Methodenartikel

Een workflow voor de kwantitatieve beoordeling van de endofytische en epifytische bacteriële microbiomen van de schors van Populus trichocarpa

DOI:

10.3791/66318

⸱

27 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een betrouwbare en efficiënte workflow van monsterafname tot gegevensanalyse voor het profileren van de endofytische en epifytische bacteriële microbiomen die aanwezig zijn in de schors van Populus trichocarpa.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Micro-organismen die plantenoppervlakken en inwendige weefsels koloniseren, kunnen gunstige functies hebben bij het bevorderen van de groei en gezondheid van planten. Informatie over het microbioom van schorsweefsels van houtachtige planten blijft echter beperkt, vooral met betrekking tot de endofytische en epifytische bacteriële microbiota van de schors van Populus. Om deze beperking te overwinnen, hebben we een workflow opgezet om de samenstelling en diversiteit van de endofytische en epifytische bacteriële microbiota die de schors van Populus trichocarpa koloniseert, te kwantificeren. In het kort werd de epidermis van de stengel van P. trichocarpa herhaaldelijk afgeveegd met een watje gedoopt in 0,1% Tween 20 om epifytische bacteriële monsters te verkrijgen. De gestripte opperhuid werd gesteriliseerd en vervolgens herhaaldelijk ingevroren en verpletterd met behulp van respectievelijk vloeibare stikstof en een kralenklopper om endofytische bacteriële monsters te verzamelen. Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit de aan katoen gehechte epifytische bacteriegemeenschappen en de geplette schors van P. trichocarpa, en onderging ploymerasekettingreactie (PCR) amplificatie met primers gericht op de hypervariabele V5-V7- en V4-regio's van het bacteriële 16S rRNA-gen. Drie replicaten van de verkregen PCR-producten van elk endofytisch of epifytisch monster werden in gelijke concentraties gemengd om de ampliconbibliotheek op te bouwen, die vervolgens werd gesequenced. De verkregen sequenties werden geanalyseerd door middel van sequentiesplitsing, kwaliteitsfiltering, verwijdering van chimaera's en taxonomische annotaties. Samenvattend hebben we een betrouwbare en efficiënte workflow opgezet van monsterverzameling tot gegevensanalyse voor het bepalen van de endofytische en epifytische bacteriële microbiomen van de schors van P. trichocarpa door middel van 16S rRNA-genprofilering. Samen met de methoden voor het onderzoeken van microbiota die schors koloniseren die in de vorige studie zijn vastgesteld, kan onze methodologie dienen als een blauwdruk voor het ontwerpen van protocollen voor het onderzoeken van het schorsmicrobioom van andere houtachtige plantensoorten, met name economisch belangrijke bomen van bossen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schors is de buitenste laag van de stengels van houtachtige planten, verwijzend naar alle weefsels buiten het vasculaire cambium, inclusief het floëem en het periderm 1,2. Uitgebreid onderzoek heeft aangetoond dat schors een cruciale rol speelt bij de translocatie van water en koolhydraten, de bescherming van bomen tegen brand en mechanische schade3, en aanpassing aan abiotische4en biotische stress5. Wat nog belangrijker is, als interface tussen een boom en de omringende lucht, dient schors ook als een unieke habitat voor micro-organismen6. Met name van schors-geassocieerde microben is bevestigd dat ze de functies hebben om de groei van de gastheer te bevorderen7, bomen te helpen bij het verwerven van voedingsstoffen8, de synthese van plantenhormonente verbeteren 9 en gastheren te beschermen tegen fytopathogene infectie5. Er is echter veel minder aandacht besteed aan de microbiële gemeenschappen die schors koloniseren in vergelijking met de phyllosphere en rhizopshere microbiota10,11. Er bestaat beperkte kennis over de biologische kenmerken van het microbioom van boomschors. Het doel van dit methodologiedocument is om onderzoekers te voorzien van een reeks protocollen voor het beschrijven van de diversiteit en samenstelling van het endofytische en epifytische bacteriële microbioom van houtachtige plantenschors.

Op basis van de gepubliceerde methoden voor het onderzoeken van de schorsmicrobiota12,13 in dit werk, hebben we een uitgebreide workflow ontworpen en getest op basis van 16S rRNA-gen amplicon sequencing-analyse om het bacteriële microbioom te onderzoeken dat de interne weefsels of de oppervlakken van de stengelschors van Populus trichocarpa, een belangrijk modelorganisme dat wordt gebruikt in de biologie van houtachtige planten14. P. trichocarpa heeft de kenmerken van snelle groei15, relatief gemak van experimentele manipulatie16 en gemakkelijke genetische transformatie, en staat ook bekend om zijn brede toepassing in de houtproductie17. Concreet begint de methode die in dit werk naar voren wordt gebracht met een gedetailleerde beschrijving van de bemonstering van de endofytische en epifytische microbiota van de stengelschors van P. trichocarpa. Met de opname van een stap voor het steriliseren van de schors met alcohol en natriumhypochloriet na het oogsten van het microbioom dat het oppervlak koloniseert, stelde deze studie een procedure vast voor het gelijktijdig en afzonderlijk verzamelen van micro-organismen die zich in de binnenstructuur van de schors bevinden (endofyten) en die op het buitenoppervlak van de schors (epifyten). Voor zover wij weten, zijn er onder de gepubliceerde studies over het microbioom van de houtachtige plantenschors geen tests uitgevoerd op de endofytische en epifytische microbiële gemeenschappen die uit hetzelfde schorsmonster zijn verzameld op basis van een duidelijk onderscheid tussen de binnen- en buitennissen van de schors 18,19,20. De methode die in dit onderzoek is ontwikkeld, zal onderzoekers dus in staat stellen om de diversiteit en de samenstelling van de bacteriegemeenschappen die in schors leven op een nauwkeurige en uitgebreide manier te onderzoeken. Daarnaast biedt deze studie gedetailleerde beschrijvingen van de procedures voor genomische DNA-extractie, polymerasekettingreactie (PCR)-amplificatie, de voorbereiding van de 16S rRNA-genampliconsequencingbibliotheek21 en sequentiegegevensanalyse. In het bijzonder maakte deze studie gebruik van een paar primers gericht op de hypervariabele V5-V7-regio's van het bacteriële 16S rRNA-gen om de niet-specifieke amplificatie van de mitochondriale en chloroplastsequenties van waardplanten te verminderen22, wat onbevooroordeelde profielen van het schors-geassocieerde microbioom opleverde. De α-diversiteiten werden geëvalueerd met behulp van de Shannon-index23, een populaire diversiteitsindex die veel wordt gebruikt in het onderzoek naar ecologie, en de taxonomische samenstelling op stamniveau werd berekend en gevisualiseerd in de Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 24en R-software25. Samen met de methoden voor het onderzoeken van microbiota die schors koloniseren die in de vorige studie zijn vastgesteld 1,6, kan onze methodologie dienen als een blauwdruk voor het ontwerpen van protocollen voor het bestuderen van het schorsmicrobioom van andere houtachtige plantensoorten, met name economisch belangrijke bomen in het bos.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monsterverzameling

  1. Groei 3 maanden oude P. trichocarpa jonge boompjes in een groeikamer (21-25°C; 16-uur licht/8-uur donkercyclus met aanvullend licht van ongeveer 300 μEm-2 s-1 van een drie-bands lineaire fluorescentielamp [T5 28 W 6400 K]; en 60-80% luchtvochtigheid)26.
  2. Snijd de 10 cm lange stengelsegmenten van P af. trichocarpa van 2-12 cm boven het gesteriliseerde grondoppervlak (Figuur 1A) met behulp van een gesteriliseerde snoeischaar. Plaats de stengelsegmenten in een gesteriliseerde vierkante petrischaal (13 cm x 13 cm).
    OPMERKING: Voor dit onderzoek werden zes bomen van dezelfde grootte geselecteerd, waarvan er drie werden gebruikt voor de PCR-amplificatie bij elke primerset.

2. Verwerking van monsters

  1. Veeg herhaaldelijk de epidermis van de stengel op de gesteriliseerde vierkante petrischaal af met een steriel wattenstaafje gedrenkt in 0,1% Tween 20 om de micro-organismen die zich op de schorsoppervlakken koloniseren efficiënter te verzamelen (Figuur 1B).
    OPMERKING: Subvochtig steriel katoen wordt gebruikt om micro-organismen op te vangen die zich aan het stengeloppervlak hechten. Gebruik geen te droog of te nat katoen bij het afvegen van het steeloppervlak. Tween 20 is een oppervlakteactieve stof die in staat is de oppervlaktespanning te verminderen, een eigenschap die gunstig is voor het verkrijgen van meer microbiële monsters van plantoppervlakken27,28.
  2. Snijd het wattenstaafje van het wattenstaafje met een steriel mesje en plaats elk wattenstaafje met epifytische microbiële monsters in een steriele centrifugebuis van 1.5 ml. Bewaar de monsters bij -80 °C.
  3. Snijd na het afvegen van het stengeloppervlak de schors open waaruit de epifytische micro-organismen zijn bemonsterd met een steriel scalpel, pel de schors eraf en plaats deze in een vierkante petrischaal.
  4. Snijd de schors die in stap 2.3 van de stengel is ontdaan in segmenten van ongeveer 1 cm (figuur 1C) met een steriel scalpel.
  5. Steriliseer de partjes door ze 2 minuten te weken in 70% (v/v) alcohol. Week vervolgens de segmenten in natriumhypochloriet (2,5% effectief chloorgehalte) aangevuld met 0,1% Tween 80 gedurende 5 minuten.
  6. Steriliseer de segmenten verkregen in stap 2.5 gedurende 30 s in 70% (v/v) alcohol29. Was vervolgens alle monsters drie keer met steriel gedestilleerd water en plaats ze op een schone bank om aan de lucht te drogen.
    OPMERKING: De schorsmonsters worden heen en weer geroerd met behulp van een steriel pincet om voldoende sterilisatie van het oppervlak te garanderen.
  7. Bewaar elk aan het oppervlak gesteriliseerd stengelschorssegment (endofytische monsters) in een steriele centrifugebuis van 2 ml bij -80 °C.

3. Genomische DNA-extractie

  1. Voer de volgende stappen uit om de monsters voor te behandelen voor DNA-extractie.
    1. Plaats de aan het oppervlak gesteriliseerde stengelschorssegmenten verkregen in stap 2.7 in steriele harde buizen van 5 ml en voeg drie gesteriliseerde stalen kralen (4 mm) toe aan elke buis.
      OPMERKING: Voer deze stap uit op een schone bank om microbiële besmetting te voorkomen. De wattenbolletjes die in stap 2.2 (epifytische monsters) worden bereid, hoeven niet te worden voorbewerkt en worden direct gebruikt voor genomische DNA-extractie.
    2. Vries de harde buizen met de monsters 10 minuten in vloeibare stikstof in.
    3. Plet de schorsmonsters gedurende 5 minuten met een kralenklopper. Vries de harde tube vervolgens opnieuw 1 minuut in vloeibare stikstof in en herhaal de druppelklopstap gedurende 5 minuten.
  2. Extraheer genomisch DNA.
    OPMERKING: Gebruik een in de handel verkrijgbare DNA-extractiekit om genomisch DNA te isoleren uit de endofytische en epifytische monsters.
    1. Voeg de geplette stengelschors van P toe. Trichocarpa en de aan katoen gehechte epifytische bacteriegemeenschappen (elk 0,25 g) aan elk van de kralenbuisjes. Voeg vervolgens 60 μL oplossing C1 toe, geleverd door een in de handel verkrijgbare kit, en meng voorzichtig door inversie.
    2. Homogeniseer vervolgens de endofytische en epifytische monsters met behulp van een kralenklopper in vier runs van 1 minuut. Plaats de monsters na elke run gedurende 30 s op ijs.
    3. Centrifugeer de buisjes op 10.000 x g gedurende 1 min.
    4. Extraheer de endofytische en epifytische monsters met behulp van een kit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
    5. Voeg 30 μl oplossing C6 toe aan het midden van het witte filtermembraan en incubeer gedurende 5 minuten bij 25 °C.
    6. Centrifugeer op 10.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 1 min.

4. PCR-amplificatie

  1. Standaardiseer de geëxtraheerde DNA-concentratie.
    1. Meet de concentraties van het genomische DNA dat is geëxtraheerd uit epifytische en endofytische monsters met behulp van een microvolumespectrofotometer.
    2. Verdun elk DNA-monster met steriel ddH2O tot 2 ng/μL om de DNA-sjabloon voor PCR-amplificatie te verkrijgen.
  2. Versterk deze DNA-monsters.
    1. Amplificeer het V5-V7-gebied van het bacteriële 16S rRNA-gen met behulp van de voorwaartse primer 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') en de omgekeerde primer 1193R (5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3') 10. Amplificeer het V4-gebied van het bacteriële 16S rRNA-gen met behulp van de voorwaartse primer 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') en de omgekeerde primer 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      OPMERKING: Het genomische DNA dat uit elk monster wordt geëxtraheerd, wordt gebruikt als sjabloon voor elk van de drievoudige PCR-amplificatiereacties, en een extra reactie die geen DNA bevat, wordt ingesteld als negatieve controle. Voor elk monster is het volume van het PCR-reactiemengsel 25 μL. Voor het primerpaar 799F/1193R bevat elke reactie 12 μL PCR-water, 1 μL van elk van de F/R primers (10 μM), 1 μL DNA-sjabloon en 10 μL mixoplossing. Voor het primerpaar 515F/806R bevat elke reactie 12 μL PCR-water, 1 μL van elk van de F/R primers (10 μM), 1 μL DNA-sjabloon en 10 μL mixoplossing. PCR-reacties met het primerpaar 799F/1193R worden uitgevoerd onder de volgende cyclusomstandigheden: initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 5 min, 25 cycli van 98 °C gedurende 30 s, 53 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 45 s, en een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min. De PCR-reacties met het primerpaar 515F/806R worden uitgevoerd onder de volgende cyclusomstandigheden: initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 3 min, 35 cycli van 94°C gedurende 45 s, 50 °C gedurende 60 s en 72 °C gedurende 90 s, en een laatste verlenging gedurende 10 minuten bij 72 °C.
    2. Meng elk monster grondig en centrifugeer om luchtbellen te verwijderen.
    3. Voer amplificatie uit van het V5-V7- of V4-gebied van de bacteriële 16S rRNA-genen op een thermische cycler.
  3. Detecteer de versterkte producten.
    1. Laad 5 μL van elke amplicon op een 1% agarosegel en voer elektroforese uit bij 120 V gedurende 30 minuten.
    2. Bekijk de gel onder UV-licht om succesvolle PCR-amplificatie te valideren. De grootte van de PCR-producten verkregen met de primerparen 799F/1193R en 515F/806R moet respectievelijk ongeveer 430 bp en 400 bp zijn.

5. Voorbereiding van amplicon sequencing Bibliotheek

  1. Meng de versterkte producten en bepaal hun concentraties.
    1. Meng de producten die zijn gegenereerd uit de drie replicaten van de PCR-amplificatie voor elk monster in een PCR-buisje.
    2. Voeg 5 μl van de PCR-producten en 195 μl werkoplossing toe aan een putje met een microtiterplaat met 96 putjes volgens de instructies van de fabrikant voor de kit (zie materiaaltabel). Voeg vervolgens 10 μl van het standaard DNA (DNA-reagentia met concentraties van 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 en 100 ng/μl uit de kit) en 190 μl werkoplossing toe aan een putje van dezelfde microtiterplaat. Bepaal na deze stap de fluorescentie-intensiteit van de PCR-producten en het standaard DNA.
    3. Meet fluorescentie met behulp van een microplaatlezer.
      OPMERKING: De excitatie/emissie van standaard fluoresceïnegolflengten is ingesteld op 480/530 nm om de hoeveelheid dubbelstrengs DNA in elk monster te meten.
    4. Bepaal de standaardcurve van DNA-concentraties en fluorescentie-intensiteiten met behulp van de standaard-DNA-concentraties van de standaard-DNA-oplossingen (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 en 100 ng/μl) en de fluorescentie-intensiteit van elk van de standaard-DNA-oplossingen. Vervang de fluorescentie-intensiteitswaarde van elk van de PCR-producten in de standaardcurve om de DNA-concentraties van de PCR-producten te berekenen.
  2. Bouw amplicon sequencing bibliotheken.
    1. Volgens de concentraties die in stap 5.1.4 zijn gedetecteerd, mengt u de resterende PCR-producten die door hetzelfde primerpaar zijn geamplificeerd in gelijke concentraties om de amplicon-sequencingbibliotheek op te bouwen.
      OPMERKING: De fractie van de PCR-producten van elk monster die wordt gebruikt voor het kwantificeren van de concentratie van het dubbelstrengs DNA door de fluorescentie-intensiteit te meten, is niet opgenomen in de amplicon-sequencingbibliotheek, die is opgebouwd uit de overige PCR-producten van hetzelfde monster.
  3. Voer gelextractie uit.
    1. Voer agarosegelelektroforese uit met behulp van elektroforese-apparatuur. Bereid in het kort een 1,3% agarosegel voor (d.w.z. 1,3 g agarosepoeder in 100 ml 1 x TAE-buffer).
      OPMERKING: Er wordt voor gezorgd dat de hoeveelheid putjes in de gel voldoende is om elk PCR-product en elke DNA-ladder vast te houden; in deze studie wordt 1,3% agarosegel bereid door 1,3 g agarosepoeder op te lossen in 100 ml 1 x TAE-buffer.
    2. Verwijder de kammen na het stollen van de gel en plaats de gel in een elektroforesetank met 1 x TAE-buffer. Voeg vervolgens 1 volume-eenheid van 6 x oranje laadbuffer toe aan 5 volume-eenheden van elk PCR-product, waarbij 100 μL van de laatste in elk putje wordt geladen. Voeg 30 μL van de DNA-ladder toe aan één putje. Voer na het aansluiten van de positieve en negatieve draden elektroforese uit op 80 V gedurende 50 minuten.
      OPMERKING: In deze studie wordt gelextractie gebruikt om de amplicon-sequencingbibliotheek te zuiveren, vertegenwoordigd door de band van 400 bp of 430 bp geamplificeerd met respectievelijk het primerpaar 515F/806R of 799F/1193R.
    3. Snijd DNA-fragmenten uit de agarosegel met behulp van een schoon, scherp scalpel.
    4. Weeg de plakje gel af en doe deze in een kleurloze tube. Voeg buffer toe om de plak gel onder te dompelen.
      OPMERKING: De maximale hoeveelheid gel per draaikolom is 400 mg. Drie volume-eenheden buffer worden toegevoegd aan één volume-eenheid van een bepaalde gelschijf.
    5. Voer gelextractie uit met behulp van de gelextractiekit (zie materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: De ampliconbibliotheek die is opgebouwd uit de producten van de PCR gericht op het bacteriële 16S rRNA-gen dat wordt gebruikt voor het sequencen van de endofytische en epifytische bacteriële gemeenschappen, wordt met deze methode verkregen.
  4. Bevestig de kwaliteit van de gezuiverde amplicon-sequencingbibliotheek.
    1. Bepaal de concentratie van dubbelstrengs DNA in de gezuiverde amplicon-sequencingbibliotheek die in stap 5.3.5 is verkregen door een fluorometer met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie materiaaltabel) volgens het protocol van de fabrikant (Figuur 2).
    2. Bepaal de doel-DNA-fragmentgrootte van de amplicon-sequencingbibliotheek verkregen in stap 5.3.5 met behulp van een nucleïnezuurkwaliteitscontroleanalysesysteem met commerciële chips en kits (zie Materiaaltabel) volgens het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de fragmentgrootte binnen het verwachte bereik ligt en dat er geen primerdimeren in de amplicon-sequencingbibliotheek staan.
    3. Bepaal de effectieve concentratie van de sequencingbibliotheek verkregen in stap 5.3.5 door gebruik te maken van de kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) met een in de handel verkrijgbare kit (zie Materiaaltabel) volgens het protocol van de fabrikant.
    4. Verdun de amplicon-sequencingbibliotheek om te voldoen aan de belastingsconcentratie die wordt aanbevolen voor het sequencingplatform.

6. Sequentieverwerking en statistische analyse

  1. Na sequentiebepaling van de ampliconbibliotheek verkregen in stap 5.4.4 met behulp van een sequencingplatform (zie Materiaaltabel)31. Maak een map met de naam emp-paired-end-sequences in de werkmap en sla vervolgens het gecomprimeerde sequentiebestand op in fastq-indeling in deze map. Open vervolgens Ubuntu en activeer de conda-omgeving en Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2)(v2021.2)32.
  2. Schrijf een toewijzingsbestand en sla het op als een tekstbestand. De inhoud van het bestand wordt weergegeven in Tabel 2.
  3. Splits de sequencinggegevens die zijn verkregen met de amplicon-sequencingbibliotheek en verwijder primers uit de sequencinggegevens met behulp van het toewijzingsbestand.
    1. Gebruik de volgende opdracht om de sequentiegegevens te splitsen: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. Gebruik het volgende commando om primers te verwijderen: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F or 515F --p-front-r 1193R or 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. Screen en verwijder eventuele chimaera's met behulp van de DADA2-pijplijn33. Cluster de gefilterde sequenties in ampliconsequentievarianten (ASV's) met 99% gelijkenis.
    1. Gebruik de volgende opdracht om chimaera- en clustersequenties te screenen en te verwijderen in ASV's: time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. Maak taxonomische annotaties met behulp van de SILVA-database (v138) op basis van de referentiesequenties34.
    1. Gebruik de volgende opdracht om de ASV's te annoteren die in stap 6.4 zijn verkregen: time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. Maak een ASV-tabel in QIIME2 (v2021.2) met behulp van de volgende opdrachten:
    qiime tools exporteren --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    qiime tools exporteren --input-path taxonomie.qza --output-path geëxporteerd-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomie.tsv --observation-header OTUID, taxonomie --sc-gescheiden taxonomie
    BIOM Convert -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key taxonomie
    OPMERKING: Deze opdrachten genereren een tabel met het aantal lezingen van alle ASV's voor elk monster.
  7. Bereken het aantal ASV's en lezingen van de endofytische en epifytische bacteriegemeenschappen die zijn gegenereerd met respectievelijk de primerparen 799F/1193R en 515F/806R.
    1. Bereken het totale aantal ASV's met ≥ 1 lezingen op het niveau van respectievelijk stam, klasse, orde, familie en geslacht in elk monster in de ASV-tabel verkregen in stap 6.6 door te tellen.
    2. Bereken het totale aantal lezingen in elk monster op basis van de som van het aantal lezingen van alle ASV's in de ASV-tabel verkregen in stap 6.6 door te tellen.
    3. Bereken het aantal plantlezingen in elk monster met behulp van het aantal lezingen van ASV's die zijn geannoteerd als chloroplasten of mitochondriën in de ASV-tabel die in stap 6.6 is verkregen door te tellen.
    4. Bereken het aantal bacteriële lezingen in elk monster met behulp van de volgende formule:
      Aantal bacteriële lezingen = Aantal totale lezingen − Aantal plantaflezingen.
    5. Bereken en visualiseer het gemiddelde aantal ASV's (op het niveau van respectievelijk stam, klasse, orde, familie en geslacht) of lezingen (in totaal of van respectievelijk plant en bacteriën) van de endofytische en epifytische bacteriegemeenschappen gegenereerd door de primerparen 799F/1193R en 515F/806R met behulp van Excel- (2019) en Prism-software (v8.0).
    6. Evalueer de significantie van de verschillen tussen het aantal ASV's (op het niveau van respectievelijk stam, klasse, orde, familie en geslacht) of lezingen (in totaal of van respectievelijk plant en bacteriën) gegenereerd met de primerparen 799F/1193R en 515F/806R met behulp van de Student's t-test in de Prism (v8.0) software.
  8. Filter de lezingen die zijn geannoteerd als chloroplasten en mitochondriën met behulp van de volgende opdracht: time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondriën, chloroplast --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. Maak een fylogenetische boom met behulp van de volgende opdracht: time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. Bereken en visualiseer de alfa-diversiteit die wordt vertegenwoordigd door de Shannon-index van de endofytische en epifytische bacteriegemeenschappen met behulp van het QIIME2 (v2021.2) en het 'ggplot2'-pakket in R (v4.0.5)35.
    1. Gebruik het volgende commando om de alfa-diversiteit te berekenen: time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth de laagste leeswaarde van alle samples --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. Bereken de relatieve abundanties van de populaties op het niveau van de stam van de endofytische en epifytische bacteriegemeenschappen. Genereer een bestand in qzv-formaat met de naam "taxa-bar-plots" met behulp van de volgende opdracht van QIIME2 (v2021.2): time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomie taxonomie.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. Open het bestand taxa-bar-plots.qzv online op https://view.qiime2.org/. Download en bewaar het nieuw gegenereerde bestand van level2. Bereken de relatieve abundantie met de volgende formule met R (v4.0.5):
      Relatieve abundantie van elke bacteriële phylum (%) = (aantal lezingen van elke bacteriële phylum in elk monster / aantal totale lezingen van elk monster) x 100 %.
      Visualiseer de gegevens met behulp van de ggplot2, RColorBrewer, reshape en ggalluviale pakketten in R (v4.0.5).
  12. Analyseer de significantie van het verschil tussen de relatieve abundantie van elk van de dominante phyla (gedefinieerd als een phylum met een relatieve abundantie van > 0,5%) in de endofytische en epifytische bacteriële gemeenschappen gesequenced met het primerpaar 799F/1193R door gebruik te maken van de eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) met Tukey's post-hoctest op een significantieniveau van 0,05 in STAMP-software36.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoogwaardig genomisch DNA van de endofytische en epifytische bacteriële microbiomen van de schors van P. trichocarpa werd verkregen met behulp van het geoptimaliseerde protocol (tabel 1). De PCR-amplificatie van alle 12 monsters leverde enkele sterke banden met de juiste grootte op (Figuur 3). Beide primerparen 799F/1193R en 515F/806R versterkten met succes de doelproducten uit endofytische of epi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontwikkeld op basis van de gepubliceerde methodologie voor het onderzoeken van schorsmicrobiota 7,18, biedt de door ons voorgestelde workflow algemene richtlijnen voor het identificeren en karakteriseren van endofytische en epifytische microbiomen van de schors van houtachtige planten. Deze methode omvat protocollen voor het verzamelen en verwerken van monsters, genomische DNA-extractie, PCR-amplificatie, voorbereiding van amplic...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de heer David Anthony Atherton voor het verstrekken van de videovertelling en leden van het BN-laboratorium voor waardevol advies. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation of China (subsidienummer 32071741 [aan BN]), de Key R&D Plan Projects in Xinjiang Uygur Autonomous Region (subsidienummer 2022B02014), het "Tianchi Talents" Introduction Plan (aan BN), het National Key R&D Program of China (subsidienummer 2021YFD2200203 [aan GQ]), en het Innovation Project van State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Northeast Forestry University) (subsidienummer 2019A01 [aan BN]).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment:
Bead beaterDHS Life Science401265
Centrifuge for 1.5 mL tubesThermo Scientific75002440
Centrifuge for PCR tubes
Microplate readerBioTek8040528
NanodropDHS Life Science & Technology Co., Ltd.2010/2020 microvolume spectrophotometer
Qubit 3.0 Fluorometer invitrogenQ33216fluorometer 
Refrigerator(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096thermal cycler
Tanon EPS-600 TanonA-179047-2313For electrophoresis
LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625Library DNA fragment distribution detection, nucleic acid quality control analysis
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694Quantification library
Illumina Novaseq6000Illumina Library sequencing
Materials:
GlovesAnyNA
aerosol barrier tip 10 μLAxygenTF-300-R-S
aerosol barrier tip 20μLAxygenTF-20-R-S
aerosol barrier tip 200μLAxygenTF-200-R-S
aerosol barrier tipr 1000μLAxygenTF-1000-R-S
centrifuge tube 1.5 mlAxygenMCT-150-C
Corning 96-well Black/Clear Flat Bottom MicroplateCorning3631
cotton stickZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN 12888-100For DNA extraction
enzyme-free centrifuge tube 1.5 mlUSA SCIENTIFIC1415-2600
ethanolTianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited64-17-5
hard tubes(5 ml)DHS Life Science0401261-17
Hot Master Mix Quanta Bio2200400
microcentrifuge tube 2.0 mlAxygenMCT-200-C-S
PCR WaterQIAGEN 17000-10
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN28704For gel extraction
Quant-iT dsDNA Assay Kits,Broad RangeInvitrogenQ33130For concentration determination of the amplified products and the purified amplicon libraries
square petri dishChangde Bkman Biotechnology Co.,Ltd110301014
steel beadsShangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.YXB36985
sodium hypochlorite solutionTianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd 7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
Dual Protocol DNA High Sens Reagent KitPerkinElmerCLS760672DNA library detection
VAHTS Library Quantification Kit for IlluminaVazyme Biotech Co., LtdNQ104Quantification library

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aguirre-Von-Wobeser, E., Alonso-Sanchez, A., Mendez-Bravo, A., Villanueva Espino, L. A., Reverchon, F. Barks from avocado trees of different geographic locations have consistent microbial communities. Archs Microbiol. 203 (7), 4593-4607 (2021).
  2. Konopka, B., Pajtik, J., Seben, V., Merganicova, K. Modeling bark thickness and bark biomass on stems of four broadleaved tree species. Plants (Basel). 11 (9), 1148(2022).
  3. Rosell, J. A. Bark in woody plants: Understanding the diversity of a multifunctional structure. Integr Comp Biol. 59 (3), 535-547 (2019).
  4. Kobayashi, K., Aoyagi, H. Microbial community structure analysis inacer palmatumbark and isolation of novel bacteria IAD-21 of the candidate division FBP. PeerJ. 7, e7876(2019).
  5. Pellitier, P. T., Zak, D. R., Salley, S. O. Environmental filtering structures fungal endophyte communities in tree bark. Mol Ecol. 28 (23), 5188-5198 (2019).
  6. Dreyling, L., Schmitt, I., Dal Grande, F. Tree size drives diversity and community structure of microbial communities on the bark of beech (fagus sylvatica). Front For Glob Change. 5, 858382(2022).
  7. Jo, Y., et al. Changes in microbial community structure in response to gummosis in peach tree bark. Plants (Basel). 11 (21), 2834(2022).
  8. Dong, C., et al. core microbiota, and function of the rhizosphere soil and bark microbiota in Eucommia ulmoides. Front Microbiol. 13, 855317(2022).
  9. Bodenhausen, N., Bortfeld-Miller, M., Ackermann, M., Vorholt, J. A. A synthetic community approach reveals plant genotypes affecting the phyllosphere microbiota. PLoS Genet. 10 (4), e1004283(2014).
  10. Bodenhausen, N., Horton, M. W., Bergelson, J. Bacterial communities associated with the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana. PLoS One. 8 (2), e52369(2013).
  11. Stone, B. W. G., Weingarten, E. A., Jackson, C. R. The Role of the phyllosphere microbiome in plant health and function. Annual plant reviews. 1, 1-24 (2018).
  12. Lambais, M. R., Lucheta, A. R., Crowley, D. E. Bacterial community assemblages associated with the phyllosphere, dermosphere, and rhizosphere of tree species of the atlantic forest are host taxon dependent. Microb. Ecol. 68 (3), 567-574 (2014).
  13. Arrigoni, E., Antonielli, L., Pindo, M., Pertot, I., Perazzolli, M. Tissue age and plant genotype affect the microbiota of apple and pear bark. Microbiol Res. 211, 57-68 (2018).
  14. Germain, H., Séguin, A. Innate immunity: Has poplar made its bed. New Phytol. 189 (3), 678-687 (2011).
  15. Varnagirytė-Kabašinskienė, I., et al. Evaluation of shoot collection timing and hormonal treatment on seedling rooting and growth in four poplar genomic groups. Forests. 15 (9), (2024).
  16. Lu, S., et al. Ptr-mir397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (26), 10848-10853 (2013).
  17. Krabel, D., et al. Early root and aboveground biomass development of hybrid poplars (populus spp.) under drought conditions. Can J For Res. 45 (10), 1289-1298 (2015).
  18. Vitulo, N., et al. Bark and grape microbiome of vitis vinifera: Influence of geographic patterns and agronomic management on bacterial diversity. Front Microbiol. 9, 3203(2018).
  19. Aschenbrenner, I. A., Cernava, T., Erlacher, A., Berg, G., Grube, M. Differential sharing and distinct co-occurrence networks among spatially close bacterial microbiota of bark, mosses and lichens. Mol Ecol. 26 (10), 2826-2838 (2017).
  20. Liang, X., Wan, D., Tan, L., Liu, H. Dynamic changes of endophytic bacteria in the bark and leaves of medicinal plant eucommia ulmoides in different seasons. Microbiol Res. 280, 127567(2024).
  21. De Muinck, E. J., Trosvik, P., Gilfillan, G. D., Hov, J. R., Sundaram, A. Y. M. A novel ultra high-throughput 16s rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the illumina Hiseq platform. Microbiome. 5 (1), 68(2017).
  22. Anguita-Maeso, M., Haro, C., Navas-Cortes, J. A., Landa, B. B. Primer choice and xylem-microbiome-extraction method are important determinants in assessing xylem bacterial community in olive trees. Plants (Basel). 11 (10), 1320(2022).
  23. Wang, C., Liu, D. W., Bai, E. Decreasing soil microbial diversity is associated with decreasing microbial biomass under nitrogen addition. Soil Biol Biochem. 120, 126-133 (2018).
  24. Almeida, A., Mitchell, A. L., Tarkowska, A., Finn, R. D. Benchmarking taxonomic assignments based on 16s rRNA gene profiling of the microbiota from commonly sampled environments. GigaScience. 7 (5), giy54(2018).
  25. Liland, K. H., Vinje, H., Snipen, L. Microclass: An R-package for 16s taxonomy classification. BMC Bioinform. 18 (1), 172(2017).
  26. Li, S., et al. The AREb1 transcription factor influences histone acetylation to regulate drought responses and tolerance in Populus trichocarpa. Plant Cell. 31 (3), 663-686 (2019).
  27. Cregger, M. A., et al. The Populus holobiont: Dissecting the effects of plant niches and genotype on the microbiome. Microbiome. 6 (1), 31(2018).
  28. Maria Rodríguez, J. O., Ziani, K., Maté, J. I. Combined effect of plasticizers and surfactants on the physical properties of starch based edible films. Food Res Int. 39 (8), 840-846 (2006).
  29. Beckers, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Boerjan, W., Vangronsveld, J. Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees. Microbiome. 5 (1), 25(2017).
  30. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16s rrna diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 4516-4522 (2011).
  31. Mcpherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments. J Vis Exp. 24 (137), e57932(2018).
  32. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  33. Callahan, B. J., et al. Dada2: High-resolution sample inference from illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  34. Pruesse, E., et al. A comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Res. 35 (21), 7188-7196 (2007).
  35. Ginestet, C. Ggplot2: Elegant graphics for data analysis. J R Stat Soc Ser A Stat Soc. 174, 245-245 (2011).
  36. Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. Stamp: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinform. 30 (21), 3123-3124 (2014).
  37. Holmes, S. P., McMurdie, P. J., Callahan, B. J. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. 11, 2639-2643 (2017).
  38. Chernov, T. I., Tkhakakhova, A. K., Kutovaya, O. V. Assessment of diversity indices for the characterization of the soil prokaryotic community by metagenomic analysis. Eurasian Soil Sci. 48 (4), 410-415 (2015).
  39. Li Yu, X., Hu, X. Y., Wang, X. X., Zhang, X. Y., Du, K. B. A protocol specialized for microbial DNA extraction from living poplar wood. Not Bot Horti Agrobot Cluj Napoca. 50 (4), (2022).
  40. Jeffrey, L. C., et al. Bark-dwelling methanotrophic bacteria decrease methane emissions from trees. Nat Commun. 12 (1), 2127(2021).
  41. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of zea mays l. Microb Ecol. 41 (3), 252-263 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Barkmicrobioomendofytische bacteri nepifytische bacteri n16S rRNA sequencingDNA extractiePCR amplificatieampliconbibliotheekagarosegelelektroforesemicrobi le diversiteit

Gerelateerde artikelen