Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Computationele voorspelling van aminozuurvoorkeuren van potentieel multispecifieke peptide-bindende domeinen die betrokken zijn bij eiwit-eiwitinteracties

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66314

⸱

26 januari 2024

 ,  , 
1Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad Tecnológica de Panamá (UTP), 2Centro de Biología Molecular y Celular de Enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología AIP (INDICASAT AIP), 3Sistema Nacional de Investigación de Panamá (SNI)

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een methodologie gebaseerd op sequentiediversificatie om de aminozuurvoorkeuren van multispecifieke bindingsplaatsen in eiwit-eiwitinteracties (PPI's) te schatten. In deze strategie worden duizenden potentiële peptideliganden gegenereerd en gescreend in silico, waardoor enkele beperkingen van beschikbare experimentele methoden worden overwonnen.

Samenvatting

Veel eiwit-eiwitinteracties omvatten de binding van korte eiwitsegmenten aan peptidebindende domeinen. Gewoonlijk vereisen dergelijke interacties de herkenning van lineaire motieven met variabele conservering. De combinatie van sterk geconserveerde en meer variabele regio's in dezelfde liganden draagt vaak bij aan de multispecificiteit van binding, een gemeenschappelijke eigenschap van enzymen en celsignaleringseiwitten. Karakterisering van aminozuurvoorkeuren van peptide-bindende domeinen is belangrijk voor het ontwerp van mediatoren van eiwit-eiwitinteracties (PPI's). Computationele methoden zijn een efficiënt alternatief voor de vaak dure en omslachtige experimentele technieken, waardoor het mogelijk is om potentiële mediatoren te ontwerpen die later kunnen worden gevalideerd in stroomafwaartse experimenten. Hier hebben we een methodologie beschreven met behulp van de Pepspec-toepassing van het moleculaire modelleringspakket Rosetta om de aminozuurvoorkeuren van peptidebindende domeinen te voorspellen. Deze methodologie is nuttig wanneer de structuur van het receptoreiwit en de aard van het peptideligand beide bekend zijn of kunnen worden afgeleid. De methodologie begint met een goed gekarakteriseerd anker uit het ligand, dat wordt uitgebreid door willekeurig aminozuurresiduen toe te voegen. De bindingsaffiniteit van peptiden die op deze manier worden gegenereerd, wordt vervolgens geëvalueerd door docking van peptiden met flexibele ruggengraat om de peptiden met de best voorspelde bindingsscores te selecteren. Deze peptiden worden vervolgens gebruikt om aminozuurvoorkeuren te berekenen en om optioneel een positie-gewichtsmatrix (PWM) te berekenen die in verdere studies kan worden gebruikt. Om de toepassing van deze methodologie te illustreren, gebruikten we de interactie tussen subeenheden van humane interferonregulerende factor 5 (IRF5), waarvan eerder bekend was dat ze multispecifiek waren, maar wereldwijd worden geleid door een kort geconserveerd motief genaamd pLxIS. De geschatte aminozuurvoorkeuren kwamen overeen met eerdere kennis over het IRF5-bindingsoppervlak. Posities ingenomen door fosforyleerbare serineresiduen vertoonden een hoge frequentie van aspartaat en glutamaat, waarschijnlijk omdat hun negatief geladen zijketens vergelijkbaar zijn met fosfoserine.

Inleiding

Interactie tussen twee eiwitten omvat vaak de binding van korte segmenten van aminozuren aan peptide-bindende domeinen, die lijken op eiwit-peptide-interfaces. Receptoreiwitten die betrokken zijn bij dergelijke eiwit-eiwitinteracties (PPI) hebben vaak het vermogen om een bepaalde reeks overlappende maar uiteenlopende ligandsequenties te herkennen, een eigenschap die bekend staat als multispecificiteit 1,2. Multispecifieke herkenning is een kenmerk van veel cellulaire eiwitten, maar het is vooral opmerkelijk in enzymen en celsignalerende eiwitten3. Eiwitten die interageren met multispecifieke bindingsplaatsen hebben vaak een combinatie van meer en minder geconserveerde regio's in hun sequentie 4,5,6. In dit scenario zijn de meer geconserveerde sequentiemotieven betrokken bij strikte moleculaire interacties. Omgekeerd interageren de meer variabele sequenties met op de een of andere manier permissieve oppervlakken in de receptorbindingsplaats. Meestal zijn deze minder geconserveerde maar nog steeds functioneel relevante segmenten lussen zonder gedefinieerde secundaire structuurpatronen of hebben ze zelfs meer dynamische conformaties, zoals die typisch zijn voor intrinsiek ongeordende eiwitten7.

Identificatie van potentiële peptideliganden van bindingsplaatsen is meestal de eerste stap in het ontwerp van mediatoren die kunnen interfereren met de overeenkomstige PPI's8. Het is echter vaak onwaarschijnlijk dat er op de meeste sequentieposities in liganden van multispecifieke bindingsplaatsen een enkel meest frequent aminozuurresidu wordt gevonden. In plaats daarvan kunnen deze sites specifieke voorkeuren hebben voor een specifieke klasse aminozuren op basis van hun chemische eigenschappen, bijvoorbeeld zure en negatief geladen aminozuren zoals aspartaat of glutamaat, volumineuze aromatische aminozuren zoals fenylalanine of meer hydrofobe residuen zoals alifatische aminozuren alanine, valine, leucine of isoleucine3. Verschillende experimentele methoden kunnen inzicht verschaffen in aminozuurvoorkeuren van eiwitbindingsplaatsen, waaronder gerichte evolutie9, multi-codon scanning mutagenese10 en diepe mutatiescanning11. Al deze methoden volgen de benadering van sequentiediversificatie, die is gebaseerd op het introduceren van mutaties in oorspronkelijke liganden en het verder analyseren van hun effect op de functie van het receptoreiwit (zie Bratulic en Badran12 voor een uitgebreid overzicht). Deze methoden vereisen echter vaak het onderzoeken van grote sequentiebibliotheken, waardoor ze omslachtiger, duurder en tijdrovender worden.

Computationele methoden om de aminozuurvoorkeuren van multispecifieke bindingsplaatsen af te leiden, hebben het potentieel om de beperkingen van natte laboratoriummethoden te omzeilen. Onder deze evalueert de in silico sequentiediversificatiebenadering de energetische impact van een breed scala aan aminozuurvervangingen in de ligandsequentie als een manier om de structurele plasticiteit van de PPI13 te karakteriseren. Deze methode begint met de structuur of het model van het peptideligand dat aan de receptorbindingsplaats is gebonden en introduceert vervolgens mutaties in de ligandsequentie. Statistische en energiescorefuncties worden vervolgens gebruikt om de impact van deze mutaties op de stabiliteit en bindingsaffiniteit te evalueren. De set van best scorende ligandsequenties die het resultaat zijn van de evaluatiefase kan vervolgens worden gebruikt om de aminozuurvoorkeuren te berekenen. Deze strategie heeft het potentieel om een zeer hoog aantal ligandsequenties op een efficiënte manier te verwerken. Daarom kan het een completere en consistentere gevolgtrekking van aminozuurvoorkeuren bieden in vergelijking met die berekend op basis van het beperktere aantal sequenties dat gewoonlijk kan worden verwerkt in natte laboratoriumbenaderingen.

De Pepspec-toepassing van de moleculaire modelleringssuite14 van Rosetta is een hulpmiddel dat sequentiediversificatie uitvoert als een belangrijke stap van de peptide-ontwerpmodus. Deze toepassing vereist een structuur of model van het receptoreiwit met een gebonden peptide tot een enkel aminozuurresidu in lengte, dat wordt gebruikt als anker voor de volgende stappen. De sequentie van het gebonden peptide wordt vervolgens uitgebreid (indien nodig) en gediversifieerd om een groot aantal vermeende peptideliganden te genereren. De bindingsaffiniteit van deze peptiden wordt vervolgens geëvalueerd door middel van docking van peptiden met flexibele ruggengraat om de peptiden te selecteren met de best voorspelde bindingsscores. Hoewel de belangrijkste output van deze applicatie de beste peptidekandidaten zijn die aan het einde van de ontwerpfase zijn geselecteerd, kan de veel grotere set peptiden die tijdens deze fase wordt geaccepteerd, ook worden gebruikt om de aminozuurvoorkeuren van de doelbindingsplaats te berekenen. Aminozuurvoorkeuren worden berekend als de frequentie van elk aminozuurresidu per positie van de ligandsequentie die wordt weergegeven als een positiegewichtsmatrix (PWM) of als een meer visueel sequentielogo.

In dit artikel beschrijven we een protocol om de aminozuurvoorkeuren van het bindingsoppervlak van een receptoreiwit dat betrokken is bij een PPI te schatten. Het protocol is gericht op PPI's waarvan bekend is dat een lineair segment van het eiwitligand bindt aan het receptoreiwit, zodat het scenario kan worden gemodelleerd als een eiwit-peptide-interface. In dit scenario interageren geconserveerde motieven van de ligand doorgaans met gedefinieerde pockets in de receptorbindingsplaats, hoewel het hele ligandsegment dat betrokken is bij de PPI mogelijk minder geconserveerde regio's bevat. Een stroomdiagram met een samenvatting van de belangrijkste stappen van het protocol is weergegeven in figuur 1. Het protocol begint met de 3D-structuur van het eiwit-eiwitcomplex en reduceert het ligand-eiwit verder tot het potentieel best interagerende segment, waarbij het receptoreiwit intact blijft. Het best interagerende segment wordt afgeleid door gebruik te maken van de BUDE Alanine Scan-server15, die computationele alaninescanmutagenese uitvoert om hot-spot-residuen tussen de twee op elkaar inwerkende eiwitten te identificeren. In deze benadering worden residuen van het ligand afzonderlijk vervangen door alanine, en de geschatte verandering in vrije energie of stabiliteit van het complex (ΔΔG) wordt vervolgens gebruikt om de relevantie van het overeenkomstige residu voor de doel-PPI af te leiden. Zodra het best interagerende segment is afgeleid, wordt het complex met het receptoreiwit gebruikt als de basisstructuur die aan Pepspec wordt voorgelegd om sequentiediversificatie uit te voeren.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van de belangrijkste stappen van het protocol dat in dit werk wordt voorgesteld. Nummers komen overeen met stapnummers in het protocolgedeelte. Er zijn figuren gemaakt met het eiwit-eiwitcomplex dat als voorbeeld in de tekst wordt gebruikt. In dit complex wordt de eiwitketen die als de receptor wordt beschouwd, in roze weergegeven, terwijl de keten die als ligand wordt beschouwd, in lichtblauw wordt weergegeven, waarbij het voorspelde best interagerende segment in rood wordt gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een van de beperkingen van het voorgestelde protocol is de vereiste voor een opgeloste structuur van de eiwit-peptide-interface. Het protocol kan ook beginnen met een model van de doeleiwit-peptide-interface, hoewel de specifieke modelleringsstappen hierin niet worden beschreven. Bovendien, hoewel het protocol kan worden uitgevoerd op een pc met elk besturingssysteem, is een Linux-omgeving vereist voor de stappen met betrekking tot de Rosetta-applicaties. Een computercluster wordt ook ten zeerste aanbevolen voor de stap van sequentiediversificatie vanwege het grote aantal iteraties dat doorgaans door Pepspec wordt uitgevoerd.

De toepassing van het voorgestelde protocol wordt geïllustreerd met de schatting van aminozuurvoorkeuren van het biding-oppervlak van IRF5, een lid van de familie van de humane interferonregulerende factor (IRF). We hebben dit eiwit als voorbeeld gekozen omdat tijdens de activering twee subeenheden binden om een dimeer te vormen waarvan de structuur goed is gekarakteriseerd16. In IRF-dimeren kan binding worden gemodelleerd als een eiwit-peptide-interface waarbij de ene subeenheid het bindingsoppervlak levert en de andere interageert via een gebied met een kort geconserveerd motief genaamd pLxIS17,18. Bovendien is binding aan IRF-subeenheden multispecifiek; Daarom kunnen ze homodimeren, heterodimeren en complexen vormen met andere cellulaire eiwitten die bekend staan als coactivatoren18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Eerste voorbereiding van de eiwit-peptide-interface

  1. De structuur van het eiwit-eiwitcomplex downloaden
    1. Navigeer naar de homepage van de Protein Data Bank (PDB) (https://www.rcsb.org/) en typ de PDB-ID voor de structuur van het eiwit-eiwitcomplex in het hoofdzoekvak (Figuur 2A). De PDB-ID voor de structuur van het IRF5-dimeer, die in dit werk als voorbeeld wordt gebruikt, is 3DSH19.
    2. Klik op de hoofdpagina voor de gewenste structuur op Bestanden downloaden (Figuur 2B) en vervolgens op Biologische Assemblage 1 (PDB - gz) (Figuur 2C).
      OPMERKING: In de PDB-database worden structuren van veel eiwitcomplexen gevormd door identieke monomeren weergegeven als biologische assemblages, waarbij alleen de structuur van één monomeer (asymmetrische eenheid) is opgeslagen in het PDB-bestand. De structuur van het multimeer, in dit geval het IRF5-dimeer, moet worden gedownload als de biologische assemblage die twee exemplaren van de asymmetrische eenheid bevat. Om de volgende stappen van dit protocol te vergemakkelijken, worden de twee monomeren eerst gescheiden en worden er verschillende keten-ID's aan toegewezen.
    3. Open de gedownloade structuur in UCSF Chimera20 en klik op Tools > Structure Editing > Change Chain ID's. In dit voorbeeld heten beide ketens in de biologische assemblage A. Hernoem de tweede keten (gelabeld #0.2) naar B en klik op OK.
    4. Klik op Favorieten > modelpaneel en selecteer vervolgens het model met de twee kettingen. Klik op de knop Groeperen/Groep opheffen om elke ketting in een ander model te scheiden. Selecteer vervolgens de twee modellen en klik op de knop Kopiëren/Combineren. Voer een nieuwe naam in voor het gecombineerde model, vink Bronnen sluiten aan en klik op OK.
    5. Klik op Selecteer > ketting en bevestig dat elke ketting in het dimeer nu wordt geïdentificeerd door een andere letter, namelijk A en B.
    6. Gebruik File > Save PDB om de bewerkte structuur op te slaan in een ander PDB-bestand, dat in de volgende stappen van het protocol zal worden gebruikt (hier werd de naam IRF5_dimer.pdb gebruikt).

figure-protocol-1
Figuur 2: De pagina van de Protein Data Bank (PDB) voor de structuur die als representatief voorbeeld in dit werk is gebruikt. (A) Zoekvak om de PDB-toetredingscode van de doelstructuur in te voeren. (B) Menu om de structuur in verschillende formaten te downloaden. (C) Opties om biologische assemblages te downloaden wanneer de structuur is opgeslagen als een asymmetrische eenheid (zie stap 1.1.2 voor meer details). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Identificatie van het doelsegment in het ligandeiwit
    1. Navigeer naar de BUDE Alanine Scan-server (https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/). Klik op de knop Bestand kiezen onder Structuur uploaden en selecteer het PDB-bestand dat is opgeslagen in stap 1.1.6.
    2. Controleer op de volgende pagina of de structuur correct is geladen (Afbeelding 3A) en voer een naam in voor de taak op de server (Afbeelding 3B).
    3. Stel de ketens van de PDB in die zullen worden behandeld als receptor (A) en ligand (B) (Figuur 3C). Klik vervolgens op de knop Scan starten om de taak in te dienen.
    4. Zodra de taak is voltooid, klikt u op Resultaten weergeven om de resultatenpagina te openen (Figuur 4).
      OPMERKING: Op de resultatenpagina worden residuen van de ligandstructuur gekleurd volgens hun geschatte verandering in vrije energie (ΔΔG), en die met hogere waarden zijn rood gekleurd.
    5. Selecteer uit de residuenlijst de rek residuen waarvan wordt voorspeld dat deze beter zal interageren met het doelbindingsoppervlak. Zorg ervoor dat deze residuen de hogere waarden voor het verschil in vrije energie (ΔΔG) clusteren. In dit voorbeeld is het segment tussen residuen Leu424 en Ser436 geselecteerd (gemarkeerd met een rood vak in het rechterpaneel van figuur 4).
  2. Voorbereiding van de eiwit-peptide-interface voor sequentiediversificatie
    1. Open het PDB-bestand dat in stap 1.1.6 in Chimera is opgeslagen en controleer of er geen atomen of bindingen ontbreken in de structuur van de doelsubeenheden.
    2. Verwijder alle kleine moleculen, ionen en oplosmiddelen die samen met de oorspronkelijke structuur zijn gekristalliseerd. Klik hiervoor op Selecteer > residuen en selecteer vervolgens alle andere moleculen dan standaard aminozuren. Klik vervolgens op Acties > atomen/bindingen en Verwijderen.
    3. Snijd de ligandketen bij tot het best interagerende segment dat in stap 1.2.5 is gekozen. Om dit te doen, klikt u op Favorieten en volgorde en klikt u vervolgens op de ketting die als de ligand wordt beschouwd (B). Sleep in het deelvenster Sequentie met de muis om alle residuen te selecteren, behalve die tussen posities 424 en 436. Om deze residuen te verwijderen, klikt u op Acties > atomen/bindingen en Verwijderen.
    4. Gebruik File > Save PDB om de bewerkte structuur op te slaan in een ander PDB-bestand, dat wordt gebruikt in de volgende stappen van het protocol (hier werd de naam IRF5_interface.pdb gebruikt).

figure-protocol-2
Figuur 3: Selectie van receptor en ligand in de BUDE Alanine Scan server. (A) Grafische weergave van het eiwit-eiwit complex. (B) Tekstvak om de naam van de taak op de server in te voeren. (C) Panel om interactief de ketens te selecteren die als receptor en ligand worden beschouwd (zie stap 1.2 voor meer details). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 4: Resultatenpagina van de BUDE Alanine Scan server. Het potentiële best interagerende segment in de ligandsequentie wordt aangegeven met een rood vak. In het linkerpaneel is het residu met de hoogste voorspelde energiebijdrage (Leu433) groen gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Diversificatie van de sequentie

OPMERKING: In de volgende stappen verwijst rosetta_main naar de hoofdinstallatiemap van Rosetta, die zich meestal bevindt op /opt/rosetta_src__bundle/main/, waar de geïnstalleerde Rosetta-versie aangeeft. Ook wordt aangenomen dat Rosetta-applicaties systeembreed toegankelijk zijn; Als dit niet het geval is, moet het volledige pad naar de uitvoerbare bestanden worden verstrekt. Wanneer deze uitvoerbare bestanden vanuit de bron worden gecompileerd, bevinden ze zich in de map /rosetta_main/source/bin/ .

  1. Initiële optimalisatie van aminozuurzijketens
    1. Kopieer de bewerkte structuur die in stap 1.3.4 is opgeslagen naar een Linux-locatie die toegankelijk is voor de Rosetta-applicaties.
    2. Gebruik de FixBB-applicatie van Rosetta om alle aminozuurzijketens van de basenstructuur opnieuw in te pakken voordat de sequentie wordt gediversifieerd. Bij deze operatie wordt de oriëntatie van alle aminozuurzijketens geoptimaliseerd om energie te minimaliseren en de stabiliteit van het complex te verbeteren. Voer hiervoor de volgende opdracht uit:
      figure-protocol-4
      OPMERKING: Deze opdracht voert een PDB-bestand uit dat is vernoemd naar de oorspronkelijke structuur met een extra numeriek achtervoegsel (IRF5_interface_0001.pdb in dit voorbeeld).
    3. Om de volgende stap van het protocol te vergemakkelijken, wijzigt u de naam van het opnieuw ingepakte PDB-bestand met het achtervoegsel _repack met behulp van de volgende opdracht:
      MV IRF5_interface_0001.pdb IRF5_repack.pdb
  2. Diversificatie van de sequentie
    1. Voer Pepspec uit in de ontwerpmodus om de daadwerkelijke sequentiediversificatiestap uit te voeren met behulp van de volgende opdracht:
      figure-protocol-5
      Dit zijn de algemene opties:
      • -s geeft het invoerbestand aan (het opnieuw verpakte PDB-bestand dat in stap 2.1.3 is gegenereerd).
      • -o geeft het voorvoegsel aan om uitvoerbestanden een naam te geven.
      • - database geeft het pad aan naar de hoofddatabase van Rosetta 3.
      • -ex1, -ex2 en extrachi_cutoff zijn rotamer-bibliotheekopties (zie Pepspec-documentatie voor meer details).
      • -overwrite vertelt de applicatie om mogelijke reeds bestaande outputs die door eerdere iteraties zijn gegenereerd, te overschrijven.
      Hieronder volgen opties die betrekking hebben op sequentiediversificatie op zich:
      • -pepspec:pep_chain geeft de PDB-ketens aan die als ligand worden beschouwd ('b' in dit voorbeeld).
      • -pepspec:native_pep_anchor geeft het aminozuurresidu aan dat als anker wordt gebruikt (in dit voorbeeld het Leu-residu op positie 10 van het ligandpeptide).
      • -pepspec:n_peptides geeft het aantal peptidestructuren aan dat moet worden uitgevoerd.
      • -pepspec:no_prepack_prot vertelt de applicatie om het opnieuw inpakken in de input basisstructuur over te slaan (aangezien dit eerder werd uitgevoerd in stap 2.1).
        OPMERKING: De belangrijkste Pepspec-uitvoer is een map met de PDB-bestanden voor peptiden die het resultaat zijn van de ontwerpfase, genoemd met behulp van het uitvoervoorvoegsel met het achtervoegsel .pdbs (IRF5.pdbs in het voorbeeld). Bovendien voert Pepspec alle geaccepteerde peptidesequenties uit die zijn getest als onderdeel van de sequentiediversificatiestap en de bijbehorende Rosetta-energiescores in een door tabs gescheiden tekstbestand dat is vernoemd naar het uitvoervoorvoegsel, met de . spec achtervoegsel (IRF5.spec in het voorbeeld). Aangezien het protocol dat in dit werk wordt beschreven, gericht is op het schatten van aminozuurvoorkeuren in plaats van het daadwerkelijke peptideontwerp, gebruiken de volgende stappen IRF5.spec in plaats van de PDB-structuren in de .pdbs-directory .

3. Schatting van aminozuurvoorkeuren

  1. Een PWM berekenen
    1. Als u een PWM wilt genereren, gebruikt u het gen_pepspec_pwm.py script dat is opgenomen in de Rosetta-suite. Gebruik de volgende opdracht om dit script uit te voeren:
      figure-protocol-6
      waar:
      • IRF5.spec is het Pepspec-uitvoerbestand dat in stap 2.2 is gegenereerd.
      • -1 geeft aan dat er geen extra N-terminale residuen in de sequentie zijn en dat de posities in de PWM daarom op 1 zijn gebaseerd.
      • 0,2 vertelt het script om alleen de top 20% best scorende peptiden uit de Pepspec-uitvoer in overweging te nemen (de standaardwaarde is 0,1, wat overeenkomt met de 10%)
      • interface_score vertelt het script om peptiden te rangschikken op basis van de interfacescore, een van de verschillende Rosetta-scores die zijn opgenomen in het Pepspec-uitvoerbestand.
        OPMERKING: Dit script genereert twee uitvoerbestanden, één voor de berekende PWM (met het achtervoegsel .pwm ) en de andere voor de sequenties van de subset van peptiden die worden gebruikt om de PWM te berekenen (met het achtervoegsel .seq ). De namen van deze bestanden bevatten ook de score en de fractie van peptiden die voor de rangschikking worden gebruikt. In dit voorbeeld heten deze bestanden respectievelijk IRF5_interface_score_0.2.pwm en IRF5_interface_score_0.2.seq.
  2. Een sequentielogo genereren
    1. Navigeer naar de WebLogo-server (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)21 en klik op de knop Bestand kiezen naast Sequentiegegevens uploaden. Upload het bestand met peptidesequenties die zijn gegenereerd in stap 3.1.1 (IRF5_interface_score_0.2.seq in dit voorbeeld).
    2. Kies het gewenste formaat en de grootte van het logo op basis van de invoerlengte. Het voorbeeld gebruikt PDF-formaat en een formaat van 15 cm x 12 cm. Klik op Logo maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit artikel hebben we een protocol beschreven om de aminozuurvoorkeuren van het bindingsoppervlak van IRF5 te voorspellen, een lid van een familie van transcriptiefactoren die bekend staat als humane interferonregulerende factoren. Deze eiwitten zijn regulatoren van aangeboren en adaptieve immuunresponsen en nemen deel aan de differentiatie en activering van verschillende immuuncellen. IRF-subeenheden hebben zeer plastische en multispecifieke bindingsoppervlakken en zijn in staat homo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige artikel beschrijft een protocol om de aminozuurvoorkeuren van potentieel multispecifieke bindingsplaatsen te schatten op basis van in silico sequentiediversificatie. Er zijn maar weinig computationele tools ontwikkeld om aminozuurvoorkeuren van eiwit-peptide-interfaces te schatten 14,25,26. Deze tools hebben een voorspellend karakter, maar ze verschillen in de computationele algoritm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiële steun van Sistema Nacional de Investigación (SNI) (subsidienummers SNI-043-2023 en SNI-170-2021), Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT) van Panama en Instituto para la Formación y Aprovechamiento de Recursos Humanos (IFARHU) wordt dankbaar erkend. De auteurs willen Dr. Miguel Rodríguez bedanken voor het zorgvuldig nakijken van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BUDE Alanine Scan ServerUniversity of Edinburghhttps://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/doi: 10.1021/acschembio.9b00560
Rosetta Modeling SoftwareRosetta Commonshttps://www.rosettacommons.org/softwaredoi: 10.1002/prot.22851
UCSF ChimeraUniversity of California San Franciscohttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/doi: 10.1002/jcc.20084

Referenties

  1. Kim, P. M., Lu, L. J., Xia, Y., Gerstein, M. B. Relating three-dimensional structures to protein networks provides evolutionary insights. Science. 314 (5807), 1938-1941 (2006).
  2. Schreiber, G., Keating, A. E. Protein binding specificity versus promiscuity. Current Opinion in Structural Biology. 21 (1), 50-61 (2011).
  3. Erijman, A., Aizner, Y., Shifman, J. M. Multispecific recognition: Mechanism, evolution, and design. Biochemistry. 50 (5), 602-611 (2011).
  4. Fromer, M., Shifman, J. M. Tradeoff between stability and multispecificity in the design of promiscuous proteins. PLoS Computational Biology. 5 (12), e1000627(2009).
  5. Xie, T., Zmyslowski, A. M., Zhang, Y., Radhakrishnan, I. Structural basis for multispecificity of MRG domains. Structure. 23 (6), London, England. 1049-1057 (2015).
  6. Hendler, A., et al. Human SIRT1 multispecificity is modulated by active-site vicinity substitutions during natural evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (2), 545-556 (2021).
  7. Teilum, K., Olsen, J. G., Kragelund, B. B. On the specificity of protein-protein interactions in the context of disorder. The Biochemical Journal. 478 (11), 2035-2050 (2021).
  8. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: Mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie (International ed. in English). 54 (31), 8896-8927 (2015).
  9. Wang, Y., Xue, P., Cao, M., Yu, T., Lane, S. T., Zhao, H. Directed evolution: Methodologies and applications. Chemical Reviews. 121 (20), 12384-12444 (2021).
  10. Liu, J., Cropp, T. A. Rational protein sequence diversification by multi-codon scanning mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 978, 217-228 (2013).
  11. Wei, H., Li, X. Deep mutational scanning: A versatile tool in systematically mapping genotypes to phenotypes. Frontiers in Genetics. 14, 1087267(2023).
  12. Bratulic, S., Badran, A. H. Modern methods for laboratory diversification of biomolecules. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 50-60 (2017).
  13. Humphris, E. L., Kortemme, T. Prediction of protein-protein interface sequence diversity using flexible backbone computational protein design. Structure. 16 (12), 1777-1788 (2008).
  14. King, C. A., Bradley, P. Structure-based prediction of protein-peptide specificity in Rosetta. Proteins. 78 (16), 3437-3449 (2010).
  15. Ibarra, A. A., et al. Predicting and experimentally validating hot-spot residues at protein-protein interfaces. ACS Chemical Biology. 14 (10), 2252-2263 (2019).
  16. Chen, W., Srinath, H., Lam, S. S., Schiffer, C. A., Royer, W. E., Lin, K. Contribution of Ser386 and Ser396 to activation of interferon regulatory factor 3. Journal of Molecular Biology. 379 (2), 251-260 (2008).
  17. Mancino, A., Natoli, G. Specificity and function of IRF family transcription factors: Insights from genomics. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 462-469 (2016).
  18. Schwanke, H., Stempel, M., Brinkmann, M. M. Of keeping and tipping the balance: Host regulation and viral modulation of IRF3-dependent IFNB1 expression. Viruses. 12 (7), 33(2020).
  19. Chen, W., et al. Insights into interferon regulatory factor activation from the crystal structure of dimeric IRF5. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (11), 1213-1220 (2008).
  20. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
  21. Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. -M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Research. 14 (6), 1188-1190 (2004).
  22. Panne, D., McWhirter, S. M., Maniatis, T., Harrison, S. C. Interferon regulatory factor 3 is regulated by a dual phosphorylation-dependent switch. The Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22816-22822 (2007).
  23. Weihrauch, D., et al. An IRF5 decoy peptide reduces myocardial inflammation and fibrosis and improves endothelial cell function in tight-skin mice. PloS One. 11 (4), e0151999(2016).
  24. Mori, M., Yoneyama, M., Ito, T., Takahashi, K., Inagaki, F., Fujita, T. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. The Journal of Biological Chemistry. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  25. Smith, C. A., Kortemme, T. Predicting the tolerated sequences for proteins and protein interfaces using RosettaBackrub flexible backbone design. PloS One. 6 (7), e20451(2011).
  26. Rubenstein, A. B., Pethe, M. A., Khare, S. D. MFPred: Rapid and accurate prediction of protein-peptide recognition multispecificity using self-consistent mean field theory. PLoS Computational Biology. 13 (6), e1005614(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Sequentiediversificatiealanine-scanningRosetta PepspecpositiegewichtenmatrixsequentielogoIRF5-binding
Computationele voorspelling van aminozuurvoorkeuren van potentieel multispecifieke peptide-bindende domeinen die betrokken zijn bij eiwit-eiwitinteracties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.