We beschrijven een methode om te bestuderen hoe pH reageert op omgevingssignalen in de glycosomen van de bloedbaanvorm van Afrikaanse trypanosomen. Deze aanpak omvat een pH-gevoelige erfelijke eiwitsensor in combinatie met flowcytometrie om de pH-dynamiek te meten, zowel als een tijdverlooptest als in een high-throughput screen-formaat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meten van dynamische glycosomale pH-veranderingen bij levende Trypanosoma brucei
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het glucosemetabolisme is van cruciaal belang voor de Afrikaanse trypanosoom, Trypanosoma brucei, als een essentieel metabolisch proces en regulator van de ontwikkeling van parasieten. Er is weinig bekend over de cellulaire reacties die worden gegenereerd wanneer de glucosespiegels in de omgeving veranderen. Bij zowel bloedbaan- als procyclische parasieten (insectenstadium) herbergen glycosomen het grootste deel van de glycolyse. Deze organellen worden snel verzuurd als reactie op glucosedeprivatie, wat waarschijnlijk resulteert in de allosterische regulatie van glycolytische enzymen zoals hexokinase. In eerder werk was het lokaliseren van de chemische sonde die werd gebruikt om pH-metingen uit te voeren een uitdaging, waardoor het nut ervan in andere toepassingen werd beperkt.
Dit artikel beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van parasieten die glycosomaal gelokaliseerd pHluorin2 tot expressie brengen, een erfelijke proteïne pH-biosensor. pHluorin2 is een ratiometrische pHluorin-variant die een pH-(zuur)-afhankelijke afname van de excitatie vertoont bij 395 nm en tegelijkertijd een toename van de excitatie oplevert bij 475 nm. Transgene parasieten werden gegenereerd door het open leesframe pHluorin2 te klonen in de trypanosoomexpressievector pLEW100v5, waardoor induceerbare eiwitexpressie in beide levenscyclusfasen mogelijk werd. Immunofluorescentie werd gebruikt om de glycosomale lokalisatie van de pHluorin2-biosensor te bevestigen, waarbij de lokalisatie van de biosensor werd vergeleken met het glycosomale residente eiwit aldolase. De reactiesnelheid van de sensor werd gekalibreerd bij verschillende pH-waarden door cellen te incuberen in een reeks buffers die in pH varieerden van 4 tot 8, een benadering die we eerder hebben gebruikt om een op fluoresceïne gebaseerde pH-sensor te kalibreren. Vervolgens hebben we pHluorin2-fluorescentie gemeten bij 405 nm en 488 nm met behulp van flowcytometrie om de glycosomale pH te bepalen. We valideerden de prestaties van de levende transgene parasieten die pHluorin2 tot expressie brachten, waarbij we de pH in de loop van de tijd volgden als reactie op glucosedeprivatie, een bekende trigger van glycosomale verzuring bij PF-parasieten. Deze tool heeft een reeks potentiële toepassingen, waaronder mogelijk worden gebruikt bij het screenen van geneesmiddelen met een hoge doorvoer. Naast de glycosomale pH kan de sensor worden aangepast aan andere organellen of worden gebruikt in andere trypanosomatiden om de pH-dynamiek in de levende celomgeving te begrijpen.
Inleiding
Parasitaire kinetoplastiden zijn, net als de meeste levende organismen, afhankelijk van glucose als een fundamenteel onderdeel van het centrale koolstofmetabolisme. Deze groep omvat medisch belangrijke organismen, zoals de Afrikaanse trypanosoom, Trypanosoma brucei; de Amerikaanse trypanosoom, T. cruzi; en parasieten van het geslacht Leishmania. Het glucosemetabolisme is van cruciaal belang voor de groei van parasieten in de pathogene levenscyclusstadia. Bij gebrek aan glucose sterft bijvoorbeeld de bloedbaanvorm (BSF) van het Afrikaanse trypanosoom snel af. Met name glycolyse dient als de enige bron van ATP tijdens dit stadium van infectie<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het gebruik van T. brucei brucei 90-13 BSF-trypanosomen, een monomorfe parasietlijn, vereist dat rekening wordt gehouden met de veiligheid, aangezien ze worden beschouwd als organismen van risicogroep 2 die moeten worden behandeld in faciliteiten van bioveiligheidsniveau 2.
1. Trypanosoomcultuur en transfectie
- Kweek T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomen in HMI-9 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS en 10% Nu-Serum bij 37 °C in 5% CO210.
OPMERKING: Om de kweek gezond te houden, moet u de celdichtheid tussen 2 × 104 en 5 × 106
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
pHLuorin2-PTS1 lokalisatie naar glycosomen in BSF T. brucei
Om de subcellulaire lokalisatie van de pHluorin2-PTS1 te beoordelen, werden parasieten onderworpen aan immunofluorescentietests. Signaal van het transgen gelokaliseerd met anti-sera verhoogd tegen een glycosoom-resident eiwit, aldolase (TbAldolase) (Figuur 2A). De gemiddelde Pearson's correlatiecoëfficiënt van colokalisatie tussen anti-TbAldolase en pHluorin2-PTS1 was 0,895, wat aangeeft dat pHluorin2-PT.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Omgevingsperceptie en responsmechanismen in het Afrikaanse trypanosoom zijn slecht begrepen. Het is bekend dat veranderingen in de beschikbaarheid van voedingsstoffen verschillende reacties in de parasiet veroorzaken, waaronder verzuring van glycosomen. Hier hebben we een methode beschreven om de glycosomale pH-respons op omgevingsverstoringen in levende cellen te bestuderen met behulp van een erfelijke eiwitsensor, pHluorin2, en flowcytometrie.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het ge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
pHluorin2-PTS1 werd gekloond in pLEW100v5 door Twist Bioscience, die het construct leverde in een kloonvector met hoge kopieën; pLEW100v5 was een geschenk van Dr. George Cross. Antiserum tegen T. brucei aldolase is op aanvraag verkrijgbaar bij Dr. Meredith T. Morris, Clemson University. Het werk van de JCM- en KAC-laboratoria werd gedeeltelijk ondersteund door een prijs van de National Institutes of Health (R01AI156382). SSP werd ondersteund door NIH 3R01AI156382.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistisch software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipettering robot voor HTS-test |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We hebben een aangepaste acryl plaatstandaard gemaakt, zodat dit merk plaat kon worden gedetecteerd en gebruikt op onze CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipettering robot voor HTS-test |
| Voor pH-kalibratie | |||
| Voor pH-kalibratie |
Referenties
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
