Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Schatting van structurele gevoeligheid van intrinsiek ongeordende regio's als reactie op hyperosmotische stress in levende cellen met behulp van FRET

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66275

⸱

12 januari 2024

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) zijn flexibele eiwitdomeinen die hun conformatie wijzigen als reactie op veranderingen in de omgeving. Ensemble fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) kan eiwitdimensies onder verschillende omstandigheden schatten. We presenteren een FRET-benadering om de structurele gevoeligheid van IDR te beoordelen in levende Saccharomyces cerevisiae-cellen onder hyperosmotische stress.

Samenvatting

Intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) zijn eiwitdomeinen die deelnemen aan cruciale cellulaire processen. Tijdens stressomstandigheden veranderen de fysisch-chemische eigenschappen van de cellulaire omgeving, wat een directe invloed heeft op het conformationele ensemble van IDR's. IDR's zijn inherent gevoelig voor verstoringen van het milieu. Het bestuderen van hoe de fysisch-chemische eigenschappen van de cel het conformationele ensemble van IDR's reguleren, is essentieel voor het begrijpen van de omgevingscontrole van hun functie. Hier beschrijven we een stap-voor-stap methode voor het meten van de structurele gevoeligheid van IDR's in levende Saccharomyces cerevisiae cellen als reactie op hyperosmotische stresscondities. We presenteren het gebruik van ensemble fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) om in te schatten hoe de globale dimensies van IDR's veranderen tijdens een progressieve toename van hyperosmotische stress die wordt opgelegd aan cellen met een osmolyt. Daarnaast bieden we een script voor het verwerken van fluorescentiemetingen en het vergelijken van structurele gevoeligheid voor verschillende IDR's. Door deze methode te volgen, kunnen onderzoekers waardevolle inzichten verkrijgen in de conformatieveranderingen die IDR's ondergaan in het complexe intracellulaire milieu bij veranderende omgevingen.

Inleiding

Intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) zijn cruciale componenten in cellulaire processen1. In combinatie met gestructureerde domeinen zijn IDR's essentieel voor eiwitfuncties. De aminozuursamenstelling van IDR's is vertekend en wordt voornamelijk weergegeven door geladen, hydrofiele en kleine residuen. Vanwege deze eigenschap worden IDR's beschouwd als domeinen met een lage complexiteit 2,3. Talrijke IDR's hebben de aandacht getrokken, vooral omdat deze regio's een cruciale rol spelen bij pathologische aandoeningen, met name neurodegeneratieve ziekten. Dergelijke ziekten worden gekenmerkt door zelfassemblage en daaropvolgende extracellulaire of intracellulaire afzetting van IDR's in neuronen4. Voorbeelden van dergelijke IDR's zijn amyloïde-β (Aβ) bij de ziekte van Alzheimer, huntingtine (HTT) bij de ziekte van Huntington en TAR DNA-bindend eiwit-43 (TDP-43) en gefuseerd bij sarcoom (FUS) bij amyotrofische laterale sclerose en frontotemporale dementie4. De studie van de structurele herschikkingen van IDR's in de context van ziekte is aanzienlijk verbeterd door spectroscopische methoden, waaronder fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET).

De hydrofiele en uitgebreide aard van IDR's maakt ze uiterst gevoelig voor veranderingen in de fysisch-chemische eigenschappen van de oplossingsomgeving5. De mate waarin het conformationele ensemble van IDR's wordt gewijzigd door de omgeving wordt structurele gevoeligheid genoemd 5,6,7. Er kunnen verschillende technieken worden gebruikt om de conformatie en dynamiek van IDR's te bestuderen, waaronder circulair dichroïsme (CD) en röntgenverstrooiing onder kleine hoek (SAXS)8,9. Helaas hebben CD en SAXS grote hoeveelheden gezuiverde eiwitten nodig, dus ze zijn niet geschikt voor studies in cellen. FRET daarentegen is een techniek die de fluorescentie-intensiteit meet van twee fluorescerende moleculen die specifiek één IDR labelen, wat betekent dat ze kunnen worden gecontroleerd in complexe mengsels zoals levende cellen10. Het dynamisch meten van de structurele gevoeligheid van IDR's in levende cellen is noodzakelijk om te begrijpen hoe de omgeving de conformatie en functie van het ongeordende proteoom reguleert.

FRET is een krachtige methode voor het kwantificeren van de structurele gevoeligheid van IDR's, evenals bolvormige en multidomeineiwitten in levende cellen. De methode vereist een construct dat bestaat uit een IDR van belang ingeklemd tussen twee fluorescerende eiwitten (FP), bekend als een FRET-paar. Voor dit protocol stellen we het gebruik van mCerulean3 voor als de donor-FP en Citrien als de acceptor-FP, vanwege hun grote dynamische bereik, in vergelijking met andere FP's gerapporteerd in een eerdere studie over IDR-gevoeligheid6. FRET is eerder gebruikt om de structurele gevoeligheid van een planten-IDR in verschillende cellulaire contexten te meten6. Bovendien is deze techniek gebruikt om de totale eiwitdimensies van IDR's te karakteriseren door verschillende onderzoeksgroepen, zowel in vitro als in vivo 5,11.

Hier beschrijven we de ensemble FRET-methode voor het bestuderen van de structurele gevoeligheid van IDR's in levende gistcellen (Saccharomyces cerevisiae). We laten representatieve resultaten zien die zijn gebaseerd op een fabrieks-IDR genaamd AtLEA4-5. AtLEA4-5 is ongeordend in oplossing, maar vouwt zich in α-helix wanneer macromoleculaire verdringing in vitro wordt geïnduceerd 12. AtLEA4-5 is een goed referentiemodel voor deze methode omdat het relatief klein is (158 residuen), ongeordend en gevoelig voor verstoring van het milieu, zoals gerapporteerd in silico en in vitro 6,12. De hier gepresenteerde methode kan worden geschaald voor benaderingen met een hoge doorvoer, omdat gistcellen gemakkelijk te kweken zijn en de behandeling in kleine volumes wordt toegepast. Bovendien kunnen kleine aanpassingen aan het protocol worden toegepast op andere cellulaire systemen zoals bacteriën en plantencellen6. Het protocol kan worden uitgevoerd in elk moleculair biologisch laboratorium met toegang tot een microplaatlezer met fluorescentiemodus, een apparatuur die beschikbaar is in de meeste onderzoeksinstellingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Plasmide construct

  1. Amplificeer het open leesframe (ORF) dat codeert voor de gewenste IDR door polymerasekettingreactie (PCR). Voeg het stopcodon niet toe, aangezien de ORF wordt geflankeerd door de genen die coderen voor de fluorescerende eiwitten. Ontwerp voor de versterking primers met de SacI (5') en BglII (3') restrictieplaatsen.
    OPMERKING: Voor het gedeelte met representatieve resultaten hebben we AtLEA4-5 gebruikt als de geselecteerde IDR. We hebben de ORF van AtLEA4-5 versterkt uit het pTrc99A-AtLEA4-5 plasmide12.
  2. Verbeter het ORF PCR-product door opeenvolgende restrictie met SacI- en BglII-enzymen13.
  3. Verkrijg het commerciële plasmide pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) van Addgene (https://www.addgene.org/178189/).
  4. Voer een opeenvolgende restrictie uit met behulp van SacI- en BglII-enzymen om het AtLEA4-5 ORF uit het pDRFLIP38-AtLEA4-5-plasmide te verwijderen, waardoor een open plasmide overblijft dat het FRET-paar13 bevat.
  5. Zuiver de verteerde DNA-fragmenten met behulp van gelherstel uit een agarosegelelektroforese14. Ligate de beperkte fragmenten met behulp van DNA-ligase15.
  6. Transformeer de kloonreactie in competente Escherichia coli-cellen (DH5α of verwante stammen) en selecteer in Luria-Bertani (LB) platen die 50 μg/ml ampicilline16 bevatten. 's Nachts (AAN) kweken bij 37 °C.
  7. Isoleer en kweek ten minste vijf getransformeerde kolonies in een nieuwe plaat en genotype door PCR17. Zuiver het plasmide-DNA van een positief getransformeerde kolonie met behulp van standaard miniprep-methoden18.
  8. Controleer de extractie en integriteit van het plasmide-DNA met behulp van agarosegelelektroforese19. Controleer de juiste klonering van het construct met behulp van Sanger-sequencing20.

2. Plasmide-expressie in gistcellen

OPMERKING: Gebruik standaard aseptische technieken om de volgende stappen uit te voeren. Gebruik een afzuigkap met laminaire stroming of een aansteker.

  1. Inoculeer een streep S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) zeef in 3 ml gistpepton dextrose (YPD) medium en kweek ON bij 30 °C en 200 rpm.
    OPMERKING: BJ5465 is een protease-deficiënte (CH1) stam die wordt aanbevolen voor het werken met IDR's. Andere S. cerevisiae-stammen kunnen worden getest en gebruikt.
  2. Centrifugeer 1 ml van de 's nachts verzadigde (OD600 ~ 3-4) gistcultuur bij 14.000 x g gedurende 1 minuut. Verwijder het supernatans voorzichtig door te pipetteren.
  3. Resuspendeer de pellet in 1 ml Tris-EDTA (TE)-buffer (pH 7,5) door zachtjes op het buisje te tikken. Centrifugeer op 14.000 x g gedurende 1 minuut en verwijder voorzichtig het supernatant.
  4. Resuspendeer de pellet in 500 μL Lazy Bones-buffer (40% w/v PEG 3.350; 100 mM lithiumacetaat; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7,5) door te pipetteren. Voeg 25 μL gekookt (100 °C gedurende 5 min, gevolgd door afkoelen op ijs gedurende 5 min) zalmsperma-DNA (2 mg/ml) toe aan de geresuspendeerde gistcellen.
  5. Voeg 100 ng van het plasmide-DNA toe aan het mengsel en draai het mengsel gedurende 1 minuut om een grondige menging te garanderen. Laat het mengsel 1-2 uur op kamertemperatuur staan.
  6. Verwarm het gistmengsel gedurende 12 minuten op 42 °C en laat het vervolgens nog eens 12 minuten afkoelen op ijs. Centrifugeer de buis gedurende 1 minuut bij 14 000 x g en verwijder voorzichtig het supernatant.
  7. Resuspendeer de pellet in 1 ml TE-buffer (pH 7,5). Plaat 100 μL van de getransformeerde cellen op Yeast Synthetic-Dropout Medium zonder uracil (SD-ura) platen aangevuld met 15 g/L agar.
  8. Incubeer de platen gedurende 2-3 dagen bij 30 °C (figuur 1). Streep ten minste vijf gisttransformatoren in een nieuwe plaat en groei ON.

3. Validatie van gisttransformatoren

  1. Kies een klein deel van elke kandidaat-transformant door voorzichtig te schrapen en te resuspenderen in 5 μL 20 mM NaOH in individuele PCR-buisjes.
  2. Verwarm het monster gedurende 10 minuten bij 99 °C in een thermische cycler om de cellen te lyseren en het DNA in de oplossing vrij te geven. Deze stap is cruciaal voor het voorbereiden van het DNA-sjabloon voor PCR.
  3. Breng 1 μl van het gekookte monster over in een afzonderlijk PCR-reactiemengsel met de juiste primers en PCR-reagentia voor genotypering. We hebben de volgende primers gebruikt: Forward primer: 5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'. Omgekeerde primer: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.
  4. Stel een PCR-reactie in en valideer de aanwezigheid van het juiste plasmide met behulp van agarosegelelektroforese. Selecteer een transformator voor verdere experimenten.

4. Bereiding van gistcelkweek voor FRET-assay

  1. Inoculeer een streep van de geselecteerde gisttransformant in 3 ml vloeibaar 1x SD-Ura-medium.
    NOTITIE: Voer deze procedure uit in een laminaire stroomkap en steriel materiaal.
  2. Groei bij 30 °C, 200 rpm gedurende ten minste 12 uur om verzadiging te bereiken. Meet de OD600. De groei zou tussen OD600 = 1,0-2,0 moeten liggen.
    OPMERKING: Als OD600 lager is dan 1,0, geef cellen dan meer incubatietijd om te groeien. Als OD600 hoger is dan 2.0, ga dan niet verder en herstart vanaf stap 4.1.

5. Gistcelbereiding voor FRET-assay

  1. Verzamel 2 ml van de gistcultuur die 's nachts is verwerkt en centrifugeer bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatans voorzichtig door te pipetteren.
  2. Resuspendeer de pellet in 1 ml 50 mM 2-(N-Morpholino) ethaansulfonzuur (MES)-buffer (pH 6).
  3. Centrifugeer op 14.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
  4. Herhaal stap 5.2 en 5.3. Resuspendeer gistcellen in 2 ml MES-buffer, pH 6 en giet het volume in een reagensreservoir.

6. Opzetten van de fluorescentiemetingen

NOTITIE: Het huidige scannen wordt geacht te zijn uitgevoerd in een microplaatlezer met fluorescentiemodus.

  1. Stel het instrument als volgt in voor basisinstellingen: Meettype: Fluorescentie-intensiteit (FI)-spectrum; Microplaatnaam: Greiner 96 F-bottom.
  2. Stel het instrument voor optische instellingen als volgt in: Nee. Aantal scanpunten voor golflengten: 91; Excitatie golflengte: 433 nm; Excitatie bandbreedte: 10 nm; Emissie golflengte: 460 - 550; Stap breedte: 1 nm; Emissie bandbreedte: 10 nm; Brandpuntsafstand verkregen door autofocus; Brandpuntsafstand: 5 mm; Golflengte gebruikt voor versterking: 490 nm.
  3. Stel het instrument voor algemene instellingen als volgt in: Rusttijd: 0,1 s; Leesrichting: unidirectioneel, horizontaal van links naar rechts, van boven naar beneden.
    NOTITIE: De handmatig ingevoerde versterking moet voor elke meting worden aangepast met behulp van de put die naar verwachting de hoogste fluorescentie-intensiteitsniveaus weergeeft tijdens de golflengtescan.

7. Bereiding van hypertone oplossingen en fluorescentiemetingen

  1. Bereid oplossingen van 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1 M, 1,5 M en 2 M NaCl in een zwarte plaat met 96 putjes en heldere bodem. Het uiteindelijke volume in elk putje is 200 μL (150 μL osmolytoplossing + 50 μL gistcelsuspensie).
    OPMERKING: Andere osmolyten kunnen worden gebruikt om hyperosmotische stress te induceren. Alle oplossingen moeten worden bereid in 50 mM MES-buffer pH 6.
  2. Laad 150 μL 50 mM MES-buffer, pH 6 in de eerste drie putjes van rij A (A1, A2, A3) en voeg in de volgende putjes 150 μL van de overeenkomstige oplossing toe in oplopende volgorde van links naar rechts (Figuur 2). Om alle voorgestelde concentraties te testen, gaat u verder met laden in rij B.
    OPMERKING: Deze instelling houdt rekening met de metingen van 3 technische replicaten voor elke concentratie.
  3. Gebruik een 12-kanaals micropipet om 50 μL gewassen gistcellen naar elk putje over te brengen. Gistcellen hebben de neiging om naar de bodem van het reservoir te bezinken. Zorg ervoor dat u de gistsuspensie grondig resuspendeert door op en neer te pipetteren voordat u de cellen overbrengt.
  4. Laad de cellen in de plaat met 96 putjes met de verschillende oplossingen en meng goed door minimaal 4x op en neer te pipetteren.
  5. Meet de emissiespectra van de fluorescentie-intensiteit onmiddellijk voor de gewenste putjes in een microplaatlezer met de specificatie-instellingen van stap 6. Herhaal de procedure voor elke IDR die in de FRET-test moet worden getest.
  6. Optionele stap. Meet indien beschikbaar een construct met alleen donoren (pDRFLIP38-mCerulean3) volgens de hier beschreven stappen.
    OPMERKING: We raden u aan deze stap uit te voeren om de FRET-efficiëntie van elke voorwaarde te berekenen. Als de lezer deze stap niet kan uitvoeren, kan FRET worden berekend met behulp van de FRET-ratiomethode. Beide methoden voor FRET-berekeningen worden toegelicht in stap 8 en 9.
  7. Voer ten minste drie replicaties uit op drie onafhankelijke dagen voor elke constructie.

8. Gegevensverwerking volgens de FRET-efficiëntiemethode

OPMERKING: Voor lezers met kennis van de programmeertaal R bieden we een set R-scripts om gegevensverwerking uit te voeren die in deze sectie wordt beschreven. Scripts zijn te vinden op https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Volg de instructies in het README-bestand.

  1. Exporteer gegevens als .xlsx bestanden van de microplaatlezer.
  2. Normaliseer de fluorescentie-intensiteitswaarden bij elke scangolflengte naar het isosbestische punt van het gebruikte FRET-paar.
    OPMERKING: Deze stap is nodig om de spectra van alle geteste omstandigheden te vergelijken. Het isosbestische punt van mCerulean3 en Citrien FRET paar is 515 nm. Verkrijg bijvoorbeeld de verhouding van fluorescentie-intensiteitswaarden van 460 nm/515 nm, 461 nm/515 nm, 462 nm/515 nm, enzovoort.
  3. Bereken het gemiddelde voor elke technische replicatie zodra de fluorescentiewaarden zijn genormaliseerd. In totaal zou er een kolom moeten zijn voor elke aandoening van hyperosmotische stress.
  4. Visualiseer alle spectra van de fluorescentie-intensiteit in dezelfde grafiek (figuur 3). Elk spectrum moet een combinatie van de fluorescentie-emissiespectra van individuele mCerulean3 en Citrien weergeven. In zeldzame gevallen, wanneer de FRET-efficiëntie 0 is, wordt alleen het donorfluorescentie-emissiespectrum waargenomen, of wanneer de FRET-efficiëntie 1 is, wordt alleen de acceptorfluorescentie waargenomen. De fluorescentie-emissiepiek voor mCerulean3 (donor) is 475 nm en de fluorescentie-emissiepiek voor Citrien (acceptor) is 525 nm.
  5. Bepaal of de fluorescentiemeting een typische FRET-verandering laat zien als reactie op hyperosmotische stress. Als de conformatie van de IDR gevoelig is voor de behandeling, zal dit tot uiting komen in een verandering in de FRET-efficiëntie. Een typische verandering in FRET-efficiëntie zal een afname van de fluorescentie-intensiteit van de donor koppelen aan een toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor of vice versa.
  6. Kwantificeer deFRET-efficiëntie (E FRET). Verkrijg de genormaliseerde piekwaarden van de donor (mCerulean3) (475 nm/515 nm) voor het IDR-construct en het donorconstruct voor elke toestand van hyperosmotische stress. Gebruik de gemiddelde genormaliseerde piekwaarden van de technische replicaten. Voer deze bewerking uit voor elk van de drie onafhankelijke replicaten. Bereken EFRET met de volgende formule:
    figure-protocol-1
    Waarbij IDA de verhouding 475 nm/515 nm is van het IDR-construct (FRET-paarconstruct), en ID de verhouding 475 nm/515 nm van het donorconstruct.
  7. Vergelijk FRET-efficiënties. Normaliseer de EFRET-waarden van elke hyperosmotische stressconditie naar de EFRET van de niet-stressconditie (bijvoorbeeld 0 M NaCl). Maak vergelijkingen met behulp van een boxplot of een vloeiende curveplot. Voer een eenrichtings-ANOVA uit, gevolgd door een post hoc Tukey-statistische test (p-waarden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

9. Gegevensverwerking volgens de FRET-ratiomethode

OPMERKING: Als er geen metingen met alleen donoren kunnen worden verkregen, voer dan de FRET-ratiomethode uit. Deze methode vergelijkt de FRET-ratio over de verschillende hyperosmotische stresscondities. Stappen 7.1 tot en met 7.5 moeten worden uitgevoerd vóór de stappen van deze sectie om een typisch FRET-gedrag te valideren. Voor lezers met kennis van de programmeertaal R bieden we een set R-scripts om gegevensverwerking uit te voeren die in deze sectie wordt beschreven. Scripts zijn te vinden op https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Volg de instructies in het README-bestand.

  1. Extraheer gegevens op 475 nm en 525 nm uit het xlsx-bestand dat eerder is geëxporteerd vanaf de microplaatlezer. Deze waarden komen overeen met de fluorescentie-emissiepiek voor mCerulean3 (donor, DxDm) en de fluorescentie-emissiepiek voor Citrien (acceptor, DxAm) wanneer de donorfluorofoor wordt geëxciteerd (433 nm).
  2. Normaliseer de fluorescentie-intensiteitswaarden bij 475 nm en 525 nm tot het isosbestische punt van het gebruikte FRET-paar. Het isosbestische punt van mCerulean3 en Citrien FRET paar is 515 nm. Verkrijg de FRET-ratio (DxAm/DxDm).
  3. Vergelijk FRET-ratio's. Normaliseer de DxAm/DxDm-waarden van elke hyperosmotische stressconditie naar de gemiddelde DxAm/DxDm van de niet-stressconditie (bijvoorbeeld 0 M NaCl). Maak vergelijkingen met behulp van een boxplot of een vloeiende curveplot (Figuur 4 en Figuur 5). Voer een eenrichtings-ANOVA uit, gevolgd door een post hoc Tukey-statistische test (p-waarden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na het transformeren van gistcellen met pDRFLIP38-AtLEA4-5 plasmide, werd de fluorescentie van de positieve transformanten waargenomen met een blauwlichttransilluminator en een filter (Figuur 1). Het voorbereiden van de verschillende oplossingen om hyperosmotische stress te induceren is tijdrovend, dus we raden aan om het 96-wells sjabloon van figuur 2 te volgen. Onmiddellijk na de hyperosmotische stressbehandeling met wisselende concentraties natriumchloride we...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier gepresenteerde methode biedt een manier om inzicht te krijgen in hoe de mondiale dimensies van het ensemble van IDR's omgevingsverstoringen waarnemen en erop reageren. Deze methode is gebaseerd op een genetisch gecodeerd construct en vereist geen extra componenten behalve een plasmidestabiele expressie in gistcellen, waardoor het aanpasbaar is voor mogelijke toepassingen in andere celtypen. Bovendien is het veelzijdig voor het onderzoeken van andere fysisch-chemische verstoringen die eukaryote cellen tijdens hun ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

We danken de leden van het Cuevas-Velazquez-lab voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) projectnummer IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), projectnummer 252952; en Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) en CAPD (CVU 1269643) erkennen CONAHCYT voor hun M.Sc. Scholarship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well plateGreiner Bio-One655096
AgarSigma-Aldrich5040
BglIINew England BioLabsR0144S
BJ5465 cellsAmerican Type Culture Collection208289
Buffer MES 50 mMSigma-AldrichM8250
Buffer Tris-HCl 10 mMInvitrogen15506017
EDTA 1 mMMerck108452
Falcon tubesCorning352057
LB mediaSigma-AldrichL2897
Lithium acetate 0.1 MSigma-AldrichL6883
Low Melt AgaroseGOLDBIOA-204-25
Microcentrifugeeppendorf5452000010
Miniprep kitZymoPureD4210
NaOH 0.02 MMerck106462
PEG 3,350 40%Sigma-Aldrich1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5addgene178189
Plate readerBMG LABTECHCLARIOstar Plus
SacINew England BioLabsR3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mLThermo Fisher Scientific15632011
SD-UraSigma-AldrichY1501
Sodium clorideSigma-AldrichS9888
Taq polymerasePromegaM5123
TransilluminatorAccuris instrumentsE4000
UV-Visible spectrofotometerThermo Fisher ScientificBiomate3
YPD mediaSigma-AldrichY1500

Referenties

  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229(2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911(2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309(2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438(2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823(2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Restriction enzyme digests. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  14. JoVE Science Education Database. Gel purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  15. JoVE Science Education Database. DNA ligation reactions. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  16. JoVE Science Education Database. Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  17. JoVE Science Education Database. PCR: Principle, instrumentation, and applications. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  18. JoVE Science Education Database. Plasmid purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  19. JoVE Science Education Database. DNA gel electrophoresis. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept. , Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023).
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005(2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

FRET-metingSaccharomyces cerevisiaefluorescentie-intensiteiteiwitconformatiemicroplaatlezerosmolytreactiestress in gistcellen
Schatting van structurele gevoeligheid van intrinsiek ongeordende regio's als reactie op hyperosmotische stress in levende cellen met behulp van FRET
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.