Computationele voorspelling van aminozuurvoorkeuren van potentieel multispecifieke peptide-bindende domeinen die betrokken zijn bij eiwit-eiwitinteracties

Samenvatting

We beschrijven een methodologie gebaseerd op sequentiediversificatie om de aminozuurvoorkeuren van multispecifieke bindingsplaatsen in eiwit-eiwitinteracties (PPI's) te schatten. In deze strategie worden duizenden potentiële peptideliganden gegenereerd en gescreend in silico, waardoor enkele beperkingen van beschikbare experimentele methoden worden overwonnen.

Samenvatting

Veel eiwit-eiwitinteracties omvatten de binding van korte eiwitsegmenten aan peptidebindende domeinen. Gewoonlijk vereisen dergelijke interacties de herkenning van lineaire motieven met variabele conservering. De combinatie van sterk geconserveerde en meer variabele regio's in dezelfde liganden draagt vaak bij aan de multispecificiteit van binding, een gemeenschappelijke eigenschap van enzymen en celsignaleringseiwitten. Karakterisering van aminozuurvoorkeuren van peptide-bindende domeinen is belangrijk voor het ontwerp van mediatoren van eiwit-eiwitinteracties (PPI's). Computationele methoden zijn een efficiënt alternatief voor de vaak dure en omslachtige experimentele technieken, waardoor het mogelijk is om potentiële mediatoren te ontwerpen die later kunnen worden gevalideerd in stroomafwaartse experimenten. Hier hebben we een methodologie beschreven met behulp van de Pepspec-toepassing van het moleculaire modelleringspakket Rosetta om de aminozuurvoorkeuren van peptidebindende domeinen te voorspellen. Deze methodologie is nuttig wanneer de structuur van het receptoreiwit en de aard van het peptideligand beide bekend zijn of kunnen worden afgeleid. De methodologie begint met een goed gekarakteriseerd anker uit het ligand, dat wordt uitgebreid door willekeurig aminozuurresiduen toe te voegen. De bindingsaffiniteit van peptiden die op deze manier worden gegenereerd, wordt vervolgens geëvalueerd door docking van peptiden met flexibele ruggengraat om de peptiden met de best voorspelde bindingsscores te selecteren. Deze peptiden worden vervolgens gebruikt om aminozuurvoorkeuren te berekenen en om optioneel een positie-gewichtsmatrix (PWM) te berekenen die in verdere studies kan worden gebruikt. Om de toepassing van deze methodologie te illustreren, gebruikten we de interactie tussen subeenheden van humane interferonregulerende factor 5 (IRF5), waarvan eerder bekend was dat ze multispecifiek waren, maar wereldwijd worden geleid door een kort geconserveerd motief genaamd pLxIS. De geschatte aminozuurvoorkeuren kwamen overeen met eerdere kennis over het IRF5-bindingsoppervlak. Posities ingenomen door fosforyleerbare serineresiduen vertoonden een hoge frequentie van aspartaat en glutamaat, waarschijnlijk omdat hun negatief geladen zijketens vergelijkbaar zijn met fosfoserine.

Inleiding

Interactie tussen twee eiwitten omvat vaak de binding van korte segmenten van aminozuren aan peptide-bindende domeinen, die lijken op eiwit-peptide-interfaces. Receptoreiwitten die betrokken zijn bij dergelijke eiwit-eiwitinteracties (PPI) hebben vaak het vermogen om een bepaalde reeks overlappende maar uiteenlopende ligandsequenties te herkennen, een eigenschap die bekend staat als multispecificiteit ^1,2. Multispecifieke herkenning is een kenmerk van veel cellulaire eiwitten, maar het is vooral opmerkelijk in enzymen en celsignalerende eiwitten³. Eiwitten die interageren met multispecifieke bindingsplaatsen hebben vaak een combinatie van meer en minder geconserveerde regio's in hun sequentie ^4,5,6. In dit scenario zijn de meer geconserveerde sequentiemotieven betrokken bij strikte moleculaire interacties. Omgekeerd interageren de meer variabele sequenties met op de een of andere manier permissieve oppervlakken in de receptorbindingsplaats. Meestal zijn deze minder geconserveerde maar nog steeds functioneel relevante segmenten lussen zonder gedefinieerde secundaire structuurpatronen of hebben ze zelfs meer dynamische conformaties, zoals die typisch zijn voor intrinsiek ongeordende eiwitten⁷.

Identificatie van potentiële peptideliganden van bindingsplaatsen is meestal de eerste stap in het ontwerp van mediatoren die kunnen interfereren met de overeenkomstige PPI's⁸. Het is echter vaak onwaarschijnlijk dat er op de meeste sequentieposities in liganden van multispecifieke bindingsplaatsen een enkel meest frequent aminozuurresidu wordt gevonden. In plaats daarvan kunnen deze sites specifieke voorkeuren hebben voor een specifieke klasse aminozuren op basis van hun chemische eigenschappen, bijvoorbeeld zure en negatief geladen aminozuren zoals aspartaat of glutamaat, volumineuze aromatische aminozuren zoals fenylalanine of meer hydrofobe residuen zoals alifatische aminozuren alanine, valine, leucine of isoleucine³. Verschillende experimentele methoden kunnen inzicht verschaffen in aminozuurvoorkeuren van eiwitbindingsplaatsen, waaronder gerichte evolutie⁹, multi-codon scanning mutagenese¹⁰ en diepe mutatiescanning¹¹. Al deze methoden volgen de benadering van sequentiediversificatie, die is gebaseerd op het introduceren van mutaties in oorspronkelijke liganden en het verder analyseren van hun effect op de functie van het receptoreiwit (zie Bratulic en Badran¹² voor een uitgebreid overzicht). Deze methoden vereisen echter vaak het onderzoeken van grote sequentiebibliotheken, waardoor ze omslachtiger, duurder en tijdrovender worden.

Computationele methoden om de aminozuurvoorkeuren van multispecifieke bindingsplaatsen af te leiden, hebben het potentieel om de beperkingen van natte laboratoriummethoden te omzeilen. Onder deze evalueert de in silico sequentiediversificatiebenadering de energetische impact van een breed scala aan aminozuurvervangingen in de ligandsequentie als een manier om de structurele plasticiteit van de PPI¹³ te karakteriseren. Deze methode begint met de structuur of het model van het peptideligand dat aan de receptorbindingsplaats is gebonden en introduceert vervolgens mutaties in de ligandsequentie. Statistische en energiescorefuncties worden vervolgens gebruikt om de impact van deze mutaties op de stabiliteit en bindingsaffiniteit te evalueren. De set van best scorende ligandsequenties die het resultaat zijn van de evaluatiefase kan vervolgens worden gebruikt om de aminozuurvoorkeuren te berekenen. Deze strategie heeft het potentieel om een zeer hoog aantal ligandsequenties op een efficiënte manier te verwerken. Daarom kan het een completere en consistentere gevolgtrekking van aminozuurvoorkeuren bieden in vergelijking met die berekend op basis van het beperktere aantal sequenties dat gewoonlijk kan worden verwerkt in natte laboratoriumbenaderingen.

De Pepspec-toepassing van de moleculaire modelleringssuite¹⁴ van Rosetta is een hulpmiddel dat sequentiediversificatie uitvoert als een belangrijke stap van de peptide-ontwerpmodus. Deze toepassing vereist een structuur of model van het receptoreiwit met een gebonden peptide tot een enkel aminozuurresidu in lengte, dat wordt gebruikt als anker voor de volgende stappen. De sequentie van het gebonden peptide wordt vervolgens uitgebreid (indien nodig) en gediversifieerd om een groot aantal vermeende peptideliganden te genereren. De bindingsaffiniteit van deze peptiden wordt vervolgens geëvalueerd door middel van docking van peptiden met flexibele ruggengraat om de peptiden te selecteren met de best voorspelde bindingsscores. Hoewel de belangrijkste output van deze applicatie de beste peptidekandidaten zijn die aan het einde van de ontwerpfase zijn geselecteerd, kan de veel grotere set peptiden die tijdens deze fase wordt geaccepteerd, ook worden gebruikt om de aminozuurvoorkeuren van de doelbindingsplaats te berekenen. Aminozuurvoorkeuren worden berekend als de frequentie van elk aminozuurresidu per positie van de ligandsequentie die wordt weergegeven als een positiegewichtsmatrix (PWM) of als een meer visueel sequentielogo.

In dit artikel beschrijven we een protocol om de aminozuurvoorkeuren van het bindingsoppervlak van een receptoreiwit dat betrokken is bij een PPI te schatten. Het protocol is gericht op PPI's waarvan bekend is dat een lineair segment van het eiwitligand bindt aan het receptoreiwit, zodat het scenario kan worden gemodelleerd als een eiwit-peptide-interface. In dit scenario interageren geconserveerde motieven van de ligand doorgaans met gedefinieerde pockets in de receptorbindingsplaats, hoewel het hele ligandsegment dat betrokken is bij de PPI mogelijk minder geconserveerde regio's bevat. Een stroomdiagram met een samenvatting van de belangrijkste stappen van het protocol is weergegeven in figuur 1. Het protocol begint met de 3D-structuur van het eiwit-eiwitcomplex en reduceert het ligand-eiwit verder tot het potentieel best interagerende segment, waarbij het receptoreiwit intact blijft. Het best interagerende segment wordt afgeleid door gebruik te maken van de BUDE Alanine Scan-server¹⁵, die computationele alaninescanmutagenese uitvoert om hot-spot-residuen tussen de twee op elkaar inwerkende eiwitten te identificeren. In deze benadering worden residuen van het ligand afzonderlijk vervangen door alanine, en de geschatte verandering in vrije energie of stabiliteit van het complex (ΔΔG) wordt vervolgens gebruikt om de relevantie van het overeenkomstige residu voor de doel-PPI af te leiden. Zodra het best interagerende segment is afgeleid, wordt het complex met het receptoreiwit gebruikt als de basisstructuur die aan Pepspec wordt voorgelegd om sequentiediversificatie uit te voeren.

Figuur 1: Overzicht van de belangrijkste stappen van het protocol dat in dit werk wordt voorgesteld. Nummers komen overeen met stapnummers in het protocolgedeelte. Er zijn figuren gemaakt met het eiwit-eiwitcomplex dat als voorbeeld in de tekst wordt gebruikt. In dit complex wordt de eiwitketen die als de receptor wordt beschouwd, in roze weergegeven, terwijl de keten die als ligand wordt beschouwd, in lichtblauw wordt weergegeven, waarbij het voorspelde best interagerende segment in rood wordt gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een van de beperkingen van het voorgestelde protocol is de vereiste voor een opgeloste structuur van de eiwit-peptide-interface. Het protocol kan ook beginnen met een model van de doeleiwit-peptide-interface, hoewel de specifieke modelleringsstappen hierin niet worden beschreven. Bovendien, hoewel het protocol kan worden uitgevoerd op een pc met elk besturingssysteem, is een Linux-omgeving vereist voor de stappen met betrekking tot de Rosetta-applicaties. Een computercluster wordt ook ten zeerste aanbevolen voor de stap van sequentiediversificatie vanwege het grote aantal iteraties dat doorgaans door Pepspec wordt uitgevoerd.

De toepassing van het voorgestelde protocol wordt geïllustreerd met de schatting van aminozuurvoorkeuren van het biding-oppervlak van IRF5, een lid van de familie van de humane interferonregulerende factor (IRF). We hebben dit eiwit als voorbeeld gekozen omdat tijdens de activering twee subeenheden binden om een dimeer te vormen waarvan de structuur goed is gekarakteriseerd¹⁶. In IRF-dimeren kan binding worden gemodelleerd als een eiwit-peptide-interface waarbij de ene subeenheid het bindingsoppervlak levert en de andere interageert via een gebied met een kort geconserveerd motief genaamd pLxIS^17,18. Bovendien is binding aan IRF-subeenheden multispecifiek; Daarom kunnen ze homodimeren, heterodimeren en complexen vormen met andere cellulaire eiwitten die bekend staan als coactivatoren¹⁸.

Protocol

1. Eerste voorbereiding van de eiwit-peptide-interface

1. De structuur van het eiwit-eiwitcomplex downloaden
   1. Navigeer naar de homepage van de Protein Data Bank (PDB) (https://www.rcsb.org/) en typ de PDB-ID voor de structuur van het eiwit-eiwitcomplex in het hoofdzoekvak (Figuur 2A). De PDB-ID voor de structuur van het IRF5-dimeer, die in dit werk als voorbeeld wordt gebruikt, is 3DSH¹⁹.
   2. Klik op de hoofdpagina voor de gewenste structuur op Bestanden downloaden (Figuur 2B) en vervolgens op Biologische Assemblage 1 (PDB - gz) (Figuur 2C).
      OPMERKING: In de PDB-database worden structuren van veel eiwitcomplexen gevormd door identieke monomeren weergegeven als biologische assemblages, waarbij alleen de structuur van één monomeer (asymmetrische eenheid) is opgeslagen in het PDB-bestand. De structuur van het multimeer, in dit geval het IRF5-dimeer, moet worden gedownload als de biologische assemblage die twee exemplaren van de asymmetrische eenheid bevat. Om de volgende stappen van dit protocol te vergemakkelijken, worden de twee monomeren eerst gescheiden en worden er verschillende keten-ID's aan toegewezen.
   3. Open de gedownloade structuur in UCSF Chimera²⁰ en klik op Tools > Structure Editing > Change Chain ID's. In dit voorbeeld heten beide ketens in de biologische assemblage A. Hernoem de tweede keten (gelabeld #0.2) naar B en klik op OK.
   4. Klik op Favorieten > modelpaneel en selecteer vervolgens het model met de twee kettingen. Klik op de knop Groeperen/Groep opheffen om elke ketting in een ander model te scheiden. Selecteer vervolgens de twee modellen en klik op de knop Kopiëren/Combineren. Voer een nieuwe naam in voor het gecombineerde model, vink Bronnen sluiten aan en klik op OK.
   5. Klik op Selecteer > ketting en bevestig dat elke ketting in het dimeer nu wordt geïdentificeerd door een andere letter, namelijk A en B.
   6. Gebruik File > Save PDB om de bewerkte structuur op te slaan in een ander PDB-bestand, dat in de volgende stappen van het protocol zal worden gebruikt (hier werd de naam IRF5_dimer.pdb gebruikt).

Figuur 2: De pagina van de Protein Data Bank (PDB) voor de structuur die als representatief voorbeeld in dit werk is gebruikt. (A) Zoekvak om de PDB-toetredingscode van de doelstructuur in te voeren. (B) Menu om de structuur in verschillende formaten te downloaden. (C) Opties om biologische assemblages te downloaden wanneer de structuur is opgeslagen als een asymmetrische eenheid (zie stap 1.1.2 voor meer details). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Identificatie van het doelsegment in het ligandeiwit
   1. Navigeer naar de BUDE Alanine Scan-server (https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/). Klik op de knop Bestand kiezen onder Structuur uploaden en selecteer het PDB-bestand dat is opgeslagen in stap 1.1.6.
   2. Controleer op de volgende pagina of de structuur correct is geladen (Afbeelding 3A) en voer een naam in voor de taak op de server (Afbeelding 3B).
   3. Stel de ketens van de PDB in die zullen worden behandeld als receptor (A) en ligand (B) (Figuur 3C). Klik vervolgens op de knop Scan starten om de taak in te dienen.
   4. Zodra de taak is voltooid, klikt u op Resultaten weergeven om de resultatenpagina te openen (Figuur 4).
      OPMERKING: Op de resultatenpagina worden residuen van de ligandstructuur gekleurd volgens hun geschatte verandering in vrije energie (ΔΔG), en die met hogere waarden zijn rood gekleurd.
   5. Selecteer uit de residuenlijst de rek residuen waarvan wordt voorspeld dat deze beter zal interageren met het doelbindingsoppervlak. Zorg ervoor dat deze residuen de hogere waarden voor het verschil in vrije energie (ΔΔG) clusteren. In dit voorbeeld is het segment tussen residuen Leu424 en Ser436 geselecteerd (gemarkeerd met een rood vak in het rechterpaneel van figuur 4).
3. Voorbereiding van de eiwit-peptide-interface voor sequentiediversificatie
   1. Open het PDB-bestand dat in stap 1.1.6 in Chimera is opgeslagen en controleer of er geen atomen of bindingen ontbreken in de structuur van de doelsubeenheden.
   2. Verwijder alle kleine moleculen, ionen en oplosmiddelen die samen met de oorspronkelijke structuur zijn gekristalliseerd. Klik hiervoor op Selecteer > residuen en selecteer vervolgens alle andere moleculen dan standaard aminozuren. Klik vervolgens op Acties > atomen/bindingen en Verwijderen.
   3. Snijd de ligandketen bij tot het best interagerende segment dat in stap 1.2.5 is gekozen. Om dit te doen, klikt u op Favorieten en volgorde en klikt u vervolgens op de ketting die als de ligand wordt beschouwd (B). Sleep in het deelvenster Sequentie met de muis om alle residuen te selecteren, behalve die tussen posities 424 en 436. Om deze residuen te verwijderen, klikt u op Acties > atomen/bindingen en Verwijderen.
   4. Gebruik File > Save PDB om de bewerkte structuur op te slaan in een ander PDB-bestand, dat wordt gebruikt in de volgende stappen van het protocol (hier werd de naam IRF5_interface.pdb gebruikt).

Figuur 3: Selectie van receptor en ligand in de BUDE Alanine Scan server. (A) Grafische weergave van het eiwit-eiwit complex. (B) Tekstvak om de naam van de taak op de server in te voeren. (C) Panel om interactief de ketens te selecteren die als receptor en ligand worden beschouwd (zie stap 1.2 voor meer details). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Resultatenpagina van de BUDE Alanine Scan server. Het potentiële best interagerende segment in de ligandsequentie wordt aangegeven met een rood vak. In het linkerpaneel is het residu met de hoogste voorspelde energiebijdrage (Leu433) groen gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Diversificatie van de sequentie

OPMERKING: In de volgende stappen verwijst rosetta_main naar de hoofdinstallatiemap van Rosetta, die zich meestal bevindt op /opt/rosetta_src__bundle/main/, waar de geïnstalleerde Rosetta-versie aangeeft. Ook wordt aangenomen dat Rosetta-applicaties systeembreed toegankelijk zijn; Als dit niet het geval is, moet het volledige pad naar de uitvoerbare bestanden worden verstrekt. Wanneer deze uitvoerbare bestanden vanuit de bron worden gecompileerd, bevinden ze zich in de map /rosetta_main/source/bin/ .

1. Initiële optimalisatie van aminozuurzijketens
   1. Kopieer de bewerkte structuur die in stap 1.3.4 is opgeslagen naar een Linux-locatie die toegankelijk is voor de Rosetta-applicaties.
   2. Gebruik de FixBB-applicatie van Rosetta om alle aminozuurzijketens van de basenstructuur opnieuw in te pakken voordat de sequentie wordt gediversifieerd. Bij deze operatie wordt de oriëntatie van alle aminozuurzijketens geoptimaliseerd om energie te minimaliseren en de stabiliteit van het complex te verbeteren. Voer hiervoor de volgende opdracht uit:
      
      OPMERKING: Deze opdracht voert een PDB-bestand uit dat is vernoemd naar de oorspronkelijke structuur met een extra numeriek achtervoegsel (IRF5_interface_0001.pdb in dit voorbeeld).
   3. Om de volgende stap van het protocol te vergemakkelijken, wijzigt u de naam van het opnieuw ingepakte PDB-bestand met het achtervoegsel _repack met behulp van de volgende opdracht:
      MV IRF5_interface_0001.pdb IRF5_repack.pdb
2. Diversificatie van de sequentie
   1. Voer Pepspec uit in de ontwerpmodus om de daadwerkelijke sequentiediversificatiestap uit te voeren met behulp van de volgende opdracht:
      
      Dit zijn de algemene opties:
      • -s geeft het invoerbestand aan (het opnieuw verpakte PDB-bestand dat in stap 2.1.3 is gegenereerd).
      • -o geeft het voorvoegsel aan om uitvoerbestanden een naam te geven.
      • - database geeft het pad aan naar de hoofddatabase van Rosetta 3.
      • -ex1, -ex2 en extrachi_cutoff zijn rotamer-bibliotheekopties (zie Pepspec-documentatie voor meer details).
      • -overwrite vertelt de applicatie om mogelijke reeds bestaande outputs die door eerdere iteraties zijn gegenereerd, te overschrijven.
      Hieronder volgen opties die betrekking hebben op sequentiediversificatie op zich:
      • -pepspec:pep_chain geeft de PDB-ketens aan die als ligand worden beschouwd ('b' in dit voorbeeld).
      • -pepspec:native_pep_anchor geeft het aminozuurresidu aan dat als anker wordt gebruikt (in dit voorbeeld het Leu-residu op positie 10 van het ligandpeptide).
      • -pepspec:n_peptides geeft het aantal peptidestructuren aan dat moet worden uitgevoerd.
      • -pepspec:no_prepack_prot vertelt de applicatie om het opnieuw inpakken in de input basisstructuur over te slaan (aangezien dit eerder werd uitgevoerd in stap 2.1).
        OPMERKING: De belangrijkste Pepspec-uitvoer is een map met de PDB-bestanden voor peptiden die het resultaat zijn van de ontwerpfase, genoemd met behulp van het uitvoervoorvoegsel met het achtervoegsel .pdbs (IRF5.pdbs in het voorbeeld). Bovendien voert Pepspec alle geaccepteerde peptidesequenties uit die zijn getest als onderdeel van de sequentiediversificatiestap en de bijbehorende Rosetta-energiescores in een door tabs gescheiden tekstbestand dat is vernoemd naar het uitvoervoorvoegsel, met de . spec achtervoegsel (IRF5.spec in het voorbeeld). Aangezien het protocol dat in dit werk wordt beschreven, gericht is op het schatten van aminozuurvoorkeuren in plaats van het daadwerkelijke peptideontwerp, gebruiken de volgende stappen IRF5.spec in plaats van de PDB-structuren in de .pdbs-directory .

3. Schatting van aminozuurvoorkeuren

1. Een PWM berekenen
   1. Als u een PWM wilt genereren, gebruikt u het gen_pepspec_pwm.py script dat is opgenomen in de Rosetta-suite. Gebruik de volgende opdracht om dit script uit te voeren:
      
      waar:
      • IRF5.spec is het Pepspec-uitvoerbestand dat in stap 2.2 is gegenereerd.
      • -1 geeft aan dat er geen extra N-terminale residuen in de sequentie zijn en dat de posities in de PWM daarom op 1 zijn gebaseerd.
      • 0,2 vertelt het script om alleen de top 20% best scorende peptiden uit de Pepspec-uitvoer in overweging te nemen (de standaardwaarde is 0,1, wat overeenkomt met de 10%)
      • interface_score vertelt het script om peptiden te rangschikken op basis van de interfacescore, een van de verschillende Rosetta-scores die zijn opgenomen in het Pepspec-uitvoerbestand.
        OPMERKING: Dit script genereert twee uitvoerbestanden, één voor de berekende PWM (met het achtervoegsel .pwm ) en de andere voor de sequenties van de subset van peptiden die worden gebruikt om de PWM te berekenen (met het achtervoegsel .seq ). De namen van deze bestanden bevatten ook de score en de fractie van peptiden die voor de rangschikking worden gebruikt. In dit voorbeeld heten deze bestanden respectievelijk IRF5_interface_score_0.2.pwm en IRF5_interface_score_0.2.seq.
2. Een sequentielogo genereren
   1. Navigeer naar de WebLogo-server (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)²¹ en klik op de knop Bestand kiezen naast Sequentiegegevens uploaden. Upload het bestand met peptidesequenties die zijn gegenereerd in stap 3.1.1 (IRF5_interface_score_0.2.seq in dit voorbeeld).
   2. Kies het gewenste formaat en de grootte van het logo op basis van de invoerlengte. Het voorbeeld gebruikt PDF-formaat en een formaat van 15 cm x 12 cm. Klik op Logo maken.

Resultaten

In dit artikel hebben we een protocol beschreven om de aminozuurvoorkeuren van het bindingsoppervlak van IRF5 te voorspellen, een lid van een familie van transcriptiefactoren die bekend staat als humane interferonregulerende factoren. Deze eiwitten zijn regulatoren van aangeboren en adaptieve immuunresponsen en nemen deel aan de differentiatie en activering van verschillende immuuncellen. IRF-subeenheden hebben zeer plastische en multispecifieke bindingsoppervlakken en zijn in staat homodimeren, heterodimeren en complexen te vormen met andere cellulaire eiwitten^17,18. Dimerisatie wordt beschouwd als de eerste stap in de activering van deze factoren, en bij de meeste familieleden wordt het veroorzaakt door de fosforylering van meerdere serine/threonine-residuen¹⁸. Tijdens dimerisatie interageert elk monomeer met het biedoppervlak van het andere monomeer via een sterk geconserveerd motief, pLxIS genaamd, dat zich in de richting van het C-terminale gebied van hun sequentie bevindt. De afkorting pLxIS vertegenwoordigt gedeeltelijk de aminozuurvoorkeuren van het bindingsvlak, dat achtereenvolgens een polair aminozuur ('p') herkent, gevolgd door twee posities met een hoge frequentie van leucine ('L') en isoleucine ('I'), gescheiden door een positie die wordt ingenomen door een aminozuur ('x') en gevolgd door een fosforyleerbaar serineresidu (Ser436 in dit voorbeeld). Fosforylering van verschillende serineresiduen, waaronder die van het pLxIS-motief, bevordert de buiging van het C-terminale segment van het ene monomeer en de interactie ervan met het bindingsoppervlak van het andere monomeer^19,22.

Het hier beschreven protocol begon met een 3D-structuur van het IRF5-dimeer¹⁹, waarbij een van de monomeren willekeurig werd beschouwd als de receptor in de PPI, terwijl de andere werd beschouwd als het ligand dat het pLxIS-motief bevatte. Om het segment van het ligand dat interageert met de receptorbindingsplaats beter te definiëren, hebben we computationele alaninescanningmutagenese uitgevoerd (stap 1.2). Het voorspelde segment bestond uit 13 aminozuurresiduen van posities 424 tot 436, waarbij het pLxIS-motief begon bij Arg432. De structuur van het oorspronkelijke dimeer werd vervolgens teruggebracht tot een peptide-eiwitcomplex waarin de sequentie van het monomeer dat als ligand werd beschouwd, werd bijgesneden tot het voorspelde best interagerende segment, terwijl het andere monomeer intact werd gelaten (stap 1.3). Deze structuur werd vervolgens gebruikt als input voor de sequentiediversificatiestrategie (sectie 2), waarbij het leucineresidu van het pLxIS-motief (Leu433) werd aangewezen als het anker dat Pepspec nodig had. Dit proces resulteerde in meer dan 26.000 potentiële peptideliganden. De top 20% potentiële liganden met de beste energiescores (5.280) werden gebruikt om de aminozuurvoorkeuren van het bindingsoppervlak te schatten in de vorm van een PWM (Figuur 5A) en een sequentielogo (Figuur 5B) (sectie 3).

Figuur 5: Aminozuurvoorkeuren van het bindingsoppervlak van IRF3. (A) PWM met vermelding van de frequentie van elk aminozuurresidu (rijen) per positie in de peptideligandsequentie (kolommen). (B) Sequentielogo dat de overeenkomstige aminozuurfrequenties visueel weergeeft. De posities van de originele IRF5-sequentie worden tussen haakjes weergegeven onder elke kolom van het sequentielogo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In de PWM komt elke rij overeen met een specifiek aminozuurresidu, terwijl elke kolom een positie in de reeks vertegenwoordigt. Elke cel van de matrix bevat de relatieve frequentie van elk aminozuur op die positie, gewogen door de totale achtergrondfrequenties. Sequentielogo's worden geconstrueerd door de letters van aminozuren zo te stapelen dat de totale hoogte van de stapel op elke positie het behoud van de algehele sequentie op die positie aangeeft. Omgekeerd geeft de hoogte van de afzonderlijke letters binnen de stapel de frequentie van het bijbehorende aminozuur aan. In dit voorbeeld komen zowel het PWM- als het sequentielogo overeen met de eerdere kennis over het bindingsoppervlak van IRF5, met een hogere voorkeur voor een polair aminozuur (glutamaat) op positie 432 ("p") en een zeer hoge voorkeur voor leucine en isoleucine op respectievelijk positie 433 en 435. Opmerkelijk genoeg werd voorspeld dat de posities 427, 429 en 436 allemaal een hogere conservering voor aspartaat zouden hebben, ondanks dat ze in de oorspronkelijke IRF5-reeks werden bezet door serine. Deze bevinding bewijst het belang van fosforylering van deze posities voor de vorming van het IRF5-dimeer, aangezien de negatieve lading in de zijketens van aspartaat en glutamaat lijkt op die van fosfoserine. In feite meldde een eerdere studie dat een lokpeptide genaamd IRF5D, waarin deze serineresiduen werden vervangen door aspartaat, in staat was om IRF5-activiteit te remmen²³. Omgekeerd werd voorspeld dat positie 425 een zeer hoge voorkeur zou hebben voor serine, wat suggereert dat het serineresidu in deze positie in zijn niet-gefosforyleerde vorm kan deelnemen aan de PPI. Inderdaad, het is eerder gerapporteerd voor andere IRF's dat fosforylering van het equivalente serineresidu een negatieve invloed heeft op dimerisatie en binding aan andere coactivatoren^16,24.

Discussie

Het huidige artikel beschrijft een protocol om de aminozuurvoorkeuren van potentieel multispecifieke bindingsplaatsen te schatten op basis van in silico sequentiediversificatie. Er zijn maar weinig computationele tools ontwikkeld om aminozuurvoorkeuren van eiwit-peptide-interfaces te schatten 14,25,26. Deze tools hebben een voorspellend karakter, maar ze verschillen in de computationele algoritmen die worden gebruikt om hun voorspellingen uit te voeren en de correcties die ze implementeren om de nauwkeurigheid te verbeteren. In dit werk hebben we de Pepspec-applicatie van de Rosetta moleculaire modelleringssuite¹⁴ gebruikt. Hoewel deze applicatie in de eerste plaats gericht is op peptideontwerp, implementeert het een algoritme voor sequentiediversificatie dat kan worden gebruikt om aminozuurvoorkeuren te voorspellen. Voor zover wij weten, is deze tool de enige die momenteel beschikbaar is en die een ingebouwd script biedt om een PWM rechtstreeks te berekenen op basis van de resultaten van de sequentiediversificatie. Het is belangrijk op te merken dat het protocol gericht is op PPI's, daarom wordt verwacht dat de initiële structuur een complex van twee eiwitsubeenheden zal zijn. Vóór de eigenlijke sequentiediversificatiestap wordt het eiwit dat als ligand wordt beschouwd, bijgesneden tot het segment dat naar verwachting zal interageren met het receptoreiwit, en wordt het verder behandeld als een peptide. Het protocol kan echter ook worden toegepast op eiwit-peptidecomplexen, een scenario waarin stappen 1.1-1.3 mogelijk niet nodig zijn. Tijdens de voorbereidingsstap (deel 1) is het ook essentieel om verkeerd geformatteerde residuen en heteroatomen te corrigeren, en om segmenten van de complexe structuur te modelleren die relevant zijn voor de doelbindingsplaats en die niet goed konden worden opgelost. Deze correcties zijn afhankelijk van de specifieke structuur die wordt bestudeerd en waren niet vereist voor de structuur die hierin als voorbeeld wordt gebruikt.

De meest kritische stappen van dit protocol zijn die welke worden uitgevoerd met de Rosetta-applicaties, waaronder een eerste herverpakking van zijketens met FixBB (stap 2.1) en de daadwerkelijke sequentiediversificatie met Pepspec (stap 2.2). Deze eerste stap voor het opnieuw inpakken, voorverpakking genoemd, wordt expliciet genoemd als vereist door de auteurs van Pepspec¹⁴. Hoewel het kan worden uitgevoerd door Pepspec, raden de auteurs van deze applicatie ten zeerste aan om de FixBB-applicatie te gebruiken, die speciaal is ontworpen om zijketenrotamers in vaste eiwitruggengraat te optimaliseren. In de stap van sequentiediversificatie is het belangrijk om te bedenken dat de Pepspec-applicatie gericht is op peptideontwerp. Bijgevolg rapporteert het standaard een paar best scorende peptidekandidaten. Aangezien het doel van het hier gepresenteerde protocol is om een groot aantal vermeende peptideliganden te genereren in plaats van een paar best scorende kandidaten, hebben we de optie "-pepspec:n_peptides" gewijzigd van 8 (de standaardinstelling) naar 200 (stap 2.2.1). Met behulp van deze instelling voorspelde Pepspec meer dan 20.000 peptiden als potentiële liganden. Deze set vermeende peptiden gaf een zeer breed beeld van het bindingslandschap van de receptor, die vervolgens werd bemonsterd voor de top 20% van de best scorende peptiden voor daadwerkelijke schatting van aminozuurvoorkeuren. Als een lager aantal peptiden wordt doorgegeven aan "-pepspec:n_peptides", zullen aanzienlijk minder kandidaten door Pepspec worden geaccepteerd. In dit scenario kan de bemonstering die in het protocol wordt voorgesteld, veel vermeende peptideliganden met suboptimale energiescores vastleggen, wat mogelijk kan leiden tot minder robuuste schattingen.

Een van de belangrijkste beperkingen van het protocol dat in dit werk wordt gepresenteerd, is dat het berust op de eerdere kennis van de structuur van het eiwit dat het bindingsoppervlak bevat. Deze structuur hoeft echter niet noodzakelijkerwijs experimenteel te worden bepaald, maar kan ab initio of door homologiemodellering worden gemodelleerd¹⁴. Daarnaast is het ook noodzakelijk om de bindingswijze van ten minste één aminozuurresidu (anker) van het peptideligand te kennen. Dit anker zal worden uitgebreid tot een bepaald aantal residuen via specifieke ankerverlengingsopties van Pepspec om de sequentiediversificatie uit te voeren. Als de oriëntatie van het gehele ligand op de bindingsplaats bekend is, zoals het geval is in het representatieve voorbeeld van deze studie, moeten opties met betrekking tot ankerextensie als standaard worden gelaten (geen extensie), hoewel een residu van het peptide nog steeds moet worden gespecificeerd als een anker om het sequentiediversificatiealgoritme te begeleiden. De Pepspec-applicatie ondersteunt de novo docking van een mogelijk ankerresidu niet, maar kan als input de output van andere docking-applicaties of een model van een homoloog eiwit-peptidecomplex gebruiken om ankerdocking uit te voeren¹⁴; Hoewel deze scenario's buiten het bestek van dit artikel vallen.

Een belangrijk nadeel van het voorgestelde protocol is het inherente voorspellende karakter, dat direct wordt beïnvloed door de resolutie en nauwkeurigheid van de initiële structuur of het initiële model van het eiwit-eiwitcomplex. Pepspec-auteurs hebben echter verklaard dat de nauwkeurigheid van deze toepassing aanzienlijk is verbeterd door de input-backbone-coördinaten te behandelen als een ensemble van structuren in plaats van een enkele eiwitstructuur te gebruiken en achtergrondnormalisatie toe te passen bij het berekenen van de PWM¹⁴. Bovendien is het protocol een alternatief voor de omslachtige en kostbare experimentele methoden voor het inschatten van aminozuurvoorkeuren. Al deze experimentele methoden zijn gebaseerd op het evalueren van grote sequentiebibliotheken die zijn verkregen door mutaties in de sequentie van eiwitliganden te introduceren, gevolgd door experimentele evaluatie van de impact van dergelijke mutaties (zie Bratulic en Badran¹² voor een overzicht). Computationele protocollen zoals degene die in dit werk wordt voorgesteld, maken het mogelijk om duizenden vermeende peptideliganden op een zeer efficiënte manier te screenen, wat mogelijk een robuustere set biedt voor de schatting van aminozuurvoorkeuren 13,14,25. Ons voorgestelde protocol kan worden toegepast op elke PPI die kan worden teruggebracht tot een eiwit-peptide-interface. Bovendien kan dit protocol dienen als een eerste strategie om mediatoren van PPI's te identificeren, zoals potentiële activatoren of remmers. De geïdentificeerde mediatoren kunnen verder worden gebruikt om deze PPI's in het laboratorium te bestuderen, of ze kunnen worden geëvalueerd als potentiële therapeutische middelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BUDE Alanine Scan Server	University of Edinburgh	https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/	doi: 10.1021/acschembio.9b00560
Rosetta Modeling Software	Rosetta Commons	https://www.rosettacommons.org/software	doi: 10.1002/prot.22851
UCSF Chimera	University of California San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	doi: 10.1002/jcc.20084