Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

Summary

Dit protocol introduceert de tools die beschikbaar zijn voor het modelleren van liganden van kleine moleculen in cryoEM-kaarten van macromoleculen.

Abstract

Het ontcijferen van de eiwit-ligandinteracties in een macromoleculair complex is cruciaal voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme, de onderliggende biologische processen en de ontwikkeling van geneesmiddelen. In de afgelopen jaren is cryogene monsterelektronenmicroscopie (cryoEM) naar voren gekomen als een krachtige techniek om de structuren van macromoleculen te bepalen en om de wijze van ligandbinding bij bijna-atomaire resolutie te onderzoeken. Het identificeren en modelleren van niet-eiwitmoleculen in cryoEM-kaarten is vaak een uitdaging vanwege de anisotrope resolutie over het betreffende molecuul en de inherente ruis in de gegevens. In dit artikel maken de lezers kennis met verschillende software en methoden die momenteel worden gebruikt voor ligandidentificatie, modelbouw en verfijning van atomaire coördinaten met behulp van geselecteerde macromoleculen. Een van de eenvoudigste manieren om de aanwezigheid van een ligand te identificeren, zoals geïllustreerd met het enolase-enzym, is door de twee afbeeldingen die met en zonder het ligand zijn verkregen, af te trekken. De extra dichtheid van het ligand zal waarschijnlijk opvallen in de verschilkaart, zelfs bij een hogere drempel. Er zijn gevallen, zoals aangetoond in het geval van metabotrope glutamaatreceptor mGlu₅, waarin dergelijke eenvoudige verschilkaarten niet kunnen worden gegenereerd. De onlangs geïntroduceerde methode voor het afleiden van de Fo-Fc weglaatkaart kan dienen als een hulpmiddel om de aanwezigheid van het ligand te valideren en aan te tonen. Ten slotte wordt, met behulp van het goed bestudeerde β-galactosidase als voorbeeld, het effect van resolutie op het modelleren van de liganden en oplosmiddelmoleculen in cryoEM-kaarten geanalyseerd en wordt een kijk gepresenteerd op hoe cryoEM kan worden gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen.

Introduction

Cellen vervullen hun functies door talloze chemische reacties tegelijkertijd en onafhankelijk uit te voeren, elk zorgvuldig gereguleerd om hun overleving en aanpassingsvermogen te garanderen als reactie op omgevingssignalen. Dit wordt bereikt door moleculaire herkenning, waardoor biomoleculen, met name eiwitten, voorbijgaande of stabiele complexen kunnen vormen met andere macromoleculen en met kleine moleculen of liganden¹. Eiwit-ligandinteracties zijn dus van fundamenteel belang voor alle processen in de biologie, waaronder de regulatie van eiwitexpressie en -activiteit, de herkenning van substraten en cofactoren door enzymen, evenals hoe cellen signalen waarnemen en doorgeven ^1,2. Een beter begrip van de kinetische, thermodynamische en structurele eigenschappen van het eiwit-ligandcomplex onthult de moleculaire basis van ligandinteractie en vergemakkelijkt ook een rationeel geneesmiddelontwerp door de geneesmiddelinteractie en specificiteit te optimaliseren. Een economische en snellere benadering voor het bestuderen van eiwit-ligandinteractie is het gebruik van moleculaire docking, een computationele methode die virtueel een breed scala aan kleine moleculen screent en de bindingsmodus en affiniteit van deze liganden aan doeleiwitten voorspelt³. Experimenteel bewijs van structuren met een hoge resolutie bepaald door röntgendiffractie (XRD), nucleaire magnetische resonantie (NMR) of elektronencryomicroscopie (cryoEM) levert echter het essentiële bewijs voor dergelijke voorspellingen en helpt bij de ontwikkeling van nieuwere en effectievere activatoren of remmers voor een bepaald doelwit. In dit artikel wordt de afkorting 'cryoEM' gebruikt, zoals de techniek gewoonlijk wordt genoemd. Er is echter een voortdurend debat gaande over het kiezen van de juiste nomenclatuur, en onlangs is de term cryogenic-sample Electron Microscopie (cryoEM) voorgesteld om aan te geven dat het monster op cryogene temperatuur is en in beeld is gebracht met elektronen⁴. Evenzo worden de kaarten die zijn afgeleid van cryoEM elektronenpotentiaal, elektrostatische potentiaal of Coulomb-potentiaal genoemd, en voor de eenvoud gebruiken we hier cryoEM-kaarten 5,6,7,8,9,10.

Hoewel XRD de gouden standaardtechniek is geweest voor de bepaling van de structuur van eiwit-ligandcomplexen met hoge resolutie, is cryoEM na resolutie-revolutie¹¹ in een stroomversnelling geraakt, zoals blijkt uit de golf van Coulomb-potentiaalkaarten of cryoEM-kaarten die de afgelopen jaren in de Electron Microscopy Database (EMDB)^12,13 zijn gedeponeerd14. Als gevolg van de vooruitgang in monstervoorbereiding, beeldvorming en gegevensverwerkingsmethoden is het aantal Protein Data Bank (PDB)^{14-afzettingen} met cryoEM tussen 2010 en 2020 toegenomen van 0,7% naar 17%, waarbij ongeveer 50% van de gerapporteerde structuren in 2020 werd bepaald met een resolutie van 3,5 Å of beter^15,16. CryoEM is snel geadopteerd door de structurele biologiegemeenschap, inclusief de farmaceutische industrie, omdat het de studie mogelijk maakt van flexibele en niet-kristallijne biologische macromoleculen, met name membraaneiwitten en multi-eiwitcomplexen, met een bijna atomaire resolutie, waardoor het proces van kristallisatie wordt overwonnen en goed diffracterende kristallen worden verkregen die nodig zijn voor structuurbepaling met hoge resolutie door XRD.

Nauwkeurige modellering van het ligand in de cryoEM-kaart is van het grootste belang, omdat het dient als een blauwdruk van het eiwit-ligandcomplex op moleculair niveau. Er zijn verschillende geautomatiseerde hulpmiddelen voor het opbouwen van liganden die worden gebruikt in röntgenkristallografie die afhankelijk zijn van de vorm en topologie van de liganddichtheid om het ligand in de elektronendichtheid 17,18,19,20 te passen of te bouwen. Desalniettemin, als de resolutie lager is dan 3 Å, hebben deze benaderingen de neiging om minder gewenste resultaten te produceren omdat de topologische kenmerken waarvan ze afhankelijk zijn voor herkenning en opbouw minder gedefinieerd worden. In veel gevallen zijn deze methoden niet effectief gebleken bij het nauwkeurig modelleren van liganden in cryoEM-kaarten, omdat deze kaarten zijn bepaald in het bereik van lage tot gemiddelde resolutie, meestal tussen 3,5 Å-5 Ź⁷.

De eerste stap in de 3D-structuurbepaling van een eiwit-ligandcomplex door cryoEM omvat ofwel het co-zuiveren van het ligand met het eiwit (wanneer het ligand een hoge bindingsaffiniteit heeft met het eiwit) of het incuberen van de eiwitoplossing met het ligand voor een bepaalde duur vóór de roostervoorbereiding. Vervolgens wordt een klein monstervolume op een met plasma gereinigd holey TEM-rooster geplaatst, gevolgd door flash-invriezen in vloeibaar ethaan en uiteindelijk beeldvorming met een cryo-TEM. De 2D-projectiebeelden van honderdduizenden tot miljoenen individuele deeltjes worden gemiddeld om een 3-dimensionale (3D) Coulomb-potentiaalkaart van het macromolecuul te reconstrueren. Het identificeren en modelleren van liganden en oplosmiddelmoleculen in deze kaarten levert in veel gevallen aanzienlijke uitdagingen op vanwege de anisotrope resolutie over de kaart (d.w.z. de resolutie is niet uniform over het macromolecuul), flexibiliteit in het gebied waar het ligand is gebonden en de ruis in de gegevens. Veel van de modellerings-, verfijnings- en visualisatietools die voor XRD zijn ontwikkeld, worden nu aangepast voor gebruik in cryoEM voor dezelfde doeleinden 18,19,20,21. In dit artikel wordt een overzicht gegeven van verschillende methoden en software die momenteel worden gebruikt om liganden te identificeren, modellen te bouwen en de coördinaten afgeleid van cryoEM te verfijnen. Er is een stapsgewijs protocol opgesteld om de processen te illustreren die betrokken zijn bij het modelleren van liganden met behulp van specifieke eiwit-ligandcomplexen met verschillende resolutie en complexiteit.

De eerste stap in het modelleren van liganden in cryoEM-kaarten omvat de identificatie van de liganddichtheid (niet-eiwit) in de kaart. Als ligandbinding geen conformationele verandering in het eiwit veroorzaakt, dan markeert het berekenen van een eenvoudige verschilkaart tussen het eiwit-ligandcomplex en het apo-eiwit in wezen de gebieden met extra dichtheid, wat de aanwezigheid van het ligand suggereert. Dergelijke verschillen kunnen onmiddellijk worden waargenomen, omdat er slechts twee kaarten nodig zijn, en zelfs tussenliggende kaarten tijdens het proces van 3D-verfijning kunnen worden gebruikt om te controleren of de ligand aanwezig is. Bovendien, als de resolutie hoog genoeg is (<3.0 Å), kan de verschilkaart ook inzicht geven in de locatie van watermoleculen en ionen die interageren met de ligand en de eiwitresiduen.

Bij afwezigheid van de apo-eiwitkaart is het nu mogelijk om Servalcat²² te gebruiken, dat beschikbaar is als een op zichzelf staande tool en ook is geïntegreerd in de CCP-EM-softwaresuite^23,24 als onderdeel van de Refmac-verfijning en in CCP4 8.0 release^25,26. Servalcat maakt het mogelijk om een FSC-gewogen verschilkaart (Fo-Fc) te berekenen met behulp van de niet-verscherpte half-maps en het apoproteïnemodel als invoer. De Fo-Fc weggelaten kaart geeft de ongelijkheid weer tussen de experimentele kaart (Fo) en de kaart die is afgeleid van het model (Fc). Bij afwezigheid van een ligand in het model, suggereert een positieve dichtheid in een Fo-Fc-kaart die overlapt met de experimentele EM-kaart doorgaans de aanwezigheid van het ligand. De aanname hier is dat de eiwitketen goed in de kaart past, en de resterende positieve dichtheid geeft de locatie van het ligand aan. Het is echter belangrijk om nauwgezet te onderzoeken of de positieve dichtheid voortkomt uit onnauwkeurigheden in het modelleren, zoals de verkeerde rotamer van een eiwitzijketen.

De tweede stap is het verkrijgen of maken van een cartesisch coördinatenbestand van de ligand met een goed gedefinieerde geometrie op basis van de beschikbare chemische informatie. Standaard liganden (bijvoorbeeld ATP en NADP⁺) die al beschikbaar zijn in de CCP4-monomeerbibliotheek kunnen worden gebruikt voor verfijning door de coördinaten- en geometriebestanden op te halen via hun monomeertoetredingscode. Voor onbekende of niet-standaard liganden zijn er echter verschillende tools beschikbaar om de geometriebestanden te maken. Enkele van de voorbeelden zijn de eLBOW²⁷ - (elektronische ligandbouwer en optimalisatiewerkbank) in Phenix²⁸, Lidia - een ingebouwde tool in Meerkoet²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep^32-een module van Glide binnen de Schrödinger-suite. Het ligandcoördinatenbestand wordt vervolgens in de dichtheid gepast, geleid door zowel de experimentele cryoEM-kaart als de verschilkaart in Coot. Dit wordt gevolgd door real-space verfijning in Phenix²⁸ of wederzijdse verfijning in Refmac³³. Een Linux-werkstation of een laptop uitgerust met een goede grafische kaart en de bovengenoemde software is vereist. De meeste van deze programma's zijn opgenomen in verschillende suites. CCP-EM²⁴ en Phenix²⁸ zijn gratis beschikbaar voor academische gebruikers en bevatten een verscheidenheid aan tools die in dit artikel worden gebruikt, waaronder Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, enz. Evenzo bieden Chimera³⁷ en ChimeraX³⁸ gratis licenties aan academische gebruikers.

Protocol

1. Modellering van fosfoenolpyruvaat (PEP) in enolase uit Mycobacterium tuberculosis

1. Identificatie van liganddichtheid in de cryoEM-kaart van het PEP-enolasecomplex
   1. Download de onverscherpte half-maps (emd_30988_additional_1.map en emd_30988_additional_2.map) van apo-enolase uit de aanvullende gegevens in EMDB (zie Tabel met materialen).
   2. Open ChimeraX (zie Tabel met materialen). Open de halve kaarten van apo-enolase door op Openen te klikken in de werkbalk en de bestandsnamen te selecteren. Typ vop voeg #1 #2 toe in de opdrachtregel om beide halve kaarten te combineren om de apo-enolase niet-verscherpte kaart te verkrijgen.
      OPMERKING: #1 en #2 geven de twee halve afbeeldingen aan voor het apo-enolase-enzym, zoals vermeld in stap 1.1.1.
   3. Hernoem de gecombineerde kaart (ChimeraX-kaart-ID: #3) door hernoem #3 Apo-enolase-unsharpened-map te typen. Kleur de kaart grijs in het modelpaneel. De kaart geeft aan dat enolase octameer is in de oplossing met D4-symmetrie.
   4. Herhaal de stappen 1.1.1-1.1.3 met behulp van de volgende halve kaarten emd_30989_additional_1.map (kaart-ID: 4) en emd_30989_additional_2.map (kaart-ID:5) om PEP-enolase-unsharpened-map (kaart-ID: #6) te verkrijgen.
   5. Om een verschilkaart te berekenen, past u eerst de twee kaarten (PEP-enolase en apo-enolase onverscherpte kaarten uit stap 1.1.3 en stap 1.1.4) op elkaar door te klikken op Fit (kaart in kaart) in het Kaartpaneel (werkbalk) in ChimeraX.
      OPMERKING: Er wordt geen normalisatie uitgevoerd tussen de twee kaarten. In sommige gevallen kan normalisatie nodig zijn om de kaarten op dezelfde schaal te brengen.
   6. Trek de PEP-enolase-kaart af van de apo-enolase-kaart door vop subtract #6 #3 in de opdrachtregel te typen.
      OPMERKING: #6 = PEP-enolase onverscherpte kaart, #3 = Apo-enolase onverscherpte kaart.
   7. Kleur de afgetrokken kaart (kaart-ID:7) in groen, wat een positieve dichtheid aangeeft (volgens de conventie in röntgenkristallografie)³⁹.
   8. Download de coördinaten van M. tuberculosis octameric enolase (PDB: 7e4x) van de Protein Data Bank (PDB), klik op openen in de werkbalk en selecteer de bestandsnaam.
   9. Hernoem het model 7e4x.pdb door hernoem #8 Apo_enolase.pdb in de opdrachtregel te typen. #8 geeft de Apo_enolase.pdb aan in ChimeraX.
   10. Selecteer het model in het modelpaneel. Klik op de rechtermuisknop in de werkbalk. Klik op Molecuul verplaatsen om het model in de buurt van de PEP-enolase-kaart (#6) te plaatsen en het model uit te lijnen ten opzichte van de kaart. Pas dit model in de PEP-enolase-unsharpened-map door fit #8 in #6 in de opdrachtregel te typen. Hier is de kaart genummerd 6 en het model is genummerd 8.
       OPMERKING: In sommige gevallen is de lokale pasvorm in ChimeraX mogelijk niet voldoende om het model uit te lijnen. In deze gevallen kan een extra stap van globale aanpassing (DockinMap, zie Tabel met materialen) worden uitgevoerd in Phenix.
   11. Sla het aangepaste model op door save Apo-enolase.pdb #8 in de opdrachtregel te typen.
2. Modellering en verfijning van PEP in de B-factor verscherpte cryoEM kaart van PEP-enolase complex
   1. Open "meerkoet" (zie Materiaaltabel) vanuit de terminal door ./Meerkoet &. in te typen.
   2. Geef "Apo-enolase.pdb" weer door op Bestand te klikken > Open Coördinaten Apo-enolase.pdb. Het coördinatenbestand wordt weergegeven door bindingen (kleur per atoom).
   3. Download de PEP-gebonden Enolase verscherpte kaart, d.w.z. emd_30989.map van EMDB. Geef hetzelfde weer door op Bestand te klikken > Open Map > emd_30989.map . Stel de drempel in op 7,00 σ door met de middelste muisknop te scrollen.
   4. Zoek niet-gemodelleerde blobs door te klikken op >Niet-gemodelleerde blobs valideren > Blobs zoeken.
   5. Lokaliseer de niet-gemodelleerde liganddichtheid in de buurt van de actieve siteresiduen, Ser 42, Lys-386 en Arg-364 van het enolasemodel.
   6. Haal het PEP-monomeermodelbestand uit de Meerkoet-monomeerbibliotheek door op Bestand > Get Monomer te klikken en PEP in te voeren als de 3-lettercode.
   7. Verplaats het PEP-molecuul naar de dichtheid met behulp van de optie Roteren/Vertalen- Zone/Keten/Molecuul in het zijbalkmenu. Gebruik real-space verfijning in Meerkoet om het PEP-molecuul in de dichtheid te passen door te klikken op Real Space Refine Zone in het zijbalkmenu. Voeg de aangebrachte ligand samen met de Apo-enolase.pdb met behulp van de optie molecuul samenvoegen in het tabblad Bewerken . Sla het model op als PEP-Enolase.pdb.
      OPMERKING: Men kan ook ligand gebruiken> Jiggle-Fit Ligand optie om ook op de ligand te passen.
   8. Om liganden toe te voegen aan de rest van de monomeren in het coördinatenbestand, klikt u op Bereken > NCS-tools > NCS-liganden. Er verschijnt een apart venster met de naam Find NCS-Related Ligands. Selecteer voor de optie Eiwit met NCS het coördinatenbestand Apo-enolase.pdb en Keten-ID A als NCS-hoofdketen.
      1. Selecteer voor het molecuul dat ligand bevat de Apo-enolase.pdb als het coördinatenbestand en Keten-ID, J en residunummer 1 tot 1. Klik op Vacatures voor kandidaten zoeken. Er verschijnt een venster met de naam Fitted Ligands met een lijst met kandidaatposities. Evalueer de pasvorm door op de individuele kandidaat-liganden te klikken en analyseer de pasvorm visueel.
         OPMERKING: In Servalcat/Refmac kan alleen een monomeermodel worden geleverd en kan de symmetrie die bij de reconstructie wordt gebruikt, worden gegeven om een uitgebreid model te verkrijgen.
   9. Extra dichtheid voor de oplosmiddelmoleculen werd ook waargenomen in de buurt van het ligand. Kristalstructuren met hoge resolutie van enolase uit verschillende homologen suggereren de aanwezigheid van twee Mg^2+-ionen^40,41, die waarschijnlijk de negatieve lading van het reactietussenproduct stabiliseren. Modelleer twee Mg^2+-ionen in de dichtheid van de actieve plaats door te klikken op atoom plaatsen bij de aanwijzer en MG te selecteren in de lijst met atoomtypelijsten.
      OPMERKING: De geometrie en afstand van de binding kunnen als richtlijn worden gebruikt om het metaalion te selecteren. In het geval van Mg²⁺ gebonden aan zuurstofatomen in eiwitresiduen, varieert de bindingsafstand tussen 2,1 Å -2,4 Å, met een octaëdrische geometrie. In het geval van kaarten met een lage resolutie is de coördinatiesfeer echter vaak onvolledig en kan de afstand ook variëren vanwege beperkingen in de resolutie.
   10. Herhaal stap 1.2.8 om de Mg²⁺ -ionen toe te voegen aan de symmetriegerelateerde monomeren.
   11. Sla het model op door op Bestand te klikken > Coördinaten opslaan > Selecteer Bestandsnaam > en typ Enolase+PEP+Mg.pdb.
   12. Open Phenix GUI (zie Tabel met materialen). Voer een echte ruimteverfijningstaak uit met de Enolase+PEP+Mg.pdb en de emd_30989.map als respectievelijk het invoermodel en de kaart, met behulp van standaardparameters. Deze stap wordt iteratief uitgevoerd met Meerkoet om een goede pasvorm en geometrie van het kaartmodel te bereiken.
       OPMERKING: De onverscherpte verschilkaart wordt gebruikt om de aanwezigheid van ligand aan te tonen, zoals in een figuur. Voor modelleringsdoeleinden is de B-factor verscherpte kaart gebruikt en wordt aanbevolen. De B-factor verscherpte kaart kan ook worden gebruikt om de verschilkaart te berekenen voor demonstratiedoeleinden, in tegenstelling tot de niet-verscherpte kaart. Als de resolutie echter lager is in het gebied waar het ligand is gebonden, is het mogelijk dat de enkele B-factor die wordt gebruikt voor het verscherpen van de hele kaart de liganddichtheid niet duidelijk weergeeft.
3. Visualisatie en figuurgeneratie van het gemodelleerde ligand
   1. Open het verfijnde Enolase+PEP+Mg-model van de uiteindelijke Phenix-verfijningstaak in PyMOL⁴² (zie Materiaaltabel) door op Bestand > Openen te klikken en de bestandsnaam te selecteren.
   2. Laad de emd-30989.map (PEP-gebonden verscherpte kaart) door op Bestand > Openen te klikken en de bestandsnaam te selecteren.
   3. Wijzig de naam van de kaart in PEP-verscherpt door op acties te klikken > hernoemen tegen het emd_30989 object en PEP-verscherpt te typen.
      OPMERKING: In de meeste gevallen, bijvoorbeeld enolase, worden de kaarten bij het openen in pymol genormaliseerd omdat de optie kaart normaliseren standaard is aangevinkt in pymol. Aangezien cryoEM-kaarten zijn gecentreerd op een grotere doos, zal de normalisatie alles in de doos omvatten. Normalisatie kan dus worden uitgeschakeld voordat deze in pymol wordt geopend.
   4. Selecteer de liganden door op weergeven > volgorde te klikken.
   5. Typ isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 in de opdrachtregel en druk op enter.
   6. Kleur de mesh_ligand blauw door op het laatste vakje, C, naast het mesh_ligand object te klikken.
   7. Geef de residuen van de actieve plaats weer, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 en Lys-386 die interageren met de PEP en Mg²⁺ in respectievelijk stok- en bolrepresentatie, en het enolase-enzym in cartoonrepresentatie.
   8. Ray trace door ray 3600, 3600 te typen om afbeeldingen van publicatiekwaliteit te genereren en op te slaan als een png-bestand door op Bestand > opslaan te klikken en PEP.png als bestandsnaam te kiezen.

2. Modellering van liganden in metabotrope glutamaatreceptor mGlu₅

1. Identificeren en modelleren van de liganddichtheid in de cryoEM-kaart van agonist- en antagonist-gebonden mGlu₅
   1. Download de twee halve afbeeldingen samen met de bijbehorende coördinatenbestanden voor elk van de agonist-gebonden (EMD-31536, 7fd8.pdb) en de antagonist-gebonden (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu_5-complexen .
   2. ChimeraX openen
      1. Open het coördinatenbestand, 7fd8.pdb door op openen te klikken en 7fd8.pdb te selecteren.
      2. Typ delete ligand in de opdrachtregel en druk op Enter.
      3. Gebruik op dezelfde manier het commando delete/B om de keten B te verwijderen.
         OPMERKING: Liganden en ketens kunnen worden verwijderd met behulp van het vervolgkeuzemenu bovenaan met behulp van selecteren en acties > atomen/bindingen > verwijderen.
      4. Sla de niet-geligandeerde pdb op door het volgende in de opdrachtregel te typen: sla 7fd8_noligand_chainA.pdb #1 op. #1 geeft de model-ID aan.
      5. Herhaal de stappen 2.1.2.1-2.1.2.4 voor 7fd9.pdb.
   3. CCP-EM openen. Maak een nieuw project aan met de naam mGlu₅ en geef de projectmap en gebruikersnaam op.
      1. Open Relion vanuit de opties in het linkerdeelvenster.
         1. Ga naar het tabblad Masker maken .
         2. Geef een van de halve kaarten voor EMD-31536 op als invoer.
            OPMERKING: Relion accepteert kaarten met .mrc als achtervoegsel en de EMD-kaarten hebben het achtervoegsel .map. De kaartbestanden kunnen in ChimeraX worden geopend voor onderzoek en worden opgeslagen in het .mrc-formaat.
         3. Geef op het tabblad Masker de pixelgrootte op als 0,89 Å en de initiële binarisatiedrempel als 0,007.
         4. Voer de taak uit met de alias 31536 (of een andere naam die gemakkelijk te volgen is).
         5. Maak op dezelfde manier een masker voor de EMD - 31537 halve kaart.
      2. Open het Refmac Servalcat-programma vanuit de opties in het linkerdeelvenster in CCPEM.
         1. Geef de naam op als mGlu₅_agonist.
         2. Importeer het 7fd8_noligand_chainA .pdb-bestand zoals beschreven in modelsectie 2.1.2.4. Geef de locatie van de twee halve kaarten en het bijbehorende masker op dat in Relion is gemaakt.
         3. Geef de resolutie op als 3,8 Å.
         4. Ga naar verfijningsinstellingen > Strikte symmetrie en vermeld C2 als de symmetrie van de Relion-puntgroep.
         5. Start het programma door op de startknop bovenaan te drukken.
   4. Zodra de taak is voltooid, opent u het resultaat in Meerkoet (optie beschikbaar bovenaan in het resultatengedeelte). Dit zal standaard een diffmap.mtz in Coot weergeven, waarbij de kleuren rood en groen respectievelijk negatieve en positieve dichtheden aangeven.
      1. Ga naar Display manager > eigenschappen van de verschilkaart met het label DELFWT PHDELWT en verander het contourniveau naar 4.0 (absolute waarde).
         OPMERKING: De keuze van de drempel is afhankelijk van de kaart en de resolutie.
      2. Verberg de kaart met het label FWT PHWT en het molecuul met het label refined.pdb.
      3. Verplaats de kaart met de muis om de positieve dichtheid te visualiseren (groen gekleurd) en breng de grotere klodder naar het midden.
      4. Ga naar Bestand > monomeer ophalen, typ QUS en druk op enter.
      5. Ga naar Bereken > modellering > Rigid Body Fit-molecuul en dubbelklik op het QUS-monomeer om het molecuul aan te passen aan de Fo-Fc-dichtheid.
      6. Gebruik de optie molecuul samenvoegen op het tabblad Bewerken om het QUS-molecuul toe te voegen aan het coördinatenbestand, refined.pdb.
      7. Herhaal stap 2.1.4.3-2.1.4.6 om de ligand met monomeercode NAG en CHS in de kleinere blob in respectievelijk het extracellulaire en aan de bovenkant van het transmembraandomein te passen.
      8. Sla de coördinaat op als refined_ligands.pdb.
         OPMERKING: De resolutie van het transmembraan (TM) domein is lager en wordt hier dus niet besproken.
2. Verfijning van de mGlu₅ geligandeerde structuur
   1. Open CCPEM en kloon de vorige verfijningstaak (stap 2.1.3.2) en voer deze uit met de refined_ligands.pdb en de verscherpte kaart (emd. 31536.mrc) als invoer, met behulp van standaardparameters en C2-symmetrie.
      OPMERKING: Als het programma de ligand niet herkent, moeten de CIF-bestanden worden aangeleverd. Deze CIF-bestanden kunnen worden gedownload van de PDB of worden gegenereerd met behulp van verschillende programma's (zie stap 3.1.1 voor details).
3. Visualisatie en figuurgeneratie in PyMOL
   1. Open het refined_expanded.pdb-model van de nieuwste Refmac-verfijningstaak in PyMOL.
   2. Ga naar Bestand > Open en blader naar de Refmac-taakmap om het bestand diffmap_normalised_fofc.mrc (verschilkaart van Servalcat-taak in stap 2.1.3.2) te laden.
      OPMERKING: Als de bestanden met de extensie .mrc niet zichtbaar zijn tijdens het browsen, wijzig dan het bestandstype in alle bestanden en blader.
   3. Selecteer de liganden met behulp van weergave > volgorde.
   4. Ga naar de knop Acties en hernoem de selectie naar liganden.
   5. Typ het volgende in de opdrachtregel en druk op enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, liganden, carve=2.5.
      OPMERKING: De maaswijdte kan worden aangepast. Hier wordt 0,2 maaswijdte gebruikt, en dit wordt ingesteld met behulp van het volgende commando: set mesh_width=0,2.
   6. Klik met de rechtermuisknop op een van de monomeren en ga naar keten > kleur om de kleur van elk monomeer op te geven. Kleur de ligand en het net met behulp van het laatste vak met het label c in de ligand en mesh_ligands objecten. Het mGlu 5-receptordimeer wordt getoond in cartoonweergave en de monomeren zijn gekleurd in groenblauw en tarwe. Liganden worden weergegeven in een stok en het gaas dat de liganden omlijnt, is groen gekleurd.
   7. Gebruik de acties > de optie oriënteren/centreren/zoomen tegen de objecten en pas deze handmatig aan om het net duidelijk te visualiseren. Selecteer de residuen in de buurt die interactie kunnen hebben met de ligand, bijvoorbeeld Tyr64, Trp100 voor QUS, en geef indien nodig hun zijketen of hoofdketen of beide weer als stickweergave.
   8. Ray trace om afbeeldingen met een hoge resolutie te genereren en deze op te slaan als een png-bestand.
      OPMERKING: De bovenstaande stappen worden herhaald voor de antagonist-gebonden kaart EMD-31537 en het bijbehorende coördinatenbestand PDB-7fd9.

3. Modellering van de inhibitor, deoxygalacto-nojirimycine (DGN) en oplosmiddelmoleculen in een verscherpte kaart met hoge resolutie van β-galactosidase

1. Identificatie van het ligand, DGN, met behulp van de halve kaarten van cryoEM
   1. Voorbereiding van een onbekend Ligand-woordenboek voor modellering [Deoxygalacto-nojirimycine (DGN)]
      OPMERKING: Het woordenboekbestand Deoxygalacto-nojirimycine is opgenomen in de CCP4-monomeerbibliotheek als DGJ (ligand-ID van 3 letters). Desalniettemin wordt het hier beschouwd als een nieuwe en onbekende ligand om het proces van het genereren van woordenboekbestanden voor onbekende liganden te illustreren, DGN wordt gebruikt als de 3-lettercode.
      1. Open de samenvatting van de verbindingen voor deoxygalacto-nojirimycine (DGN) op de PubChem-webpagina en kopieer de smiles-tekenreeks voor de verbinding deoxygalacto-nojirimycine.
      2. Open Phenix > Liganden > eLBOW.
      3. Geef de tekenreeks 'Smiles' op als invoer.
      4. Geef de juiste optimalisatiemethode voor ligandopbouw op. Hier wordt gebruik gemaakt van eenvoudige optimalisatie.
      5. Plak de tekenreeks voor chemische glimlachen in het gedeelte over de liganddefinitie.
      6. Geef op de juiste manier een functietitel, het voorvoegsel van het uitvoerbestand en de ligand-ID op en druk op uitvoeren.
         OPMERKING: De uitvoer van de taak bevat een coördinatenbestand, DGN.pdb, en een woordenboekbestand, DGN.cif-bestand. Jligand²⁹ kan ook worden gebruikt om het cif-bestand te maken.
   2. Download het β-galactosidase coördinatenbestand (6tsh.pdb) van de PDB en verwijder de coördinaten voor de eiwitketens (B, C, D), ligand, DGN en andere oplosmiddelmoleculen met behulp van een teksteditor of de optie voor het verwijderen van ketens/zones in Coot. Sla het coördinatenbestand op als apo-betaGal_chainA.pdb.
      OPMERKING: ChimeraX of Pymol kan ook worden gebruikt om het ligand/oplosmiddelmolecuul te verwijderen.
   3. Download de halve kaarten (emd_10563_half_map_1.map en emd_10563_half_map_2.map) van aanvullende gegevens van de EMD-10563-vermelding van EMDB.
   4. Open CCPEM en gebruik Relion om het masker voor de kaart te maken op een drempel van 0,01 (zoals beschreven in de stappen 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
   5. Voer Servalcat uit (binnen de CCPEM-suite zoals beschreven in stap 2) met de half-maps verkregen in stap 3.1.3 en het apo-model in stap 3.1.2 en D2-symmetrie.
      OPMERKING: Het model moet worden uitgelijnd met een van de halve kaarten of volledige kaarten voor het lokaliseren van de liganddichtheid. Dit kan worden gedaan door het model in de kaart te passen met behulp van ChimeraX en vervolgens de coördinaten ten opzichte van de halve kaart op te slaan. In dit voorbeeld hebben half-maps en de primaire map in EMDB verschillende vakformaten/rasters en moet het model in de half-map worden geplaatst.
   6. Open Meerkoet.
      1. Open DGN.cif voor het ligandwoordenboek zoals gegenereerd in stap 3.1.1 met Phenix eLBOW. Dit wordt gedaan door naar Bestand > CIF-woordenboek importeren te gaan en door de eLBOW-taakmap te bladeren.
      2. Open de eiwit- en ligandcoördinatenbestanden, respectievelijk apo-betaGal_chainA.pdb uit stap 3.1.2 en DGN.pdb uit stap 3.1.6.
      3. Open automatisch het bestand diffmap.mtz vanuit de Servalcat-taak (stap 3.1.5) en visualiseer de kaart met het label DELFWT PHDELWT in Coot. Contour de kaart op een drempel van ~ 4 absolute waarde.
         OPMERKING: Het is belangrijk om de kaartstatistieken te controleren door header map.mrc te typen of tools in Chimera te gebruiken. Alle benodigde informatie over de pixelgrootte, doosgrootte, minimale, gemiddelde en maximale dichtheid en rms-afwijking van de gemiddelde dichtheid kan worden verkregen. Het is van cruciaal belang om de pixelgrootte en doosgrootte van de cryoEM-kaarten te controleren. De 3D-kaart vertegenwoordigt het eiwit-ligandkaartvolume in een raster van 3D-voxels. In elke voxel wordt de elektronenpotentiaalwaarde of de kans dat het elektron op die locatie wordt gevonden, opgeslagen. Wanneer een bepaalde drempel wordt gekozen, worden de voxels, die een dichtheid hebben die lager is dan de opgegeven waarde, op nul gezet. Dit helpt om de experimentele ruis in de kaart te minimaliseren en de kaartkenmerken beter te visualiseren⁴³. De kaart moet dus worden omlijnd op een drempel waar de kaartkenmerken gemakkelijk zichtbaar zijn en de ruis op de kaart minimaal is.
      4. Ga naar Ligand > Liganden te vinden. Selecteer in het nieuwe venster dat verschijnt ligand, de verschilkaart en het apo-betaGal_chainA.pdb-model. Laat de andere opties op hun standaardinstellingen staan en klik op Liganden zoeken om het zoeken te starten.
      5. Een lijst met toptreffers die de potentiële liganddichtheid aangeven, wordt weergegeven met een kopie in elk van de dichtheden. Controleer handmatig alle treffers waar de ligand is geplaatst. Bewaar de meest waarschijnlijke treffers en verwijder de dubbelzinnige.
         OPMERKING: Het verschil in kaartdichtheid bij een hoge drempel suggereert duidelijk de aanwezigheid van het ligand in de actieve site.
2. Modellering van de ligand DGN en oplosmiddelmoleculen
   1. Voer een echte ruimteverfijning uit in Meerkoet om de ligand (DGN.pdb) in de verschildichtheidskaart te laten passen, en voeg vervolgens de ligandcoördinaten samen met de apo-betaGal_chainA.pdb en sla deze op als betaGal_chainA+ligand.pdb.
      OPMERKING: De liganden die in gebieden van andere ketens zijn geplaatst, kunnen worden verwijderd en worden niet samengevoegd tijdens het opslaan van het samengevoegde coördinatenbestand. De liganden in andere ketens kunnen worden gegenereerd door NCS-liganden, zoals weergegeven in voorbeeld 1, stap 1.2.8, of in Refmac/Servalcat met behulp van symmetrie-uitbreiding.
   2. Voer nog een Servalcat-taak uit zoals hierboven (stap 3.1.5) met betaGal_chainA+ligand.pdb als invoermodel en de half-maps (uit stap 3.1.3) met D2-symmetrie.
   3. Verschildichtheid (van de Servalcat-taak in stap 3.2.2) rond het gemodelleerde ligand suggereert de aanwezigheid van de oplosmiddelmoleculen die coördineren met het ligandmolecuul. De centrale dichtheid dicht bij het ligand lijkt te groot voor watermoleculen.
   4. Op basis van eerdere biochemische en structurele gegevens die de aanwezigheid van Mg²⁺ op die positie aangeven, wordt het Mg^2+- ion hier gemodelleerd door op de optie plaatsatoom te klikken en het atoom als MG te specificeren.
   5. Modelleer watermoleculen in de verschildichtheid op de actieve plaats die de aanwezigheid van een oplosmiddelmolecuul aangeven door op het plaatsatoom op de aanwijzer te klikken en water te selecteren.
      OPMERKING: Meerkoet heeft ook de mogelijkheid om automatisch watermoleculen te kiezen. Hier, aangezien de focus alleen op de actieve site ligt, worden watermoleculen handmatig toegevoegd.
   6. Voeg de coördinaten voor Mg²⁺ en water samen met het bestand betaGal+ligand.pdb en sla het op als betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
   7. Met de betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb voer je Refmac-verfijning uit in Servalcat met D2-symmetrie.
      OPMERKING: De outputverschilkaart van deze taak kan dienen als een middel om te valideren of de ligand nauwkeurig is gemodelleerd, aangezien de verschilkaart een minimale resterende positieve of negatieve dichtheid moet laten zien.
3. Visualisatie en figuurgeneratie met PyMOL
   OPMERKING: De hieronder beschreven stappen geven enkele voorbeelden van het maken van figuren met behulp van modellen en kaarten die kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van liganden en oplosmiddelen te illustreren.
   1. Open de refined_expanded.pdb van de laatste Servalcat-taak (stap 3.2.6) met de ligand en het oplosmiddel gemodelleerd.
   2. Selecteer verschillende kettingen afzonderlijk om ze magenta, geel, groen en groenblauw te kleuren, zoals beschreven in voorbeeld 2.
   3. Ga naar Weergave > volgorde, maak afzonderlijke selecties voor de watermoleculen, magnesium en DGN, en hernoem de objecten respectievelijk water, MG en DGN.
   4. Geef MG- en watermoleculen weer als bollen door de objecten te selecteren, met de rechtermuisknop te klikken en > bol te tonen. Geef op dezelfde manier de ligand weer in stickweergave en kleur de liganden en oplosmiddelen op de juiste manier. In dit geval is het ligand geel gekleurd door een heteroatoom, het magnesiumion is paars gekleurd en watermoleculen zijn rood gekleurd.
   5. Selecteer DGN-, MG- en watermoleculen. Klik met de rechtermuisknop en selecteer acties > naar object te kopiëren en het een naam te geven als liganden.
   6. Open de diffmap_normalised_fo.mrc van de Servalcat-taak in stap 3.2.6 en hernoem deze naar ligand_fo.mrc. Typ het volgende commando: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, liganden, carve=2.
      OPMERKING: De snijoptie van 2 Å wordt toegepast rond de atomen en afhankelijk van de resolutie en kwaliteit van de kaarten kunnen waarden van 3-5 worden gebruikt. Verder is het bij het openen van cryoEM-kaarten in PyMOL aan te raden om normalize_ccp4_maps uit te zetten.
   7. Gebruik de acties > oriënteren/zoomen opties en pas deze handmatig aan om de liganden en nabijgelegen interagerende residuen (indien van toepassing) te visualiseren, zoals weergegeven in stap 2.3.7.
   8. Ray trace deze scènes om afbeeldingen met een hoge resolutie op te slaan met behulp van de opdracht ray 3600, 3600.
   9. Sla de scène op als .png bestand.
      OPMERKING: De volgende stappen zijn optioneel en schetsen het proces om (1) de verschildichtheid (Fo-Fc) voor het niet-gemodelleerde ligand, DGN, (2) de dichtheid (Fo) van het gemodelleerde ligand, DGN, evenals de verschildichtheid (Fo-Fc) voor niet-gemodelleerde oplosmiddelen en ten slotte voor de (3) de dichtheid (Fo) voor het gemodelleerde ligand, DGN en de oplosmiddelmoleculen op de actieve plaats.
   10. Om de aanwezigheid van de ligand-, DGN- en omringende oplosmiddelmoleculen aan te tonen met behulp van de verschilkaart, opent u diffmap_normalised_fofc.mrc van de Servalcat-taak in stap 3.1.5. Wijzig de naam van het kaartbestand in unliganded_fofc.mrc door op acties te klikken > de naam wijzigen naast het kaartobject. Typ het volgende in de opdrachtregel: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, liganden, level=6, carve=2.
   11. Om de dichtheid van het gemodelleerde ligand, DGN, en de omringende niet-gemodelleerde oplosmiddeldichtheid aan te tonen, opent u zowel de diffmap_normalised_fo.mrc als diffmap_normalised_fofc.mrc van de servalcat-taak in stap 3.2.2. Hernoem de diffmap_normalised_fo.mrc als DGN_fo en de diffmap_normalised_fofc.mrc als DGN_unmodelled_solvents_fofc.
   12. Selecteer MG en water in Display > Sequence, klik met de rechtermuisknop en selecteer acties > naar object te kopiëren en noem ze als oplosmiddelen.
   13. Typ het volgende in de opdrachtregel: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, niveau=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, oplosmiddelen, niveau=6, carve=2.
       OPMERKING: De mesh_DGN_fo toont de dichtheid van het ligand en de mesh_solvent_fofc toont de weggelaten dichtheid voor de MG en water.
   14. Ten slotte, om de gemodelleerde liganden en de omringende oplosmiddelmoleculen in de actieve site te visualiseren, opent u de diffmap_normalised_fo.mrc van de Servalcat-taak in stap 3.2.6 en hernoemt u deze naar ligand_fo.mrc.
   15. Typ het volgende in de opdrachtregel: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
       OPMERKING: Hier hebben we diffmap_normalised_fo.mrc gebruikt, maar de uiteindelijke verscherpte kaart kan worden gebruikt om de dichtheid van liganden en de omringende residuen weer te geven. Het is een goede gewoonte om het type kaart dat wordt gebruikt, B-factor verscherpingswaarden te vermelden in de legenda van de figuur.
   16. De maaswijdte en bolgrootte kunnen worden ingesteld door de volgende commando's te typen: set mesh_width=0.2 en set sphere_scale=0.25 om de bolgrootte kleiner te maken.
   17. Kleur de fo mesh blauw en de fofc mesh groen.
   18. Gebruik de acties > oriënteren/zoomen opties en pas deze handmatig aan om de liganden en nabijgelegen interagerende residuen te visualiseren (indien van toepassing), zoals weergegeven in stap 2.3.7.
   19. Ray trace deze scènes om afbeeldingen met een hoge resolutie op te slaan met behulp van de opdracht ray 3600, 3600.
   20. Sla de afzonderlijke scènes op als .png bestanden.

4. Effect van resolutie op ligandmodellering in β-galactosidase

1. Open Terminal en ga naar de map met de twee halve kaarten.
2. Open de twee half-maps (stap 3.1.3) in .map formaat in ChimeraX, visualiseer ze en sla ze op als emd10563_half1_1_unfil.mrc en emd10563_half2_1_unfil.mrc.
3. Het masker dat in stap 3.1.4 is gemaakt, kan als invoer worden gebruikt.
4. Voer een PostProcessing-taak uit in Relion met behulp van halve toewijzingen en maskers uit stap 4.2-4.3, met de standaardparameters.
5. Herhaal stap 4.4, nu met een Skip FSC-weging ingeschakeld en met een ad-hoc laagdoorlaatfilter van 3 Å.
6. Herhaal stap 4.4 met een ad-hoc laagdoorlaatfilter van 3,5 Å.
7. Open de kaarten (postprocess.mrc) uit stap 4.4-4.6, filter op verschillende resoluties en het bestand modelcoördinaat, 6tsh.pdb (uitgelijnd met de halve kaarten in ChimeraX) uit stap 3.1.2 in PyMOL. Wijzig de naam van de verschillende kaarten in 3.0, 3.5 en 2.3, zoals gedefinieerd door hun resoluties.
   OPMERKING: Men kan de low-pass filtering van de kaarten bevestigen door ze te visualiseren in ChimeraX of Coot.
8. Visualiseer het effect van resolutie op de dichtheid van ligand- en oplosmiddelmoleculen door een mesh van 2 Å rond de ligand- en oplosmiddelmoleculen te creëren bij een drempel van 6σ, zoals beschreven in stap 3.3.6 met kaarten gefilterd op verschillende resoluties.

Results

Voorbeeld 1
Het enzym enolase van M. tuberculosis katalyseert de voorlaatste stap van glycolyse en zet 2-fosfoglyceraat om in fosfoenolpyruvaat (PEP), een essentieel tussenproduct voor verschillende metabole routes^44,45. CryoEM-gegevens voor de apo-enolase- en PEP-gebonden enolase-monsters werden verzameld met dezelfde pixelgrootte van 1,07 Å, en beeldverwerking werd uitgevoerd met Relion 3.1^46,47. De apo-enolase- en de PEP-enolasestructuren werden bepaald op respectievelijk 3,1 Å en 3,2 Å,⁴⁸. De kaarten en modellen werden gedeponeerd in EMDB en PDB ^49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x en PDB-7e51). De cryoEM-kaart van het enzym laat zien dat het een octameer in de oplossing is (Figuur 1A). Om de liganddichtheid in de PEP-enolasekaart te identificeren, werden de niet-verscherpte kaarten van het apo-enzym en het PEP-gebonden enzym geselecteerd, en werd een verschilkaart berekend in ChimeraX, door de PEP-enolase-kaart af te trekken van de apo-enzymkaart. Er werd een duidelijke dichtheid (groen) waargenomen bij een hoge drempel, wat de aanwezigheid van de ligand suggereerde (Figuur 1B). Het modelleren van de eiwitketen in de niet-verscherpte kaart gaf duidelijk aan dat de extra dichtheid aanwezig is op de actieve plaats van het eiwit (Figuur 1C). Het ligand, PEP, werd vervolgens gemodelleerd in de B-factor verscherpte kaart met behulp van Coot, en het eiwit+ligandmodel werd in de echte ruimte verfijnd met Phenix. Twee Mg²⁺ ionen werden gemodelleerd in de dichtheid waargenomen in de buurt van het ligand (Figuur 1D). Het ligand, PEP, neemt een vergelijkbare oriëntatie aan als waargenomen in andere enolase-homogen, en verschillende actieve plaatsresiduen, zoals Lys-386, Arg-364, vormen waterstofbruginteracties met het ligand PEP. De Mg^2+-ionen vormen metaalcoördinatiebindingen met Asp-241, Glu-283, Asp-310 en het fosfaat van PEP (Figuur 1D).

Voorbeeld 2
Als er geen apo-eiwitstructuur beschikbaar is of als het eiwit een grote conformatieverandering ondergaat, is het niet mogelijk om de verschilkaarten zoals hierboven beschreven te berekenen. In 2021 introduceerde de groep van Garib Murshudov van het Laboratorium voor Moleculaire Biologie, Cambridge, Servalcat²², dat een verfijningsworkflow implementeert met behulp van Refmac en ook een Fo-Fc-verschilkaart berekent na verfijning. Een positieve Fo-Fc-verschildichtheid suggereert de aanwezigheid van moleculen/liganden die tijdens de verfijning niet in het model zijn opgenomen, in wezen een weggelaten kaart. Het wordt echter aanbevolen om eerst te beoordelen of het model in overeenstemming is met de kaart in het algemeen en vervolgens de kaart met de verschildichtheid te evalueren.

Om het gebruik van Servalcat/Refmac te illustreren, werd mGlu₅ gekozen, een dimeer G-proteïne gekoppelde receptor die bindt aan de neurotransmitter, L-Glutamaat. Bij binding van de agonist, L-quisqualate, heroriënteert het extracellulaire domein, wat de rotatie van de 7TM activeert, waardoor ze dichter bij elkaar komen om de geactiveerde toestand te stabiliseren. Er is dus een grote conformationele verandering waargenomen tussen de apo/antagonist vs. agonist-gebonden toestanden⁵¹ (Figuur 2A en Figuur 2E). De twee halve kaarten voor zowel de agonist (EMD-31536) als de antagonist (EMD-31537) gebonden complexen werden verkregen van EMDB, en de cryoEM-kaarten tonen een gevarieerde resolutie over het molecuul en het beter opgeloste extracellulaire domein. Vervolgens werden deze gebruikt als invoer in Servalcat, samen met het apo-eiwit als model om het verschil of de Fo-Fc-kaart voor elke dataset te berekenen. Deze kaart toonde duidelijk de aanwezigheid van verschillende ligandmoleculen (niet-eiwit). De door FSC geschatte resolutie (Fourier Shell-correlatie) voor de agonist- en antagonist-gebonden complexen was respectievelijk 3,8 Å en 4,0 Å. In het geval van het agonist-gebonden mGlu₅ toonde de Servalcat Fo-Fc verschilkaart de aanwezigheid van zowel de agonist (L-quisqualaat) (Figuur 2B) als N-AcetylGlucosamine (NAG) (Figuur 2C) in de ECD van de receptor (vanwege de lagere resolutie van de TMD, hier richten we ons alleen op de ECD en de bovenkant van de TMD). Eiwitresiduen, waaronder Tyr-64, Trp-100, Ser-151 en Thr-175, worden gezien als interagerend met de agonist. Dichtheid in de buurt van het Asn-210-residu suggereerde de aanwezigheid van N-acetylglucosamine (Figuur 2C). Een dichtheid die overeenkomt met cholesterylhemisuccinaat, dat werd toegevoegd tijdens de zuivering van mGlu_5, werd waargenomen nabij de bovenkant van transmembraanhelix 1 (Figuur 2D). Omdat de resolutie matig is en het ligand, L-quisqualate, in verschillende oriëntaties kan worden geplaatst, werd de eerdere structuur van het extracellulaire domein met het ligand (PDB-6N50) gebruikt als leidraad om het ligand te modelleren. Antagonistische binding stabiliseert de open of rusttoestand van de receptor (Figuur 2E). Een dichtheid die consistent is met de antagonist LY341495 werd waargenomen bij het scharnier van lob I en lob II van het domein van de venusvliegenval in de ECD. De antagonist interageert met residuen die vergelijkbaar zijn met die van de agonist. Stapelinteractie tussen Tyr-223 in lob II met de antagonist stabiliseert de receptor in een open toestand (Figuur 2F). Net als bij de agonistische structuur werd glycosylering of de aanwezigheid van N-acetylglucosaminegroep waargenomen in de buurt van Asn-210 (Figuur 2G).

Voorbeeld 3
Het derde voorbeeld verduidelijkt het protocol om liganden en oplosmiddelmoleculen ter grootte van een fragment of kleine omvang te modelleren in CryoEM-kaarten met hoge resolutie. Fragment-based Drug Discovery (FBDD) is naar voren gekomen als een krachtige en innovatieve methode bij de ontwikkeling van target-based nieuwe therapieën in verschillende ziektegebieden, waardoor het een veelbelovende weg is in farmaceutische R&D^52,53. FBDD begint met het screenen en zorgvuldig selecteren van kleine, goed oplosbare fragmenten met een laag moleculair gewicht van moleculen die binden aan specifieke doeleiwitten of biomoleculen die van belang zijn. Het bepalen van de structuren van deze eiwit-fragmentcomplexen onthult de wijze van binding van deze fragmenten, die dient als leidraad voor het ontwerpen van grotere en complexere geneesmiddelachtige moleculen met toenemende affiniteit en specificiteit voor het doeleiwit⁵⁴. Deze methode vereist echter een liganddichtheid met hoge resolutie om de pose nauwkeurig te bepalen en de functionele groepen van de ligand¹⁵ correct te plaatsen.

β-galactosidase, een van de eerste structuren met hoge resolutie die is bepaald op basis van de vooruitgang in cryoEM-technologie, is een goed bestudeerd homotetrameer enzym van 450 kDa dat de hydrolyse van lactose tot glucose en galactose katalyseert⁵⁵. Om het gebruik van cryoEM in FBDD te demonstreren, bepaalde Astex, VK, de structuur van β-galactosidase met een remmer ter grootte van een fragment, deoxygalacto-nojirimycine (DGN) gebonden in de actieve plaats (EMDB-10563, PDB:6tsh)⁵⁶. Deze dataset wordt gebruikt om het protocol te illustreren om liganden en oplosmiddelen eenduidig te modelleren in kaarten met hoge resolutie. Om het effect van resolutie op ligandmodellering en visualisatie te demonstreren, werden de kaarten gefilterd op 3,0 Å en 3,5 Å in de nabewerkingsstap in Relion. Dit benadrukt de kwaliteit van de kaartdichtheid bij verschillende resoluties en onderstreept de noodzaak van een hogere resolutie voor het modelleren van liganden en oplosmiddelen.

Het enzym is een tetrameer met D2-symmetrie in oplossing (figuur 3A). Verschilkaart (tussen kaart en model), zoals berekend door Servalcat, suggereerde de aanwezigheid van DGN en verschillende oplosmiddelmoleculen op de actieve plaats van het enzym (Figuur 3B). Met een geschatte resolutie van 2,3 Å vertoonde de dichtheid kenmerken met een hoge resolutie, wat hielp bij de nauwkeurige modellering van de remmer op de actieve plaats van het eiwit. Interacties tussen DGN en Tyr-503 en His-540 werden waargenomen (Figuur 3C). De verschildichtheid suggereerde ook de aanwezigheid van oplosmiddelmoleculen die interageren met DGN, evenals de eiwitresiduen. Mg²⁺ en verschillende watermoleculen werden gemodelleerd in de dichtheid (Figuur 3D). Metaalcoördinatiebindingen tussen Mg²⁺ en Glu-416, Glu-461 en verschillende watermoleculen worden waargenomen (Figuur 3D). Mg²⁺ bleek te interageren met DGN via een watermolecuul.

Bij een lagere resolutie van 3,5 Å en 3,0 Å lijkt de liganddichtheid op een blob en mist het functies met een hoge resolutie die cruciaal zijn voor nauwkeurige modellering van het ligand (Figuur 4A,B). De dichtheid van watermoleculen was bij deze resoluties bijna onbestaande. Samenvattend, met een toenemende resolutie, vooral hoger dan 3,0 Å, maakte de dichtheid het mogelijk om een groter aantal watermoleculen te modelleren (Figuur 4C,D). De juiste positionering van het chirale centrum van de ligand werd haalbaar op ~2,3 Å (Figuur 4C,D) dankzij de aanwezigheid van verschillende kenmerken in de kaart die de plaatsing begeleidden, evenals het modelleren van watermoleculen en Mg²⁺. Ter vergelijking: de dichtheid voor Mg²⁺ bleef waarneembaar over het resolutiebereik (Figuur 4A-C).

Figuur 1: Modellering van het ligandfosfoenolpyruvaat in M. tuberculosis enolase. (A) toont de B-factor verscherpte kaart van het PEP-gebonden enolase enzym. De kaart suggereert dat enolase octameer in oplossing is en dat elk monomeer op de kaart anders gekleurd is. (B) toont een onverscherpte cryoEM-kaart van het apo-Enolase-enzym in grijs met de verschilkaart (tussen PEP-gebonden en apo-Enolase niet-verscherpte kaarten) bedekt met groen, wat de aanwezigheid van ligand, PEP, suggereert. Dit is een demonstratiekaart om de aanwezigheid van liganden aan te tonen. (C) geeft de pasvorm van het enolase-model weer in de onverscherpte cryoEM-kaart, waarbij de positie van de verschildichtheid ten opzichte van het eiwit wordt benadrukt. Het eiwitmodel wordt getoond in cartoonweergave en ingekleurd in Chainbow. Deze figuur laat zien dat de extra dichtheid (groen) aanwezig is in de actieve plaats van elk monomeer. (D) toont het ligand, PEP, ingekapseld in de B-factor verscherpte kaart, blauw gekleurd. Bovendien werd ook de dichtheid voor twee Mg^2+-ionen waargenomen, die metaalcoördinatiebindingen vormen met verschillende actieve plaatsresiduen, waaronder Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 en ligandatomen. Het ligand maakt interacties met waterstofbruggen met Lys-386, Lys-335 en Arg-364. De eiwitresiduen worden weergegeven in stickweergave en Mg^2+-ionen worden weergegeven als paarse bollen. De figuren in panelen (A-D) zijn gegenereerd met Pymol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Identificatie, modellering en visualisatie van verschillende liganden in de mGlu_5-receptor. De Fo-Fc weggelaten kaarten zijn verkregen met behulp van Servalcat. (A) toont de mGlu 5-receptordimeerstructuur (PDB-7fd8) in cartoonweergave, waarbij elk monomeer gekleurd is in respectievelijk groenblauw en tarwe en gebonden is aan de agonist L-quisqualate. Alle liganden die werden geïdentificeerd in het extracellulaire en aan de bovenkant van het transmembraandomein van de receptor zijn ingekapseld in de Fo-Fc-weglaatkaart, groen gekleurd en gevormd op 6σ. (B) benadrukt de pasvorm van de agonist, L-quisqualaat ingekapseld in de verschilkaart. L-quisqualaat interageert met verschillende mGlu_5-residuen, waaronder Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 en Gly-280. De interacties van de H-binding worden weergegeven door rode streepjes. In (C) is een extra dichtheid zichtbaar in de buurt van Asn-210, die aanwezig is in het extracellulaire domein van de receptor, en N-acetylglucosaminemolecuul (NAG) werd in deze dichtheid gemodelleerd. Voor de duidelijkheid: de NAG is in de huidige figuur niet gekoppeld aan Asn. (D) toont het verschil in dichtheid voor cholesterolhemisuccinaat (CHS) in groen nabij het aan lipiden blootgestelde oppervlak van de receptor. Het CHS-molecuul, vertegenwoordigd in de stokjes, werd in deze dichtheid gemodelleerd. (E) toont de mGlu_{5-receptorstructuur} (PDB-7fd9) gebonden aan de antagonist LY341495 in cartoonrepresentatie. In (F) duidt een extra dichtheid in de Fo-Fc-verschilkaart bij het scharnier tussen lob I en lob II van het extracellulaire domein op de aanwezigheid van de antagonist. Belangrijke residuen (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 en Tyr-223) rond de antagonist worden weergegeven in stick-representaties en mogelijke interacties van de waterstofbrug met de antagonist worden weergegeven in rode streepjes. (G) toont het verschil in dichtheid dat wijst op de aanwezigheid van NAG-molecuul in de buurt van Asn-210 in de antagonist-gebonden structuur (let op, de NAG is voor de duidelijkheid niet gekoppeld aan Asn). De cijfers zijn gegenereerd met Pymol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Identificatie, modellering en verfijning van een kleine remmer en oplosmiddel molecule in de hoge-resolutie kaart van β-galactosidase (EMD-10563). (A) toont het β-galactosidase model opgelost tot 2,3 Å (PDB: 6tsh) in cartoonweergave, waarbij elk monomeer duidelijk gekleurd is. Het grijze vak markeert de ligandbindingsplaats. (B) geeft de Fo-Fc-verschildichtheid weer (van Servalcat) in groen gaas op de actieve plaats van het enzym. Het verschil in dichtheid suggereert de aanwezigheid van de remmer (DGN) en verschillende oplosmiddelmoleculen op de actieve plaats. (C) toont aan dat op basis van de Fo-Fc-kaart de remmer deoxygalacto-nojirimycine (DGN) wordt gemodelleerd op de actieve plaats. Deze gemodelleerde ligand is afgebeeld in stokformaat en ingekapseld in de Fo-dichtheid (door Servalcat), die is gekleurd in blue_mesh. Interacties in de waterstofbrug tussen DGN en verschillende eiwitresiduen, waaronder Tyr-503 en His-540, worden waargenomen. De extra Fo-Fc-verschildichtheid rond het ligand (groen) is indicatief voor de oplosmiddelmoleculen. (D) De kaart toont verschillende oplosmiddelmoleculen, waaronder water en Mg²⁺, weergegeven als respectievelijk rode en paarse bollen, die op de actieve plaats zijn gemodelleerd nadat ervoor is gezorgd dat elk oplosmiddelmolecuul is gebonden aan eiwit (Glu-416, His-418 en Glu-461) of ligandresiduen. De watermoleculen en Mg²⁺ zijn ingekapseld in de Fo-dichtheid (blauwe mazen). Mg²⁺ wordt gezien als interagerend met het ligand, DGN via een watermolecuul. De Fo-Fc-kaart (groene mazen) in panelen (B,C) is gevormd op 6σ, terwijl de Fo-dichtheid - blauwe mazen in C en D (van de Servalcat-verfijning na modellering) is gevormd op 3σ. De figuren in panelen (A-D) zijn gegenereerd met Pymol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Effect van resolutie op ligandmodellering in β-galactosidase. Halve kaarten van EMD-10563 werden gebruikt als input in de Relion-nabewerkingsstap en de gecombineerde nabewerkingskaarten werden gefilterd op resoluties 2,3 Å, 3,0 Å en 3,5 Å met verschillende B-factoren. De kaart die op alle panelen wordt getoond, heeft een contour van 6σ. Voor de duidelijkheid wordt alleen de eiwitruggengraat getoond zonder zijketens, ligand- of oplosmiddelmoleculen in panelen A, B en C. (A) De kaart wordt gefilterd op 3,5 Å en de actieve plaats van β-galactosidase wordt weergegeven. Een klodder die lijkt op de ligand, DGN, is te zien bij deze resolutie, vergezeld van een paar kleinere klodders in de buurt. Het modelleren van de ligand in de juiste oriëntatie blijkt een uitdaging vanwege het ontbreken van duidelijke kenmerken op de kaart. (B) De kaart gefilterd op een resolutie van 3,0 Å wordt weergegeven. Hier wordt de ligand-blob iets meer gedefinieerd, maar mist nog steeds functies in het algemeen. Er worden ook nog een paar kleine klodders waargenomen die doen denken aan oplosmiddelmoleculen. (C) De kaart, gefilterd op een resolutie van 2,3 Å, toont de liganddichtheid met duidelijke kenmerken, met name de stoelconformatie van de iminosuiker. Een aanzienlijk aantal kleine klodders die overeenkomen met watermoleculen wordt waargenomen met deze resolutie. De automatische schatting/verscherping van de B-factor in Relion nabewerking geeft een waarde van -18 Ų voor de kaarten gefilterd op 3 Å en 3,5 Å, terwijl de waarde -52 Ų is voor de kaart gefilterd op 2,3 Å. Verschillende B-factor verscherping van EM-kaarten kan ook worden uitgevoerd met Meerkoet en nuttig bij het bouwen van modellen. (D) Het paneel illustreert dat de ligand DGN (stick-representatie), Mg²⁺, en watermoleculen (als bollen) zoals gemodelleerd in de actieve site en de verscherpte kaart op 2,3 Å, weergegeven in blauwe mazen rond deze atomen. De figuren in panelen (A-D) zijn gegenereerd met Pymol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De verbeteringen in de hardware en software van microscopen hebben de afgelopen jaren geleid tot een toename van het aantal cryoEM-structuren. Hoewel de hoogste resolutie die op dit moment wordt bereikt in cryoEM met één deeltje 1,2 Å 57,58,59 is, wordt het merendeel van de structuren bepaald rond de 3-4 Å resolutie. Het modelleren van liganden in kaarten met een gemiddelde tot lage resolutie kan lastig zijn en vaak beladen met dubbelzinnigheid. Gezien het wijdverbreide gebruik van cryoEM in zowel de academische wereld als de farmaceutische industrie voor translationeel onderzoek en het ontdekken van geneesmiddelen, is het essentieel om ervoor te zorgen dat liganden correct en zonder dubbelzinnigheid worden gemodelleerd. Het is dus verstandig om de oplosbaarheid van ligandatomen te kwantificeren door Q-scores⁶⁰ te berekenen, die nu beschikbaar is in de EMDB als een metriek om de kwaliteit van de kaarten en de pasvorm van het model te evalueren, evenals in Chimera.

In het eerste voorbeeld werd ChimeraX gebruikt om de verschilkaart in de werkelijke ruimte te berekenen tussen de apo en de ligandgebonden afbeeldingen in het M. tuberculosis enolase-enzym. De extra dichtheid bij een hoge drempel suggereert de aanwezigheid van het ligand, fosfoenolpyruvaat, in de actieve plaats en Mg²⁺ gebonden aan het ligand. Het is belangrijk op te merken dat de kaart in dit geval een gemiddelde resolutie heeft (3,2 Å) en dat watermoleculen niet met zekerheid kunnen worden gemodelleerd (Figuur 1). De beperking van deze methode is dat deze alleen kan worden toegepast wanneer ligandbinding geen significante conformationele veranderingen in het eiwit induceert. Kaartnormalisatie werd in dit geval niet uitgevoerd, omdat zowel de apo- als de ligand-gebonden datasets met dezelfde pixelgrootte werden verkregen en met identieke parameters in Relion werden verwerkt. Het is echter vermeldenswaard dat bij het vergelijken van kaarten die zijn gegenereerd door verschillende reconstructieprogramma's, zoals Relion^46,47 en CryoSparc⁶¹, of met verschillende kwaliteit, normalisatie van de kaarten essentieel wordt voordat zinvolle vergelijkingen kunnen worden gemaakt.

Het volgende voorbeeld is mGlu₅, dat een grote moleculaire reorganisatie ondergaat na agonistbinding, zoals blijkt uit de cryoEM-structuren^51,62 (Figuur 2). In dit scenario is het niet haalbaar om een eenvoudige verschilkaart te berekenen tussen de ongebonden (apo) en ligand-gebonden receptoren vanwege substantiële verschillen tussen de kaarten. Hier werd Servalcat gebruikt, dat onverscherpte en ongewogen halve afbeeldingen gebruikt als input voor verfijning in de reciproke ruimte en vervolgens een verschilkaart berekent tussen de experimentele kaart en de kaart die van het model is afgeleid. Bij een hoge drempel kan men verschillen visualiseren en als leidraad dienen voor correctie en verbetering van het model. Verschillende niet-gemodelleerde blobs in het extracellulaire en nabij het transmembraandomein van mGlu₅ werden waargenomen en gebruikt als leidraad voor het modelleren van liganden (Figuur 2).

Het derde voorbeeld laat zien hoe resolutie (2,3 Å) een cruciale rol speelt bij de kaartinterpretatie en modellering van een remmer ter grootte van een fragment in β-galactosidase. Hier was de uitdaging om een zeer kleine ligand (<200 Da) in de Servalcat-verschilkaart te identificeren te midden van de inherente ruis in de gegevens en deze nauwkeurig te modelleren. Naast de hoge globale resolutie die werd bepaald met behulp van Fourierschaalcorrelatie (FSC), was de lokale resolutie die specifiek is voor de ligand ook voldoende hoog om een nauwkeurige plaatsing van de chirale centra van de liganden te garanderen (Figuur 3). De dichtheid van oplosmiddelmoleculen werd waargenomen in de verschilkaart door het hele enzym en vooral rond het ligand. Het effect van resolutie op het modelleren van liganden en oplosmiddelatomen werd ook aangetoond (Figuur 4). Het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het modelleren van water- of oplosmiddelmoleculen, omdat ruis op een lage drempel soms kan lijken op water- of oplosmiddelmoleculen, wat kan leiden tot mogelijke verkeerde interpretaties.

Een andere belangrijke overweging is dat de cryoEM-kaarten alleen mogelijk niet voldoende zijn om een metaalion op zichzelf nauwkeurig te identificeren. Aanvullende biofysische methoden zoals Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) of Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX) zijn vaak nodig om de aanwezigheid en identiteit van het metaalion te bevestigen. In zowel enolase- als β-galactosidase-enzymen werd Mg²⁺ gemodelleerd vanwege de schat aan informatie die al beschikbaar was over deze eiwitten, die de identiteit van het metaalion bevestigt. Ook de coördinatie van de metaalionen in deze gevallen, geïllustreerd door de klassieke octaëdrische geometrie en de bijna ideale coördinatieafstanden van Mg²⁺, leverde een substantieel bewijs van hun identiteit.

Over het algemeen moet rekening worden gehouden met een paar belangrijke overwegingen bij het modelleren van liganden in cryoEM-kaarten. Om te beginnen is het belangrijk om de juiste kaart te kiezen voor ligandidentificatie en -modellering. In alle gevallen is een niet-verscherpte en ongewogen kaart of een halve kaart aan te raden boven een verscherpte en gewogen kaart om de liganddichtheid te visualiseren, aangezien verscherping en weging kunnen resulteren in onder- of oververscherpte (ruis als gevolg van seriebeëindiging) gebieden in de kaart. Dit kan resulteren in een suboptimale liganddichtheid, en het gebruik van verschillende B-factor verscherping kan worden gebruikt om de dichtheid te evalueren tijdens het bouwen van modellen in Coot. Hoewel er een risico bestaat bij het gebruik van de verscherpte kaart om liganden in een cryoEM-kaart te identificeren, toont de niet-verscherpte kaart mogelijk niet het volledige detail van de liganddichtheid, maar kan deze worden gebruikt voor demonstratiedoeleinden, zoals weergegeven in figuur 1B,C.

De pose van de gemodelleerde ligand moet worden gevalideerd, vooral in gevallen waarin de gegevens zwak zijn. Zoals hier voor mGlu₅ te zien is, varieert de lokale resolutie over de cryoEM-kaart, en onbevooroordeelde modellering van het ligand kan een uitdaging zijn. Servalcat kan worden gebruikt als een waardevol hulpmiddel voor het detecteren van mogelijke onnauwkeurigheden in eiwit- en ligandmodellering²².

Samenstellingsheterogeniteit kan aanwezig zijn in een eiwit-ligandcomplex waar alleen een specifieke populatie het ligand aanwezig kan hebben (als het ligand een laag molecuulgewicht heeft, kan de classificatiestap de heterogeniteit mogelijk niet verwijderen). Desalniettemin is het belangrijk om de stap^{3D-classificatie 63} iteratief uit te voeren tijdens de beeldverwerking voorafgaand aan ligandmodellering en te controleren of de dichtheid van het ligand verbetert. Als er meerdere kopieën van eiwit aanwezig zijn, moet voorzichtigheid worden betracht bij het toepassen van symmetrie over de kaart tijdens de eerste modelgeneratie en verfijning, omdat dit het gemiddelde kan zijn van de liganddichtheid in alle symmetriegerelateerde moleculen. Symmetrie mag alleen worden opgelegd nadat de kaart grondig is geïnspecteerd om de aanwezigheid van liganddichtheid in alle eiwitketens te bevestigen.

Afhankelijk van de toestand (kristal of oplossing) en de locatie (begraven of oppervlak), kunnen de atomen dynamisch zijn, en in modelverfijning wordt dit de atomaire verplaatsingsparameter (ADP) genoemd. Samen met de verschilkaart, die visuele aanwijzingen geeft voor mogelijke onnauwkeurigheden in het model, kunnen ADP-waarden worden gebruikt om de nauwkeurigheid van de liganden na verfijning 64,65,66,67 te evalueren. Normaal gesproken zou de ligand vergelijkbare ADP-waarden moeten hebben als de omringende residuen, d.w.z. als ze stabiel gebonden en nauwkeurig gemodelleerd zijn. Liganden aan de periferie of atomen van een ligand (zoals lipiden) die ver van macromoleculen verwijderd zijn, kunnen echter hogere ADP-waarden hebben. Naast het verfijnen van de coördinaten, maken zowel Refmac^33,34 als Phenix verfijning van ADP-waarden ^28,68 mogelijk. In Refmac wordt de Mott-Bethe-benadering gebruikt om de elektronenverstrooiingsfactor van individuele atomen te berekenen tijdens de kaartberekening. In de recente versie van Phenix is individuele B-factorverfijning, vergelijkbaar met kristallografie, geïntroduceerd om rekening te houden met atoomwanorde. Heel vaak wordt in de verfijnde modellen die zijn afgeleid van cryoEM een breed scala aan ADP-waarden waargenomen (soms waarden dicht bij nul), en zelfs de Q-score die in EMDB wordt gebruikt om de pasvorm van het model met de kaart te evalueren, hangt af van de primaire kaart die is gedeponeerd en de aard van de B-factorverscherping⁶⁰. Bij het bouwen van cryoEM-modellen worden vaak meerdere kaarten gebruikt, en daarom moeten de kaarten die worden gebruikt bij het modelleren en verfijnen duidelijk worden vermeld in de methoden, omdat vanwege de anisotrope resolutie in veel macromoleculen één enkele kaart mogelijk niet voldoende is om alle details te verklaren. 

Bij het modelleren van liganden in macromoleculen is een van de belangrijkste beperkingen van cryoEM-kaarten (zoals in de kristallografie) dat als de ligandbindingsplaats een lage resolutie heeft of als het gebonden ligand dynamisch is, het moeilijk kan zijn om de juiste conformatie vast te stellen. Bovendien hebben de meeste cryoEM-structuren resoluties van minder dan 3 Å, en is de weergave van watermoleculen in de kaarten beperkt, waardoor het moeilijk is om de rol van hydratatie in ligand of geneesmiddelbinding te beoordelen (zoals hier wordt getoond met de voorbeelden van enolase en mGluR). Computationele methoden kunnen worden gebruikt in combinatie met cryoEM-gegevens om deze beperkingen aan te pakken⁶⁹. In tegenstelling tot kristallografie wordt alleen het model verfijnd, niet de kaart. Momenteel is de enige methode om de aanwezigheid van een ligand aan te geven of nauwkeurige modellering te garanderen, het genereren van weglatingskaarten (met behulp van tools zoals Servalcat). Er zijn dus een aantal hulpmiddelen om onderzoekers te helpen bij het bouwen en evalueren van het model, maar er zijn verschillende gebieden in modelverfijning waar in de nabije toekomst nieuwere benaderingen of aanpassingen van de huidige benaderingen kunnen worden verwacht.

In dit artikel hebben we ons gericht op de huidige benaderingen voor het modelleren van liganden, waaronder handmatige inspectie van de liganddichtheid, het genereren van het ligandgeometriebestand, gevolgd door het modelleren van de ligand in de cryoEM-kaart. Dit is een opwindende periode in de structurele biologie en de ontdekking van geneesmiddelen, aangezien directe elektronendetectoren met snellere framesnelheden en het gebruik van snellere data-acquisitie⁷⁰ hebben geresulteerd in het verkrijgen van hoge-resolutiekaarten (<2,8 Å) van verschillende macromoleculen die vaak zijn gebonden aan liganden van kleine moleculen in een relatief korte tijd. De recente introductie van geautomatiseerde ligandmodelleringstools zoals GEMspot⁶⁹ in de Schrödinger-suite en EMERALD¹⁷ in de Rosetta-suite, die probeert de meest waarschijnlijke gebonden pose van de ligand te vinden terwijl rekening wordt gehouden met de experimentele cryoEM-gegevens, is veelbelovend om dit proces te stroomlijnen en te automatiseren. Net als bij röntgenkristallografie wordt verwacht dat het identificeren van de bindingsmodi van liganden met kleine moleculen door cryoEM, misschien twee of meer op één dag, een realistische mogelijkheid zal worden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consortium van verschillende instituten	https://www.ccp4.ac.uk	Gratis voor academische gebruikers en bevat Coot en een lijst van tools ontwikkeld voor röntgenkristallografie
CCP-EM	Consortium van verschillende instituten	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Gratis voor academische gebruikers en bevat Coot, Relion en vele anderen
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	Algemene software voor modelbouw maar ook beschikbaar met andere suites hierboven beschreven
DockinMap (Phenix)	Consortium van verschillende instituten	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software binnen de Phenix suite voor het docken van modellen in cryoEM kaarten
Electron Microscopy Data Bank	Consortium van verschillende instituten	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Publieke opslagplaats voor elektronenmicroscopie kaarten
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercieel, camera van Thermo Fisher
Phenix	Consortium van verschillende instituten	https://phenix-online.org/download	Gratis voor academische gebruikers en bevat Coot
Protein Data Bank	Consortium van verschillende instituten	https://rcsb.org	Publieke database van macromoleculaire structuren
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Moleculair visualisatietool. Educatieve versie is gratis maar komt met beperkingen. De volledige versie kan worden verkregen tegen een kleine vergoeding.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software voor cryoEM beeldverwerking, ook beschikbaar met CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercieel, cryoTEM van Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	Algemeen doel software voor weergave, analyse en meer
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Algemeen doel software voor weergave, analyse en meer