Method Article

Vergelijkende studie van basaalmembraanmatrices voor het onderhoud van menselijke stamcellen en het genereren van darmorganoïden

DOI:

10.3791/66277

⸱

March 15th, 2024

 ,  ,  , 
1Center for Pharmacometrics & Systems Pharmacology, Department of Pharmaceutics, University of Florida, 2TheWell Bioscience, Inc

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïden zijn waardevolle hulpmiddelen geworden voor het modelleren van ziekten. De extracellulaire matrix (ECM) stuurt het lot van cellen tijdens het genereren van organoïden, en het gebruik van een systeem dat lijkt op het natuurlijke weefsel kan de nauwkeurigheid van het model verbeteren. Deze studie vergelijkt de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide menselijke darmorganoïden in dierlijk ECM en xeno-vrije hydrogels.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire matrix (ECM) speelt een cruciale rol in het gedrag en de ontwikkeling van cellen. Organoïden gegenereerd uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) staan in de schijnwerpers van veel onderzoeksgebieden. Het gebrek aan fysiologische signalen in klassieke celkweekmaterialen belemmert echter een efficiënte iPSC-differentiatie. Het opnemen van in de handel verkrijgbare ECM in stamcelcultuur biedt fysische en chemische aanwijzingen die gunstig zijn voor celonderhoud. In de handel verkrijgbare basale membraanproducten van dierlijke oorsprong zijn samengesteld uit ECM-eiwitten en groeifactoren die het celonderhoud ondersteunen. Omdat de ECM weefselspecifieke eigenschappen heeft die het lot van cellen kunnen moduleren, worden xenovrije matrices gebruikt om de vertaling naar klinische studies te stroomlijnen. Hoewel in de handel verkrijgbare matrices veel worden gebruikt in hiPSC- en organoïdewerk, is de equivalentie van deze matrices nog niet geëvalueerd. Hier werd een vergelijkende studie uitgevoerd van hiPSC-onderhoud en de aanmaak van menselijke darmorganoïden (hIO) in vier verschillende matrices: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) en VitroGel (Matrix 4-XF). Hoewel de kolonies geen perfect ronde vorm hadden, was er minimale spontane differentiatie, waarbij meer dan 85% van de cellen de stamcelmarker SSEA-4 tot expressie bracht. Matrix 4-XF leidde tot de vorming van 3D ronde klonten. Ook verbeterde het verhogen van de concentratie van supplementen en groeifactoren in de media die werden gebruikt om de Matrix 4-XF-hydrogeloplossing te maken, de hiPSC-expressie van SSEA-4 met een factor 1,3. Differentiatie van Matrix 2-AB-onderhouden hiPSC leidde tot minder sferoïde releases tijdens het midden-/achterdarmstadium in vergelijking met de andere van dieren afkomstige basale membranen. In vergelijking met andere leidt de xenovrije organoïdematrix (Matrix 4-O3) tot grotere en rijpere hIO, wat suggereert dat de fysische eigenschappen van xenovrije hydrogels kunnen worden benut om de vorming van organoïden te optimaliseren. Al met al suggereren de resultaten dat variaties in de samenstelling van verschillende matrices de stadia van IO-differentiatie beïnvloeden. Deze studie vergroot het bewustzijn over de verschillen in commercieel verkrijgbare matrices en biedt een leidraad voor matrixoptimalisatie tijdens iPSC- en IO-werk.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamisch en multifunctioneel onderdeel van weefsels dat een centrale rol speelt bij het reguleren van het gedrag en de ontwikkeling van cellen. Als een complex netwerk biedt het structurele ondersteuning, celadhesieve liganden1 en opslag van groeifactoren en cytokinen die de celsignalering reguleren. Tijdens wondgenezing dient de ECM bijvoorbeeld als een steiger voor migrerende cellen en als een reservoir van groeifactoren die betrokken zijn bij weefselherstel2. Evenzo kan ontregeling in de ECM leiden tot een toename van de ernst van verschillende ziekten zoals fibrose en kanker 3,4. Tijdens de embryonale ontwikkeling begeleidt de ECM de weefselmorfogenese. Bij de ontwikkeling van het hart spelen ECM-componenten bijvoorbeeld een rol bij het creëren van de juiste architectuur en functie van het hartweefsel5. Meer dan tien jaar onderzoek heeft aangetoond dat de stijfheid van de micro-omgevingalleen al 6,7 de specificatie van de stamcelafstamming kan beheersen. Het is dan ook niet verwonderlijk dat ECM tijdens in vitro celdifferentiatie het lot van stamcellen beïnvloedt door signalen voor differentiatie te geven.

Organoïden kunnen worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Beginnen met een goed gekarakteriseerde iPSC-lijn is nodig om met succes organoïden te genereren. Het gebrek aan fysiologische signalen in klassieke celkweekmaterialen belemmert echter efficiënte iPSC-differentiatie en organoïdegeneratie. Bovendien heeft recent onderzoek het belang benadrukt van de samenstelling van de extracellulaire matrix (ECM), interacties tussen cellen en de ECM8, evenals mechanische en geometrische signalen 9,10,11 in de context van organoïde expansie en differentiatie12. Het bevorderen van organoïdetechnologie door het verbeteren van de reproduceerbaarheid omvat het opnemen van weefselspecifieke fysische en chemische signalen.

Organoïden zijn bedoeld om het natuurlijke weefsel samen te vatten binnen een fysiologisch vergelijkbare micro-omgeving. Het kiezen van een ECM-systeem dat de ECM van het natuurlijke weefsel nauw nabootst, is cruciaal voor het bereiken van fysiologische relevantie met betrekking tot celgedrag, functie en reactie op stimuli13. De keuze van ECM-componenten kan van invloed zijn op de differentiatie van stamcellen tot specifieke celtypen binnen de organoïde. Verschillende ECM-eiwitten en hun combinaties kunnen aanwijzingen geven die het lot van de cel sturen14. Studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat het gebruik van specifieke ECM-componenten de differentiatie van darmstamcellen tot volwassen darmceltypen kan bevorderen, wat resulteert in fysiologisch relevante darmorganoïden15. Hoewel organoïden een waardevol hulpmiddel zijn tijdens het modelleren van ziekten en het testen van geneesmiddelen, is het selecteren van een geschikt ECM-systeem van cruciaal belang voor deze toepassing. Een geschikt ECM-systeem kan de nauwkeurigheid van ziektemodellering verbeteren door een micro-omgeving te creëren die lijkt op het aangetasteweefsel16. Bovendien kan weefselspecifieke ECM helpen bij het genereren van organoïden die ziekte-geassocieerde fenotypes en geneesmiddelreacties beter samenvatten17. Het optimaliseren van het ECM-systeem dat wordt gebruikt bij organoïdedifferentiatie is van cruciaal belang voor het bereiken van de gewenste differentiatieresultaten.

In de handel verkrijgbare basale membraansystemen die zijn afgeleid van dierlijke ECM-bronnen (bijv. Matrigel, Cultrex) en xenovrije hydrogel (bijv. VitroGel) worden veel gebruikt in iPSC- en organoïdeonderzoek. Bedrijven die ze commercialiseren en onderzoekers die ze gebruiken, hebben in de loop der jaren veel instructies opgesteld voor hun specifieke producten en toepassingen. Veel van deze instructies dienden als leidraad voor het genereren van dit protocol. Bovendien zijn de voordelen en tegenslagen die verband houden met hun intrinsieke eigenschappen door velen individueel opgemerkt 18,19,20,21. Er is echter geen systematische workflow om de selectie van optimale systemen voor iPSC- en organoïdewerk te begeleiden. Hier wordt een workflow geboden om systematisch de equivalentie van ECM-systemen uit verschillende bronnen voor iPSC- en organoïdewerk te evalueren. Dit is een vergelijkende studie van het onderhoud van twee verschillende menselijke iPSC-lijnen (hiPSC) en menselijke darmorganoïden (hIO) generatie in vier verschillende matrices: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) en VitroGel (Matrix 4-XF). Voor de organoïdecultuur werden vier versies van de xenovrije matrix VitroGel gebruikt die eerder waren geoptimaliseerd voor organoïdecultuur: ORGANOÏDE 1 (Matrix 4-O1), ORGANOÏDE 2 (Matrix 4-O2), ORGANOÏDE 3 (Matrix 4-O3), ORGANOÏDE 4 (Matrix 4-O4). Ook werden dierlijke matrices gebruikt die geoptimaliseerd waren voor organoïden: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) en Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). In de handel verkrijgbare stamcelkweekmedia (mTeSR Plus) en organoïdedifferentiatiekit (STEMdiff intestinale organoïdekit) werden gebruikt. Dit protocol combineert de individuele instructies van de fabrikanten van de producten met laboratoriumervaringen om de lezer te begeleiden naar een succesvolle optimalisatie van ECM voor hun specifieke iPSC- en organoïdewerk. Al met al benadrukken dit protocol en de representatieve resultaten het belang van het selecteren van de optimale microomgeving voor stamcelwerk en organoïdedifferentiatie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hiPSC onderhoud

LET OP: Al het werk wordt gedaan in een Biosafety Cabinet (BSC) volgens standaard aseptische technieken. Moet voldoen aan de OSHA-veiligheidsnormen voor laboratoria, inclusief het juiste gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen zoals laboratoriumjassen, handschoenen en veiligheidsbrillen.

  1. Bereiding van matrices, aliquots en celkweekmedia
    1. Voor in de handel verkrijgbare, van dieren afkomstige basale membranen (BM's; Matrix 1-AB, Matrix 2-AB, Matrix 3-AB), bereid aliquots van werkvolumes op volgens de aanbeveling van de fabrikant samengevat in tabel 1 en bewaar deze bij -20 °C of -80 °C voor langdurige opslag. Vermijd de vorming van luchtbellen. Als er enkele bellen worden gevormd, centrifugeer dan voordat u ze opbergt de monsters bij 4 °C, bij <200 x g, gedurende ~1-2 minuten om de bel naar de oppervlakte te dwingen.
      OPMERKING: Het maken van aliquots voor eenmalig gebruik helpt herhaalde vries-dooicycli te voorkomen die de ECM-architectuur verstoren. Omdat de BM-concentratie varieert met het lotnummer, moet u ervoor zorgen dat u de aanbeveling van de fabrikant volgt om aliquots voor eenmalig gebruik te bereiden en coatingoplossingen te maken. Hooggeconcentreerde BM's zijn stroperig en moeilijk te pipetten; gebruik koude tips die eerder bij -20 °C zijn bewaard.
    2. Bereid stamcelkweekmedium voor volgens de aanbeveling van de fabrikant. Om de specifieke, in de handel verkrijgbare volledige media te bereiden die in dit protocol worden gebruikt, voegt u 100 ml 5x supplementcocktail toe aan 400 ml basaal medium. Meng dit medium vervolgens grondig en aliquot in volumes van 40 ml, bewaard bij 20 °C. Ontdooi voor gebruik elke aliquot van volledige media, gebruik het aliquoted complete medium onmiddellijk of bewaar bij 2 - 8 °C gedurende maximaal 2 weken. Vries het niet opnieuw in.
    3. Bereid aliquots van het stamcelcomplete medium met 3x de concentratie van de supplementcocktail om de Matrix 4-XE Hydrogel te bereiden, d.w.z. verdun 5x supplement tot 3x.
  2. Weefselkweekplastic coaten met BM's van dierlijke oorsprong (Matrix 1-3AB)
    1. Bereid het volgende voor voordat u begint: bewaar de matrices altijd in ijs bij het ontdooien en hanteren om te voorkomen dat ze gaan geleren. Gebruik koude media om de verdunde matrices voor te bereiden. Bereid voldoende replicatieputjes per aandoening voor om cellen te testen voordat u begint en in elke fase van het hiPSC-differentiatieproces en de hIO-organoïdegeneratie.
      OPMERKING: Hier werden voor dit onderzoek platen met 24 putjes gebruikt. Raadpleeg Tabel 2 voor aanbevolen coatingvolumes voor andere plaatformaten.
    2. Bereid voor elk type matrix 25 ml cold advance DMEM/F-12 met 15 mM HEPES in een conische buis van 50 ml. Bewaar deze op het ijs.
    3. Voeg de ontdooide matrices toe aan hun respectievelijke koude advance DMEM/F-12 en meng goed. Houd de media koud tijdens het mengproces. Controleer visueel op homogene menging door ervoor te zorgen dat er geen klonten zijn.
    4. Gebruik de verdunde matriceoplossingen onmiddellijk om elk voor gebruik geselecteerd putje te coaten (250 μl/putje bij gebruik van platen met 24 putjes).
    5. Kantel het kweekgerei voorzichtig om de coatingoplossing gelijkmatig over het oppervlak te verdelen. Incubeer bij kamertemperatuur (15 - 25 °C) gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
      OPMERKING: Als de plaat niet onmiddellijk wordt gebruikt, kan deze tot 1 week na het coaten bij 2 - 8 °C worden bewaard, maar deze moet worden afgesloten met een transparante film om verdamping te voorkomen. Als u opgeslagen borden gebruikt, laat ze dan 30 minuten op kamertemperatuur komen (15 - 25 °C) voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    6. Verwijder de overtollige oplossing voorzichtig met een serologische pipet of door aspiratie. Zorg ervoor dat er geen krassen op het gecoate oppervlak komen.
    7. Voeg onmiddellijk een warm, compleet stamcelmedium toe (50% van het totale volume dat nodig is voor een specifiek putje, bijv. 250 μL/putje bij gebruik van een plaat met 24 putjes).
  3. Weefselkweek kunststof coaten met Matrix 4-XE hydrogel
    1. Bereid het volgende voor voordat u begint: haal de Matrix 4-XE hydrogel uit de koelkast en laat deze opwarmen tot kamertemperatuur (25 °C). Bereid voldoende replicatieputjes per aandoening voor om cellen te testen voordat u begint en in elke fase van het hiPSC-differentiatieproces en de hIO-organoïdegeneratie.
      OPMERKING: Hier werden voor dit onderzoek platen met 24 putjes gebruikt. Raadpleeg Tabel 3 voor de aanbevolen coatingvolumes voor andere plaatformaten.
    2. Bereid een compleet stamcelkweekmedium voor met een concentratie van 3x de groeifactor in vergelijking met de standaardformulering voor stamcelcultuur (3x stamcelmedium).
    3. Meng Matrix 4-XE hydrogel en 3x stamcelmedium in een mengverhouding van 2:1 v/v en pipetteer voorzichtig 5x-10x op en neer om grondig te mengen.
    4. Breng het hydrogelmengsel over op een putplaat en kantel het cultuurgerei voorzichtig om het mengsel gelijkmatig over het oppervlak te verdelen. Gebruik 250 μl/putje als u een plaat met 24 putjes gebruikt. Zie tabel 3 voor de aanbevolen volumes.
    5. Wacht 10-15 minuten bij kamertemperatuur voor de vorming van zachte gel. Verstoor de hydrogel tijdens het hydrogelvormingsproces niet door de plaat te kantelen of te schudden.
  4. hiPSC-enzymvrije klontpassage en zaaien
    1. Bereid het volgende voor voordat u begint: smeer ten minste 1 uur voor het passeren het gewenste plastic ware in met matrices. Aliquot voldoende volledige stamcelmedia en warm tot kamertemperatuur (15 - 25 °C). Vermijd meerdere verwarmingscycli voor de volledige media.
      OPMERKING: De onderstaande stappen beschrijven de passage van een reeds gevestigde en >90% confluente cultuur van iPSC's op een plaat met 6 putjes en het zaaien ervan in platen met 24 putjes voor differentiatie van darmorganoïden.
    2. Spoel de cellen met 1 ml D-PBS (zonder Ca++ en Mg++) en zuig ze op. Voeg 1 ml enzymvrij humaan pluripotent stamcelselectiereagens toe, draai voorzichtig om gelijkmatig te verspreiden en zuig binnen 1 minuut op. Kolonies hoeven alleen te worden blootgesteld aan een dunne vloeistoffilm.
    3. Incubeer bij 37 °C totdat de kolonies er minder verdicht uit beginnen te zien, wat ~ 3-8 minuten duurt.
      OPMERKING: De optimale incubatietijd kan variëren, afhankelijk van de gebruikte cellijn. De optimale incubatietijd moet worden bepaald wanneer elke cellijn voor het eerst wordt gepasseerd met het enzymvrije reagens voor het selecteren van menselijke pluripotente stamcellen.
    4. Voeg 1 ml volledige stamcelmedia toe. Maak de kolonies los door voorzichtig stevig op de zijkant van de plaat te tikken. Zorg ervoor dat je de plaat met de andere hand vasthoudt.
    5. Breng met een pipet van 1 ml of groter de suspensie van de celklonten over in een conische buis van 15 ml. Evalueer de grootte van de klompjes met behulp van een helderveldmicroscoop en zorg ervoor dat de grootte van de celklomp tussen 50-200 μm ligt; Als ze groter zijn, schud dan voorzichtig met de conische buis om ze af te breken.
    6. Teken een x-y-raster op de bodem van elk putje van een platbodemplaat met 96 putjes die zal worden gebruikt voor het tellen van klonten en voeg 50 μL D-PBS toe aan elk van de putjes. Het wordt aanbevolen om het gemiddelde te nemen van de klompen geteld uit 3 putten.
    7. Zorg ervoor dat de celklonten gelijkmatig worden verdeeld door de buis voorzichtig te schudden en vervolgens 5 μL klontensuspensie over te brengen in elk van de putjes van de platbodemplaat met 96 putjes.
      OPMERKING: Het wordt niet aanbevolen om een automatische cellenteller te gebruiken om klonten te tellen. Een handmatige telling wordt aanbevolen.
    8. Tel het totale aantal klonten in elke put met een diameter van 50 - 200 μm. Als de meeste celklompjes een diameter van > 200 μm hebben (zie figuur 1), herhaal dan stap 1.4.5 - 1.4.7.
    9. Bereken het volume (in μL) van de klompsuspensie die nodig is om 6.000 klonten te zaaien als volgt:
      figure-protocol-1
      OPMERKING: De optimale zaaidichtheid moet bij elke cellijn worden geoptimaliseerd. Om de optimale zaaidichtheid te bepalen, wordt aanbevolen om een eerste zaaiing uit te voeren in een reeks klompdichtheden (bijv. 4.000, 5.000 en 6.000 klonten per put) en 24-48 uur na het zaaien te controleren of 85%-90% confluentie is bereikt.
    10. Scheid als kwaliteitscontrole een monster van cellen voor flowcytometrieonderzoek van stamcelmarkers. Zie Tabel 4 voor een lijst met veelvoorkomende markeringen.
    11. Scheid het vereiste volume iPSC-klompsuspensie tot zaad op de met verschillende ECM bedekte putjes in afzonderlijke buisjes van 15 ml.
    12. Centrifugeer de buis met de iPSC-klompoplossing bij 200 x g gedurende 5 minuten om media te verwijderen die enzymvrij humaan pluripotent stamcelselectiereagens bevatten. Terwijl u wacht op het centrifugeren, voegt u 50% van het gewenste volume per putje toe aan elk putje als dit nog niet was gedaan.
  5. iPSC-cultuur in platen met matrices van dierlijke oorsprong
    1. Resuspendeer voorzichtig iPSC's klonten in het 50% berekende volume van volledige stamcelmedia om de gewenste dichtheid te krijgen en plaats het celaggregaatmengsel op gecoate putjes die 50% van de berekende volledige stamcelmedia bevatten.
      OPMERKING: Het toevoegen van een ROCK-1-remmer kan nodig zijn voor sommige cellijnen of wanneer klonten 50 μm of kleiner zijn. Het wordt aanbevolen om <10 μm toe te voegen om vroege gastrulatie te voorkomen.
    2. Voeg voorzichtig medium toe met cellen bovenop de matrices, 250 μl/putje bij gebruik van een plaat met 24 putjes. Raadpleeg tabel 2 voor het aanbevolen volume celmedium voor putplaten van andere grootte.
    3. Kantel de plaat in verschillende korte heen-en-weer en zijwaartse bewegingen om de celklonten gelijkmatig te verdelen.
      LET OP: Ongelijke verdeling van aggregaten leidt tot verhoogde spontane differentiatie van menselijke iPSC's. Cirkelvormige spreiding van de suspensie van de klonten resulteert in klonten die samenklonteren aan de rand van de putten en een lagere dichtheid in het midden.
    4. Incubeer de plaat bij 37 °C en voer dagelijks of om de dag mediumveranderingen uit met behulp van volledige stamcelmedia. Beoordeel bij het uitvoeren van mediumveranderingen culturen visueel om de groei te volgen en te bepalen of de cellen passeertijd nodig hebben of klaar zijn voor differentiatie. Om twee opeenvolgende dagen voeding over te slaan, voegt u 2x het volume van het medium toe dat nodig is voor een enkele dag.
  6. iPSC-cultuur in platen die Matrix 4-XE bevatten
    1. Resuspendeer de iPSC's klonten voorzichtig in het totale berekende volume van 3x volledige stamcelmedia om de gewenste dichtheid te krijgen.
    2. Voeg voorzichtig medium met cellen toe bovenop de hydrogel 250 μL/putje als u een plaat met 24 putjes gebruikt. Raadpleeg Tabel 3 voor het aanbevolen volume van het celmedium voor putplaten van andere grootte.
      LET OP: De hydrogel zal opzwellen en een groter volume innemen dan vers gemaakt. iPSC-kolonies zullen gedeeltelijk worden ingebed in de hydrogel aan de onderkant van de plaat, dus het wordt aanbevolen om 50%-80% van het bovenste medium te veranderen zonder de hydrogel te verstoren.
    3. Beweeg de plaat in verschillende snelle, korte, heen en weer en zijwaartse bewegingen om de celklonten gelijkmatig te verdelen.
    4. Plaats de plaat in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Verander het celmedium met behulp van volledige stamcelmedia. Voer dagelijks of om de dag mediumveranderingen uit; Voor de laatste voeg je 2x het volume van het medium toe.
    5. Inspecteer de culturen visueel om hun groei te volgen wanneer ze het stadium bereiken dat geschikt is voor differentiatie.

figure-protocol-2
Figuur 1: Optimale klontgrootte. Afbeeldingen van klonten van de iPSC-cellijn SCTi003A die een voorbeeld zijn van de optimale klontgrootte. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. hiPSC-differentiatie en intestinale organoïdegeneratie

LET OP: Al het werk wordt gedaan in een Biosafety Cabinet (BSC) volgens standaard aseptische technieken. Moet voldoen aan de OSHA-veiligheidsnormen voor laboratoria, inclusief het juiste gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen zoals laboratoriumjassen, handschoenen en veiligheidsbrillen.

  1. Bereid het volgende voor voordat u begint: bereid aliquots voor van het differentiatiemedium dat nodig is voor elke fase. Gebruik de aliquots na het ontdooien onmiddellijk. Niet opnieuw invriezen. Volg Tabel 5 voor een algemene handleiding van elk type en volume van de fase, media en volumes die nodig zijn voor een plaat met 24 putjes.
    OPMERKING: De optimale tijd in elke differentiatiefase kan per cellijn verschillen. Het wordt aanbevolen om de expressie van elke stadiumcelmarker te controleren om de differentiatie-efficiëntie te verbeteren. Periodieke beoordeling van genexpressie op de iPSCS-culturen is niet opgenomen in dit onderzoek, omdat we gebruik hebben gemaakt van door de leverancier gekwalificeerde batches bij lage passages, maar het wordt aanbevolen als een kwaliteitscontrolestap voor nieuwe/nog niet gekwalificeerde iPSC-lijnen tijdens de volgende differentiatiestappen.
  2. Fase 1: Definitief endoderm (DE)
    1. Om te beoordelen of u klaar bent om met differentiatie te beginnen, controleert u op de volgende criteria.
      1. Evalueer met een microscoop de samenvloeiing van de stamcelkolonies en de mate van spontane differentiatie in de cultuur. Vertrouw niet alleen op morfologische evaluatie. Optimale confluentie moet tussen 85%-90% liggen (boven ~105 cellen/cm2), en minimale spontane differentiatie die wordt waargenomen moet <5% differentiatie zijn.
      2. Verzamel cellen uit een offerput voor flowcytometrie, karakterisering van hiPSC-markers voordat u doorgaat met de volgende stap. Een voorwaartse en zijwaartse scatter gating-strategie werd gebruikt voor de representatieve karakterisering van flowcytometrie. Als cellen aan de optimale criteria voldoen, begin dan met differentiatie. Het criterium voor het passeren van cellen is >85% expressie van idealiter 3 markers (tabel 4), vooral in het geval van nieuwe/nog niet gekwalificeerde iPSC-lijnen in het laboratorium.
        OPMERKING: iPSC-culturen die op verschillende matrices worden gekweekt, ondergaan hetzelfde algehele proces met alleen iPSC-groei op Matrix 4-XE, waardoor zachtere mediaveranderingen nodig zijn om de semi-ingebedde cellen niet te verstoren. Significante celdood wordt verwacht tijdens de inductie van definitief endoderm, aangezien cellen in dit stadium bijzonder gevoelig zijn. Wees voorzichtig bij mediumveranderingen en probeer de duur dat cellen buiten de incubatieomgeving van 37 °C worden blootgesteld zoveel mogelijk te minimaliseren.
    2. Begin met differentiatie van celkolonies zoals hieronder beschreven.
      1. Dag 0: Verwarm een hoeveelheid DE medium tot 37 °C. Om denaturering van media door opwarmings-koelcycli te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat u alleen het volume verwarmt dat nodig is voor dag 0 (0.7 ml/putje).
      2. Zuig de media van hiPSC's op. Voeg voorzichtig 0,7 ml DE Medium per putje toe langs de zijkant van het putje. Vermijd hard pipetteren dat de kolonies kan losraken of beschadigen. Incubeer de plaat bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 24 uur.
      3. Dag 1: Verwarm een hoeveelheid DE-medium met alleen het volume dat nodig is voor dag 1 (0,5 ml/putje) tot 37 °C. Zuig het DE-medium uit de cellen en voeg voorzichtig 0,5 ml DE-medium per putje toe langs de zijkant van het putje. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 24 uur.
      4. Dag 3: Cellen zijn klaar om te worden getest voor definitieve endodermvorming. Raadpleeg Tabel 4 voor aanbevolen markeringen. Voordat u doorgaat met de volgende fase, offert u een put op om een flowcytometriekarakterisering uit te voeren van specifieke markers die verband houden met DE. Een voorwaartse en zijwaartse scatter gating-strategie werd gebruikt voor de representatieve karakterisering van flowcytometrie. Het wordt aanbevolen om de expressie van meer dan 1 marker te controleren, vooral in het geval van nieuwe/nog niet gekwalificeerde iPSC-lijnen in het laboratorium.
  3. Fase 2: Middendarm/Dikke darm (MH)
    1. Dag 3: Verwarm alleen de hoeveelheid MH-medium die nodig is voor dag 3 (0,5 ml/putje) tot 15 - 25 °C. Aspireer DE-medium uit de cellen en vervang het door 0,5 ml MH-medium. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 24 uur.
    2. Dagen 4 - 9: Gebruik de microscoop met een vergroting van 2x of 4x voordat het medium dagelijks verandert, om de vorming van sferoïden te beoordelen door te controleren op zichtbare 3D-structuren (kan gebeuren vanaf dag 4); vrij zwevende sferoïden (kunnen optreden vanaf dag 5).
    3. Zodra sferoïden beginnen los te laten, gebruikt u een pipettor van 1 ml om het medium voorzichtig van de cellen over te brengen naar een steriele conische buis van 15 ml om het aantal sferoïden dat van de cellen is losgekomen te beoordelen.
      OPMERKING: Vermijd elke afschuifkracht die 3D-structuren van de monolaag zou kunnen losmaken; Eenmaal klaar, zullen de sferoïden vanzelf loskomen.
    4. Als er minder dan 50 sferoïden zijn losgemaakt, centrifugeer dan gedurende 5 minuten bij 200 x g , verwijder het oude medium en resuspendeer de sferoïden op 0,5 ml/putje medium en breng het over naar het betreffende putje totdat er voldoende sferoïden zijn gerijpt.
      OPMERKING: De duur van de blootstelling aan het middendarm/achterdarm speelt een cruciale rol bij het bepalen van de regionale identiteit van zich ontwikkelende organoïden van de dunne darm, zoals twaalfvingerige darm (kortere blootstelling) of ileum (langere blootstelling). Om meer uniforme culturen met dezelfde identiteit te bereiken, moet u ernaar streven sferoïden te verzamelen die tegelijkertijd zijn blootgesteld aan het middendarm/achterdarmmedium.
    5. Herhaal stap 2.3.3 totdat er voldoende sferoïden zijn losgemaakt om de menselijke darmorganoïde (hIO)-cultuur in te bedden en te starten.
    6. Voordat u doorgaat met de volgende fase, scheidt u een monster van sferoïden en voert u een flowcytometriekarakterisering uit van specifieke markers die verband houden met Midgut/Hindgut (MH). Een voorwaartse en zijwaartse scatter gating-strategie werd gebruikt voor de representatieve karakterisering van flowcytometrie. Zie Tabel 4 voor een lijst met veelgebruikte markeringen. Het wordt aanbevolen om de expressie van meer dan 1 marker te controleren, vooral in het geval van nieuwe/nog niet gekwalificeerde iPSC-lijnen in het laboratorium.
  4. Fase 3: sferoïde inbedding
    1. Bereid het volgende voor voordat u met de procedure begint.
      1. Ontdooi aliquots van Matrix 1-ABO en Matrix 3-ABO op ijs. Beschouw het aantal verzamelde sferoïden om de totale hoeveelheid matrix te bepalen die nodig is als er 30-40 μL matrix per koepel nodig is.
      2. Bereid 25 ml koude Advance DMEM/F-12 met 15 mM HEPES. Hooggeconcentreerde ECM's zijn stroperig en moeilijk te pipetteren. Plaats een doos met steriele pipetpunten van 100 μl bij -20 °C voor het bereiden van koude tips die het proces kunnen helpen. Bereid aliquots van Intestinal Organoid Growth Medium (OGM) voor, waarvoor 4 voedingen nodig zijn (0,5 ml/putje per voeding). Zie tabel 5 voor de voorbereiding.
      3. Ontdooi een aliquot van het OGM-supplement op ijs. Gebruik de aliquots na het ontdooien onmiddellijk. Niet opnieuw invriezen. Bewaar complete OGM bij 2-8 °C gedurende maximaal 2 weken.
      4. Bereid OGM voor met 3x van het supplement in vergelijking met de standaardformulering voor (3x OGM). Haal de Matrix 4-XFO1 thought Matrix 4-XFO4 uit de koelkast en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur (25 °C).
    2. Voer voor het van dieren afkomstige systeem de onderstaande stappen uit.
      1. Plaats een steriele weefselkweekplaat met 24 putjes in de incubator om op te warmen tot 37 °C terwijl u de sferoïden en matrices bereidt. Laat de verzamelde sferoïden bezinken op de bodem van een conische buis van 15 ml. Zuig de supernatant voorzichtig op en gooi deze weg.
        OPMERKING: Om een nauwkeurigere vergelijking van het effect van de matrices te maken, moet u ervoor zorgen dat de sferoïden die van de hiPSC zijn verzameld, gedifferentieerd zijn op elke matrix in afzonderlijke buisjes.
      2. Voeg 1 ml DMEM/F-12 met 15 mM HEPES toe aan de sferoïden. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (15 - 25 °C).
      3. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk van het supernatans. Het wordt aanbevolen om te beginnen met verwijderen met een pipetor van 1 ml en over te schakelen op pipetten van 100 μl en zelfs 10 μl om zoveel mogelijk te verwijderen zonder de pellet sferoïden te verstoren.
        OPMERKING: Hoe groter het resterende mediavolume, hoe meer verdund de matrices zullen zijn. Verdunde matrices kunnen leiden tot geleerproblemen of zachtere koepels. Zachtere koepels leiden tot een grotere kans op instorten met minimale verstoringen.
      4. Gebruik een pipetor met een koude pipetpunt van 100 μl en voeg 40 μl/50 sferoïden koude (2 - 8 °C) Matrix 1-ABO of Matrix 3-ABO toe aan hun respectievelijke buis. Verdeel de sferoïden voorzichtig in de matrix door ~5x op en neer te pipetteren. Maak de pipetpunt niet helemaal leeg, hierdoor kunnen er luchtbellen ontstaan.
      5. Haal de plaat uit de couveuse en breng met behulp van een koude pipetpunt de ingebedde sferoïden voorzichtig over naar het midden van de plaat volgens de stappen in Figuur 2. Doseer Matrix 1-ABO en Matrix 3-ABO niet te snel in de kweekschaal, omdat dit de koepel plat maakt.
      6. Breng de plaat voorzichtig over in een incubator van 37 °C en incubeer gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen dat de koepel geleert. Wees vooral voorzichtig met schudden of harde bewegingen tijdens het transport en in de couveuse.
      7. Verwarm tijdens het incuberen van de koepel voor geleren bij 37 °C een voldoende volume intestinale OGM (0,5 ml/putje) voor het aantal te gebruiken putjes.
        NOTITIE: Verwarm alleen het benodigde volume. Vermijd opwarming-afkoelcycli. Zorg ervoor dat het medium warm is voordat u het aan de koepel toevoegt; Koude media kunnen leiden tot het instorten van de koepel.
      8. Voeg na 30 minuten voorzichtig 0,5 ml intestinale OGM toe aan de zijkant van de put om de koepel niet te verstoren. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Voer elke 3 - 4 dagen een volledige mediumverandering uit door het medium te verwijderen en voeg vervolgens vers medium toe.
    3. Voor de Matrix 4-XF organoïde systemen volg je de beschreven stappen.
      OPMERKING: Het Matrix 4-XF-organoïdesysteem bevat vier verschillende opties (O1-O4); De formulering van elk type varieert in biofunctionele liganden, stijfheid en afbreekbaarheid. Daarom wordt aanbevolen om eerste experimenten uit te voeren om het optimale type voor de specifieke toepassing te bepalen. Dit protocol beschrijft het gebruik van de vier opties om een optimale formulering te vinden voor hiPSC-afgeleide darmorganoïden. Bovendien, hoewel er meerdere kweekprotocollen zijn die kunnen worden gebruikt (bijv. 3D-inkapseling, koepelinkapseling), omvat dit protocol het gebruik van de koepelmethode, zodat het mogelijk is om direct te vergelijken met de gebruikelijke methoden die worden gebruikt bij het werken met van dieren afkomstige basale membraansystemen.
      1. Voeg 1 ml/putje cold advance DMEM/F-12 met 16 mM HEPES toe aan de sferoïden die worden gegenereerd op het Matrix 4-XFO4-systeem. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (15 - 25 °C).
        OPMERKING: Om de optimale formulering voor de toepassing te vinden, moet u ervoor zorgen dat u de sferoïden vóór het centrifugeren over 4 afzonderlijke buizen verdeelt. Sferoïden die zijn gegenereerd op matrices van dieren, kunnen met dit systeem ook worden gerijpt tot darmorganoïden.
      2. Gebruik een pipettor van 1 ml om het supernatans te verwijderen zonder de sferoïden te verstoren. Voeg 50 μL 3x OGM toe aan de sferoïdenkorrel (~100 sferoïden). Voeg 100 μL van de geselecteerde Matrix 4-XFO toe aan de 50 μL sferoïde suspensie en meng voorzichtig 5x-10x keer. Houd de Matrix 4-XFO tot 3x OGM op een 2:1 v/v mengverhouding om een eindconcentratie van 1x te hebben.
      3. Voeg 40 μL van het hydrogel-sferoïde mengsel toe aan het midden van een weefselkweekplaat met 24 putjes. Breng de platen voorzichtig over in een incubator van 37 °C en broed ze 30 minuten uit.
        OPMERKING: Matrix 4-XFO vereist geen incubatie van 37 °C voor gelering; het wordt echter aanbevolen om organoïden bloot te stellen aan vergelijkbare omstandigheden in vergelijking met Matrix 1-ABO- en Matrix 3-ABO-systemen die 37 °C nodig hebben voor een betere gelering van de koepels.
      4. Voeg na 30 minuten voorzichtig 0,5 ml intestinale OGM toe aan de zijkant van het putje om de koepel niet te verstoren. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Voer elke 3 - 4 dagen een volledige mediumverandering uit door het medium te verwijderen en vervolgens vers medium toe te voegen.
  5. hIO passaging en rijping
    1. Bereid dezelfde chemicaliën, oplossingen en reagentia voor als in stap 2.4.1.
    2. Voeg 1-2 ml antikleefoplossing toe aan een conische buis van 15 ml (1 per aandoening) en draai om de buis te coaten.
    3. Verwijder de antikleefoplossing en spoel de tubes af met 5 ml D-PBS (zonder Ca++ en Mg++). Sluit alle gecoate buizen af en bewaar ze op kamertemperatuur (15 - 25 °C) tot ze nodig zijn.
    4. Zuig het medium uit de koepels. Voeg met een pipet van 1 ml 1 ml koude DMEM/F-12 rechtstreeks toe aan de koepel. Het doel is om de koepels los te maken van de plaat.
    5. Voeg nog eens 1 ml koude DMEM/F-12 toe aan het putje en pipetteer op en neer om de resterende organoïden te oogsten. Breng over naar de gecoate conische buizen van 15 ml.
      OPMERKING: Controleer de succesvolle oogst van organoïden door de put visueel onder een microscoop te onderzoeken. Als er restanten van organoïden worden waargenomen, herhaal dan stap 2.5.5.
    6. Voer met een pipettor van 1 ml op-en-neer pipetteren van de suspensie uit om organoïden te desintegreren totdat een uniforme fragmentsuspensie is bereikt met de gewenste organoïdegrootte (bijv. 100 - 500 μm).
      OPMERKING: Gebruik een pipetor van 200 μl om te controleren of de organoïden voldoen aan de aanbevolen grootte. Het gebruik van de pipetor van 200 μl vergemakkelijkt extra fragmentatie indien nodig, zodat de fragmenten soepel door een pipetpunt van 200 μl kunnen gaan.
      LET OP: Vermijd het opbreken van fragmenten in afzonderlijke cellen door hard of langdurig pipetteren.
    7. Bepaal de gewenste organoïdedichtheid door fragmenten te tellen of de splitsingsverhouding te gebruiken. Scheid een aliquot en voer de telling uit volgens dezelfde procedure als in de stappen 1.4.6-1.4.9 voor het tellen van klompen.
      OPMERKING: De optimale organoïdedichtheid moet per lijn worden geoptimaliseerd; Over het algemeen wordt een dichtheid van 40 - 80 darmorganoïden per koepel aanbevolen.
    8. Zorg ervoor dat de buis tijdens het tellen van de organoïden op ijs wordt geplaatst. Na ongeveer 5 minuten zullen organoïde fragmenten door de zwaartekracht op de bodem van de buis zijn neergedaald.
      OPMERKING: Hoe groter het volume van de organoïde-oplossing, hoe langer het duurt om naar de bodem te zakken.
    9. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatans en de troebele laag die zich bovenop de organoïden heeft gevormd. In de vroege passages, wanneer organoïden rijpen, omvat deze troebele fase een matrix en individuele cellen.
    10. Voeg 2 ml koude DMEM/F-12 toe door direct op de pellet te pipetteren. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (15 - 25 °C).
    11. Voor een systeem van dierlijke oorsprong moet het supernatans voorzichtig worden verwijderd en weggegooid volgens dezelfde stappen als beschreven in de stappen 2.4.2.4-2.4.2.9.
    12. Voor het Matrix 4-XFO-systeem moet het supernatans voorzichtig worden verwijderd en weggegooid volgens dezelfde stappen als beschreven in de stappen 2.4.3.2-2.4.3.4.
      OPMERKING: Bij het werken met het Matrix 4-XFO-systeem wordt aanbevolen om een xenovrije hydrogel-organoïdehersteloplossing te gebruiken voor een optimale verwijdering van hydrogelresten. Deze hersteloplossing wordt vooral aanbevolen bij het overschakelen van dierlijke naar xenovrije hydrogelsystemen om de eliminatie van xenogeen materiaal te garanderen.

figure-protocol-3
Figuur 2. Schema van de techniek die wordt aanbevolen voor koepelvorming. Het schema beschrijft het stapsgewijze proces dat wordt aanbevolen voor een succesvolle koepelvorming voor alle systemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Karakterisering van de IO-grootte

OPMERKING: De grootte van de organoïden werd gekenmerkt door helderveldopnamen die met 4x en 10x waren gemaakt. De analyse van de beeldverwerking werd geautomatiseerd met behulp van MATLAB. De algemene stappen van het proces worden hieronder beschreven en een voorbeeld van de code is opgenomen in aanvullend bestand 1.

  1. Definieer de map met de afbeeldingen en maak een lijst van alle afbeeldingsbestanden in de map. Initialiseer de tabel om de resultaten op te slaan. Lees de helderveldafbeeldingen in een bestand.
  2. Definieer de conversie van pixel naar μm en stel de schaal in. Als de afbeelding geen schaalbalk bevat, vraagt u de gebruiker om de pixel-naar-μm-conversiefactor.
  3. Converteer de afbeelding naar grijstinten. Pas een Gaussiaans filter toe om ruis in de afbeelding te verminderen. Drempel de gefilterde afbeelding om organoïden van de achtergrond te scheiden.
  4. Vul kleine gaatjes en verwijder kleine voorwerpen om de binaire afbeelding op te ruimen. Voer een analyse van verbonden componenten uit om individuele organoïden te identificeren en hun eigenschappen te berekenen, zoals oppervlakte, zwaartepunt, hoofdaslengte en kleine aslengte.
  5. Bereken de grootte van de organoïde op basis van de grote en kleine aslengtes. Toon de gesegmenteerde organoïden op de originele afbeelding en label ze met hun grootte. Print de organoïde formaten en sla de resultaten op in een .cvs-bestand.
    OPMERKING: De eerste paar afbeeldingen werden handmatig geanalyseerd om de optimale parameters voor de standaarddeviatie van het Gauss-filter en het gebied tot de drempel te bepalen. De code in aanvullend bestand 1 geeft een voorbeeld van het basiskader voor de analyse van de organoïdegrootte op basis van helderveldafbeeldingen; Er is echter verdere verfijning nodig om te voldoen aan de specifieke vereisten voor elk beeldtype en elke kwaliteit. Hetzelfde proces kan worden gedaan met behulp van open-source software zoals FIJI van Image J.
  6. Volg de onderstaande stappen om de FIJI-software te gebruiken.
    1. Definieer de conversie van pixel naar μm en stel de schaal in. Als de afbeelding geen schaalbalk bevat, vraagt u de gebruiker om de pixel-naar-μm-conversiefactor door te klikken op Analyseren > Schaal instellen.
    2. Converteer de afbeelding naar grijswaarden door te klikken op Afbeelding > Type > 8-bits. Pas een Gaussiaans filter toe om ruis in de afbeelding te verminderen door te klikken op Verwerken > filter > Gaussiaanse blurb > Sigma (straal) gebruikt: 2.
    3. Drempel voor de gefilterde afbeelding om organoïden van de achtergrond te scheiden door te klikken op Afbeelding > Drempel > MaxEntropy > Toepassen.
    4. Vul kleine gaatjes en verwijder kleine objecten om de binaire afbeelding op te schonen door te klikken op Verwerken > ruis > Uitschieters > 20 pixels verwijderen.
    5. Voer een analyse van verbonden componenten uit om individuele organoïden te identificeren en hun eigenschappen te berekenen, zoals oppervlakte, zwaartepunt, hoofdaslengte en kleine aslengte door te klikken op Analyseren > Meting instellen > Zorg ervoor dat Oppervlakte, Omtrek en Diameter zijn opgenomen > Analyseer > Deeltjes > toon contouren.
  7. Statistische analyse
    1. Beoordeel de gegevensverdeling op normaliteit via de Saphiro-Wilk-test met behulp van JMP (SAS)-software. Om statistische verschillen tussen groepen te onderzoeken, voert u een tweerichtings-ANOVA uit en voert u post-hoctests uit met behulp van de niet-parametrische Wilcoxon-methode in JMP(SAS)-software. De significantie werd vastgesteld op een alfaniveau van p ≤ 0,05.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens dit protocol werden in de handel verkrijgbare basale membranen en een xeno-vrij hydrogelsysteem met succes gebruikt om hiPSC-cellen te kweken en ze te differentiëren tot hIO. Het belangrijkste doel van deze experimenten was het systematisch evalueren van de equivalentie van matrices uit verschillende bronnen voor hiPSC- en hIO-werk. Het eerste deel van dit protocol was gericht op het onderhouden en karakteriseren van een gezonde iPSC-cultuur die een efficiënte intestinale organoïdegeneratie oplevert. Het proces van het coaten van het cultuurgerei met dierlijke matrices Matrix 1-AB, Matrix 2-AB en Matrix 3-AB werd beschreven en vergeleken met een xeno-vrij hydrogelsysteem Matrix 4-XF.

Zoals te zien is in figuur 3A, vertonen de hiPSC's BXS 0116 (afgeleid van CD34+) een vergelijkbare morfologie wanneer ze worden gekweekt op de drie van dieren afkomstige matrices. Desalniettemin benadrukt het vergelijken van de cellijn BXS 0116 met SCTi003-A (PBMC afgeleid) gekweekt op Matrix 1-AB-gecoate putjes dat intrinsieke verschillen tussen cellijnen (weergegeven in tabel 6) kunnen leiden tot variatie met betrekking tot celproliferatie, differentiatie en morfologie. Terwijl het bijvoorbeeld 3 dagen duurde om DE te genereren voor de SCTi003-A-cellijnen, duurde het 5 dagen voor de BXS0116 lijn. Bovendien, zoals weergegeven in figuur 3B-C, leidt het kweken van hiPSC's in Matrix 4-XF-hydrogelsystemen tot kolonievorming in een gedeeltelijk ingebedde 3D-kolonie die drastisch verschilt van de vlakke morfologie van hiPSC-cultuur op platen bedekt met Matrix 1-AB of gelijkwaardige systemen. Een van de belangrijkste aspecten van deze experimenten is ook dat het maken van een xenovrij hydrogelsysteem met behulp van 3x groeifactoren de levensvatbaarheid van cellen en de expressie van stamcelmarkers aanzienlijk kan verbeteren. Al met al leidden hiPSC-culturen op matrices van dieren en xenovrije Matrix 4-XF gemaakt met een concentratie van 3x groeifactoren tot een equivalente expressie van SSEA-4 (stamcelmarker)22; het hydrogelsysteem bevordert echter de vorming van gedeeltelijk ingebedde 3D-kolonies.

Het tweede deel van dit protocol richt zich op de differentiatie van hiPSC's om hIO te genereren. Hier werd een in de handel verkrijgbare kit ontwikkeld op basis van Spence et al.23 gebruikt om te differentiëren in definitief endoderm (DE), vervolgens middendarm/dikke darm (MH) en ten slotte sferoïde te verzamelen om te rijpen tot IO (Figuur 4C). Voor een efficiënte generatie van IO is het van cruciaal belang om te onderzoeken of de hiPSC-cultuur minimale spontane differentiatie heeft voordat met het differentiatieprotocol wordt begonnen. Zoals te zien is in figuur 4A, hoe lager de expressie van stamcelmarkers zoals SSEA-4 bij het starten van de DE-differentiatie, hoe minder efficiënt het proces zal zijn in elke fase (d.w.z. lagere expressie van MH-markers) en de daaropvolgende slechte generatie van hIO. Door gebruik te maken van een compact benchtop flowcytometrie-apparaat kon snel toegang worden verkregen tot flowcytometrieresultaten en kon worden beslist over de kwaliteit van de differentiatie voordat naar de volgende fase werd gegaan. Een eigenaardige observatie was dat Matrix 2-AB-onderhouden hiPSC resulteerde in minder sferoïde releases tijdens het middendarm/achterdarmstadium in vergelijking met de andere van dieren afkomstige systemen. Een ander belangrijk aspect om op te merken is dat, omdat kolonies van hiPSC die in Matrix 4-XF werden onderhouden al een 3D-structuur hadden aan het begin van de differentiatie, deze systemen leidden tot grotere sferoïden.

Sferoïden werden ingebed in Matrix 1-ABO, Matrix 3-ABO en Matrix 4-XFO1-Matrix 4-XFO4 en werden met behulp van een kit gerijpt tot hIO. Nadat sferoïden 7 dagen hadden gerijpt, werden ze gepasseerd en ingebed in hun respectievelijke matricesystemen. De groei van de organoïde op elk systeem werd 7 dagen lang gevolgd op basis van helderveldbeelden. Terwijl de cultuur begon met organoïden van relatief vergelijkbare grootte, varieerde de hIO-grootte na 5 dagen als functie van de matrix waarin ze waren ingebed (Figuur 5). Van de vier Matrix 4-XFO was de formulering die resulteerde in grotere organoïden Matrix 4-XFO3. De Matrix 4-XFO-systemen zijn geformuleerd met verschillende liganden en mechanische eigenschappen om geschikt te zijn voor een verscheidenheid aan toepassingen24. In het bijzonder ligt Matrix 4-XFO3-stijfheid25 dichter bij menselijke darmstijfheid26 dan de andere Matrix 4-XFO-formuleringen, wat recente bevindingen ondersteunt over de rol van mechanische eigenschappen van ECM op organoïde-expansie 12,27,28. Onze representatieve resultaten geven aan dat Matrix 1-ABO en Matrix 3-ABO de groei en expansie van darmorganoïden in gelijke mate vergemakkelijken.

figure-results-1
Figuur 3: Selectie van een matrixsysteem voor iPSC-onderhoud. (A) Representatieve afbeeldingen van twee cellijnen die zijn gekweekt op een coating van cultuurware met de drie verschillende van dieren afkomstige matrixsystemen. (B) Representatieve afbeeldingen die het gebruik van Matrix 4-XF vergelijken met 1x vs. 3x groeifactorsuppletie tonen aan dat het verhogen van groeifactorsuppleties de levensvatbaarheid van hiPSC op Matrix 4-XF-hydrogel verbetert. (C) Flowcytometrievergelijking van SSEA-4-expressie van Matrix 1-AB, Matrix 3-AB, Matrix 4-XF (3X) toont equivalente expressie, terwijl Matrix 4-XF (1X) leidde tot een lagere expressie van SSEA-4. Balken vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van n = 5; tweerichtings-ANOVA en post-hoctesten met niet-parametrische Wilcoxon-methode werden gebruikt voor significantietesten. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 4: Differentiëring van iPSC in definitief endoderm (DE) en middendarm/dikke darm (MH). (A) Representatieve beelden van iPSC-differentiatie naar DE, beginnend met verschillende niveaus van SSEA4-marker, benadrukken het belang van startdifferentiatie met een hiPSC-populatie met hoge expressie van stamcelmarkers. De rode pijlen wijzen naar gebieden van spontane differentiatie voorafgaand aan het starten van DE. (B) Voorbeeld van flowcytometrieanalyse van de expressie van de stamcelmarker SSEA4 vóór aanvang van de differentiatie en DE-marker FOXA2 na 3 dagen DE-differentiatie voor een slechte DE-differentiatie (links) en een goede differentiatie (rechts). Elke grafiek vertegenwoordigt de analyse van cellen die zijn geëxtraheerd uit 1; Voor statistische analyse wordt aanbevolen om het gemiddelde te nemen van de resultaten van ten minste 3 flowcytometrieruns. (C) Representatieve beelden van iPSC-differentiatie in hIO op alle bestudeerde matrices. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 5: Selectie van een matrixsysteem voor sferoïde inbedding en hIO-rijping. (A) Voorbeeldafbeeldingen van de rijping van hIO ingebed in Matrix 4-XFO 1-4. De elastische modulus van de Matrix 4-XFO-systemen is ongeveer 50-300 Pa, met de hoogste voor Matrix 4-XFO3 > Matrix 4-XFO4 > Matrix 4-XFO2 > Matrix 4-XFO1. De stijfheid van Matrix 1-ABO en Matrix 3-ABO varieert van 440-800 Pa, afhankelijk van de batch. (B) Voorbeeldafbeeldingen van de rijping van hIO werden ingebed in Matrix 1-ABO, Matrix 3-ABO en Matrix 4-XFO3 op de dag van inbedding (dag 0) en na 1 week cultuur (dag 7). (C) Gegevens die een vergelijking van de grootte van hIO laten zien, gerijpt op de verschillende matrixsystemen. Balken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van n = 7; tweerichtings-ANOVA en post-hoctesten met niet-parametrische Wilcoxon-methode werden gebruikt voor significantietesten. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 6: Representatieve immunofluorescentiebeelden van darmorganoïden die in de verschillende matrices zijn gekweekt, bevestigen de epitheelcelpopulatie. Organoïden van de hele darm die in de verschillende matrices werden gekweekt, werden gefixeerd en gekleurd met epitheelceladhesiemolecuul (EpCAM) (groen) en tegengekleurd voor celkernen DAPI (blauw). Alle organoïden vertonen EpCAM-positieve cellen, wat de epitheelcelpopulatie bevestigt die aan de buitenkant van de organoïden is gelokaliseerd. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenvatting van aliquot bereiding, opslag en verdunning van matrices die worden gebruikt voor het coaten van cultuurgoed dat wordt gebruikt voor iPSC. * Controleer voor een nauwkeurige verdunningsfactor de aanbevolen verdunningsfactor en/of eiwitconcentraties in het analysecertificaat van elke partij. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Referentietabel van het volume coatingoplossingen per oppervlak van cultuurwaren en mTeSR Plus Medium. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Referentietabel van het volume van Matrix 4-XF-precursoroplossingen per oppervlak van kweekgoederen en volledig stamcelmedium. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Lijst met veelgebruikte markers die worden aanbevolen om hiPSC en hIO tijdens het proces te karakteriseren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Samenvatting van media die nodig zijn tijdens hiPSC-differentiatie tot darmorganoïden. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: Specifieke details over de twee hiPSC-lijnen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Algemene MATLAB-code om aan te passen aan het specifieke afbeeldingstype. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het selecteren van de optimale microomgeving voor stamcel- en organoïdewerk is een cruciale eerste stap bij het gebruik van deze platforms voor een breed scala aan toepassingen. Onze representatieve resultaten tonen aan dat Matrix 4-XFO3, in combinatie met een hogere concentratie van groeifactoren, leidt tot grotere organoïden, wat suggereert dat de fysische eigenschappen van xenovrije hydrogels kunnen worden benut om de vorming van organoïden te optimaliseren met behulp van deze systemen. Eerder is aangetoond dat de unieke kenmerken van de extracellulaire matrix (ECM) nauw verweven zijn met de identiteit van de cellen in het orgaan12. Omdat cellen externe krachten waarnemen via integrinen en andere receptoren, hebben de mechanische kenmerken van de ECM een diepgaande invloed op stamcellen, en als reactie daarop kunnen stamcellen interne krachten genereren12. Interacties tussen de stamcellen en hun micro-omgeving zijn essentieel voor het initiëren van diverse signaalroutes12. Bovendien is aangetoond dat de ECM kan dienen als een reservoir voor het opslaan en vrijgeven van groeifactoren en andere signaalmoleculen die het celgedrag beïnvloeden. Daarom benadrukken onze representatieve resultaten en tientallen jaren onderzoek het belang van het in overweging nemen van biochemische en fysische aspecten van de oorspronkelijke celmicro-omgeving en weefseleigenschappen bij het selecteren van matrixsystemen voor in-vitro-onderzoeken 29,30.

Verschillende cruciale stappen en aanbevelingen werden in het protocol uitgelegd om de gebruikers te informeren over mogelijke problemen en manieren om deze te vermijden. Desalniettemin worden in deze methoden twee cruciale stappen gepresenteerd die cruciaal zijn voor een succesvolle implementatie van dit protocol. Ten eerste is het controleren op specifieke markers die verband houden met de stamcelpopulatie cruciaal voor het bepalen van het optimale coatingsysteem om de stamcelpopulatie klaar te houden voor efficiënte gecontroleerde differentiatie. Evenzo is het bevestigen van de expressie van markers die bij elke differentiatiestap horen, essentieel om te beslissen wanneer naar de volgende fase moet worden overgegaan. Dit protocol biedt een algemene richtlijn met betrekking tot de minimale tijd die nodig is in elke fase. Desalniettemin zal de optimale tijd in elke fase variëren voor verschillende cellijnen en experimentele omstandigheden (bijv. genotype, stijfheid). Daarom is het karakteriseren van meerdere fasespecifieke markers de beste aanpak om de efficiëntie van hIO-generatie te verbeteren.

De tweede cruciale stap was het integreren van een hogere concentratie van groeifactoren bij het gebruik van het xenovrije Matrix 4-XF-systeem, wat van het grootste belang is. Een vaak genoemde beperking van xenovrije biomateriaalsystemen is het ontbreken van groeifactoren31. Deze zwakte kan echter een kracht worden: volledige controle over groeifactoren in de systemen om de reproduceerbaarheid te verbeteren. Hoewel dit protocol het gebruik van een in de handel verkrijgbare kit voor media- en groeifactorsuppletie beschrijft, kan dezelfde grondgedachte worden gebruikt bij het intern maken van de complete media met individuele componenten. De specifieke verhouding hydrogel/media bepaalt hoeveel hoger de concentratie van groeifactoren moet zijn; Een verhouding van 2:1 kan bijvoorbeeld een concentratie van 3x groeifactoren vereisen om te eindigen met een concentratie die representatief is voor de standaard complete media die worden gebruikt. De volledige controle van de groeifactoren die in het systeem aanwezig zijn, is gunstig voor het beantwoorden van mechanistische vragen en het vermijden van regelgevingsproblemen voor veel toepassingen.

De beeldverwerkingsstappen die in stap 3 worden beschreven, worden beperkt door de kwaliteit van de beelden en het soort beelden dat wordt gemaakt. Het kan verfijning vereisen om te voldoen aan de specifieke vereisten van elk afbeeldingstype en elke kwaliteit. De algemene stappen van het proces en een voorbeeld van MATLAB-code van het basiskader voor de analyse van de organoïdegrootte op basis van helderveldafbeeldingen helpen echter om een workflow te definiëren die verder kan worden geoptimaliseerd en uitgebreid. Bovendien is de toegang tot een helderveldmicroscoop gebruikelijker dan bij andere soorten microscopen. Hoewel gebrek aan toegang en vertrouwdheid met MATLAB het gebruik van deze code kan beperken, zijn de algemene stappen van het proces compatibel met open-source software zoals Fiji van Image J. Organoïde grootte alleen is geen aanbevolen maatstaf om rijping te beoordelen; het wordt aangemoedigd om te volgen met een evaluatie van specifieke markers die representatief zijn voor het doelorgaan; sommige van deze markers voor darmweefsel zijn opgenomen in tabel 4. Figuur 6 toont een voorbeeld van immunofluorescentiekleuring van hele organoïden met het epitheelceladhesiemolecuul (EpCAM), dat gelokaliseerd is op het buitenoppervlak (basolateraal) van de organoïden. Hoewel EpCAM werd gevisualiseerd in de organoïden die in alle ECM-systemen werden gekweekt, waren er verschillen in de grootte van deze organoïden. Informatie over de grootte van de organoïden helpt dus om de kweekomstandigheden te optimaliseren. Bovendien dient in onderzoeken naar de respons op geneesmiddelen de grootte van de organoïde als maatstaf voor de respons op de geteste verbinding; Veranderingen in grootte kunnen de effectiviteit of toxiciteit van de geteste verbindingen weerspiegelen. Belangrijk is dat het genereren van meerdere batches organoïden met een gestandaardiseerde grootte een huidige uitdaging is in het veld, maar het is een belangrijke maatstaf voor experimentele reproduceerbaarheid, zodat de resultaten kunnen worden vergeleken tussen verschillende experimenten of laboratoria. Al met al is een geautomatiseerde workflow die het mogelijk maakt om belangrijke informatie over organoïden uit helderveldafbeeldingen te extraheren, een nuttig hulpmiddel voor veel onderzoekers.

Beide systemen, matrices van dierlijke oorsprong en xenovrije hydrogels, hebben hun voor- en nadelen. Matrix 2-AB die leidt tot minder sferoïde afgiftes tijdens het MH-stadium dan de andere van dieren afkomstige matrices, kan het gevolg zijn van variaties van partij tot partij, een algemeen bekend kenmerk van in de handel verkrijgbare van dieren afkomstige matrices. Het is belangrijk op te merken dat de concentratie van de in de handel verkrijgbare ECM-systemen varieert; Zo werden de verdunningsfactoren in de productspecificatiebladen gebruikt voor de bereiding van de coatingoplossingen, wat in het geval van de dierlijke matrices tot enigszins afwijkende concentraties zou kunnen leiden. Deze verschillen in eiwitconcentratie kunnen een aanzienlijke invloed hebben op de differentiatie, wat leidt tot variatie in differentiatie-efficiëntie bij gebruik van hetzelfde product uit verschillende partijen. Om tussen deze systemen te kiezen, moet u rekening houden met factoren zoals specifieke experimentele doelen, ethische overwegingen en wettelijke vereisten. In het geval van het vergelijken van in vitro experimentele resultaten met een muisdiermodel om vragen over tumor- en kankerbiologie te beantwoorden, kan het gebruik van matrices die zijn afgeleid van de Engelbreth-Holm Swarm EHS-muis een goede keuze zijn. Omdat producten zoals Matrigel al tientallen jaren worden gebruikt, zijn er ook veel protocollen, gegevens en referenties. Het gebruik van goed gedefinieerde xenovrije matrices die het mogelijk maken om fysische en chemische eigenschappen aan te passen, kan echter een geschiktere optie zijn wanneer de onderzoeksvraag verband houdt met ziekten of therapieën bij de mens. Bovendien zijn de meeste xenovrije hydrogelsystemen ontworpen om te voldoen aan wettelijke normen, waardoor ze een geschikte keuze zijn voor onderzoek dat naleving van goede productiepraktijken (GMP) of andere regelgevende richtlijnen vereist.

Samenvattend, hoewel matrices van dieren op grote schaal zijn gebruikt voor iPSC-onderhoud en het genereren van organoïden vanwege hun biocompatibiliteit, bieden xenovrije hydrogelsystemen voordelen op het gebied van reproduceerbaarheid, kosteneffectiviteit, naleving van regelgeving en ethische overwegingen. De keuze tussen de twee hangt af van de specifieke behoeften van het onderzoek of de klinische toepassing. Xenovrije hydrogelsystemen winnen aan populariteit als een veelzijdiger en duurzamer alternatief dat het gebruik van organoïden en microfysiologische systemen voor de preklinische shortlist van therapeutische kandidaten kan ondersteunen. Deze toepassing kan de vroege ontwikkeling van geneesmiddelen aanzienlijk verbeteren en helpen bij het aanpakken van de huidige uitdagingen op het gebied van klinische vertaling in de farmaceutische industrie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. John Huang is oprichter en CEO van TheWell Bioscience.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen eerdere training en algemene aanbevelingen met betrekking tot het starten van hiPSC- en organoïde-werk van Drs. Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano en Russell D'Souza. Ze bedanken Dr. Chelsey Simmons voor haar begeleiding bij het gebruik van hydrogelsystemen voor in vitro celkweekwerk. Ook willen de auteurs Drs. Christine Rodriguez en Thomas Allison van STEMCELL Technologies bedanken voor hun begeleiding bij hiPSC-cultuur. De auteurs bedanken ook TheWell Bioscience voor het dekken van de publicatiekosten.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)Falcon353504
37 °C water bathVWR
96-well plate Fisher ScientificFB012931
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634
Anti-adherence Rinsing SolutioSTEMCELL Technologies7010
Biological safety cabinet (BSC)Labconco Logic
Brightfield MicroscopeEcho RebelREB-01-E2
BXS0116ATCCACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)ThermoScientific75002441
Conical tubes, 15 mL, sterileThermo Fisher Scientific339650
Conical tubes, 50 mL, sterileThermo Fisher Scientific339652
Cultrex RGF BME, Type 2Bio-techne3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME Bio-techne3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)Thermo Fisher Scientific14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth FactorGibco A14133-02
GlutaMAX SupplementThermo Fischer Scientific35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)Luminex0500-3115
HEPES buffer solutionThermo Fischer Scientific15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)Thermo Scientific 51033775
JMP SoftwareSAS InstituteJMP 16
MATLABMathWorks, IncR2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV freeCorning 356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-freeCorning 354263
mTeSR Plus MediumSTEMCELL Technologies100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plateThermo Scientific144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)BD Pharmingen566841
PE Mouse Anti-human CDX2 BD Pharmingen563428
PE Mouse Anti-human FOXA2BD Pharmingen561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4 BD Pharmingen561565
ReLeSRSTEMCELL5872
SCTi003-ASTEMCELL Technologies200-0510
Serological pipettes (10 mL) Fisher Scientific13-678-11E
Serological pipettes (5 mL) Fisher Scientific13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth MediumSTEMCELL Technologies5145
STEMdiff Intestinal Organoid KitSTEMCELL Technologies5140
Vitrogel Hydrogel MatrixTheWell BioscienceVHM01
VitroGel ORGANOID Discovery KitTheWell BioscienceVHM04-K

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).
  3. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).
  4. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).
  5. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  6. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  8. Tran, O. N., et al. Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).
  9. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  10. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  11. Gjorevski, N., et al. Tissue geometry drives deterministic organoid patterning. Science. 375 (6576), (2022).
  12. Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. Engineering the extracellular matrix for organoid culture. Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).
  13. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  16. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  17. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  18. Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing. Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).
  19. Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf (2024).
  20. biotechne R&D Systems. Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor. biotechne R&D Systems. , (2024).
  21. VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: https://www.thewellbio.com/video-protocols (2024).
  22. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  23. Henderson, J. K., et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).
  24. Haruna, N. F., Huang, J. Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture. J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).
  25. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
  26. Stewart, D. C., et al. Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease. PLoS One. 13, e0200377(2018).
  27. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  28. Broguiere, N., et al. Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel. Adv Mater. 30, 1801621(2018).
  29. Barthes, J., et al. Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances. BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Basement Membrane MatricesHuman Stem CellsIntestinal OrganoidsXeno Free HydrogelOrganoid GenerationStem Cell MaintenanceExtracellular MatrixOrganoid CultureInduced Pluripotent Stem CellsOrganoid Differentiation

Related Articles