaire verandering onder laboratoriumomstandigheden 2,3,4,5. Vaak gaat het om een gedefinieerde veranderingsomgeving (bijv. temperatuur, zoutgehalte, introductie van een toxine of een concurrerend organisme)^7,8,9. In combinatie met sequencing van het hele genoom heeft experimentele evolutie ons in staat gesteld om belangrijke aspecten van evolutionaire processen te testen, waaronder parallellisme, herhaalbaarheid en de genomische basis voor aanpassing. Tot op heden is het grootste deel van de experimentele evolutie echter uitgevoerd met mesofiele microben (inclusief bacteriën, schimmels en virussen 2,3,4,5, maar grotendeels exclusief archaea). Een methode voor experimentele evolutie die van toepassing is op thermofiele microben zou ons in staat stellen beter te begrijpen hoe ze evolueren en bijdragen aan een beter begrip van evolutie. Dit heeft potentieel verstrekkende implicaties, van het ontcijferen van de oorsprong van thermofiel leven op aarde tot biotechnologische toepassingen met 'extremozymen' die worden gebruikt in bioprocessen op hoge temperatuur¹⁰ en astrobiologisch onderzoek¹¹.

Het archaeon Sulfolobus acidocaldarius is een ideale kandidaat als modelorganisme voor het ontwikkelen van experimentele evolutietechnieken voor thermofielen. S. acidocaldarius plant zich aëroob voort, met een optimale groeitemperatuur bij 75 °C (bereik 55 °C tot 85 °C) en een hoge zuurgraad (pH 2-3) ^4,6,12,13,14. Opmerkelijk is dat S. acidocaldarius, ondanks zijn extreme groeiomstandigheden, populatiedichtheden en mutatiesnelheden behoudt die vergelijkbaar zijn met die van mesofielen 7,15,16,17,18. Bovendien heeft het een relatief klein, goed geannoteerd genoom (stam DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2.347 genen)¹²; S. acidocaldarius profiteert ook van robuuste hulpmiddelen voor genoomengineering, waardoor een directe beoordeling van het evolutionaire proces mogelijk is door middel van gerichte gen-knock-outs¹⁹. Een opmerkelijk voorbeeld hiervan is de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen van S. acidocaldarius, zoals de uracil-auxotrofe stammen van MW001¹⁹ en SK-1²⁰, die als selecteerbare merkers kunnen dienen.

Er zijn aanzienlijke uitdagingen bij het uitvoeren van experimentele evolutie met thermofielen zoals S. acidocaldarius. De voor deze studies vereiste langdurige incubatie bij hoge temperaturen impliceert een aanzienlijke verdamping voor zowel vloeibare als vaste kweektechnieken. Langdurig gebruik bij hoge temperaturen kan ook schade toebrengen aan de traditionele schudincubatoren die vaak worden gebruikt in experimentele evolutie in vloeibare media. Het verkennen van meerdere temperaturen vereist een aanzienlijke financiële investering voor het verwerven en onderhouden van meerdere incubatoren. Bovendien roept het hoge energieverbruik dat nodig is aanzienlijke milieu- en financiële zorgen op.

Dit werk introduceert een methode om de uitdagingen aan te pakken die zich voordoen bij het uitvoeren van experimentele evolutie met thermofielen zoals S. acidocaldarius. Voortbouwend op een techniek ontwikkeld door Baes et al. voor het onderzoeken van hitteschokrespons^14,21, maakt de hier ontwikkelde methode gebruik van bench-top thermomixers voor consistente en betrouwbare incubatie bij hoge temperatuur. De schaalbaarheid maakt de gelijktijdige beoordeling van meerdere temperatuurbehandelingen mogelijk, met lagere kosten voor de aanschaf van extra incubatieapparatuur. Dit verbetert de experimentele efficiëntie, waardoor robuuste statistische analyse en uitgebreid onderzoek mogelijk worden naar factoren die de evolutionaire dynamiek bij thermofielen beïnvloeden²². Bovendien vermindert deze aanpak de financiële initiële investering en het energieverbruik aanzienlijk in vergelijking met traditionele incubatoren, waardoor een duurzamer en milieuvriendelijker alternatief wordt geboden.

Onze methode legt de basis voor experimenteel onderzoek naar evolutionaire dynamiek in omgevingen die worden gekenmerkt door extreme temperaturen, die mogelijk een sleutelrol hebben gespeeld tijdens de vroege stadia van de diversificatie van het leven op aarde. Thermofiele organismen hebben unieke eigenschappen, maar hun extreme groeiomstandigheden en gespecialiseerde vereisten hebben hun toegankelijkheid als modelsysteem vaak beperkt. Het overwinnen van deze barrières vergroot niet alleen de onderzoeksmogelijkheden voor het onderzoeken van evolutionaire dynamiek, maar vergroot ook het bredere nut van thermofielen als modelsystemen in wetenschappelijk onderzoek.

Protocol

1. Bereiding van het groeimedium S. acidocaldarius (BBM⁺)

OPMERKING: Voor de teelt van S. acidocaldarius wordt in dit protocol gebruik gemaakt van Basal Brock Medium (BBM⁺)²³. Dit wordt voorbereid door eerst de hieronder beschreven anorganische voorraadoplossingen te combineren om BBM⁻ te creëren, die van tevoren kan worden voorbereid. BBM⁺ wordt vervolgens naar behoefte bereid door de biologische voorraadoplossingen aan BBM⁻ toe te voegen. Recepten voor bouillonoplossingen worden ook weergegeven in tabel 1. Alle media en papieroplossingen moeten worden bereid in dubbel gedistilleerd H₂O (ddH₂O).

1. Bereiding van anorganische voorraadoplossingen voor groeimedium
   1. Bereid de oplossing van de sporenelementenbouillon voor.
      1. Bereid de sporenelementenoplossing door 9 g/l natriumtetraboraatdecahydraat (Na₂B₄O₇·10H₂O) toe te voegen aan ddH₂O, gevolgd door de toevoeging van 1:1 H₂SO₄ druppelsgewijs totdat het is opgelost.
      2. Introduceer achtereenvolgens 0,44 g/l zinksulfaatheptahydraat (ZnSO_{4,7H 2}O), 0,1 g/l koper(II)chloridedihydraat (CuCl_{2,2H 2}O), 0,06 g/l natriummolybdaatdihydraat (Na₂MoO_{4,2H 2}O), 0,06 g/l vanadium(IV)sulfaatdihydraat (VOSO_{4,2H 2}O), 0,02 g/l kobalt(II)sulfaatheptahydraat (CoSO_{4,7H 2}O), en 3,6 g/L mangaan(II)chloridetetrahydraat (MnCl_{2,4H 2}O). Autoclameer de oplossing en bewaar bij 4 °C.
   2. Bereid Fe Stock-oplossing (1000x) door 20 g/L ijzerchloridehexahydraat (FeCl_{3,6H 2}O) op te lossen in ddH₂O. Steriliseer de oplossing door te filtreren door een filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
   3. Bereid Brock Solution I (1000x) door 70 g/L calciumchloride (CaCl_{2,2H 2}O) op te lossen in dubbel gedestilleerd water (ddH₂O). Autoclaaf en bewaren bij 4 °C.
      LET OP: Het oplossen van CaCl₂·2H₂O in water is een exotherm proces. Voer deze stap met zorg uit. Draag handschoenen met een EN407-classificatie voor thermisch gevaar om te beschermen tegen letsel. Sluit het vat niet goed af, omdat er druk kan ontstaan.
   4. Bereid Brock Solution II/III door 130 g/l ammoniumsulfaat ((NH₄)₂SO₄), 25 g/l magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO 4,7H₂O), 28 g/l kaliumdiwaterstoffosfaat (KH₂PO₄) en 50 ml van de eerder bereide Trace Element Stock Solution te combineren. Stel met behulp van 1:1 H₂SO₄ de pH van de bouillonoplossing in op 2-3. Autoclameer de oplossing en bewaar deze bij kamertemperatuur (RT).
2. Bereiding van organische voorraadoplossingen voor groeimedium
   1. Bereid D-glucose-voorraadoplossing (100x) door 300 g/L (30% m/v) D-glucose op te lossen in ddH₂O en filtreer (door een filter van 0,22 μm). Bewaren bij 4 °C.
      OPMERKING: Andere koolstofbronnen kunnen worden gebruikt in plaats van D-glucose volgens experimentele vereisten (bijv. D-xylose).
   2. Bereid pepton uit caseïne bouillonoplossing (100x) door pepton uit caseïne op te lossen bij 100 g/L in ddH₂O. Autoclaaf om de bouillonoplossing te steriliseren en op te slaan bij RT.
   3. Bereid Uracil Stock Solution (100x) voor door 2 g/L uracil op te lossen in ddH₂O en filtreer (via een filter van 0,22 μm); bewaren bij -20 °C.
3. Bereiding van BBM⁺ groeimedium bij 1x werkconcentratie
   1. Bereid eerst 988 ml steriele ddH₂O voor door middel van autoclaveren.
   2. Bereid 1 L BBM⁻ voor door 1 ml Brock Stock Solution I, 10 ml Brock Stock Solution II/III en 1 ml Fe stockoplossing toe te voegen aan de 988 ml steriele ddH₂O die eerder is geautoclaveerd. Pas de gemiddelde pH aan tot het bereik van 2-3 met 1:1 H₂SO₄.
      OPMERKING: BBM⁻ kan van tevoren worden gemaakt en maximaal 1 maand bij RT worden bewaard.
   3. Tot slot, om 1 L BBM⁺ te produceren, combineert u 10 ml D-Glucose Stock Solution, Peptone uit Caseïne Stock Solution en Uracil Stock Solution met 985 ml BBM⁻. Meng goed en pas de gemiddelde pH aan tot 2-3 met 1:1 H₂SO₄.
      OPMERKING: BBM⁺ moet indien nodig vers worden gemaakt.
4. Bereiding van BBM⁺ solid medium
   1. Bereid 1 M voorraadoplossingen van MgCl₂ en CaCl₂; deze zullen helpen bij het stollen van het vaste medium van BBM. Voeg voor 1 M MgCl₂ 9,5 g toe aan 100 ml ddH₂O. Voeg voor 1 M CaCl₂ 11 g toe aan 100 ml ddH₂O. Autoclaaf om te steriliseren.
      LET OP: Het oplossen van CaCl₂·2H₂O in water is een exotherm proces. Voer deze stap met zorg uit. Draag handschoenen met een EN407-classificatie voor thermisch gevaar om te beschermen tegen letsel. Sluit het vat niet goed af, omdat er druk kan ontstaan.
   2. Meng 3% (w/v) gellangom (bijv. 30 g/l) in ddH₂O en autoclaaf om te steriliseren.
      OPMERKING: Gellangom (bijv. Gelriet) wordt hier gebruikt als geleermiddel, omdat standaard bacteriologische agar niet kan stollen bij 75 °C.
   3. Bereid BBM⁺ apart voor op vast medium, dat in een verhouding van 1:1 moet worden gemengd met de steriele gellangom die in stap 1.4.1 is bereid.
      1. Bereid eerst 1 L BBM⁻ voor zoals in stap 1.3.2. Combineer 887 ml BBM⁻ met 1 ml Fe-voorraadoplossing en 20 ml D-glucose-voorraadoplossing, pepton uit caseïne-voorraadoplossing en Uracil-voorraadoplossing.
      2. Voeg 40 ml 1 M MgCl₂ en 12 ml 1 M CaCl₂ toe. Meng goed en pas de gemiddelde pH aan tot 2-3 met 1:1 H₂SO₄.
         OPMERKING: De volumes van de hier toegevoegde voorraadoplossingen zijn opzettelijk groter dan voor de bereiding van vloeibare BBM⁺ in stap 1.3. Dit is om rekening te houden met het mengen in een verhouding van 1:1 met gesmolten gellangom in de volgende stap.
   4. Verwarm de BBM⁺ voor op vast medium tot ongeveer 75 °C en meng in een verhouding van 1:1 met gesmolten gellangom in ddH₂O. Meng goed en giet in hittebestendig plastic (bijv. polypropyleen), glazen petrischaaltjes of zeswells platen voor de groeivan S. acidocaldarius. Gebruik de agar onmiddellijk na het mengen, want deze zal snel hard worden.
      OPMERKING: Sommige petrischalen van polystyreen 90 mm die vaak voor microbiologie worden gebruikt, zullen vervormen als ze gedurende langere tijd bij hoge temperaturen worden geïncubeerd.
      LET OP: Neem de juiste veiligheidsmaatregelen bij het omgaan met hete vloeistoffen; draag EN407-geclassificeerde handschoenen voor thermisch gevaar om te beschermen tegen letsel.

2. S. acidocaldarius nieuw leven inblazen uit een diepvriesbouilloncultuur

1. Voorbereiding van geventileerde groeibuizen om voldoende beluchting en zuurstofbeschikbaarheid te garanderen.
   1. Bereid van tevoren doorboorde microcentrifugebuisjes van 2 ml voor op de groei van Sulfolobus . Verwarm stompe draad (>0,7 mm, zoals een rechtgebogen paperclip) voorzichtig met behulp van een bunsenbrander en prik in het deksel van de buis, zodat er een klein gaatje van ongeveer 1 mm ontstaat.
   2. Plaats doorboorde buisjes in een autoclaveerbaar vat (bijv. lege pipetpuntdoos) en autoclaaf om te steriliseren.
      LET OP: Draag handschoenen met een EN407-classificatie voor thermisch gevaar om te beschermen tegen thermisch letsel aan de handen door verhit metaal. Verwarm de draad slechts een korte tijd (1-2 s) om oververhitting te voorkomen. Alleen metalen met een hoge smelttemperatuur (staal) mogen worden gebruikt.
2. Inoculeer starterculturen van S. acidocaldarius.
   1. Vul de geautoclaveerde doorboorde buisjes van 2 ml met 1,5 ml voorverwarmde BBM⁺ (zoals bereid in sectie 1, voorgeïncubeerd bij 75 °C gedurende ten minste 15 minuten).
   2. Inoculeer de met BBM⁺ gevulde buisjes met een schraapsel (overeenkomend met 50 - 60 mg) uit een glycerolvoorraad (25% v/v glycerol, bewaard bij -80 °C). Hier wordt S. acidocaldarius stam DSM639 gebruikt. Vul een extra tube met 1,5 ml BBM+ als negatieve controle.
3. Om te voorkomen dat aërosolen uit het doorboorde buisdeksel van 2 ml ontsnappen en de groeiomgeving (en eventuele andere monsters) verontreinigen en om de variabiliteit van de verdamping van de cultuur in de buizen te verminderen, plaatst u een gasdoorlatend membraan op het deksel dat bestand is tegen verhoogde temperaturen (65-85 °C) en microbiële ontsnapping/infiltratie blokkeert.
   OPMERKING: Het gebruik van gasdoorlatende membranen voor het afdichten van buizen vermindert de verdamping aanzienlijk. Gedurende een periode van 48 uur bij 75 °C vertonen verzegelde buizen een gemiddeld volumeverlies van 8,63% (bereik: 3,29-16,45%, n = 24 technische replicaten, tweemaal herhaald), in tegenstelling tot 25,05% (bereik: 11,92-62,91%, n = 24 technische replicaten, tweemaal herhaald) voor niet-verzegelde buizen.
4. Incubeer de geënte buizen in een thermomixer bij 75 °C met constant schudden met 400 omwentelingen per minuut (RPM) gedurende 48-72 uur of totdat OD_{600 nm} van 0,3 - 0,8 is bereikt zoals gemeten met een spectrofotometer.
   OPMERKING: Het doorboorde deksel van de buisjes van 2 ml en het schudden zorgen voor een passende beluchting voor een optimale groei. Het deksel van de thermomixer moet op zijn plaats zitten om een constante temperatuur te garanderen en verdamping te verminderen.
5. Geef de nieuw leven ingeblazen culturen na de incubatieperiode een tweede groeifase (preconditionering).
   1. Pelleteer de culturen door de buisjes 2 minuten op 5000 x g te draaien bij RT. Gooi vervolgens het supernatans weg en suspendeer de celpellet in verse 1,5 ml warme BBM⁺.
      OPMERKING: Dit experiment maakt gebruik van de S. acidocaldarius wild-type stam DSM639, maar deze groeimethoden en experimentele evolutie kunnen worden toegepast op elke Sulfolobus-stam en mogelijk andere thermofielen.

3. Bepaling van de bevolkingsdichtheid, verdubbelingstijd en exponentiële groeifase voor S. acidocaldarius

1. Bepaal de populatiedichtheid en de tijd tot de exponentiële groeifase voor de gekozen selectieomstandigheden. Bereid voor elke te testen milieutoestand drie starterculturen voor volgens de stappen 2.1-2.5.
2. Verdun de drie culturen in BBM⁺ tot een OD_600nm van 0,01. Maak van elke cultuur minstens 20 ml. Deze drie culturen vertegenwoordigen technische replicaten.
3. Voer replicatiegroeicurven van OD_600nm uit in de loop van de tijd met behulp van destructieve bemonstering.
   1. Bereid 24 doorboorde buisjes van 2 ml voor uit stap 2.1, verdeel ze in drie sets van acht en label deze technische replicaten 1, 2 en 3 (bijv. acht buisjes met het label replicaat 1 enz.).
   2. Pipetteer van elk van de drie verdunde culturen uit stap 3.2 1,5 ml in zeven voorbereide buisjes. Vul de resterende tube met 1,5 ml BBM+ als negatieve controle.
4. Incubeer alle 24 buizen in een thermomixer bij 75 °C en 400 RPM. Afdichten met een gasdoorlatend membraan. Verwijder met regelmatige tussenpozen (zoals 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 uur) één buis van elk van de drie replicaten en meet OD_{600 nm} met behulp van een spectrofotometer en gooi de buis vervolgens weg. Vervang het gasdoorlatende membraan na het verwijderen van een slang.
5. Bepaal tegelijkertijd de relatie tussen OD_600nm en bevolkingsdichtheid. Voer seriële verdunningen uit (1 x ^10-1 tot 1 x ^10-6) in BBM⁺ medium gedurende ten minste drie tijdstippen (idealiter begin, midden en einde). Inoculeer 100 μl van elke verdunning op vast BBM⁺ medium (bereid zoals in stap 1.4).
   OPMERKING: Om een consistente koloniegroei en nauwkeurige tellingen te bereiken, is het het beste om de verdunde cultuur op een plek op vaste media te pipetteren zonder mechanische spreiding uit te voeren, zoals met behulp van een L-vormige spreider of glasparels. Mechanische verspreiding lijkt een nadelige invloed te hebben op de vorming van kolonies.
6. Incubeer de platen in een statische incubator bij 75 °C tot er kolonies verschijnen (5-7 dagen).
   1. Houd de broedmachine gedurende deze periode vochtig om overmatig uitdrogen van de platen te voorkomen, anders vormen zich geen kolonies.
   2. Bereik dit door de platen in een gesloten polypropyleen doos te plaatsen die bekleed is met een vochtige doek. Prik minstens drie keer in het deksel van de doos om beluchting mogelijk te maken.
   3. Plaats emmers water in de couveuse om de luchtvochtigheid te verhogen. Vul de emmers dagelijks bij.
7. Zodra alle OD_{600nm-metingen} zijn verzameld, bepaal je de verdubbelingstijd en tijd om de exponentiële groeifase te bereiken door een logistieke curve aan te passen aan de relatie tussen OD_600nm en tijd, bijvoorbeeld met behulp van SummarizeGrowth uit het growthcurver-pakket in R.
8. Zodra zichtbare kolonies zijn gevormd op vaste media, telt u kolonievormende eenheden (CFU's), met als doel te tellen vanaf de verdunningsfactor, waarbij 50-100 kolonies worden geproduceerd voor de beste nauwkeurigheid.
9. Bereken de celdichtheid in het kweekmedium met behulp van de formule: kve/ml = aantal kolonies/(volume verguld × verdunningsfactor).
10. Voer log-log lineaire regressie uit om de relatie tussen log10 (CFU) en log10 (OD_600nm) te bepalen. Bereken dus de voorspelde kve/ml voor een gegeven OD op basis van de helling en het snijpunt van het regressiemodel: voorspelde kve = 10 ^{[helling × log10(OD600nm) + interceptie]}.
11. (Optioneel) Voer ook de stappen 3.1-3.10 uit in een schudincubator om te bepalen of een vergelijkbare groei wordt bereikt in thermomixers.

4. Initiëren van onafhankelijke afstammingslijnen voor experimentele evolutie

1. Dag 1: Om enkele kolonies te genereren, voert u eerst alle stappen van sectie 2 hierboven uit om een startcultuur te genereren.
2. Dag 3: Meet OD_600nm van de cultuur om er zeker van te zijn dat deze voldoende dichtheid heeft bereikt in de exponentiële fase (OD_600nm 0,3-0,8 door spectrofotometer).
3. Maak seriële verdunningen van de S. acidocaldarius DSM639-cultuur van 1 x ^10-1-1 x ^10-6 en verdeel 100 μL uit elke verdunning van 1 x ^10-5 en 1 x ^10-6 in putjes van een plaat met 6 putjes die vast BBM⁺ -medium bevat (sectie 1 en tabel 1) in verschillende replicaten. Incubeer platen bij 75 °C in een statische incubator zoals in stap 3.5 gedurende 5-7 dagen om enkele kolonies te laten ontstaan.
4. Dag 8-10 (5-7 dagen na incubatie):
   1. Bepaal het aantal evoluerende afstammingslijnen van enkele kolonies. Kies voor elke afstamming willekeurig een kolonie van de platen met behulp van een inoculatielus. Resuspendeer de kolonie in een doorboorde tube van 2 ml met 1,5 ml voorverwarmd BBM⁺ medium. Label de buis op de juiste manier.
   2. Herhaal dit voor het gewenste aantal afstammingslijnen; hier werden zeven afstammingslijnen vastgesteld en gelabeld als SA1-7. Vul een extra tube met 1,5 ml BBM+ als negatieve controle.
   3. Sluit de bovenkanten van de buizen af met een ademend membraan en incubeer in een thermomixer bij 75 °C, 400 rpm gedurende 48-72 uur, totdat de culturen troebel worden (overeenkomend met OD_{600 nm} 0,3-0,8 door spectrofotometer).
5. Dag 10-12 (7-9 dagen na inoculatie):
   1. Draai de klonale culturen in een tafelcentrifuge op 5.000 x g gedurende 1 minuut bij RT. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet met 200 μL vloeibare BBM⁺.
   2. Meng de celsuspensies van 200 μl met 200 μl 50% glycerol (25% v/v glycerol) om glycerolvoorraden van de zeven onafhankelijke lijnen te creëren en bewaar bij -80 °C. Dit zijn de voorouderlijke populaties voor de evolutie-experimenten.

5. Uitvoering van het experiment met de temperatuurevolutie

OPMERKING: Een conceptueel diagram waarin de belangrijkste aspecten van het experimentprotocol worden geschetst, wordt gegeven in figuur 1.

1. Gebruik de zeven voorouderlijke populaties die in sectie 4 zijn gegenereerd voor het evolutie-experiment.
   1. Voer alle experimentele evolutietesten uit in steriele, doorboorde buisjes van 2 ml die zijn afgesloten met een permeabel membraan (hierboven beschreven, sectie 2).
   2. Houd naast deze populaties aparte doorboorde buisjes van 2 ml met 1,5 ml BBM⁺ als negatieve controles, vrij van kweek, om te controleren op (kruis)besmetting en om een drempelwaarde voor OD in te stellen die aangeeft dat er geen groei van de cultuur is.
2. Temperatuurbehandelingen instellen: Het gebruik van thermomixers maakt het mogelijk om meerdere temperatuurbehandelingen tot stand te brengen. Gebruik hier de volgende temperatuurbehandelingen: constant 75 °C, constant 65 °C en geleidelijk afnemend van 75-65 °C door de temperatuur elke 4 dagen met 1 °C te verlagen ('temperatuurdruppelbehandeling').
   OPMERKING: Deze behandelingen kunnen worden aangepast aan specifieke experimentele vereisten. Voor elke temperatuurbehandeling is een aparte thermomixer nodig.
3. Dag 1: Herleef de voorouderlijke populaties uit hun glycerolvoorraden (voorbereid in stap 4.5) volgens de stappen die worden beschreven in sectie 2.
4. Dag 3:
   1. Verdun deze culturen tot een OD_{600 nm} van 0,01 (gemeten met spectrofotometer) tot een totaal volume van ten minste 6 ml voorverwarmde BBM⁺. Aliquot 1,5 ml van elk van de zeven verdunde voorouderlijke bevolkingsculturen in drie afzonderlijke doorboorde buisjes van 2 ml, één voor elke temperatuurbehandeling die in stap 5.2 is vastgesteld.
      OPMERKING: Deze aliquoterende stap zorgt ervoor dat elke genetische variatie die aanwezig is in elke voorouderlijke populatie, aanwezig is in alle temperatuurbehandelingen aan het begin van het evolutie-experiment. Deze culturen zullen fungeren als overdracht 0 (Tx0) om het temperatuurevolutie-experiment te starten.
   2. Sluit de buizen af met het ademende membraan en plaats elke set van zeven voorouderlijke populaties in afzonderlijke thermomixers. Stel elke thermomixer in op de gewenste temperatuur en 400 tpm om het evolutie-experiment te starten.
5. Dag 5:
   1. Voer na 48 uur transfer 1 (Tx1) uit door 1,5 ml verwarmd BBM^+- medium te inoculeren in een doorboorde buis van 2 ml met 15 μL cultuur van elk van de Tx0-culturen (verdunning 1:100). Voor snelheid voert u deze stap uit met een meerkanaalspipet met variabele breedte om meerdere overdrachten van een enkel experiment tegelijk uit te voeren, waardoor de tijd dat de culturen uit de thermomixer zijn, wordt verkort.
   2. Net als eerder, sluit u de buizen af voordat u ze in willekeurige posities terugplaatst in hun respectievelijke thermomixers. Voer randomisatie handmatig uit of via de iMetaLab 96 putrandomizers.
6. Meet de OD_{600 nm} van Tx0 in een spectrofotometer op basis van platen (200 μL in platen met 96 putjes; hetzelfde volume BBM⁺ wordt gebruikt als een blanco) om de groei van de onafhankelijke lijnen te volgen.
   OPMERKING: De OD_600nm moet worden gemeten na het uitvoeren van de overdracht naar een vers medium om besmetting te voorkomen. Optische dichtheid kan ook op andere manieren worden gemeten, zoals met een standaard spectrofotometer. Het gebruik van een spectrofotometer op basis van platen maakt gelijktijdige meting van meerdere culturen mogelijk, waardoor het proces wordt gestroomlijnd.
7. Herhaal stap 5.5 en 5.6 op dag 7, 9, 11, enz., die overeenkomen met Tx2, Tx3, Tx4, enz. Houd de temperatuur constant voor de behandelingen van 75 °C en 65 °C. Verlaag voor de behandeling van temperatuurdaling de temperatuur met 1 °C elke tweede overdracht (d.w.z. op Tx2, Tx4, Tx6, enz.).
8. Bereid glycerolvoorraden voor (stap 3.2.3) van populaties na elke 10e^{overdracht (} d.w.z. Tx10, Tx20, enz.), Label de buis met de voorouderlijke populatie-ID (bijv. SA1 voor de 1e^{onafhankelijke populatie} ) en het overdrachtsnummer (bijv. Tx10 voor de 10e^overdracht). Gebruik deze glycerolvoorraden later om populaties nieuw leven in te blazen, om te bestuderen hoe populaties in de loop van de tijd zijn veranderd, of om het experiment indien nodig opnieuw te starten (bijvoorbeeld door besmetting of onverwachte incidenten die leiden tot verlies van culturen).
9. Laat het experiment doorgaan voor een vooraf bepaald aantal overdrachten of totdat een vooraf bepaald aantal generaties is verstreken. Bereid bij de laatste overdracht glycerolvoorraden van alle afstammelingen voor.
   OPMERKING: Hier ging het experiment door totdat de temperatuurdalingsbehandeling 65 °C bereikte, wat gebeurde op Tx22. Dit komt overeen met ongeveer 150 generaties (berekend op basis van de verdunningsfactor van 100 in 4.6: log₂(100) = 6.64 generaties per overdracht). De duur van evolutie-experimenten kan worden aangepast aan de experimentele vereisten.

6. Groeitesten na evolutie-experimenten: voorouderlijke versus geëvolueerde afstammingslijnen

OPMERKING: Een conceptueel diagram waarin het groei-/fitnesstestprotocol wordt geschetst, wordt gegeven in figuur 2.

1. Bereid doorboorde buisjes van 2 ml voor met 1,5 ml BBM⁺. Bereid voldoende buizen voor om alle afstammelingen plus elk van de voorouderlijke soorten te laten groeien.
2. Herleef voorouderlijke populaties, en elke afstammende populatie opgeslagen in stap 5.9 na de definitieve overdracht van het evolutie-experiment met behulp van de methode beschreven in stappen 2.2-2.5, maar met incubatie bij de temperatuur die elke populatie ervoer voor de laatste twee overdrachten van het evolutie-experiment, d.w.z. 75 °C voor de 75 °C constante behandeling, en 65 °C voor de 65 °C constante en temperatuurdalingsexperimenten. Om vergelijkbare bevolkingsdichtheden te bereiken, voert u de incubatie van 75 °C uit gedurende 72 uur en de incubatie van 65 °C gedurende 120 uur.
3. Meet OD_600nm van de gekweekte culturen via een spectrofotometer op basis van platen.
4. Voer groeianalyses uit van elke afstammelende populatie en elke voorouderlijke stam bij beide temperaturen (d.w.z. 75 °C en 65 °C) in drie replicaten. Bereid doorboorde centrifugebuisjes van 2 ml voor met 1,5 ml BBM⁺. Bereid zes buizen voor voor elke geëvolueerde afstamming en elke voorouderlijke stam. Label de buizen met de afstammingsnaam (SA1-7 of voorouder), de groeitemperatuur (75 °C of 65 °C) en de replicatie-ID (1, 2 of 3).
   OPMERKING: Als er minder dan zes thermomixers beschikbaar zijn, kan de groeitest over meerdere dagen worden gerepliceerd in verschillende experimentele blokken. In dit geval is het belangrijk om elke afstamming en voorouder in elk experimenteel blok te meten, zodat blokeffecten kunnen worden geschat en statistisch kunnen worden verklaard.
5. Inoculeer het verse medium in de zes voorbereide buisjes met 15 μL cultuur van elke afstammende afstamming en voorouderlijke stam.
6. Stel drie thermomixers in op 75 °C en drie thermomixers op 65 °C, waarbij u elke thermomixer aanwijst als een replicatie-ID. Plaats de buizen in de thermomixer die overeenkomen met de temperatuur en repliceer ID. Zorg er binnen elke thermomixer voor dat de afstammingslijnen en voorouders willekeurig worden geplaatst om te controleren op heterogeniteit.
7. Sluit elke set van 24 buizen af met een doorlaatbaar membraan. Incubeer gedurende 48 uur.
8. Breng 200 μL van elke cultuur over naar een plaat met 96 putjes. Meet OD_600nm met behulp van een spectrofotometer.
   OPMERKING: Een meerkanaalspipet met variabele breedte kan worden gebruikt om het overbrengen tussen microcentrifugebuisjes en platen met 96 putjes te vergemakkelijken.
9. Gegevens plotten en analyseren met behulp van statistische software (bijv. R).

7. Sequentiebepaling van het hele genoom van geëvolueerde afstammingslijnen en identificatie van mutaties

1. Herleef afstammelingen die zijn opgeslagen in stap 5.9 in voorverwarmde BBM⁺ bij 75 °C van 48-72 uur door een stuk ijs van elke bevroren populatie te inoculeren in BBM⁺ zoals in sectie 2, stappen 2.2-2.5. Bereid tussen 1-10 ml kweekvolume voor om een voldoende hoeveelheid genoom-DNA te verkrijgen. Het exacte vereiste volume is afhankelijk van de optie die is gekozen voor de sequencing in stap 7.2 of 7.3 (hieronder).
   OPMERKING: Het is een goede gewoonte om ook de stam te sequencen die wordt gebruikt om de voorouderlijke populaties te initiëren. Dit is om correct te bepalen of eventuele mutaties die in de afstammende afstammingslijnen zijn gedetecteerd, zijn ontstaan tijdens het evolutie-experiment en niet eerder.
2. (Optie 1) Extraheer genoom-DNA en bereid Illumina-sequencingbibliotheken voor Illumina-sequencing voor.
   1. Genoom-DNA extraheren en zuiveren met behulp van een commerciële genomische DNA-extractiekit voor bacteriën.
   2. Zorg ervoor dat het geëxtraheerde genomische DNA voldoet aan de kwantiteits- en kwaliteitseisen van de sequencing-aanbieder door commerciële kits te gebruiken die door de aanbieder worden aanbevolen.
   3. Voer de voorbereiding van de genomische DNA-bibliotheek uit met behulp van een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Een paired-end protocol van 250 bp wordt aanbevolen. Bewaar geëxtraheerd genoom-DNA bij -20 °C tot het klaar is om monsters in te dienen bij de sequencingprovider.
3. (Optie 2) U kunt de monsters ook naar een commerciële aanbieder sturen die DNA-extractie, genomische DNA-kwaliteitscontroles, voorbereiding van de Illumina-bibliotheek en Illumina-sequencing uitvoert als een gecombineerde service.
4. Analyseer gesequencede genomen om mutaties te identificeren.
   1. Ontvang FASTQ-bestanden en, indien nog niet uitgevoerd door de sequencingprovider, voer adaptertrimming uit met behulp van Trimmomatic met een kwaliteitsuitschakeling van het schuifvenster van Q15.
   2. Gebruik de bijgesneden FASTQ-bestanden om de breseq-pijplijn (versie 0.38.1) uit te voeren om mutaties te detecteren, waarbij u de genomische DNA-metingen vergelijkt met de referentiesequentie voor de gekozen stam. Voor S. acidocaldarius DSM639 is dit RefSeq ID NC_007181.

8. (Optioneel) Beoordeling van het energieverbruik van de thermomixer versus de incubator

1. Om het energieverbruik van het gebruik van een incubator te vergelijken met een thermomixer voor groei, meet u het energieverbruik van elk apparaat gedurende 24 uur met behulp van een energiebewakingsstekker.
2. Gebruik twee stekkers om het energieverbruik van beide apparaten tegelijk te meten. U kunt ook het energieverbruik op opeenvolgende dagen meten.
3. Haal de stekker van de broedstoof of thermomixer uit het stopcontact. Steek de stekker van de energiemonitoring in het stopcontact en initialiseer deze volgens de instructies van de fabrikant, inclusief het installeren van de bewakings- en besturingssoftware.
4. Sluit de incubator of thermomixer aan op de energiebewakingsstekker en laat deze minimaal 2 uur draaien (maar idealiter 24 uur of langer) om een goede schatting van het typische energieverbruik te krijgen. Noteer het energieverbruik van elk apparaat.

Resultaten

Metingen van de groeicurve
De groeicurves voor S. acidocaldarius DSM639 zijn weergegeven in figuur 3A. De groei bleek vergelijkbaar te zijn bij het vergelijken van de incubatie met behulp van thermomixers met die in conventionele incubatoren. De parameters voor de gemiddelde groeisnelheid werden geschat door een logistische curve aan te passen op elke gerepliceerde groeicurve en de gemiddelde en standaardfout te berekenen. De tijden tot de mid-exponentiële fase op de thermomixer en incubator waren respectievelijk 27,2 uur ± 1,1 uur en 31,1 uur ± 1,9 uur. De geschatte initiële verdubbelingstijden voor de thermomixer en de incubator bij 75 °C waren respectievelijk 4,29 uur ± 0,28 uur en 4,19 uur ± 0,44 uur, wat consistent is met eerder gepubliceerde waarden²⁴. De relatie tussen log₁₀ (OD_600nm) en log₁₀ (CFU) werd goed gekarakteriseerd door een lineair model (aangepast R² = 0,82, F(1,22) = 104, p < 0,00001, helling = 1,73 ± 0,17, snijpunt = 9,73 ± 0,14). De relatie tussen OD_600nm en CFU wordt dus gegeven door de formule CFU = 10^{(1,73 × log10(OD600nm) + 9,73)}. Een OD_{600 nm} van 0,3 komt dus overeen met ongeveer 6,7 × 10⁸ kve/ml (figuur 3B).

Experiment met temperatuurevolutie
Drie temperatuuromstandigheden, constant 75 °C, constant 65 °C en temperatuurdaling (75-65 °C, afnemend met 1 °C elke twee transfers), werden geïnitieerd met behulp van zeven onafhankelijke afstammingslijnen afgeleid van S. acidocaldarius DSM639. OD_{600nm-metingen} werden uitgevoerd na elke overdracht gedurende de 45 dagen van het experiment (ongeveer 150 generaties bij 75 °C) en zijn weergegeven in figuur 4. OD_{600nm-metingen} die over dagen worden uitgevoerd, zijn inherent luidruchtig, omdat ze onderhevig kunnen zijn aan subtiele verschillen in bijvoorbeeld groeiperiode, temperatuur, enz. Metingen die over dagen worden uitgevoerd, kunnen echter nog steeds nuttig zijn om de levensvatbaarheid van de populatie te beoordelen en om een indicatie te geven of de fitheid in de loop van de tijd verbetert. Afstammingslijnen van de constante toestand van 75 °C namen toe in OD_600nm van een aanvankelijk bereik van 0,125-0,3 tot een bereik van 0,248-0,471 aan het einde van het experiment. Dit suggereert dat de conditie is verbeterd met deze behandeling. Daarentegen vertoonden afstammingslijnen van de constante 65 °C-behandeling een daling van OD_{600 nm}, van een aanvankelijk bereik van 0,018-0,087 tot 0,008-0,04 op het laatste tijdstip. Dit suggereert dat populaties niet in staat waren zich aan te passen aan de constante temperatuur van 65 °C, hoewel het feit dat levensvatbare organismen konden worden hersteld, aantoont dat de populaties niet werden weggespoeld door opeenvolgende verdunningen, wat een zekere mate van aanpassing suggereert. Ten slotte namen de populaties in de behandeling met temperatuurdaling toe van het initiële OD_600nm-bereik van 0,099-0,279 tot 0,3-0,39 bij Tx6 (overeenkomend met 288 uur en 73 °C in deze behandeling), gevolgd door een gestage afname tot een bereik van 0,003-0,024 op het laatste tijdstip.

Groei/fitness testen
Fitnesstests werden uitgevoerd voor elke afstammende populatie na de evolutie-experimenten. OD_600nm werd getest na 48 uur groei voor alle zeven onafhankelijke afstammingslijnen, gevolgd door het passen van lineaire modellen in R voor elke testtemperatuur, met 'selectieomgeving' als hoofdeffect en 'replicate/thermomixer' als blokeffect. De groei van de voorouderlijke stam werd gebruikt als referentieniveau voor behandelingscontrasten. De gegevens zijn weergegeven in figuur 5.

Bij meting bij 75 °C waren er gemiddeld significante verhogingen in fitness ten opzichte van de voorouderlijke belasting voor afstammingslijnen van de constante 75 °C (t-toets: t₂₁₀=3,64, p=0,0003) en constante 65 °C (t-toets: t₂₁₀=2,8, p=0,005) behandelingen, maar niet van de temperatuurdalingsbehandeling (t-toets: t₂₁₀=−0,87, p=0,38). Bij meting bij 65 °C vertoonden de afstammingslijnen van alle behandelingen gemiddeld een toename in fitheid (constante 75 °C-afstammingslijnen; t-toets: t₂₁₀=4.68, p<0.0001, constante 65 °C afstammingslijnen; T-test: T₂₁₀,=4,24, p<0,0001, temperatuurdaling lijnen; T-toets: T₂₁₀=3.15, p=0.002). Voor beide testtemperaturen waren er echter aanzienlijke verschillen tussen de afstammingslijnen in hun fitness (Figuur 5). Sommige afstammingslijnen verschilden niet significant van de voorouderlijke stam of waren in fitness afgenomen; Dit was vooral duidelijk voor afstammingslijnen van de temperatuurdalingsbehandeling.

Het is vermeldenswaard dat de relatie tussen OD_600nm en CFU/ml mogelijk is veranderd tijdens het evolutie-experiment. Dit kan worden beoordeeld door groeiparameters voor geëvolueerde afstammingslijnen te bepalen (volgens de stappen 3.1-3.10).

Resultaten van sequentiebepaling van het hele genoom
Analyse van het hele genoom werd uitgevoerd met behulp van breseq (versie 0.38.1)²⁵ op de zeven afstammingslijnen van de constante toestand van 75 °C met behulp van het referentiegenoom van S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq-toetreding NC_007181.1). Er werd een verscheidenheid aan mutaties onthuld met inserties, deleties en single nucleotide polymorfisme (SNP) in het genoom van alle afstammelingen (Tabel 2). Multipele insertie en niet-synonieme mutaties bevonden zich in eiwitcoderende genen, alsook in intergene regio's die de genexpressie kunnen beïnvloeden als gevolg van frameshifts in de promotorregio's van genen. Sommige van de mutaties waren consistent over meerdere afstammelingen in genen die betrokken zijn bij verschillende functies zoals biosynthese van de celwand, transcriptie, metabolisme, cellulair transport en katalytische activiteit (Tabel 2). Een van deze mutaties was een grote deletie van 54.667 basenparen in vijf van de zeven afstammingslijnen; Dit werd bevestigd door een ontbrekende dekkingsgrafiek voor elke populatie (frequentie variërend van 93,2% tot 100%). Het verwijderde gebied komt overeen met een verlies van 53 genen; De rol van deze genen bij adaptatie zal in toekomstige studies worden onderzocht. Er werden enkele verschillen opgemerkt tussen het gebruikte isolaat van DSM639 en de gepubliceerde referentiesequentie (weergegeven in aanvullende tabel 1).

Energieverbruik van schudincubator versus thermomixer
Het energieverbruik van een schudincubator werd vergeleken met een thermomixer met behulp van een in de handel verkrijgbare slimme stekker voor energiemonitoring voor een reeks gangbare incubatietemperaturen en de hier gebruikte temperatuur van 75 °C. Bij 75 °C verbruikte de thermomixer ongeveer 1/40^ste van de energie van een traditionele schudincubator (Figuur 6), wat suggereert dat thermomixers een potentieel middel zijn om de koolstofvoetafdruk van experimentele evolutie te verkleinen.

Figuur 1: Stroomdiagram dat het protocol van het evolutie-experiment over drie temperatuurbehandelingen illustreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Stroomdiagram dat de stappen van het groei-/fitnesstestprotocol illustreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Bepaling van de belangrijkste groeiparameters en vergelijking van incubatie-apparaten voor S. acidocaldarius DSM639. Drie duplicaatculturen werden gekweekt bij 75 °C in 7 afzonderlijke buizen. Destructieve bemonstering werd gebruikt om (A) OD_600nm te meten (betekent ± standaardfout van n=3 technische replicaten; sommige foutbalken zijn kleiner dan plotsymbolen); curves vertegenwoordigen passende logistische groeimodellen en (B) kolonievormende eenheden (CFU's); lijnen vertegenwoordigen passende log-log lineaire regressiemodellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten voor optische dichtheden (OD_600nm) verkregen tijdens evolutie-experimenten. Optische dichtheden van onafhankelijke afstammingslijnen gemeten tijdens de evolutie-experimenten onder drie temperatuurbehandelingen (constant 65 °C, constant 75 °C, daling 75 °C-65 °C) uitgevoerd over ongeveer 150 generaties. Rondingen geven aan dat Löss in de loop van de tijd gladstrijkt voor elke onafhankelijke afstammingslijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve resultaten voor groeianalyses. Groeitesten voor onafhankelijke afstammingslijnen afgeleid van S. acidocaldarius DSM639 na experimenten met temperatuurevolutie (constant 65 °C, constant 75 °C, daling 75 °C-65 °C) in vergelijking met de voorouderstam. Voor alle afstammingslijnen werd de groei getest bij 65 °C en 75 °C. Gekleurde punten tonen de gemiddelde ± standaardfout van technische replicaten (weergegeven in grijs, n = 12 voor de voorouder en n = 3 voor elke geëvolueerde afstammingslijn). De grijze balk geeft het gemiddelde ± de standaardfout van de voorouderlijke fitness aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Energieverbruik van traditionele incubatoren versus thermomixers. Het energieverbruik werd gedurende 2 uur geregistreerd met behulp van een in de handel verkrijgbare slimme stekker voor energiemonitoring. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Tabel 1: Mediarecepten en voorraadoplossingen die nodig zijn om S. acidocaldarius te kweken. Alle media en stockoplossingen moeten worden gemaakt met dubbel gedistilleerd H₂O (ddH₂O) en vervolgens worden gesteriliseerd door autoclaaf of filtersterilisatie door een filter van 0,22 μm, zoals aangegeven. Raadpleeg sectie 1 van het protocol voor een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van alle media- en voorraadoplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Representatieve resultaten voor sequencing van het hele genoom van afstammelingen . Mutaties gevonden in afstammelingen die afstammen van S. acidocaldarius DSM639 door constante behandeling met 75 °C. Mutaties duiden op veranderingen ten opzichte van de directe voorouder van de afstammingslijn, die verschillende veranderingen vertoont ten opzichte van de referentiesequentie voor S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; mutaties in de voorouder worden weergegeven in aanvullende tabel 1). n geeft het aantal afstammingslijnen aan waarin een mutatie is gevonden. → gen op het 'forward reading frame'; ← gen op het 'reverse reading frame'. †Deze veranderingen zijn relatief ten opzichte van een (A)10→11 frameshift aanwezig in het isolaat van S. acidocaldarius DSM639 (aanvullende tabel 1). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende Tabel 1: Mutaties aanwezig in het isolaat van S. acidocaldarius DSM639 ten opzichte van de referentiesequentie (RefSeq-toetreding NC_007181.1). → gen op het 'forward reading frame'; ← gen op het 'reverse reading frame'. ‡SACI_RS04020 is geannoteerd als een pseudogen in NC_007181.1, maar de Δ1 bp frameshift-mutatie die hier wordt waargenomen, herstelt vermoedelijk zijn functie zoals bij de mutatie, het codeert voor een eiwit met 100% identiteit aan rgy reverse gyrase-gen (RefSeq-toetreding WP_176586667.1). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit werk heeft een experimenteel evolutieprotocol voor thermofielen ontwikkeld, hier op maat gemaakt voor de archaeon S. acidocaldarius, maar aanpasbaar aan andere microben met hoge groeivereisten. Dit protocol bouwt voort op technieken die oorspronkelijk zijn ontworpen voor mesofiele bacteriën, maar is specifiek aangepast om de technische uitdagingen te overwinnen die gepaard gaan met aerobe groei op hoge temperatuur 2,4,5,24. De creatie van deze methode zal het mogelijk maken om voorheen niet-gekarakteriseerde evolutionaire dynamieken te verkennen die zich voordoen onder extreme temperatuuromstandigheden, vergelijkbaar met de omstandigheden die mogelijk bestonden tijdens de vroegste stadia van de evolutie van^{het leven.}

Er zijn verschillende kritische aspecten van het protocol die in acht moeten worden genomen om betrouwbare resultaten van evolutie-experimenten te bereiken. De eerste is onafhankelijkheid tussen afstammingslijnen, die wordt bereikt door uit te spreiden naar enkele kolonies voordat het experiment wordt gestart. Dit is absoluut noodzakelijk om ervoor te zorgen dat alle gemeenschappelijke mutaties die in afzonderlijke afstammingslijnen worden gevonden, een onafhankelijke oorsprong hebben. Als in plaats daarvan een bulkcultuur wordt gealiquoteerd om de afstammingslijnen te initiëren, kunnen gemeenschappelijke genetische varianten over elke populatie worden verspreid. Een tweede belangrijke overweging is de controle op contaminatie, wat wordt bereikt door een negatieve controle vrij van cultuur te handhaven en de groei te monitoren. In tegenstelling tot experimenten met mesofielen, is het onwaarschijnlijk dat extremofiele evolutie-experimenten worden besmet door externe bronnen, maar kruisbesmetting tussen afstammingslijnen kan nog steeds voorkomen. Het handhaven van een evenwicht tussen beluchting en verdamping is een andere belangrijke overweging. S.acidocaldarius is een obligate aerobe en heeft dus zuurstof nodig om te groeien^10,23. Het handmatig doorboren van polypropyleen microcentrifugebuisjes en deze afdichten met gasdoorlatend membraan^21,25 was essentieel om de beluchting te behouden zonder overmatige verdamping. Deze vermindering kan waarschijnlijk worden toegeschreven aan het behoud van een uniforme omgeving binnen de verzegelde buizen (gegevens niet weergegeven).

Twee aspecten van de methode kunnen moeten worden aangepast of opgelost, afhankelijk van de specifieke milieuomstandigheden die voor het evolutie-experiment zijn gebruikt: de verdunningsfactor en de tijd tussen de overdrachten. Bij deze methode werd bij elke overdracht een verdunning van 1:100 uitgevoerd, waardoor een gemiddelde van log₂(100) = 6,64 verdubbelingen nodig was om terug te keren naar dezelfde populatiegrootte. Dit zorgt voor een goede balans tussen het aanpassingspotentieel (een optimale verdunningsfactor wordt berekend door Wahl en Gerrish²⁶) en experimentele traceerbaarheid. In principe zou een sterke verdunningsfactor het mogelijk maken om meer generaties per dag voor te komen, omdat er meer verdubbelingen nodig zijn om terug te keren naar dezelfde bevolkingsdichtheid (bijv. 1:1000 vereist log₂(1000) = 9,97 verdubbelingen gemiddeld). Als er echter minder verdubbelingen worden bereikt dan nodig zijn tussen de overdrachten, zullen de populaties geleidelijk worden weggespoeld door verdunning, tenzij er een gunstige mutatie optreedt die de verdubbelingstijd verkort. met populaties die elke 48 uur worden overgedragen, is het vereist dat de verdubbelingstijden minder dan 8 uur zijn, wat overeenkomt met de geschatte verdubbelingstijd en eerder gepubliceerde waarden voor heterotrofe groei in S. acidocaldarius bij 75 °C (4-6 uur)^23,27. De geleidelijke afname van de OD_600nm in de loop van de tijd voor de constante 65 °C- en temperatuurdalingsbehandelingen suggereert echter dat dit misschien niet lang genoeg is om het vereiste aantal verdubbelingen te bereiken en dat een langere overdrachtsperiode gunstig zou zijn.

Er worden verschillende belangrijke voordelen opgemerkt van het gebruik van thermomixers ten opzichte van traditionele schudincubatoren voor experimentele evolutie, vooral bij het onderzoeken van aanpassing aan temperatuur. Thermomixers bieden een kosteneffectief alternatief voor schudincubatoren, met als bijkomend voordeel een kleinere ruimtelijke voetafdruk. Deze eigenschappen maken een efficiënte beoordeling van meerdere temperatuurbehandelingen parallel mogelijk. Thermomixers hebben ook een lager energieverbruik dan schudincubatoren, dus het gebruik ervan kan mogelijk de milieu-impact verminderen wanneer een bescheiden aantal buizen wordt geïncubeerd (bijv. minder dan 100). Dit verschil in energieverbruik is vooral duidelijk bij temperaturen die relevant zijn voor thermofielen, maar is ook van toepassing op een spectrum van meer gematigde temperatuurbereiken (Figuur 6), wat betekent dat thermomixers ook kunnen worden gebruikt om de milieu-impact van mesofiele experimentele evolutie te verminderen. Gezamenlijk suggereren deze kenmerken dat het gebruik van thermomixers in experimentele evolutie het potentieel heeft om de toegankelijkheid van deze onderzoeksmethodologie te verbeteren, met name in omgevingen met beperkte middelen, zoals laboratoria in ontwikkelingslanden en in het basis- en secundair onderwijs.

Ondanks het feit dat de huidige methode een weg vooruit biedt voor thermofiele experimentele evolutie, heeft ze enkele beperkingen ten opzichte van mesofiele experimentele evolutie. Ten eerste is het aantal gerepliceerde onafhankelijke afstammingslijnen dat kan worden vastgesteld met behulp van thermomixers klein in vergelijking met high-throughput-methoden met microtiterplaten, die op grote schaal worden gebruikt voor mesofielen⁴. Verdamping bij hoge temperaturen verhindert momenteel het gebruik van microtiterplaten gedurende het tijdvenster dat nodig is om exponentiële groei te bereiken. Ten tweede wordt het schatten van belangrijke groeicurveparameters, zoals groeisnelheid, verdubbelingstijd en vertragingstijd, bemoeilijkt omdat plaatgebaseerde spectrofotometers die bij hoge temperaturen (>45 °C) kunnen werken, momenteel niet te koop zijn. Met de hier geschetste methode vereist de karakterisering van de groeicurve momenteel arbeidsintensieve destructieve bemonstering en beperkt daarom de doorvoer. Ten slotte zijn high-throughput technieken voor het beoordelen van de competitieve fitheid van aangepaste isolaten nog niet grondig ontwikkeld voor thermofielen. Met name de ontwikkeling van een thermostabiel fluorescerend eiwit dat kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen stammen zou op high-throughput flowcytometrie gebaseerde fitnessassays^{mogelijk maken 28,29}; Recente ontwikkelingen van thermostabiele fluorescerende eiwitten met verschillende spectra roepen dit op als een mogelijke toekomstige ontwikkeling 30,31,32. Een toename van de doorvoer is een logische volgende stap in de verdere ontwikkeling van experimentele evolutietechnieken voor thermofielen, omdat evolutionaire processen hierdoor vollediger kunnen worden beschreven.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	Voor het steriliseren van filtermedia-componenten die niet gesteriliseerd kunnen worden met een autoclaaf.
1 μL inoculatielussen	Greiner	731161, 731165, of 731101	Voor het inoeculeren van culturen. Andere lussen kunnen worden gebruikt.
1000 μL pipettentips	StarLab	S1111-6811	Andere pipettentips kunnen worden gebruikt.
2 mL microcentrifugebuisjes	StarLab	S1620-2700	Voor het kweken van S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipettentips	StarLab	S1111-0816	Andere pipettentips kunnen worden gebruikt.
50 mL polystyreenbuisjes met conische bodem	Corning	430828 of 430829	Andere buisjes mogen worden gebruikt. Controleer de prestaties bij 75 °C. Buisjes met plugafdichtingen zorgen mogelijk niet voor voldoende beluchting; controleer dit voor gebruik.
50 mL spuit	BD plastipak	300865	Voor gebruik met spuit-aangedreven filters.
96 well microtiterplaten (niet-behandeld, platte bodem)	Nunc	260860	Voor het meten van OD bij 600 nm in een spectrofotometer.
Meervoudige pipet met verstelbare breedte	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optioneel, maar bespaart tijd bij het overbrengen tussen microcentrifuge en 96-well platen.
Ammoniumsulfaat ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	Voor Brock stockoplossing I.
Autoclaaf	Priorclave	B60-SMART of SV100-BASE	Andere autoclaven kunnen ook worden gebruikt.
Breathe-EASY gasdoorlatende afdichtmembraan	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Op maat gesneden om op doorboord microcentrifugebuisjes te gebruiken. Indien andere gasdoorlatende membranen worden gebruikt, zorg er dan voor dat de prestaties voldoende zijn bij 75 °C
Calciumchloridedihydraat (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Voor Brock stockoplossing I.
CELLSTAR Zes-well platen (suspensie/niet-behandeld)	Greiner	M9062	Zes-well platen van andere fabrikanten kunnen waarschijnlijk worden vervangen. Controleer de prestaties bij hoge temperaturen.
Kobalt(II)sulfaatheptahydraat (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	Voor trace element stockoplossing.
Koper(II)chloridedihydraat (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	Voor trace element stockoplossing.
D-(+)-glucose anhydrisch (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Andere pentose en hexose suikers kunnen ook worden gebruikt (bijv. D-xylose, D-arabinose). Glucose is geen voorkeurskoolstofbron voor S. acidocaldarius (SV Albers, persoonlijke communicatie)
Dubbel-gedistilleerde water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gom) wordt gebruikt in plaats van agar om vaste media te maken vanwege het hogere smeltpunt.
Glazen 100 mm Petri-schaaltjes	Brand	BR455742	Glazen Petri-schaaltjes worden gebruikt omdat de meeste standaard polystyreen 90 mm Petri-schaaltjes bij 75 °C vervormen (afhankelijk van het merk). Als alternatief kunnen zes-well platen worden gebruikt, omdat deze bij hoge temperaturen niet vervormen.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Ook andere incubators kunnen worden gebruikt. Controleer de werktemperatuur van apparatuur voor aankoop/gebruik, omdat veel incubators niet geschikt zijn voor temperaturen hoger dan 65°C.
IJzer(III)chloridehexahydraat (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	Voor Fe-Stockoplossing
Magnesiumsulfaatheptahydraat (Epsom-zout) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	Voor Brock stockoplossing I.
Mangaan(II)chloridetetrahydraat (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	Voor trace element stockoplossing.
Mini Smart Wi-Fi Stopcontact, Energiebewaking	Tapo	Tapo P110	Om energieverbruik te monitoren
N-Z-Amine A - Caseïne enzymatisch hydrolysaat	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A wordt gebruikt als bron van aminozuren.
Papclip (of andere stevige draad)	geen	geen	Voor het doorboren van 2 mL microcentrifugebuisjes.
Kaliumdiwaterstoffosfaat (Monokaliumfosfaat) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	Voor Brock stockoplossing I.
Promega Wizard Genomisch DNA-zuiveringskit	Promega	A1120	Optioneel, om genomisch DNA in het lab te extraheren
Natriummolybdaatdihydraat (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	Voor trace element stockoplossing.
Natriumtetraboraatdecahydraat (Borax) (Na2B4O7