Schatting van structurele gevoeligheid van intrinsiek ongeordende regio's als reactie op hyperosmotische stress in levende cellen met behulp van FRET

Summary

Intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) zijn flexibele eiwitdomeinen die hun conformatie wijzigen als reactie op veranderingen in de omgeving. Ensemble fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) kan eiwitdimensies onder verschillende omstandigheden schatten. We presenteren een FRET-benadering om de structurele gevoeligheid van IDR te beoordelen in levende Saccharomyces cerevisiae-cellen onder hyperosmotische stress.

Abstract

Intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) zijn eiwitdomeinen die deelnemen aan cruciale cellulaire processen. Tijdens stressomstandigheden veranderen de fysisch-chemische eigenschappen van de cellulaire omgeving, wat een directe invloed heeft op het conformationele ensemble van IDR's. IDR's zijn inherent gevoelig voor verstoringen van het milieu. Het bestuderen van hoe de fysisch-chemische eigenschappen van de cel het conformationele ensemble van IDR's reguleren, is essentieel voor het begrijpen van de omgevingscontrole van hun functie. Hier beschrijven we een stap-voor-stap methode voor het meten van de structurele gevoeligheid van IDR's in levende Saccharomyces cerevisiae cellen als reactie op hyperosmotische stresscondities. We presenteren het gebruik van ensemble fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) om in te schatten hoe de globale dimensies van IDR's veranderen tijdens een progressieve toename van hyperosmotische stress die wordt opgelegd aan cellen met een osmolyt. Daarnaast bieden we een script voor het verwerken van fluorescentiemetingen en het vergelijken van structurele gevoeligheid voor verschillende IDR's. Door deze methode te volgen, kunnen onderzoekers waardevolle inzichten verkrijgen in de conformatieveranderingen die IDR's ondergaan in het complexe intracellulaire milieu bij veranderende omgevingen.

Introduction

Intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) zijn cruciale componenten in cellulaire processen¹. In combinatie met gestructureerde domeinen zijn IDR's essentieel voor eiwitfuncties. De aminozuursamenstelling van IDR's is vertekend en wordt voornamelijk weergegeven door geladen, hydrofiele en kleine residuen. Vanwege deze eigenschap worden IDR's beschouwd als domeinen met een lage complexiteit ^2,3. Talrijke IDR's hebben de aandacht getrokken, vooral omdat deze regio's een cruciale rol spelen bij pathologische aandoeningen, met name neurodegeneratieve ziekten. Dergelijke ziekten worden gekenmerkt door zelfassemblage en daaropvolgende extracellulaire of intracellulaire afzetting van IDR's in neuronen⁴. Voorbeelden van dergelijke IDR's zijn amyloïde-β (Aβ) bij de ziekte van Alzheimer, huntingtine (HTT) bij de ziekte van Huntington en TAR DNA-bindend eiwit-43 (TDP-43) en gefuseerd bij sarcoom (FUS) bij amyotrofische laterale sclerose en frontotemporale dementie⁴. De studie van de structurele herschikkingen van IDR's in de context van ziekte is aanzienlijk verbeterd door spectroscopische methoden, waaronder fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET).

De hydrofiele en uitgebreide aard van IDR's maakt ze uiterst gevoelig voor veranderingen in de fysisch-chemische eigenschappen van de oplossingsomgeving⁵. De mate waarin het conformationele ensemble van IDR's wordt gewijzigd door de omgeving wordt structurele gevoeligheid genoemd ^5,6,7. Er kunnen verschillende technieken worden gebruikt om de conformatie en dynamiek van IDR's te bestuderen, waaronder circulair dichroïsme (CD) en röntgenverstrooiing onder kleine hoek (SAXS)^8,9. Helaas hebben CD en SAXS grote hoeveelheden gezuiverde eiwitten nodig, dus ze zijn niet geschikt voor studies in cellen. FRET daarentegen is een techniek die de fluorescentie-intensiteit meet van twee fluorescerende moleculen die specifiek één IDR labelen, wat betekent dat ze kunnen worden gecontroleerd in complexe mengsels zoals levende cellen¹⁰. Het dynamisch meten van de structurele gevoeligheid van IDR's in levende cellen is noodzakelijk om te begrijpen hoe de omgeving de conformatie en functie van het ongeordende proteoom reguleert.

FRET is een krachtige methode voor het kwantificeren van de structurele gevoeligheid van IDR's, evenals bolvormige en multidomeineiwitten in levende cellen. De methode vereist een construct dat bestaat uit een IDR van belang ingeklemd tussen twee fluorescerende eiwitten (FP), bekend als een FRET-paar. Voor dit protocol stellen we het gebruik van mCerulean3 voor als de donor-FP en Citrien als de acceptor-FP, vanwege hun grote dynamische bereik, in vergelijking met andere FP's gerapporteerd in een eerdere studie over IDR-gevoeligheid⁶. FRET is eerder gebruikt om de structurele gevoeligheid van een planten-IDR in verschillende cellulaire contexten te meten⁶. Bovendien is deze techniek gebruikt om de totale eiwitdimensies van IDR's te karakteriseren door verschillende onderzoeksgroepen, zowel in vitro als in vivo ^5,11.

Hier beschrijven we de ensemble FRET-methode voor het bestuderen van de structurele gevoeligheid van IDR's in levende gistcellen (Saccharomyces cerevisiae). We laten representatieve resultaten zien die zijn gebaseerd op een fabrieks-IDR genaamd AtLEA4-5. AtLEA4-5 is ongeordend in oplossing, maar vouwt zich in α-helix wanneer macromoleculaire verdringing in vitro wordt geïnduceerd ¹². AtLEA4-5 is een goed referentiemodel voor deze methode omdat het relatief klein is (158 residuen), ongeordend en gevoelig voor verstoring van het milieu, zoals gerapporteerd in silico en in vitro ^6,12. De hier gepresenteerde methode kan worden geschaald voor benaderingen met een hoge doorvoer, omdat gistcellen gemakkelijk te kweken zijn en de behandeling in kleine volumes wordt toegepast. Bovendien kunnen kleine aanpassingen aan het protocol worden toegepast op andere cellulaire systemen zoals bacteriën en plantencellen⁶. Het protocol kan worden uitgevoerd in elk moleculair biologisch laboratorium met toegang tot een microplaatlezer met fluorescentiemodus, een apparatuur die beschikbaar is in de meeste onderzoeksinstellingen.

Protocol

1. Plasmide construct

1. Amplificeer het open leesframe (ORF) dat codeert voor de gewenste IDR door polymerasekettingreactie (PCR). Voeg het stopcodon niet toe, aangezien de ORF wordt geflankeerd door de genen die coderen voor de fluorescerende eiwitten. Ontwerp voor de versterking primers met de SacI (5') en BglII (3') restrictieplaatsen.
   OPMERKING: Voor het gedeelte met representatieve resultaten hebben we AtLEA4-5 gebruikt als de geselecteerde IDR. We hebben de ORF van AtLEA4-5 versterkt uit het pTrc99A-AtLEA4-5 plasmide¹².
2. Verbeter het ORF PCR-product door opeenvolgende restrictie met SacI- en BglII-enzymen¹³.
3. Verkrijg het commerciële plasmide pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) van Addgene (https://www.addgene.org/178189/).
4. Voer een opeenvolgende restrictie uit met behulp van SacI- en BglII-enzymen om het AtLEA4-5 ORF uit het pDRFLIP38-AtLEA4-5-plasmide te verwijderen, waardoor een open plasmide overblijft dat het FRET-paar¹³ bevat.
5. Zuiver de verteerde DNA-fragmenten met behulp van gelherstel uit een agarosegelelektroforese¹⁴. Ligate de beperkte fragmenten met behulp van DNA-ligase¹⁵.
6. Transformeer de kloonreactie in competente Escherichia coli-cellen (DH5α of verwante stammen) en selecteer in Luria-Bertani (LB) platen die 50 μg/ml ampicilline¹⁶ bevatten. 's Nachts (AAN) kweken bij 37 °C.
7. Isoleer en kweek ten minste vijf getransformeerde kolonies in een nieuwe plaat en genotype door PCR¹⁷. Zuiver het plasmide-DNA van een positief getransformeerde kolonie met behulp van standaard miniprep-methoden¹⁸.
8. Controleer de extractie en integriteit van het plasmide-DNA met behulp van agarosegelelektroforese¹⁹. Controleer de juiste klonering van het construct met behulp van Sanger-sequencing²⁰.

2. Plasmide-expressie in gistcellen

OPMERKING: Gebruik standaard aseptische technieken om de volgende stappen uit te voeren. Gebruik een afzuigkap met laminaire stroming of een aansteker.

1. Inoculeer een streep S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) zeef in 3 ml gistpepton dextrose (YPD) medium en kweek ON bij 30 °C en 200 rpm.
   OPMERKING: BJ5465 is een protease-deficiënte (CH1) stam die wordt aanbevolen voor het werken met IDR's. Andere S. cerevisiae-stammen kunnen worden getest en gebruikt.
2. Centrifugeer 1 ml van de 's nachts verzadigde (OD₆₀₀ ~ 3-4) gistcultuur bij 14.000 x g gedurende 1 minuut. Verwijder het supernatans voorzichtig door te pipetteren.
3. Resuspendeer de pellet in 1 ml Tris-EDTA (TE)-buffer (pH 7,5) door zachtjes op het buisje te tikken. Centrifugeer op 14.000 x g gedurende 1 minuut en verwijder voorzichtig het supernatant.
4. Resuspendeer de pellet in 500 μL Lazy Bones-buffer (40% w/v PEG 3.350; 100 mM lithiumacetaat; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7,5) door te pipetteren. Voeg 25 μL gekookt (100 °C gedurende 5 min, gevolgd door afkoelen op ijs gedurende 5 min) zalmsperma-DNA (2 mg/ml) toe aan de geresuspendeerde gistcellen.
5. Voeg 100 ng van het plasmide-DNA toe aan het mengsel en draai het mengsel gedurende 1 minuut om een grondige menging te garanderen. Laat het mengsel 1-2 uur op kamertemperatuur staan.
6. Verwarm het gistmengsel gedurende 12 minuten op 42 °C en laat het vervolgens nog eens 12 minuten afkoelen op ijs. Centrifugeer de buis gedurende 1 minuut bij 14 000 x g en verwijder voorzichtig het supernatant.
7. Resuspendeer de pellet in 1 ml TE-buffer (pH 7,5). Plaat 100 μL van de getransformeerde cellen op Yeast Synthetic-Dropout Medium zonder uracil (SD-ura) platen aangevuld met 15 g/L agar.
8. Incubeer de platen gedurende 2-3 dagen bij 30 °C (figuur 1). Streep ten minste vijf gisttransformatoren in een nieuwe plaat en groei ON.

3. Validatie van gisttransformatoren

1. Kies een klein deel van elke kandidaat-transformant door voorzichtig te schrapen en te resuspenderen in 5 μL 20 mM NaOH in individuele PCR-buisjes.
2. Verwarm het monster gedurende 10 minuten bij 99 °C in een thermische cycler om de cellen te lyseren en het DNA in de oplossing vrij te geven. Deze stap is cruciaal voor het voorbereiden van het DNA-sjabloon voor PCR.
3. Breng 1 μl van het gekookte monster over in een afzonderlijk PCR-reactiemengsel met de juiste primers en PCR-reagentia voor genotypering. We hebben de volgende primers gebruikt: Forward primer: 5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'. Omgekeerde primer: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.
4. Stel een PCR-reactie in en valideer de aanwezigheid van het juiste plasmide met behulp van agarosegelelektroforese. Selecteer een transformator voor verdere experimenten.

4. Bereiding van gistcelkweek voor FRET-assay

1. Inoculeer een streep van de geselecteerde gisttransformant in 3 ml vloeibaar 1x SD-Ura-medium.
   NOTITIE: Voer deze procedure uit in een laminaire stroomkap en steriel materiaal.
2. Groei bij 30 °C, 200 rpm gedurende ten minste 12 uur om verzadiging te bereiken. Meet de OD₆₀₀. De groei zou tussen OD₆₀₀ = 1,0-2,0 moeten liggen.
   OPMERKING: Als OD₆₀₀ lager is dan 1,0, geef cellen dan meer incubatietijd om te groeien. Als OD₆₀₀ hoger is dan 2.0, ga dan niet verder en herstart vanaf stap 4.1.

5. Gistcelbereiding voor FRET-assay

1. Verzamel 2 ml van de gistcultuur die 's nachts is verwerkt en centrifugeer bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatans voorzichtig door te pipetteren.
2. Resuspendeer de pellet in 1 ml 50 mM 2-(N-Morpholino) ethaansulfonzuur (MES)-buffer (pH 6).
3. Centrifugeer op 14.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
4. Herhaal stap 5.2 en 5.3. Resuspendeer gistcellen in 2 ml MES-buffer, pH 6 en giet het volume in een reagensreservoir.

6. Opzetten van de fluorescentiemetingen

NOTITIE: Het huidige scannen wordt geacht te zijn uitgevoerd in een microplaatlezer met fluorescentiemodus.

1. Stel het instrument als volgt in voor basisinstellingen: Meettype: Fluorescentie-intensiteit (FI)-spectrum; Microplaatnaam: Greiner 96 F-bottom.
2. Stel het instrument voor optische instellingen als volgt in: Nee. Aantal scanpunten voor golflengten: 91; Excitatie golflengte: 433 nm; Excitatie bandbreedte: 10 nm; Emissie golflengte: 460 - 550; Stap breedte: 1 nm; Emissie bandbreedte: 10 nm; Brandpuntsafstand verkregen door autofocus; Brandpuntsafstand: 5 mm; Golflengte gebruikt voor versterking: 490 nm.
3. Stel het instrument voor algemene instellingen als volgt in: Rusttijd: 0,1 s; Leesrichting: unidirectioneel, horizontaal van links naar rechts, van boven naar beneden.
   NOTITIE: De handmatig ingevoerde versterking moet voor elke meting worden aangepast met behulp van de put die naar verwachting de hoogste fluorescentie-intensiteitsniveaus weergeeft tijdens de golflengtescan.

7. Bereiding van hypertone oplossingen en fluorescentiemetingen

1. Bereid oplossingen van 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1 M, 1,5 M en 2 M NaCl in een zwarte plaat met 96 putjes en heldere bodem. Het uiteindelijke volume in elk putje is 200 μL (150 μL osmolytoplossing + 50 μL gistcelsuspensie).
   OPMERKING: Andere osmolyten kunnen worden gebruikt om hyperosmotische stress te induceren. Alle oplossingen moeten worden bereid in 50 mM MES-buffer pH 6.
2. Laad 150 μL 50 mM MES-buffer, pH 6 in de eerste drie putjes van rij A (A1, A2, A3) en voeg in de volgende putjes 150 μL van de overeenkomstige oplossing toe in oplopende volgorde van links naar rechts (Figuur 2). Om alle voorgestelde concentraties te testen, gaat u verder met laden in rij B.
   OPMERKING: Deze instelling houdt rekening met de metingen van 3 technische replicaten voor elke concentratie.
3. Gebruik een 12-kanaals micropipet om 50 μL gewassen gistcellen naar elk putje over te brengen. Gistcellen hebben de neiging om naar de bodem van het reservoir te bezinken. Zorg ervoor dat u de gistsuspensie grondig resuspendeert door op en neer te pipetteren voordat u de cellen overbrengt.
4. Laad de cellen in de plaat met 96 putjes met de verschillende oplossingen en meng goed door minimaal 4x op en neer te pipetteren.
5. Meet de emissiespectra van de fluorescentie-intensiteit onmiddellijk voor de gewenste putjes in een microplaatlezer met de specificatie-instellingen van stap 6. Herhaal de procedure voor elke IDR die in de FRET-test moet worden getest.
6. Optionele stap. Meet indien beschikbaar een construct met alleen donoren (pDRFLIP38-mCerulean3) volgens de hier beschreven stappen.
   OPMERKING: We raden u aan deze stap uit te voeren om de FRET-efficiëntie van elke voorwaarde te berekenen. Als de lezer deze stap niet kan uitvoeren, kan FRET worden berekend met behulp van de FRET-ratiomethode. Beide methoden voor FRET-berekeningen worden toegelicht in stap 8 en 9.
7. Voer ten minste drie replicaties uit op drie onafhankelijke dagen voor elke constructie.

8. Gegevensverwerking volgens de FRET-efficiëntiemethode

OPMERKING: Voor lezers met kennis van de programmeertaal R bieden we een set R-scripts om gegevensverwerking uit te voeren die in deze sectie wordt beschreven. Scripts zijn te vinden op https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Volg de instructies in het README-bestand.

1. Exporteer gegevens als .xlsx bestanden van de microplaatlezer.
2. Normaliseer de fluorescentie-intensiteitswaarden bij elke scangolflengte naar het isosbestische punt van het gebruikte FRET-paar.
   OPMERKING: Deze stap is nodig om de spectra van alle geteste omstandigheden te vergelijken. Het isosbestische punt van mCerulean3 en Citrien FRET paar is 515 nm. Verkrijg bijvoorbeeld de verhouding van fluorescentie-intensiteitswaarden van 460 nm/515 nm, 461 nm/515 nm, 462 nm/515 nm, enzovoort.
3. Bereken het gemiddelde voor elke technische replicatie zodra de fluorescentiewaarden zijn genormaliseerd. In totaal zou er een kolom moeten zijn voor elke aandoening van hyperosmotische stress.
4. Visualiseer alle spectra van de fluorescentie-intensiteit in dezelfde grafiek (figuur 3). Elk spectrum moet een combinatie van de fluorescentie-emissiespectra van individuele mCerulean3 en Citrien weergeven. In zeldzame gevallen, wanneer de FRET-efficiëntie 0 is, wordt alleen het donorfluorescentie-emissiespectrum waargenomen, of wanneer de FRET-efficiëntie 1 is, wordt alleen de acceptorfluorescentie waargenomen. De fluorescentie-emissiepiek voor mCerulean3 (donor) is 475 nm en de fluorescentie-emissiepiek voor Citrien (acceptor) is 525 nm.
5. Bepaal of de fluorescentiemeting een typische FRET-verandering laat zien als reactie op hyperosmotische stress. Als de conformatie van de IDR gevoelig is voor de behandeling, zal dit tot uiting komen in een verandering in de FRET-efficiëntie. Een typische verandering in FRET-efficiëntie zal een afname van de fluorescentie-intensiteit van de donor koppelen aan een toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor of vice versa.
6. Kwantificeer de_{FRET-efficiëntie (E FRET).} Verkrijg de genormaliseerde piekwaarden van de donor (mCerulean3) (475 nm/515 nm) voor het IDR-construct en het donorconstruct voor elke toestand van hyperosmotische stress. Gebruik de gemiddelde genormaliseerde piekwaarden van de technische replicaten. Voer deze bewerking uit voor elk van de drie onafhankelijke replicaten. Bereken E_FRET met de volgende formule:
   
   Waarbij I_DA de verhouding 475 nm/515 nm is van het IDR-construct (FRET-paarconstruct), en I_D de verhouding 475 nm/515 nm van het donorconstruct.
7. Vergelijk FRET-efficiënties. Normaliseer de E_FRET-waarden van elke hyperosmotische stressconditie naar de E_FRET van de niet-stressconditie (bijvoorbeeld 0 M NaCl). Maak vergelijkingen met behulp van een boxplot of een vloeiende curveplot. Voer een eenrichtings-ANOVA uit, gevolgd door een post hoc Tukey-statistische test (p-waarden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

9. Gegevensverwerking volgens de FRET-ratiomethode

OPMERKING: Als er geen metingen met alleen donoren kunnen worden verkregen, voer dan de FRET-ratiomethode uit. Deze methode vergelijkt de FRET-ratio over de verschillende hyperosmotische stresscondities. Stappen 7.1 tot en met 7.5 moeten worden uitgevoerd vóór de stappen van deze sectie om een typisch FRET-gedrag te valideren. Voor lezers met kennis van de programmeertaal R bieden we een set R-scripts om gegevensverwerking uit te voeren die in deze sectie wordt beschreven. Scripts zijn te vinden op https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Volg de instructies in het README-bestand.

1. Extraheer gegevens op 475 nm en 525 nm uit het xlsx-bestand dat eerder is geëxporteerd vanaf de microplaatlezer. Deze waarden komen overeen met de fluorescentie-emissiepiek voor mCerulean3 (donor, DxDm) en de fluorescentie-emissiepiek voor Citrien (acceptor, DxAm) wanneer de donorfluorofoor wordt geëxciteerd (433 nm).
2. Normaliseer de fluorescentie-intensiteitswaarden bij 475 nm en 525 nm tot het isosbestische punt van het gebruikte FRET-paar. Het isosbestische punt van mCerulean3 en Citrien FRET paar is 515 nm. Verkrijg de FRET-ratio (DxAm/DxDm).
3. Vergelijk FRET-ratio's. Normaliseer de DxAm/DxDm-waarden van elke hyperosmotische stressconditie naar de gemiddelde DxAm/DxDm van de niet-stressconditie (bijvoorbeeld 0 M NaCl). Maak vergelijkingen met behulp van een boxplot of een vloeiende curveplot (Figuur 4 en Figuur 5). Voer een eenrichtings-ANOVA uit, gevolgd door een post hoc Tukey-statistische test (p-waarden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Results

Na het transformeren van gistcellen met pDRFLIP38-AtLEA4-5 plasmide, werd de fluorescentie van de positieve transformanten waargenomen met een blauwlichttransilluminator en een filter (Figuur 1). Het voorbereiden van de verschillende oplossingen om hyperosmotische stress te induceren is tijdrovend, dus we raden aan om het 96-wells sjabloon van figuur 2 te volgen. Onmiddellijk na de hyperosmotische stressbehandeling met wisselende concentraties natriumchloride werden de fluorescentie-emissiespectra verkregen (figuur 3). De fluorescentie-emissiespectra van elke conditie werden verkregen om een typisch FRET-veranderingsgedrag te valideren. Normalisatie van de fluorescentie-intensiteitswaarden tot het isosbestische punt is vereist om experimentele fouten te corrigeren. Voor deze representatieve resultaten hebben we het eerder gerapporteerde AtLEA4-5 getest, een zeer gevoelige IDR⁶ van een plant. Ter referentie hebben we ook het licht ongevoelige ABP-bolvormige eiwit getest (Figuur 3). Er kan worden waargenomen dat beide constructen een combinatie vertonen van mCerulean3- en Citrienemissiespectra (pieken voor de donor- en acceptor-FP's), wat wijst op een zekere mate van basale FRET-efficiëntie onder standaardomstandigheden (0 M NaCl). Voor AtLEA4-5 veroorzaakte hyperosmotische stress een toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor in combinatie met een afname van de fluorescentie-intensiteit van de donor, wat wijst op hyperosmotische stress-geïnduceerde verdichting van de IDR (figuur 3A). Deze trend werd niet waargenomen in ABP (figuur 3B). Om verschillen in structurele gevoeligheid tussen de verschillende hyperosmotische stressbehandelingen te kwantificeren, hebben we de FRET-ratio (DxAm/DxDm) voor elke aandoening uitgezet en een One-way ANOVA statistische test uitgevoerd (Figuur 4). Tot slot hebben we de structurele sensitiviteit van AtLE4-5 en ABP vergeleken. We zagen dat AtLEA4-5 een significant hogere gevoeligheid vertoonde dan ABP (Figuur 5).

Figuur 1: Fluorescentie-emissie van S. cerevisiae-transformatoren . SD-ura petrischaal verguld met S. cerevisiae getransformeerd met het pDRFLIP38-AtLEA4-5 plasmide. Fluorescentie werd waargenomen met behulp van een blauwlichttransilluminator en een oranje filter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Een plaatsjabloon met 96 putjes voor het FRET-systeem. Voor elke hyperosmotische stresstoestand worden drie technische replicaten in opeenvolgende putjes geplaatst. De eerste twee rijen (A en B) voldoen aan acht voorwaarden voor één construct (IDR1). De volgende rijen zijn geschikt voor nieuwe constructies (IDR2, IDR3, enz.). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Genormaliseerde fluorescentie-emissiespectra onder verschillende hyperosmotische stressomstandigheden. Spectra valideerde een typisch FRET-gedrag als reactie op de behandeling van hyperosmotische stress (NaCl). (A) AtLEA4-5, een zeer gevoelige IDR. De toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor gaat gepaard met de afname van de fluorescentie-intensiteit van de donor. (B) ABP, een enigszins ongevoelig bolvormig eiwit. Pieken worden waargenomen bij 475 nm en 525 nm volgens het FRET-paar mCerulean3 en Citrien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Kwantificering van structurele gevoeligheid bij verschillende hyperosmotische stresscondities. Genormaliseerde FRET-ratio (DxAm/DxDm) van levende gistcellen behandeld met verschillende concentraties NaCl. (A) AtLEA4-5. (B) Arabinose-bindend eiwit (ABP). n = 9 onafhankelijke metingen. Enkele reis ANOVA. NS: Niet significant. p-waarden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Vakken vertegenwoordigen het 25e-75e percentiel (lijn bij de mediaan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Vergelijking van de structurele gevoeligheid van AtLEA4-5 en ABP. (A) Genormaliseerde FRET-ratio (DxAm/DxDm) onder verschillende hyperosmotische stresscondities voor AtLEA4-5 en ABP. n = 3 onafhankelijke metingen. (B) Delta FRET-waarde (1,5 M - 0 M NaCl) voor AtLEA4-5 en ABP. Verandering wordt gerapporteerd als de structurele gevoeligheid van de constructen gemeten in het FRET-systeem bij 1,5 M NaCl. n = 3 onafhankelijke metingen. Gemiddelde ± SD. Tweerichtings-ANOVA met de volgende p-waarden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De hier gepresenteerde methode biedt een manier om inzicht te krijgen in hoe de mondiale dimensies van het ensemble van IDR's omgevingsverstoringen waarnemen en erop reageren. Deze methode is gebaseerd op een genetisch gecodeerd construct en vereist geen extra componenten behalve een plasmidestabiele expressie in gistcellen, waardoor het aanpasbaar is voor mogelijke toepassingen in andere celtypen. Bovendien is het veelzijdig voor het onderzoeken van andere fysisch-chemische verstoringen die eukaryote cellen tijdens hun levenscyclus^ervaren21. De resolutie van FRET is opmerkelijk, waarbij de energieoverdracht alleen plaatsvindt binnen een nabijheid van minder dan 10 nm tussen de FP's van de donor en de acceptor. De belangrijkste beperking is echter het ontbreken van precieze structurele informatie die niet kan worden verkregen met behulp van de ensemble FRET-methode.

De inherente heterogeniteit en flexibiliteit van IDR's vormen een uitdaging bij het bestuderen van hun ensemble in een cellulaire context, waardoor technieken zoals röntgenkristallografie onpraktisch zijn. NMR is overwogen voor het bestuderen van ongeordende eiwitten in cellen, maar veranderende omstandigheden kunnen een probleem zijn vanwege signaalinterferentie²². Het implementeren van de FRET-techniek voor het bestuderen van IDR-conformationele ensembles biedt unieke mogelijkheden, waardoor de populatieverdeling binnen levende cellen in kaart kan worden gebracht. Bovendien kan het worden aangevuld met in-vitromethoden zoals FRET met één molecuul (smFRET), waarmee het aanpassingsvermogen aan verschillende benaderingen en^{experimentele omstandigheden wordt} aangetoond. Dit protocol maakt gebruik van mCerulean3 als donor-FP en Citrien als acceptor-FP, wat een eenvoudig en gemakkelijk te volgen systeem biedt. Bij het selecteren van FRET-paren moet zorgvuldig rekening worden gehouden met spectrale overlap om de overspraak tussen signalen te verminderen^24,25. Bij het rapporteren van veranderingen in structurele gevoeligheid met behulp van deze methode is het kiezen van een geschikte FRET-metriek, zoals_{FRET-efficiëntie (E FRET),} cruciaal voor een betrouwbare signaalinterpretatie. Als alternatief kan de structurele gevoeligheid worden geanalyseerd en vergeleken met behulp van de FRET-ratio (DxAm/DxDm), maar dit vereist een zorgvuldige correctie voor donor-acceptor fluorescentie-overspraak²⁵. De interpretatie van fluorescentiegegevens verkregen van microplaatlezers kan worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder de eigenschappen van de fluoroforen, dipooloriëntatie, intermoleculaire-FRET- versus intramoleculaire-FRET-systemen, monstervoorbereiding en gegevensanalyse²⁵.

Intermoleculair-FRET is een belangrijke beperking van de ensemble-FRET-methode, omdat het niet mogelijk is om deze weg te laten uit de eerste analyse van de gegevens. Dit is een belangrijke overweging voor de lezer, omdat van sommige IDR's bekend is dat ze rekruteren in biomoleculaire condensaten^26,27. De lokale concentratie van macromoleculen in biomoleculaire condensaten is hoog, wat intermoleculaire interacties kan induceren en dus de FRET-uitlezing kan beïnvloeden. Voor AtLEA4-5 werd aangetoond dat het zichzelf assembleert tot discrete puntvormige structuren bij hyperosmotische stress in gistcellen⁶. Om het effect van intermoleculair-FRET uit te sluiten, incubeerden de auteurs de cellen met 1,6-hexaandiol (1,6-HD), een molecuul dat biomoleculaire condensaten verstoort. Behandeling met 1,6-HD loste de AtLEA4-5-condensaten op, maar de FRET-niveaus werden niet verlaagd, wat aangeeft dat eiwitcondensatie geen ongewenste intermoleculaire FRET veroorzaakt. Omdat dit effect van elke IDR afhangt, moeten lezers aanvullende benaderingen uitvoeren, zoals het fotobleken van acceptoren of co-expressie van constructies die alleen donor en alleen acceptor zijn⁶. Toch is de informatie die is verkregen uit ensemble FRET in levende cellen van groot belang om de structurele gevoeligheid van IDR's te karakteriseren.

Een ingewikkeld aspect van het hier gepresenteerde protocol is dat het gebruik maakt van een organisme dat responsief gedrag vertoont voor hyperosmotische stress. In aanwezigheid van hoge externe concentraties natriumchloride verlaat water de cel, waardoor de totale eiwitconcentratie toeneemt en een drukke omgeving ontstaat²⁸. IDR's zijn gevoelig voor veranderingen in macromoleculaire crowding 5,6,11,12. In het bijzonder was AtLEA4-5, het eiwit dat in dit protocol als model werd gebruikt, gevoelig voor verschillende molecuulgewichtverstuivers, maar niet voor hoge concentraties zouten of glycerol in vitro⁶. Aangezien de accumulatie van glycerol belangrijk is voor de respons en acclimatisatie van gistcellen op hyperosmotische stress²⁹, is het relevant om te benadrukken dat de belangrijkste bijdrage aan AtLEA4-5-verdichting macromoleculaire verdringing is tijdens vroege gebeurtenissen van osmo-detectie. Hoe de structuur van AtLEA4-5 verandert tijdens de volgende stadia van acclimatisatie, wanneer glycerol zich ophoopt, vereist verder onderzoek.

Het onderzoeken van conformationele dynamiek in ongeordende eiwitten omvat een verscheidenheid aan technieken. In deze context is FRET een cruciale methode. Afhankelijk van de specifieke onderzoeksvragen en kenmerken die worden overwogen, kunnen onderzoekers in vivo NMR-spectroscopie gebruiken om IDR's³⁰ te karakteriseren. Bovendien is smFRET een waardevol hulpmiddel voor in vivo studies²³. Elektronenparamagnetische resonantie (EPR) spectroscopie is een andere techniek die wordt gebruikt om IDR's kwantitatief te bestuderen in een cellulaire context³¹. Op massaspectrometrie gebaseerde methoden zijn ook krachtige benaderingen, omdat ze structurele informatie kunnen verschaffen over de cellulaire conformatie van eiwitten³². Deze methoden omvatten native massaspectrometrie (native-MS) en ion-mobility mass spectrometry (IM-MS)^32,33. Al deze methoden stellen onderzoekers in staat om zich te verdiepen in de meervoudige conformaties van een IDR en de dynamiek ervan, en licht te werpen op hun bijdragen aan de celbiologie. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven, kan worden gebruikt om een eerste screening van structurele gevoeligheid uit te voeren op een manier met een hoge doorvoer. Vervolgstudies kunnen zich richten op het testen van de structurele gevoeligheid in een gewenst celtype of met het potentieel om mechanistisch inzicht te verkrijgen door middel van in vitro methoden zoals smFRET, CD of SAXS. De combinatie van methoden is nodig om een duidelijk beeld te krijgen van de structurele gevoeligheid van IDR in de veranderende omgeving van cellen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500