Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66310

⸱

19 juli 2024

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol introduceert de tools die beschikbaar zijn voor het modelleren van liganden van kleine moleculen in cryoEM-kaarten van macromoleculen.

Samenvatting

Het ontcijferen van de eiwit-ligandinteracties in een macromoleculair complex is cruciaal voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme, de onderliggende biologische processen en de ontwikkeling van geneesmiddelen. In de afgelopen jaren is cryogene monsterelektronenmicroscopie (cryoEM) naar voren gekomen als een krachtige techniek om de structuren van macromoleculen te bepalen en om de wijze van ligandbinding bij bijna-atomaire resolutie te onderzoeken. Het identificeren en modelleren van niet-eiwitmoleculen in cryoEM-kaarten is vaak een uitdaging vanwege de anisotrope resolutie over het betreffende molecuul en de inherente ruis in de gegevens. In dit artikel maken de lezers kennis met verschillende software en methoden die momenteel worden gebruikt voor ligandidentificatie, modelbouw en verfijning van atomaire coördinaten met behulp van geselecteerde macromoleculen. Een van de eenvoudigste manieren om de aanwezigheid van een ligand te identificeren, zoals geïllustreerd met het enolase-enzym, is door de twee afbeeldingen die met en zonder het ligand zijn verkregen, af te trekken. De extra dichtheid van het ligand zal waarschijnlijk opvallen in de verschilkaart, zelfs bij een hogere drempel. Er zijn gevallen, zoals aangetoond in het geval van metabotrope glutamaatreceptor mGlu5, waarin dergelijke eenvoudige verschilkaarten niet kunnen worden gegenereerd. De onlangs geïntroduceerde methode voor het afleiden van de Fo-Fc weglaatkaart kan dienen als een hulpmiddel om de aanwezigheid van het ligand te valideren en aan te tonen. Ten slotte wordt, met behulp van het goed bestudeerde β-galactosidase als voorbeeld, het effect van resolutie op het modelleren van de liganden en oplosmiddelmoleculen in cryoEM-kaarten geanalyseerd en wordt een kijk gepresenteerd op hoe cryoEM kan worden gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen.

Inleiding

Cellen vervullen hun functies door talloze chemische reacties tegelijkertijd en onafhankelijk uit te voeren, elk zorgvuldig gereguleerd om hun overleving en aanpassingsvermogen te garanderen als reactie op omgevingssignalen. Dit wordt bereikt door moleculaire herkenning, waardoor biomoleculen, met name eiwitten, voorbijgaande of stabiele complexen kunnen vormen met andere macromoleculen en met kleine moleculen of liganden1. Eiwit-ligandinteracties zijn dus van fundamenteel belang voor alle processen in de biologie, waaronder de regulatie van eiwitexpressie en -activiteit, de herkenning van substraten en cofactoren door enzymen, evenals hoe cellen signalen waarnemen en doorgeven 1,2. Een beter begrip van de kinetische, thermodynamische en structurele eigenschappen van het eiwit-ligandcomplex onthult de moleculaire basis van ligandinteractie en vergemakkelijkt ook een rationeel geneesmiddelontwerp door de geneesmiddelinteractie en specificiteit te optimaliseren. Een economische en snellere benadering voor het bestuderen van eiwit-ligandinteractie is het gebruik van moleculaire docking, een computationele methode die virtueel een breed scala aan kleine moleculen screent en de bindingsmodus en affiniteit van deze liganden aan doeleiwitten voorspelt3. Experimenteel bewijs van structuren met een hoge resolutie bepaald door röntgendiffractie (XRD), nucleaire magnetische resonantie (NMR) of elektronencryomicroscopie (cryoEM) levert echter het essentiële bewijs voor dergelijke voorspellingen en helpt bij de ontwikkeling van nieuwere en effectievere activatoren of remmers voor een bepaald doelwit. In dit artikel wordt de afkorting 'cryoEM' gebruikt, zoals de techniek gewoonlijk wordt genoemd. Er is echter een voortdurend debat gaande over het kiezen van de juiste nomenclatuur, en onlangs is de term cryogenic-sample Electron Microscopie (cryoEM) voorgesteld om aan te geven dat het monster op cryogene temperatuur is en in beeld is gebracht met elektronen4. Evenzo worden de kaarten die zijn afgeleid van cryoEM elektronenpotentiaal, elektrostatische potentiaal of Coulomb-potentiaal genoemd, en voor de eenvoud gebruiken we hier cryoEM-kaarten 5,6,7,8,9,10.

Hoewel XRD de gouden standaardtechniek is geweest voor de bepaling van de structuur van eiwit-ligandcomplexen met hoge resolutie, is cryoEM na resolutie-revolutie11 in een stroomversnelling geraakt, zoals blijkt uit de golf van Coulomb-potentiaalkaarten of cryoEM-kaarten die de afgelopen jaren in de Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 zijn gedeponeerd14. Als gevolg van de vooruitgang in monstervoorbereiding, beeldvorming en gegevensverwerkingsmethoden is het aantal Protein Data Bank (PDB)14-afzettingen met cryoEM tussen 2010 en 2020 toegenomen van 0,7% naar 17%, waarbij ongeveer 50% van de gerapporteerde structuren in 2020 werd bepaald met een resolutie van 3,5 Å of beter15,16. CryoEM is snel geadopteerd door de structurele biologiegemeenschap, inclusief de farmaceutische industrie, omdat het de studie mogelijk maakt van flexibele en niet-kristallijne biologische macromoleculen, met name membraaneiwitten en multi-eiwitcomplexen, met een bijna atomaire resolutie, waardoor het proces van kristallisatie wordt overwonnen en goed diffracterende kristallen worden verkregen die nodig zijn voor structuurbepaling met hoge resolutie door XRD.

Nauwkeurige modellering van het ligand in de cryoEM-kaart is van het grootste belang, omdat het dient als een blauwdruk van het eiwit-ligandcomplex op moleculair niveau. Er zijn verschillende geautomatiseerde hulpmiddelen voor het opbouwen van liganden die worden gebruikt in röntgenkristallografie die afhankelijk zijn van de vorm en topologie van de liganddichtheid om het ligand in de elektronendichtheid 17,18,19,20 te passen of te bouwen. Desalniettemin, als de resolutie lager is dan 3 Å, hebben deze benaderingen de neiging om minder gewenste resultaten te produceren omdat de topologische kenmerken waarvan ze afhankelijk zijn voor herkenning en opbouw minder gedefinieerd worden. In veel gevallen zijn deze methoden niet effectief gebleken bij het nauwkeurig modelleren van liganden in cryoEM-kaarten, omdat deze kaarten zijn bepaald in het bereik van lage tot gemiddelde resolutie, meestal tussen 3,5 Å-5 Å17.

De eerste stap in de 3D-structuurbepaling van een eiwit-ligandcomplex door cryoEM omvat ofwel het co-zuiveren van het ligand met het eiwit (wanneer het ligand een hoge bindingsaffiniteit heeft met het eiwit) of het incuberen van de eiwitoplossing met het ligand voor een bepaalde duur vóór de roostervoorbereiding. Vervolgens wordt een klein monstervolume op een met plasma gereinigd holey TEM-rooster geplaatst, gevolgd door flash-invriezen in vloeibaar ethaan en uiteindelijk beeldvorming met een cryo-TEM. De 2D-projectiebeelden van honderdduizenden tot miljoenen individuele deeltjes worden gemiddeld om een 3-dimensionale (3D) Coulomb-potentiaalkaart van het macromolecuul te reconstrueren. Het identificeren en modelleren van liganden en oplosmiddelmoleculen in deze kaarten levert in veel gevallen aanzienlijke uitdagingen op vanwege de anisotrope resolutie over de kaart (d.w.z. de resolutie is niet uniform over het macromolecuul), flexibiliteit in het gebied waar het ligand is gebonden en de ruis in de gegevens. Veel van de modellerings-, verfijnings- en visualisatietools die voor XRD zijn ontwikkeld, worden nu aangepast voor gebruik in cryoEM voor dezelfde doeleinden 18,19,20,21. In dit artikel wordt een overzicht gegeven van verschillende methoden en software die momenteel worden gebruikt om liganden te identificeren, modellen te bouwen en de coördinaten afgeleid van cryoEM te verfijnen. Er is een stapsgewijs protocol opgesteld om de processen te illustreren die betrokken zijn bij het modelleren van liganden met behulp van specifieke eiwit-ligandcomplexen met verschillende resolutie en complexiteit.

De eerste stap in het modelleren van liganden in cryoEM-kaarten omvat de identificatie van de liganddichtheid (niet-eiwit) in de kaart. Als ligandbinding geen conformationele verandering in het eiwit veroorzaakt, dan markeert het berekenen van een eenvoudige verschilkaart tussen het eiwit-ligandcomplex en het apo-eiwit in wezen de gebieden met extra dichtheid, wat de aanwezigheid van het ligand suggereert. Dergelijke verschillen kunnen onmiddellijk worden waargenomen, omdat er slechts twee kaarten nodig zijn, en zelfs tussenliggende kaarten tijdens het proces van 3D-verfijning kunnen worden gebruikt om te controleren of de ligand aanwezig is. Bovendien, als de resolutie hoog genoeg is (<3.0 Å), kan de verschilkaart ook inzicht geven in de locatie van watermoleculen en ionen die interageren met de ligand en de eiwitresiduen.

Bij afwezigheid van de apo-eiwitkaart is het nu mogelijk om Servalcat22 te gebruiken, dat beschikbaar is als een op zichzelf staande tool en ook is geïntegreerd in de CCP-EM-softwaresuite23,24 als onderdeel van de Refmac-verfijning en in CCP4 8.0 release25,26. Servalcat maakt het mogelijk om een FSC-gewogen verschilkaart (Fo-Fc) te berekenen met behulp van de niet-verscherpte half-maps en het apoproteïnemodel als invoer. De Fo-Fc weggelaten kaart geeft de ongelijkheid weer tussen de experimentele kaart (Fo) en de kaart die is afgeleid van het model (Fc). Bij afwezigheid van een ligand in het model, suggereert een positieve dichtheid in een Fo-Fc-kaart die overlapt met de experimentele EM-kaart doorgaans de aanwezigheid van het ligand. De aanname hier is dat de eiwitketen goed in de kaart past, en de resterende positieve dichtheid geeft de locatie van het ligand aan. Het is echter belangrijk om nauwgezet te onderzoeken of de positieve dichtheid voortkomt uit onnauwkeurigheden in het modelleren, zoals de verkeerde rotamer van een eiwitzijketen.

De tweede stap is het verkrijgen of maken van een cartesisch coördinatenbestand van de ligand met een goed gedefinieerde geometrie op basis van de beschikbare chemische informatie. Standaard liganden (bijvoorbeeld ATP en NADP+) die al beschikbaar zijn in de CCP4-monomeerbibliotheek kunnen worden gebruikt voor verfijning door de coördinaten- en geometriebestanden op te halen via hun monomeertoetredingscode. Voor onbekende of niet-standaard liganden zijn er echter verschillende tools beschikbaar om de geometriebestanden te maken. Enkele van de voorbeelden zijn de eLBOW27 - (elektronische ligandbouwer en optimalisatiewerkbank) in Phenix28, Lidia - een ingebouwde tool in Meerkoet29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-een module van Glide binnen de Schrödinger-suite. Het ligandcoördinatenbestand wordt vervolgens in de dichtheid gepast, geleid door zowel de experimentele cryoEM-kaart als de verschilkaart in Coot. Dit wordt gevolgd door real-space verfijning in Phenix28 of wederzijdse verfijning in Refmac33. Een Linux-werkstation of een laptop uitgerust met een goede grafische kaart en de bovengenoemde software is vereist. De meeste van deze programma's zijn opgenomen in verschillende suites. CCP-EM24 en Phenix28 zijn gratis beschikbaar voor academische gebruikers en bevatten een verscheidenheid aan tools die in dit artikel worden gebruikt, waaronder Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, enz. Evenzo bieden Chimera37 en ChimeraX38 gratis licenties aan academische gebruikers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Modellering van fosfoenolpyruvaat (PEP) in enolase uit Mycobacterium tuberculosis

  1. Identificatie van liganddichtheid in de cryoEM-kaart van het PEP-enolasecomplex
    1. Download de onverscherpte half-maps (emd_30988_additional_1.map en emd_30988_additional_2.map) van apo-enolase uit de aanvullende gegevens in EMDB (zie Tabel met materialen).
    2. Open ChimeraX (zie Tabel met materialen). Open de halve kaarten van apo-enolase door op Openen te klikken in de werkbalk en de bestandsnamen te selecteren. Typ vop voeg #1 #2 toe in de opdrachtregel om beide halve kaarten te combineren om de apo-enolase niet-verscherpte kaart te verkrijgen.
      OPMERKING: #1 en #2 geven de twee halve afbeeldingen aan voor het apo-enolase-enzym, zoals vermeld in stap 1.1.1.
    3. Hernoem de gecombineerde kaart (ChimeraX-kaart-ID: #3) door hernoem #3 Apo-enolase-unsharpened-map te typen. Kleur de kaart grijs in het modelpaneel. De kaart geeft aan dat enolase octameer is in de oplossing met D4-symmetrie.
    4. Herhaal de stappen 1.1.1-1.1.3 met behulp van de volgende halve kaarten emd_30989_additional_1.map (kaart-ID: 4) en emd_30989_additional_2.map (kaart-ID:5) om PEP-enolase-unsharpened-map (kaart-ID: #6) te verkrijgen.
    5. Om een verschilkaart te berekenen, past u eerst de twee kaarten (PEP-enolase en apo-enolase onverscherpte kaarten uit stap 1.1.3 en stap 1.1.4) op elkaar door te klikken op Fit (kaart in kaart) in het Kaartpaneel (werkbalk) in ChimeraX.
      OPMERKING: Er wordt geen normalisatie uitgevoerd tussen de twee kaarten. In sommige gevallen kan normalisatie nodig zijn om de kaarten op dezelfde schaal te brengen.
    6. Trek de PEP-enolase-kaart af van de apo-enolase-kaart door vop subtract #6 #3 in de opdrachtregel te typen.
      OPMERKING: #6 = PEP-enolase onverscherpte kaart, #3 = Apo-enolase onverscherpte kaart.
    7. Kleur de afgetrokken kaart (kaart-ID:7) in groen, wat een positieve dichtheid aangeeft (volgens de conventie in röntgenkristallografie)39.
    8. Download de coördinaten van M. tuberculosis octameric enolase (PDB: 7e4x) van de Protein Data Bank (PDB), klik op openen in de werkbalk en selecteer de bestandsnaam.
    9. Hernoem het model 7e4x.pdb door hernoem #8 Apo_enolase.pdb in de opdrachtregel te typen. #8 geeft de Apo_enolase.pdb aan in ChimeraX.
    10. Selecteer het model in het modelpaneel. Klik op de rechtermuisknop in de werkbalk. Klik op Molecuul verplaatsen om het model in de buurt van de PEP-enolase-kaart (#6) te plaatsen en het model uit te lijnen ten opzichte van de kaart. Pas dit model in de PEP-enolase-unsharpened-map door fit #8 in #6 in de opdrachtregel te typen. Hier is de kaart genummerd 6 en het model is genummerd 8.
      OPMERKING: In sommige gevallen is de lokale pasvorm in ChimeraX mogelijk niet voldoende om het model uit te lijnen. In deze gevallen kan een extra stap van globale aanpassing (DockinMap, zie Tabel met materialen) worden uitgevoerd in Phenix.
    11. Sla het aangepaste model op door save Apo-enolase.pdb #8 in de opdrachtregel te typen.
  2. Modellering en verfijning van PEP in de B-factor verscherpte cryoEM kaart van PEP-enolase complex
    1. Open "meerkoet" (zie Materiaaltabel) vanuit de terminal door ./Meerkoet &. in te typen.
    2. Geef "Apo-enolase.pdb" weer door op Bestand te klikken > Open Coördinaten Apo-enolase.pdb. Het coördinatenbestand wordt weergegeven door bindingen (kleur per atoom).
    3. Download de PEP-gebonden Enolase verscherpte kaart, d.w.z. emd_30989.map van EMDB. Geef hetzelfde weer door op Bestand te klikken > Open Map > emd_30989.map . Stel de drempel in op 7,00 σ door met de middelste muisknop te scrollen.
    4. Zoek niet-gemodelleerde blobs door te klikken op >Niet-gemodelleerde blobs valideren > Blobs zoeken.
    5. Lokaliseer de niet-gemodelleerde liganddichtheid in de buurt van de actieve siteresiduen, Ser 42, Lys-386 en Arg-364 van het enolasemodel.
    6. Haal het PEP-monomeermodelbestand uit de Meerkoet-monomeerbibliotheek door op Bestand > Get Monomer te klikken en PEP in te voeren als de 3-lettercode.
    7. Verplaats het PEP-molecuul naar de dichtheid met behulp van de optie Roteren/Vertalen- Zone/Keten/Molecuul in het zijbalkmenu. Gebruik real-space verfijning in Meerkoet om het PEP-molecuul in de dichtheid te passen door te klikken op Real Space Refine Zone in het zijbalkmenu. Voeg de aangebrachte ligand samen met de Apo-enolase.pdb met behulp van de optie molecuul samenvoegen in het tabblad Bewerken . Sla het model op als PEP-Enolase.pdb.
      OPMERKING: Men kan ook ligand gebruiken> Jiggle-Fit Ligand optie om ook op de ligand te passen.
    8. Om liganden toe te voegen aan de rest van de monomeren in het coördinatenbestand, klikt u op Bereken > NCS-tools > NCS-liganden. Er verschijnt een apart venster met de naam Find NCS-Related Ligands. Selecteer voor de optie Eiwit met NCS het coördinatenbestand Apo-enolase.pdb en Keten-ID A als NCS-hoofdketen.
      1. Selecteer voor het molecuul dat ligand bevat de Apo-enolase.pdb als het coördinatenbestand en Keten-ID, J en residunummer 1 tot 1. Klik op Vacatures voor kandidaten zoeken. Er verschijnt een venster met de naam Fitted Ligands met een lijst met kandidaatposities. Evalueer de pasvorm door op de individuele kandidaat-liganden te klikken en analyseer de pasvorm visueel.
        OPMERKING: In Servalcat/Refmac kan alleen een monomeermodel worden geleverd en kan de symmetrie die bij de reconstructie wordt gebruikt, worden gegeven om een uitgebreid model te verkrijgen.
    9. Extra dichtheid voor de oplosmiddelmoleculen werd ook waargenomen in de buurt van het ligand. Kristalstructuren met hoge resolutie van enolase uit verschillende homologen suggereren de aanwezigheid van twee Mg2+-ionen40,41, die waarschijnlijk de negatieve lading van het reactietussenproduct stabiliseren. Modelleer twee Mg2+-ionen in de dichtheid van de actieve plaats door te klikken op atoom plaatsen bij de aanwijzer en MG te selecteren in de lijst met atoomtypelijsten.
      OPMERKING: De geometrie en afstand van de binding kunnen als richtlijn worden gebruikt om het metaalion te selecteren. In het geval van Mg2+ gebonden aan zuurstofatomen in eiwitresiduen, varieert de bindingsafstand tussen 2,1 Å -2,4 Å, met een octaëdrische geometrie. In het geval van kaarten met een lage resolutie is de coördinatiesfeer echter vaak onvolledig en kan de afstand ook variëren vanwege beperkingen in de resolutie.
    10. Herhaal stap 1.2.8 om de Mg2+ -ionen toe te voegen aan de symmetriegerelateerde monomeren.
    11. Sla het model op door op Bestand te klikken > Coördinaten opslaan > Selecteer Bestandsnaam > en typ Enolase+PEP+Mg.pdb.
    12. Open Phenix GUI (zie Tabel met materialen). Voer een echte ruimteverfijningstaak uit met de Enolase+PEP+Mg.pdb en de emd_30989.map als respectievelijk het invoermodel en de kaart, met behulp van standaardparameters. Deze stap wordt iteratief uitgevoerd met Meerkoet om een goede pasvorm en geometrie van het kaartmodel te bereiken.
      OPMERKING: De onverscherpte verschilkaart wordt gebruikt om de aanwezigheid van ligand aan te tonen, zoals in een figuur. Voor modelleringsdoeleinden is de B-factor verscherpte kaart gebruikt en wordt aanbevolen. De B-factor verscherpte kaart kan ook worden gebruikt om de verschilkaart te berekenen voor demonstratiedoeleinden, in tegenstelling tot de niet-verscherpte kaart. Als de resolutie echter lager is in het gebied waar het ligand is gebonden, is het mogelijk dat de enkele B-factor die wordt gebruikt voor het verscherpen van de hele kaart de liganddichtheid niet duidelijk weergeeft.
  3. Visualisatie en figuurgeneratie van het gemodelleerde ligand
    1. Open het verfijnde Enolase+PEP+Mg-model van de uiteindelijke Phenix-verfijningstaak in PyMOL42 (zie Materiaaltabel) door op Bestand > Openen te klikken en de bestandsnaam te selecteren.
    2. Laad de emd-30989.map (PEP-gebonden verscherpte kaart) door op Bestand > Openen te klikken en de bestandsnaam te selecteren.
    3. Wijzig de naam van de kaart in PEP-verscherpt door op acties te klikken > hernoemen tegen het emd_30989 object en PEP-verscherpt te typen.
      OPMERKING: In de meeste gevallen, bijvoorbeeld enolase, worden de kaarten bij het openen in pymol genormaliseerd omdat de optie kaart normaliseren standaard is aangevinkt in pymol. Aangezien cryoEM-kaarten zijn gecentreerd op een grotere doos, zal de normalisatie alles in de doos omvatten. Normalisatie kan dus worden uitgeschakeld voordat deze in pymol wordt geopend.
    4. Selecteer de liganden door op weergeven > volgorde te klikken.
    5. Typ isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 in de opdrachtregel en druk op enter.
    6. Kleur de mesh_ligand blauw door op het laatste vakje, C, naast het mesh_ligand object te klikken.
    7. Geef de residuen van de actieve plaats weer, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 en Lys-386 die interageren met de PEP en Mg2+ in respectievelijk stok- en bolrepresentatie, en het enolase-enzym in cartoonrepresentatie.
    8. Ray trace door ray 3600, 3600 te typen om afbeeldingen van publicatiekwaliteit te genereren en op te slaan als een png-bestand door op Bestand > opslaan te klikken en PEP.png als bestandsnaam te kiezen.

2. Modellering van liganden in metabotrope glutamaatreceptor mGlu5

  1. Identificeren en modelleren van de liganddichtheid in de cryoEM-kaart van agonist- en antagonist-gebonden mGlu5
    1. Download de twee halve afbeeldingen samen met de bijbehorende coördinatenbestanden voor elk van de agonist-gebonden (EMD-31536, 7fd8.pdb) en de antagonist-gebonden (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu5-complexen .
    2. ChimeraX openen
      1. Open het coördinatenbestand, 7fd8.pdb door op openen te klikken en 7fd8.pdb te selecteren.
      2. Typ delete ligand in de opdrachtregel en druk op Enter.
      3. Gebruik op dezelfde manier het commando delete/B om de keten B te verwijderen.
        OPMERKING: Liganden en ketens kunnen worden verwijderd met behulp van het vervolgkeuzemenu bovenaan met behulp van selecteren en acties > atomen/bindingen > verwijderen.
      4. Sla de niet-geligandeerde pdb op door het volgende in de opdrachtregel te typen: sla 7fd8_noligand_chainA.pdb #1 op. #1 geeft de model-ID aan.
      5. Herhaal de stappen 2.1.2.1-2.1.2.4 voor 7fd9.pdb.
    3. CCP-EM openen. Maak een nieuw project aan met de naam mGlu5 en geef de projectmap en gebruikersnaam op.
      1. Open Relion vanuit de opties in het linkerdeelvenster.
        1. Ga naar het tabblad Masker maken .
        2. Geef een van de halve kaarten voor EMD-31536 op als invoer.
          OPMERKING: Relion accepteert kaarten met .mrc als achtervoegsel en de EMD-kaarten hebben het achtervoegsel .map. De kaartbestanden kunnen in ChimeraX worden geopend voor onderzoek en worden opgeslagen in het .mrc-formaat.
        3. Geef op het tabblad Masker de pixelgrootte op als 0,89 Å en de initiële binarisatiedrempel als 0,007.
        4. Voer de taak uit met de alias 31536 (of een andere naam die gemakkelijk te volgen is).
        5. Maak op dezelfde manier een masker voor de EMD - 31537 halve kaart.
      2. Open het Refmac Servalcat-programma vanuit de opties in het linkerdeelvenster in CCPEM.
        1. Geef de naam op als mGlu5_agonist.
        2. Importeer het 7fd8_noligand_chainA .pdb-bestand zoals beschreven in modelsectie 2.1.2.4. Geef de locatie van de twee halve kaarten en het bijbehorende masker op dat in Relion is gemaakt.
        3. Geef de resolutie op als 3,8 Å.
        4. Ga naar verfijningsinstellingen > Strikte symmetrie en vermeld C2 als de symmetrie van de Relion-puntgroep.
        5. Start het programma door op de startknop bovenaan te drukken.
    4. Zodra de taak is voltooid, opent u het resultaat in Meerkoet (optie beschikbaar bovenaan in het resultatengedeelte). Dit zal standaard een diffmap.mtz in Coot weergeven, waarbij de kleuren rood en groen respectievelijk negatieve en positieve dichtheden aangeven.
      1. Ga naar Display manager > eigenschappen van de verschilkaart met het label DELFWT PHDELWT en verander het contourniveau naar 4.0 (absolute waarde).
        OPMERKING: De keuze van de drempel is afhankelijk van de kaart en de resolutie.
      2. Verberg de kaart met het label FWT PHWT en het molecuul met het label refined.pdb.
      3. Verplaats de kaart met de muis om de positieve dichtheid te visualiseren (groen gekleurd) en breng de grotere klodder naar het midden.
      4. Ga naar Bestand > monomeer ophalen, typ QUS en druk op enter.
      5. Ga naar Bereken > modellering > Rigid Body Fit-molecuul en dubbelklik op het QUS-monomeer om het molecuul aan te passen aan de Fo-Fc-dichtheid.
      6. Gebruik de optie molecuul samenvoegen op het tabblad Bewerken om het QUS-molecuul toe te voegen aan het coördinatenbestand, refined.pdb.
      7. Herhaal stap 2.1.4.3-2.1.4.6 om de ligand met monomeercode NAG en CHS in de kleinere blob in respectievelijk het extracellulaire en aan de bovenkant van het transmembraandomein te passen.
      8. Sla de coördinaat op als refined_ligands.pdb.
        OPMERKING: De resolutie van het transmembraan (TM) domein is lager en wordt hier dus niet besproken.
  2. Verfijning van de mGlu5 geligandeerde structuur
    1. Open CCPEM en kloon de vorige verfijningstaak (stap 2.1.3.2) en voer deze uit met de refined_ligands.pdb en de verscherpte kaart (emd. 31536.mrc) als invoer, met behulp van standaardparameters en C2-symmetrie.
      OPMERKING: Als het programma de ligand niet herkent, moeten de CIF-bestanden worden aangeleverd. Deze CIF-bestanden kunnen worden gedownload van de PDB of worden gegenereerd met behulp van verschillende programma's (zie stap 3.1.1 voor details).
  3. Visualisatie en figuurgeneratie in PyMOL
    1. Open het refined_expanded.pdb-model van de nieuwste Refmac-verfijningstaak in PyMOL.
    2. Ga naar Bestand > Open en blader naar de Refmac-taakmap om het bestand diffmap_normalised_fofc.mrc (verschilkaart van Servalcat-taak in stap 2.1.3.2) te laden.
      OPMERKING: Als de bestanden met de extensie .mrc niet zichtbaar zijn tijdens het browsen, wijzig dan het bestandstype in alle bestanden en blader.
    3. Selecteer de liganden met behulp van weergave > volgorde.
    4. Ga naar de knop Acties en hernoem de selectie naar liganden.
    5. Typ het volgende in de opdrachtregel en druk op enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, liganden, carve=2.5.
      OPMERKING: De maaswijdte kan worden aangepast. Hier wordt 0,2 maaswijdte gebruikt, en dit wordt ingesteld met behulp van het volgende commando: set mesh_width=0,2.
    6. Klik met de rechtermuisknop op een van de monomeren en ga naar keten > kleur om de kleur van elk monomeer op te geven. Kleur de ligand en het net met behulp van het laatste vak met het label c in de ligand en mesh_ligands objecten. Het mGlu 5-receptordimeer wordt getoond in cartoonweergave en de monomeren zijn gekleurd in groenblauw en tarwe. Liganden worden weergegeven in een stok en het gaas dat de liganden omlijnt, is groen gekleurd.
    7. Gebruik de acties > de optie oriënteren/centreren/zoomen tegen de objecten en pas deze handmatig aan om het net duidelijk te visualiseren. Selecteer de residuen in de buurt die interactie kunnen hebben met de ligand, bijvoorbeeld Tyr64, Trp100 voor QUS, en geef indien nodig hun zijketen of hoofdketen of beide weer als stickweergave.
    8. Ray trace om afbeeldingen met een hoge resolutie te genereren en deze op te slaan als een png-bestand.
      OPMERKING: De bovenstaande stappen worden herhaald voor de antagonist-gebonden kaart EMD-31537 en het bijbehorende coördinatenbestand PDB-7fd9.

3. Modellering van de inhibitor, deoxygalacto-nojirimycine (DGN) en oplosmiddelmoleculen in een verscherpte kaart met hoge resolutie van β-galactosidase

  1. Identificatie van het ligand, DGN, met behulp van de halve kaarten van cryoEM
    1. Voorbereiding van een onbekend Ligand-woordenboek voor modellering [Deoxygalacto-nojirimycine (DGN)]
      OPMERKING: Het woordenboekbestand Deoxygalacto-nojirimycine is opgenomen in de CCP4-monomeerbibliotheek als DGJ (ligand-ID van 3 letters). Desalniettemin wordt het hier beschouwd als een nieuwe en onbekende ligand om het proces van het genereren van woordenboekbestanden voor onbekende liganden te illustreren, DGN wordt gebruikt als de 3-lettercode.
      1. Open de samenvatting van de verbindingen voor deoxygalacto-nojirimycine (DGN) op de PubChem-webpagina en kopieer de smiles-tekenreeks voor de verbinding deoxygalacto-nojirimycine.
      2. Open Phenix > Liganden > eLBOW.
      3. Geef de tekenreeks 'Smiles' op als invoer.
      4. Geef de juiste optimalisatiemethode voor ligandopbouw op. Hier wordt gebruik gemaakt van eenvoudige optimalisatie.
      5. Plak de tekenreeks voor chemische glimlachen in het gedeelte over de liganddefinitie.
      6. Geef op de juiste manier een functietitel, het voorvoegsel van het uitvoerbestand en de ligand-ID op en druk op uitvoeren.
        OPMERKING: De uitvoer van de taak bevat een coördinatenbestand, DGN.pdb, en een woordenboekbestand, DGN.cif-bestand. Jligand29 kan ook worden gebruikt om het cif-bestand te maken.
    2. Download het β-galactosidase coördinatenbestand (6tsh.pdb) van de PDB en verwijder de coördinaten voor de eiwitketens (B, C, D), ligand, DGN en andere oplosmiddelmoleculen met behulp van een teksteditor of de optie voor het verwijderen van ketens/zones in Coot. Sla het coördinatenbestand op als apo-betaGal_chainA.pdb.
      OPMERKING: ChimeraX of Pymol kan ook worden gebruikt om het ligand/oplosmiddelmolecuul te verwijderen.
    3. Download de halve kaarten (emd_10563_half_map_1.map en emd_10563_half_map_2.map) van aanvullende gegevens van de EMD-10563-vermelding van EMDB.
    4. Open CCPEM en gebruik Relion om het masker voor de kaart te maken op een drempel van 0,01 (zoals beschreven in de stappen 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
    5. Voer Servalcat uit (binnen de CCPEM-suite zoals beschreven in stap 2) met de half-maps verkregen in stap 3.1.3 en het apo-model in stap 3.1.2 en D2-symmetrie.
      OPMERKING: Het model moet worden uitgelijnd met een van de halve kaarten of volledige kaarten voor het lokaliseren van de liganddichtheid. Dit kan worden gedaan door het model in de kaart te passen met behulp van ChimeraX en vervolgens de coördinaten ten opzichte van de halve kaart op te slaan. In dit voorbeeld hebben half-maps en de primaire map in EMDB verschillende vakformaten/rasters en moet het model in de half-map worden geplaatst.
    6. Open Meerkoet.
      1. Open DGN.cif voor het ligandwoordenboek zoals gegenereerd in stap 3.1.1 met Phenix eLBOW. Dit wordt gedaan door naar Bestand > CIF-woordenboek importeren te gaan en door de eLBOW-taakmap te bladeren.
      2. Open de eiwit- en ligandcoördinatenbestanden, respectievelijk apo-betaGal_chainA.pdb uit stap 3.1.2 en DGN.pdb uit stap 3.1.6.
      3. Open automatisch het bestand diffmap.mtz vanuit de Servalcat-taak (stap 3.1.5) en visualiseer de kaart met het label DELFWT PHDELWT in Coot. Contour de kaart op een drempel van ~ 4 absolute waarde.
        OPMERKING: Het is belangrijk om de kaartstatistieken te controleren door header map.mrc te typen of tools in Chimera te gebruiken. Alle benodigde informatie over de pixelgrootte, doosgrootte, minimale, gemiddelde en maximale dichtheid en rms-afwijking van de gemiddelde dichtheid kan worden verkregen. Het is van cruciaal belang om de pixelgrootte en doosgrootte van de cryoEM-kaarten te controleren. De 3D-kaart vertegenwoordigt het eiwit-ligandkaartvolume in een raster van 3D-voxels. In elke voxel wordt de elektronenpotentiaalwaarde of de kans dat het elektron op die locatie wordt gevonden, opgeslagen. Wanneer een bepaalde drempel wordt gekozen, worden de voxels, die een dichtheid hebben die lager is dan de opgegeven waarde, op nul gezet. Dit helpt om de experimentele ruis in de kaart te minimaliseren en de kaartkenmerken beter te visualiseren43. De kaart moet dus worden omlijnd op een drempel waar de kaartkenmerken gemakkelijk zichtbaar zijn en de ruis op de kaart minimaal is.
      4. Ga naar Ligand > Liganden te vinden. Selecteer in het nieuwe venster dat verschijnt ligand, de verschilkaart en het apo-betaGal_chainA.pdb-model. Laat de andere opties op hun standaardinstellingen staan en klik op Liganden zoeken om het zoeken te starten.
      5. Een lijst met toptreffers die de potentiële liganddichtheid aangeven, wordt weergegeven met een kopie in elk van de dichtheden. Controleer handmatig alle treffers waar de ligand is geplaatst. Bewaar de meest waarschijnlijke treffers en verwijder de dubbelzinnige.
        OPMERKING: Het verschil in kaartdichtheid bij een hoge drempel suggereert duidelijk de aanwezigheid van het ligand in de actieve site.
  2. Modellering van de ligand DGN en oplosmiddelmoleculen
    1. Voer een echte ruimteverfijning uit in Meerkoet om de ligand (DGN.pdb) in de verschildichtheidskaart te laten passen, en voeg vervolgens de ligandcoördinaten samen met de apo-betaGal_chainA.pdb en sla deze op als betaGal_chainA+ligand.pdb.
      OPMERKING: De liganden die in gebieden van andere ketens zijn geplaatst, kunnen worden verwijderd en worden niet samengevoegd tijdens het opslaan van het samengevoegde coördinatenbestand. De liganden in andere ketens kunnen worden gegenereerd door NCS-liganden, zoals weergegeven in voorbeeld 1, stap 1.2.8, of in Refmac/Servalcat met behulp van symmetrie-uitbreiding.
    2. Voer nog een Servalcat-taak uit zoals hierboven (stap 3.1.5) met betaGal_chainA+ligand.pdb als invoermodel en de half-maps (uit stap 3.1.3) met D2-symmetrie.
    3. Verschildichtheid (van de Servalcat-taak in stap 3.2.2) rond het gemodelleerde ligand suggereert de aanwezigheid van de oplosmiddelmoleculen die coördineren met het ligandmolecuul. De centrale dichtheid dicht bij het ligand lijkt te groot voor watermoleculen.
    4. Op basis van eerdere biochemische en structurele gegevens die de aanwezigheid van Mg2+ op die positie aangeven, wordt het Mg2+- ion hier gemodelleerd door op de optie plaatsatoom te klikken en het atoom als MG te specificeren.
    5. Modelleer watermoleculen in de verschildichtheid op de actieve plaats die de aanwezigheid van een oplosmiddelmolecuul aangeven door op het plaatsatoom op de aanwijzer te klikken en water te selecteren.
      OPMERKING: Meerkoet heeft ook de mogelijkheid om automatisch watermoleculen te kiezen. Hier, aangezien de focus alleen op de actieve site ligt, worden watermoleculen handmatig toegevoegd.
    6. Voeg de coördinaten voor Mg2+ en water samen met het bestand betaGal+ligand.pdb en sla het op als betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
    7. Met de betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb voer je Refmac-verfijning uit in Servalcat met D2-symmetrie.
      OPMERKING: De outputverschilkaart van deze taak kan dienen als een middel om te valideren of de ligand nauwkeurig is gemodelleerd, aangezien de verschilkaart een minimale resterende positieve of negatieve dichtheid moet laten zien.
  3. Visualisatie en figuurgeneratie met PyMOL
    OPMERKING: De hieronder beschreven stappen geven enkele voorbeelden van het maken van figuren met behulp van modellen en kaarten die kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van liganden en oplosmiddelen te illustreren.
    1. Open de refined_expanded.pdb van de laatste Servalcat-taak (stap 3.2.6) met de ligand en het oplosmiddel gemodelleerd.
    2. Selecteer verschillende kettingen afzonderlijk om ze magenta, geel, groen en groenblauw te kleuren, zoals beschreven in voorbeeld 2.
    3. Ga naar Weergave > volgorde, maak afzonderlijke selecties voor de watermoleculen, magnesium en DGN, en hernoem de objecten respectievelijk water, MG en DGN.
    4. Geef MG- en watermoleculen weer als bollen door de objecten te selecteren, met de rechtermuisknop te klikken en > bol te tonen. Geef op dezelfde manier de ligand weer in stickweergave en kleur de liganden en oplosmiddelen op de juiste manier. In dit geval is het ligand geel gekleurd door een heteroatoom, het magnesiumion is paars gekleurd en watermoleculen zijn rood gekleurd.
    5. Selecteer DGN-, MG- en watermoleculen. Klik met de rechtermuisknop en selecteer acties > naar object te kopiëren en het een naam te geven als liganden.
    6. Open de diffmap_normalised_fo.mrc van de Servalcat-taak in stap 3.2.6 en hernoem deze naar ligand_fo.mrc. Typ het volgende commando: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, liganden, carve=2.
      OPMERKING: De snijoptie van 2 Å wordt toegepast rond de atomen en afhankelijk van de resolutie en kwaliteit van de kaarten kunnen waarden van 3-5 worden gebruikt. Verder is het bij het openen van cryoEM-kaarten in PyMOL aan te raden om normalize_ccp4_maps uit te zetten.
    7. Gebruik de acties > oriënteren/zoomen opties en pas deze handmatig aan om de liganden en nabijgelegen interagerende residuen (indien van toepassing) te visualiseren, zoals weergegeven in stap 2.3.7.
    8. Ray trace deze scènes om afbeeldingen met een hoge resolutie op te slaan met behulp van de opdracht ray 3600, 3600.
    9. Sla de scène op als .png bestand.
      OPMERKING: De volgende stappen zijn optioneel en schetsen het proces om (1) de verschildichtheid (Fo-Fc) voor het niet-gemodelleerde ligand, DGN, (2) de dichtheid (Fo) van het gemodelleerde ligand, DGN, evenals de verschildichtheid (Fo-Fc) voor niet-gemodelleerde oplosmiddelen en ten slotte voor de (3) de dichtheid (Fo) voor het gemodelleerde ligand, DGN en de oplosmiddelmoleculen op de actieve plaats.
    10. Om de aanwezigheid van de ligand-, DGN- en omringende oplosmiddelmoleculen aan te tonen met behulp van de verschilkaart, opent u diffmap_normalised_fofc.mrc van de Servalcat-taak in stap 3.1.5. Wijzig de naam van het kaartbestand in unliganded_fofc.mrc door op acties te klikken > de naam wijzigen naast het kaartobject. Typ het volgende in de opdrachtregel: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, liganden, level=6, carve=2.
    11. Om de dichtheid van het gemodelleerde ligand, DGN, en de omringende niet-gemodelleerde oplosmiddeldichtheid aan te tonen, opent u zowel de diffmap_normalised_fo.mrc als diffmap_normalised_fofc.mrc van de servalcat-taak in stap 3.2.2. Hernoem de diffmap_normalised_fo.mrc als DGN_fo en de diffmap_normalised_fofc.mrc als DGN_unmodelled_solvents_fofc.
    12. Selecteer MG en water in Display > Sequence, klik met de rechtermuisknop en selecteer acties > naar object te kopiëren en noem ze als oplosmiddelen.
    13. Typ het volgende in de opdrachtregel: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, niveau=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, oplosmiddelen, niveau=6, carve=2.
      OPMERKING: De mesh_DGN_fo toont de dichtheid van het ligand en de mesh_solvent_fofc toont de weggelaten dichtheid voor de MG en water.
    14. Ten slotte, om de gemodelleerde liganden en de omringende oplosmiddelmoleculen in de actieve site te visualiseren, opent u de diffmap_normalised_fo.mrc van de Servalcat-taak in stap 3.2.6 en hernoemt u deze naar ligand_fo.mrc.
    15. Typ het volgende in de opdrachtregel: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
      OPMERKING: Hier hebben we diffmap_normalised_fo.mrc gebruikt, maar de uiteindelijke verscherpte kaart kan worden gebruikt om de dichtheid van liganden en de omringende residuen weer te geven. Het is een goede gewoonte om het type kaart dat wordt gebruikt, B-factor verscherpingswaarden te vermelden in de legenda van de figuur.
    16. De maaswijdte en bolgrootte kunnen worden ingesteld door de volgende commando's te typen: set mesh_width=0.2 en set sphere_scale=0.25 om de bolgrootte kleiner te maken.
    17. Kleur de fo mesh blauw en de fofc mesh groen.
    18. Gebruik de acties > oriënteren/zoomen opties en pas deze handmatig aan om de liganden en nabijgelegen interagerende residuen te visualiseren (indien van toepassing), zoals weergegeven in stap 2.3.7.
    19. Ray trace deze scènes om afbeeldingen met een hoge resolutie op te slaan met behulp van de opdracht ray 3600, 3600.
    20. Sla de afzonderlijke scènes op als .png bestanden.

4. Effect van resolutie op ligandmodellering in β-galactosidase

  1. Open Terminal en ga naar de map met de twee halve kaarten.
  2. Open de twee half-maps (stap 3.1.3) in .map formaat in ChimeraX, visualiseer ze en sla ze op als emd10563_half1_1_unfil.mrc en emd10563_half2_1_unfil.mrc.
  3. Het masker dat in stap 3.1.4 is gemaakt, kan als invoer worden gebruikt.
  4. Voer een PostProcessing-taak uit in Relion met behulp van halve toewijzingen en maskers uit stap 4.2-4.3, met de standaardparameters.
  5. Herhaal stap 4.4, nu met een Skip FSC-weging ingeschakeld en met een ad-hoc laagdoorlaatfilter van 3 Å.
  6. Herhaal stap 4.4 met een ad-hoc laagdoorlaatfilter van 3,5 Å.
  7. Open de kaarten (postprocess.mrc) uit stap 4.4-4.6, filter op verschillende resoluties en het bestand modelcoördinaat, 6tsh.pdb (uitgelijnd met de halve kaarten in ChimeraX) uit stap 3.1.2 in PyMOL. Wijzig de naam van de verschillende kaarten in 3.0, 3.5 en 2.3, zoals gedefinieerd door hun resoluties.
    OPMERKING: Men kan de low-pass filtering van de kaarten bevestigen door ze te visualiseren in ChimeraX of Coot.
  8. Visualiseer het effect van resolutie op de dichtheid van ligand- en oplosmiddelmoleculen door een mesh van 2 Å rond de ligand- en oplosmiddelmoleculen te creëren bij een drempel van 6σ, zoals beschreven in stap 3.3.6 met kaarten gefilterd op verschillende resoluties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voorbeeld 1
Het enzym enolase van M. tuberculosis katalyseert de voorlaatste stap van glycolyse en zet 2-fosfoglyceraat om in fosfoenolpyruvaat (PEP), een essentieel tussenproduct voor verschillende metabole routes44,45. CryoEM-gegevens voor de apo-enolase- en PEP-gebonden enolase-monsters werden verzameld met dezelfde pixelgrootte van 1,07 Å, en beeldverwerking werd uitgevoerd met Relion 3.146,47

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De verbeteringen in de hardware en software van microscopen hebben de afgelopen jaren geleid tot een toename van het aantal cryoEM-structuren. Hoewel de hoogste resolutie die op dit moment wordt bereikt in cryoEM met één deeltje 1,2 Å 57,58,59 is, wordt het merendeel van de structuren bepaald rond de 3-4 Å resolutie. Het modelleren van liganden in kaarten met een gemiddelde tot lage resolutie kan lastig zijn en vaak beladen met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

SJ is een ontvanger van het PhD-studentschap van DAE-TIFR, en de financiering wordt erkend. KRV erkent DBT B-Life-subsidie DBT/PR12422/MED/31/287/2014 en de steun van het Department of Atomic Energy, Government of India, onder Project Identification No. RTI4006.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CCP4-8.0Consortium van verschillende institutenhttps://www.ccp4.ac.ukGratis voor academische gebruikers en bevat Coot en een lijst van tools ontwikkeld voor röntgenkristallografie
CCP-EMConsortium van verschillende institutenhttps://www.ccpem.ac.uk/download.phpGratis voor academische gebruikers en bevat Coot, Relion en vele anderen
Coot Paul Emsley, LMB, Cambridgehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/Algemene software voor modelbouw maar ook beschikbaar met andere suites hierboven beschreven
DockinMap (Phenix)Consortium van verschillende institutenhttps://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.htmlSoftware binnen de Phenix suite voor het docken van modellen in cryoEM kaarten
Electron Microscopy Data Bank Consortium van verschillende institutenhttps://www.ebi.ac.uk/emdb/Publieke opslagplaats voor elektronenmicroscopie kaarten
FalconThermo Fisher Scientific https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdfCommercieel, camera van Thermo Fisher 
Phenix Consortium van verschillende institutenhttps://phenix-online.org/downloadGratis voor academische gebruikers en bevat Coot
Protein Data BankConsortium van verschillende institutenhttps://rcsb.orgPublieke database van macromoleculaire structuren
PymolSchrodingerhttps://pymol.org/2/Moleculair visualisatietool. Educatieve versie is gratis maar komt met beperkingen. De volledige versie kan worden verkregen tegen een kleine vergoeding.
RelionMRC-LMB, Cambridgehttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.htmlSoftware voor cryoEM beeldverwerking, ook beschikbaar met CCP-EM
Titan KriosThermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		Commercieel, cryoTEM van Thermo Fisher
UCSF ChimeraUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.htmlAlgemeen doel software voor weergave, analyse en meer
UCSF Chimera XUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Algemeen doel software voor weergave, analyse en meer

Referenties

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514(2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM': electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. EMDB (the Electron Microscopy Data Bank. , Available from: www.ebi.ac.uk/emdb/ (2023).
  13. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  14. RCSB.org. , Available from: http://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2024).
  15. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  16. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  17. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164(2023).
  18. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  19. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  20. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  21. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  22. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  23. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  24. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  25. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  26. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  27. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  28. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  29. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  30. Debreczeni, J. É, Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  31. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  32. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , Schrödinger, LLC. New York, NY. (2022).
  33. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  35. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  36. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  37. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  39. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  40. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  41. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemistry. 62 (3), 735-746 (2023).
  42. DeLano, W. L. The PyMOL molecular graphics system. Schrödinger LLC wwwpymolorg. Version 1. , Available from: http://www.pymol.org (2002).
  43. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  44. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  45. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  46. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  48. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  49. RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB). , Available from: http://www.rcsb.org (2023).
  50. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  51. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648(2021).
  52. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  53. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  54. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309(2019).
  55. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  56. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  57. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98(2023).
  58. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  59. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  60. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  61. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  62. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  63. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  64. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  65. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  66. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  67. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  68. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  69. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  70. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cryo-EM-kaartenLigandmodelleringProteïne-ligandinteractiesMacromoleculaire complexenDifferentiekaartReal-space verfijningActieve site-residuenFosfoenolpyruvaatbindingMagnesiumcoördinatie
Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.