Methodenartikel

Circadiane oscillaties monitoren met een bioluminescentiereporter in organoïden

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66381

⸱

16 februari 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Circadiane ritmes, die in de meeste organismen voorkomen, reguleren de tijdelijke organisatie van biologische processen. 3D-organoïden zijn onlangs naar voren gekomen als een fysiologisch relevant in vitromodel . Dit protocol beschrijft het gebruik van bioluminescente reporters om circadiane ritmes in organoïden te observeren, waardoor in vitro onderzoek naar circadiane ritmes in meercellige systemen mogelijk wordt.

Samenvatting

De meeste levende organismen bezitten circadiane ritmes, dit zijn biologische processen die binnen een periode van ongeveer 24 uur plaatsvinden en een divers repertoire van cellulaire en fysiologische processen reguleren, variërend van slaap-waakcycli tot metabolisme. Dit klokmechanisme voert het organisme mee op basis van veranderingen in de omgeving en coördineert de temporele regulatie van moleculaire en fysiologische gebeurtenissen. Eerder werd aangetoond dat autonome circadiane ritmes zelfs op het niveau van één cel worden gehandhaafd met behulp van cellijnen zoals NIH3T3-fibroblasten, die een belangrijke rol speelden bij het blootleggen van de mechanismen van circadiane ritmes. Deze cellijnen zijn echter homogene culturen zonder meercelligheid en robuuste intercellulaire communicatie. In het afgelopen decennium is uitgebreid gewerkt aan de ontwikkeling, karakterisering en toepassing van 3D-organoïden, dit zijn in vitro meercellige systemen die lijken op in vivo morfologische structuren en functies. Dit artikel beschrijft een protocol voor het detecteren van circadiane ritmes met behulp van een bioluminescente reporter in menselijke darmenteroïden, waarmee circadiane ritmes in vitro kunnen worden onderzocht.

Inleiding

Circadiane klok
Alle organismen, van bacteriën tot zoogdieren, hebben een complexe en dynamische relatie met hun omgeving. Binnen deze relatie is aanpassing aan veranderingen in het milieu van cruciaal belang voor het voortbestaan van organismen. De meeste organismen hebben circadiane ritmes die hen in staat stellen zich aan te passen en hun functies te optimaliseren voor dagelijkse cycli van ongeveer 24 uur. De circadiane klok is een hiërarchisch netwerk van centrale en perifere klokken die samenwerken om de fysiologische homeostase te handhaven en organismen gesynchroniseerd te houden met dagelijkse veranderingen 1,2. Bij zoogdieren ontvangt de centrale of hoofdklok in de suprachiasmatische kern (SCN) externe signalen, zoals licht, en verzendt de informatie naar de perifere klokken via een geavanceerd samenspel van neurale en humorale signaalroutes3. Naast de centrale klok bezitten perifere weefsels hun eigen celautonome circadiane klokmechanisme, dat wordt ondersteund door een transcriptie-translationele negatieve feedbacklus (TTFL) die weefselspecifieke klokgecontroleerde genen (CCG's) reguleert4,5. Deze moleculaire machinerie produceert ongeveer 24 uur ritmiek in cellulaire en fysiologische gebeurtenissen, zoals genexpressies, signaalroutes, immuunresponsen en spijsvertering. De circadiane klok is aanwezig in bijna alle zoogdiercellen en het is aangetoond dat tot 50% van de expressiepatronen van de genen circadiane ritmiek vertonen6. Gezien de overvloed aan CCG's kan verstoring van dit klokmechanisme leiden tot kritieke fysiologische problemen. Daarom is onderzoek naar circadiane ritmes nodig om essentiële biologische mechanismen op te helderen en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen.

Luciferase reporter systeem
In circadiane studies is real-time monitoring van cruciaal belang voor een beter begrip van cellulair gedrag en reacties, omdat het het mogelijk maakt om tijdelijke veranderingen in genexpressie en/of eiwitniveaus te volgen, waardoor inzicht wordt verkregen in de moleculaire mechanismen die worden gereguleerd door de circadiane klok. Bovendien stelt real-time monitoring onderzoekers in staat om de effecten van veranderingen in het milieu op moleculaire mechanismen te bestuderen 7,8. Er zijn tal van technieken voor real-time monitoringstudies, waaronder bioluminescentie-assay, die veel wordt gebruikt om genexpressie of eiwitniveaus in de loop van de tijd te volgen. Bioluminescentietest is een methode om biologische processen te detecteren met behulp van lichtproductie als uitlezing. In deze test wordt een oxidatief enzym dat bioluminescentie produceert (bijv. luciferase) tijdelijk of stabiel getransfecteerd in cellen van belang, en de bioluminescentie-uitlezing wordt gemeten in de aanwezigheid van een substraat (bijv. luciferine) in de loop van de tijd. Het luciferase-enzym produceert bijvoorbeeld bioluminescentie door het substraat luciferine te oxideren in aanwezigheid van ATP9. Vanwege de korte halfwaardetijd, 3-4 uur10, is vuurvliegluciferase een krachtig hulpmiddel voor circadiane studies in termen van het bieden van real-time dynamische monitoring met minimale achtergrondruis 11,12,13. Voor het invoegen van DNA met een luciferase-gelabelde promotor of open leesframe (ORF) is het lentivirale genafgiftesysteem een betrouwbare methode die een hoge transductie-efficiëntie, stabiele integratie en lage immunogeniciteit biedt. Stabiele transductie van een bioluminescente reporter zorgt voor robuuste expressie in delende en niet-delende cellen, waardoor consistente gegevens worden gegenereerd voor circadiane studies14.

Organoïde als model
Traditionele onsterfelijke tweedimensionale cellijnen hebben een belangrijke rol gespeeld in biologische studies, variërend van het blootleggen van fundamentele moleculaire mechanismen van circadiane ritmes tot het screenen van geneesmiddelen. Ondanks het gemak van het gebruik van gehomogeniseerde cellijnen, missen ze meercellige structuren en intercellulaire interacties. Organoïden daarentegen zijn in vitro 3D meercellige "orgaanachtige" structuren die de orgaanstructuur in een schaal nabootsen door gelijkenis te vertonen met in vivo weefselarchitectuur en meercelligheid, inclusief stam-, voorloper- en gedifferentieerde celtypen15,16. Het bezit van zelforganisatie, meercelligheid en functionaliteitskenmerken maakt organoïden tot een opmerkelijk in vitro-model dat de cellulaire en fysiologische processen vertegenwoordigt die plaatsvinden in echte weefsels17. Verschillende soorten organoïden kunnen worden afgeleid van pluripotente stamcellen via gerichte differentiatie of volwassen stamcellen die worden geoogst uit verschillende organen, waaronder de dunne darm, hersenen, lever, longen en nieren18,19. Aangezien organoïde structuren een echte weefselachtige architectuur en functie bezitten met meercelligheid en dynamische cel-tot-celinteractie, zijn ze superieur aan gehomogeniseerde cellijnen voor het begrijpen van de cellulaire gebeurtenissen die zich voordoen in in vivo weefsels. Organoïden zijn ook gemakkelijk te manipuleren en kunnen onder gecontroleerde omstandigheden worden gekweekt, waardoor ze nuttig zijn voor circadiane studies20.

Het belangrijkste doel van dit werk is het introduceren van een real-time monitoringmethode met behulp van een bioluminescentietest die speciaal is afgestemd op het bestuderen van circadiane ritmes in meercellige 3D-organoïden. Real-time monitoring van cellulaire gebeurtenissen met behulp van een bioluminescentie-testtechniek is op grote schaal uitgevoerd voor celculturen die niet de meercellige complexiteit en intercellulaire communicatie hebben die in echte weefsels bestaan. 3D-organoïden bieden unieke mogelijkheden om de functies van circadiane ritmes in meercellige systemen in vitro te onderzoeken. Men zou bijvoorbeeld circadiane ritmes kunnen onderzoeken in de organoïden met veranderde celsamenstellingen of organoïden die zijn afgeleid van zieke weefsels van patiënten. Dit protocol maakt het gebruik van een bioluminescentietest mogelijk om verschillende aspecten van circadiane ritmes te onderzoeken in een meer fysiologisch relevant in vitro-model , organoïden, dat ons zal helpen de rol van circadiane ritmes in perifere organen beter te begrijpen.

Protocol

Alle experimenten met menselijke weefsels voor het genereren van HIE's werden goedgekeurd door een IRB bij CCHMC (IRB#2014-0427). Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen die in dit protocol worden gebruikt.

OPMERKING: Om de procedure die in dit protocol wordt beschreven te illustreren, hebben we Bmal1-luc menselijke darmenteroïden (HIE's) gebruikt. Deze enteroïden ondergingen een stabiele lentivirale transductie22 met het pABpuro-BluF reporter plasmide, dat de Bmal1-promotor bevat die is gefuseerd met luciferase, wat de activiteit van de Bmal1-promotor 21 aantoont.

1. Lentivirale transductie

  1. Voer de lentivirale transductie22 uit onder met stamcellen verrijkte omstandigheden voor HIE's. Zorg met name voor de vorming van sferoïden in HIE's binnen 3-4 dagen na passage in de darmgroeimedia, waardoor met stamcellen verrijkte omstandigheden ontstaan.
  2. Voer na de lentivirale transductie22 antibioticaselectie uit met 2 μg/ml puromycine, herstel de puromycine-resistente HIE's en passeer ze met een relatief hoge dichtheid (d.w.z. 1 putje in 2 putjes) gedurende 2-3x. Als de groeisnelheid van de HIE's traag is, voeg dan 10 μM ROCK-remmers (Y-27632) en 10 μM GSK-3-remmer (CHIR-99021) toe aan het intestinale organoïde groeimedium.

2. Bereiding van organoïden voor bioluminescentietest

  1. Dag 1: Passage HIE's naar ronde schalen van 35 mm.
    1. In het kort, voor uitbreiding van HIE's, mengt u de HIE's met groeifactor-gereduceerde (GFR) 3D-cultuurmatrix en zaait u ze op platen met 24 putjes met drie druppeltjes van 10 μL 3D-kweekmatrix per putje. Voeg 350 μL van het HIE groeimedium toe en vervang dit om de dag.
      OPMERKING: De dichtheid van HIE in de 3D-cultuurmatrix is van cruciaal belang voor de groei van enteroïden. Ongeveer het aantal sferoïden moet meer dan 50 in elke druppel bedragen. Als het aantal laag is, wordt de groeisnelheid van de HIE negatief beïnvloed.
    2. Wanneer HIE's voldoende groeien (ongeveer 7 dagen na de post-passage), verzamel dan HIE's uit vier putjes in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
    3. Was de HIE's met de koude PBS met behulp van een tafelmodel minicentrifuge (2.000 × g) gedurende 40 s snel centrifugeren om vuil en overmatige 3D-cultuurmatrix te verwijderen met een pipet.
    4. Voeg 0,5 ml van de koude PBS toe aan de pellet en pas fysieke turbulentie toe door tot 10x te spuiten met een insulinespuit van 1 ml om de HIE's te dissociëren.
    5. Draai de gedissocieerde HIE's rond met een tafelmodel minicentrifuge zoals in stap 2.1.3 en verwijder het supernatans voorzichtig met een pipet. Plaats vervolgens de microcentrifugebuis met de HIE-pellet op ijs om ongeveer 3 minuten af te koelen.
    6. Voeg de GFR 3D-cultuurmatrix toe aan de microcentrifugebuis en meng deze met de HIE-pellet.
      OPMERKING: Bereken de hoeveelheid van de 3D-cultuurmatrix op basis van het aantal ronde schalen van 35 mm dat voor het experiment zal worden gebruikt. Over het algemeen zaaien we 30 μL 3D-cultuurmatrixdruppels per ronde schaal.
    7. Zaai het mengsel van HIE's en de 3D-cultuurmatrix op het midden van de ronde schaal van 35 mm en broed de schaal 20 minuten uit bij 37 °C om de 3D-cultuurmatrix te laten stollen.
      OPMERKING: De dichtheid van het zaaien van HIE's moet experimenteel worden bepaald. Op basis van de intensiteit van de bioluminescentie kan men het aantal HIE's tijdens dit proces bepalen.
    8. Voeg 2 ml voorverwarmd darmorganoïde groeimedium toe aan elk gerecht en broed de schalen uit in een CO2 -incubator tot de volgende stap.
  2. Dag 3: Initiatie van differentiatie
    1. Om de differentiatie van de HIE's op gang te brengen, verwijdert u het groeimedium en voegt u 2 ml voorverwarmd differentiatiemedium toe.
      OPMERKING: Zie Tabel 1 voor de recepten van de HIE-differentiatiemedia23.
  3. Dag 4: Er is geen extra proces vereist.
  4. Dag 5: Vervang het medium van de enteroïden door 2 ml voorverwarmd differentiatiemedium.
  5. Dag 6: Kloksynchronisatie en registratie van bioluminescentie
    1. Om de moleculaire klok van enteroïden te synchroniseren, voegt u 2 μL 100 μM dexamethason (Dex) toe om de uiteindelijke concentratie 100 nM in elk gerecht te maken en incubeert u de gerechten vervolgens in een CO2 -incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 1 uur24.
    2. Bereid tijdens het resetten van Dex de incuberende luminometer voor. Controleer de CO2 en temperatuur van de incuberende luminometer en stel deze in op respectievelijk 5% en 37 °C.
      NOTITIE: Het wordt aanbevolen om de binnenkant van de incuberende luminometer voor en na elk gebruik van de machine af te vegen met 70% alcohol om deze steriel te houden.
    3. Na de kloksynchronisatie vult u de enteroïden aan met 3 ml voorverwarmd differentiatiemedium dat 200 μM D-luciferine bevat.
      OPMERKING: Omdat luciferine lichtgevoelig is, moet het luciferinehoudende medium in folie worden gewikkeld en worden voorverwarmd in een warmtebad van 37 °C voordat het op het gerecht wordt aangebracht.
    4. Plaats de schalen in een 8-wells schoteltafel van de incuberende luminometer en bedek de monsterschoteltafel met het deksel. Plaats twee bevochtigingskamers met een nat doekje of spons op de bovenkant van de monsterschaaltafel. Dit is een eenmalig proces.
      OPMERKING: Nadat het experiment is gestart, moet het deksel van de incuberende luminometer gesloten blijven totdat het experiment is beëindigd. Zorg ervoor dat je de tissues/sponzen voldoende nat maakt.
    5. Sluit het deksel van de machine en start het programma om de bioluminescentie te meten voor het gewenste aantal dagen en de resolutie.
      1. Selecteer in de software de conditie-instellingen door op het tabblad Conditie te klikken en pas de instellingen op dit paneel aan: aantal gerechten, meettijd, achtergrondverwerking en filtertype.
        OPMERKING: Voor deze demonstratie hebben we alle gerechten van A tot H geselecteerd; standaard meettijd, die door de software wordt bepaald op basis van het aantal gerechten; wachttijd voor achtergrondverwerking en filtertype F0. Omdat er drie filteropties zijn, kunnen drie lichtgevende kleuren tegelijkertijd worden gemeten.
      2. Nadat u alle geschikte instellingen op basis van het experiment hebt ingevoerd, slaat u de instellingen op door op OK te klikken.
      3. Als u het experiment wilt uitvoeren, klikt u op het tabblad Uitvoeren | Startknop (pictogram met groene driehoek). Bekijk de gegevens als ruw, gefilterd door ruis of detrend door de juiste selecties te maken boven aan het scherm van de software tijdens het uitvoeren van experimenten. Klik op de tabbladen Raw, Noise Filtered of Detrended om de geselecteerde gegevens te bekijken.
      4. Observeer signalen tot 5 dagen.
        OPMERKING: Na 5 dagen monitoring in een incuberende luminometer kunnen enteroïden beginnen af te sterven als gevolg van uitputting van de media. Om elke mogelijke circadiane verstoring tijdens het experiment te voorkomen, voeren we tijdens het experiment geen mediawissel uit.
      5. Aan het einde van het experiment stopt u de uitvoering door op de knop Stoppen (blauw vierkant pictogram) te klikken, naar het tabblad Bestand te gaan en op Opslaan als te klikken. Sla de gegevens op in het Kronos-formaat; exporteer de gegevens naar een spreadsheet in de sectie Bestand door op de optie Bestand te klikken en vervolgens Exporteren als Excel-indeling te selecteren onder het bestand voor verdere analyse.

Resultaten

Bioluminescentie-opname werd uitgevoerd om de circadiane ritmiek van menselijke darmenteroïden (HIE's) te beoordelen onder twee verschillende omstandigheden: met stamcellen verrijkte omstandigheden met behulp van intestinaal organoïde groeimedium (Figuur 3) versus differentiatie-inducerende omstandigheden, wat werd bereikt door het intestinale organoïde groeimedium te vervangen door een differentiatiemedium. Op de dag van het experiment synchroniseerden we de circadiane klokken door een behandeling van 1 uur uit te voeren met 100 nM Dexamethason. Vervolgens vervingen we het medium door 3 ml intestinaal organoïde groeimedium of differentiatiemedium aangevuld met 200 μM D-Luciferine en startten we de monitoring van de bioluminescentie-activiteit. Na een opnameperiode van 4-5 dagen voerden we een Fast Fourier Transform (FFT)-analyse uit om de periode van de waargenomen circadiane ritmes te bepalen. Figuur 3 toont de temporele dynamiek van de activiteit van de Bmal1-promotor in de bovengenoemde omstandigheden. Onder differentiërende omstandigheden vertoonde Bmal1-luc bioluminescentie robuuste circadiane oscillaties met een gemiddelde periodiciteit van 22,92 uur. Daarentegen vertoonden HIE's verstoorde circadiane ritmes in met stamcellen verrijkte omstandigheden (Figuur 3). Deze gegevens tonen aan dat HIE's in met stamcellen verrijkte omstandigheden geen robuuste circadiane oscillaties vertonen. Met andere woorden, men zou de impact van groeiomstandigheden met betrekking tot circadiane ritmes moeten beoordelen voordat circadiane klokafhankelijke functies in organoïden worden onderzocht.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische tekening van het protocol. HIE's worden op dag 1 in schaaltjes van 35 mm gepasseerd en tot dag 3 gekweekt met 2 ml groeimedium. Op de derde dag na passage wordt het medium vervangen door 2 ml voorverwarmd differentiatiemedium om de differentiatie van enteroïden op gang te brengen. De mediumverandering wordt herhaald met 2 ml voorverwarmd medium op dag 5 om uitputting van de voeding te voorkomen. Op dag 6 worden enteroïden gedurende 1 uur behandeld met 100 nM dexamethason voor circadiane kloksynchronisatie. Na een uur wordt het medium vervangen door 3 ml 200 μM D-luciferinehoudend medium en worden de schalen in de incubatieluminometer geïnstalleerd. Nadat de bioluminescentie-expressie gedurende 4-5 dagen is vastgelegd, wordt het experiment beëindigd en worden de gegenereerde gegevens geëxporteerd als spreadsheets voor verdere analyse. Afkorting: HIE = humaan intestinaal enteroïde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Een representatief beeld voor HIE's onder groeimedium. De foto is gemaakt door een breedveldmicroscoop met een 25x objectief. Schaal balk = 1 mm. Afkorting: HIE = humaan intestinaal enteroïde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Bioluminescentie-opnames van HIE's van met stamcellen verrijkte en differentiatieomstandigheden. (A) Ruwe en (B) trendmatige bioluminescentie-registratiegegevens van Bmal1-luc HIE's onder stamcelverrijkte (rood) en differentiatie- (zwart) omstandigheden. (C) Periode van Bmal1-luc-oscillaties in HIE's onder differentiatieomstandigheden. De periode wordt berekend met FFT-analyse; n = 3 voor Bmal1-luc HIE's onder stamcelverrijkte conditie en n = 4 voor Bmal1-luc HIE's onder differentiatieconditie. Foutbalken geven SD aan. Afkortingen: HIE = humaan intestinaal enteroïde; FFT = Snelle Fouriertransformatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Differentiatie Media Recepten
Naam van het reagensBedrijfCatalogusnummerEindconcentratieOpmerkingen
Geavanceerde DMEM/F12Levens Technologieën12634-028Voeg toe als laatste component. Als u media van 50 ml bereidt, vult u na het toevoegen van alle andere componenten de rest tot 50 ml met Advanced DMEM/F12 aan het einde.
83-01Sigma AldrichSML0788500 nM
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-0441x
Gastrin I MensSigma AldrichG9020 NL10 miljoen
GlutaMAXGibco350500611x
HEPESGibco1563008010 mM
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-0481x
N-acetyl-L-cysteïneSigma AldrichA91651 mM
NOGGIN Geconditioneerd Medium5%Gemaakt in het lab
Penicilline-StreptomycineGibco15140122100 E/ml
Recombinant muizen EGFPeproTech315-0950 ng/ml
R-SPONDIN Geconditioneerd Medium10%Gemaakt in het lab

Tabel 1: Samenstelling van HIE-differentiatiemedia23.

Discussie

Bioluminescentie-assay biedt verschillende voordelen voor het onderzoek naar circadiane ritmes, waarvoor gegevensverzameling nodig is van langdurige tijdverloopexperimenten. Ten eerste stelt het onderzoekers in staat om de genexpressie of het eiwit van belang te volgen terwijl cellen bewegen en zich vermenigvuldigen. Zonder onnodige aanpassingen te maken of de functies van de cellen te verstoren, kunnen geïnteresseerde cellulaire gebeurtenissen of genexpressie worden geregistreerd met behulp van bioluminescentie-uitlezing, wat betrouwbare real-time gegevens oplevert. Belangrijk is dat de bioluminescentietest minimale achtergrondruis genereert in vergelijking met fluorescentietests, omdat deze wordt uitgevoerd in constante duisternis25. Bovendien heeft de bioluminescentietest de voorkeur voor monitoring op lange termijn, omdat de continue excitatie voor fluorescentietest gedurende meerdere dagen hoge fototoxiciteit en fotobleking kan veroorzaken. Omdat er echter geen lichtopwinding is, geeft de bioluminescentietest een zwakker signaal dan fluorescentie-eiwitten26. De korte halfwaardetijd van luciferase maakt het wenselijk voor circadiane studies, en het kan verder worden verkort door extra destabiliserende sequenties toe te voegen12.

Ondanks dat ze verschillende voordelen bieden voor het monitoren van levende cellen, hebben bioluminescentietests enkele beperkingen. Hoewel de bioluminescentietest een robuuste uitlezing biedt voor temporele genexpressie of eiwitmonitoring van een populatie cellen, is de ruimtelijke resolutie beperkt, waardoor het minder haalbaar is voor experimenten die eiwitlokalisatiegegevens van afzonderlijke cellen verzamelen. Gezien de voor- en nadelen is de bioluminescentietest superieur aan andere methoden, vooral voor circadiane studies; Het biedt minder toxiciteit en een hoge gevoeligheid, waardoor het ideaal is voor langdurige monitoring.

Tijdens de experimentele voorbereidingsfase moet rekening worden gehouden met verschillende kritische factoren. In de eerste plaats is de implementatie van een geschikte selectiestrategie voor lentivirale transductie van cruciaal belang; in ons geval hebben we gedurende 2 weken 2 μg/ml puromycine-selectie uitgevoerd. Ontoereikende uitvoering van de selectie kan resulteren in onvoldoende aantallen enteroïden die het reporterplasmide herbergen, wat inconsistente luciferase-expressieniveaus oplevert. Een optimale zaaidichtheid is net zo belangrijk; Een te hoge dichtheid kan tijdens het experiment leiden tot voortijdige uitputting van voedingsstoffen, aangezien er geen mediumvervanging is na het starten van de bioluminescentieregistratie. Omgekeerd kan een lage dichtheid van HIE's leiden tot een verminderde bioluminescentie-output, waardoor de robuustheid van de uitlezing wordt beïnvloed. Het waarborgen van een geschikte omgeving voor enteroïden tijdens monitoring is van fundamenteel belang voor de betrouwbaarheid van experimentele resultaten. Het handhaven van optimale omstandigheden, waaronder CO2 -, temperatuur- en vochtigheidsniveaus, is van cruciaal belang voor het behoud van HIE's en bevordert de robuustheid van cellulaire processen in de enteroïden. Afwijkingen van de optimale temperatuur en CO2 -niveaus kunnen het cellulaire metabolisme en de signaalroutes beïnvloeden, waardoor het circadiane ritme mogelijk wordt beïnvloed. Een adequate luchtvochtigheid is net zo belangrijk, het voorkomen van uitdroging en het behouden van de structurele integriteit van enteroïden. Nauwgezette aandacht voor de omgevingsomstandigheden is dus van cruciaal belang voor de nauwkeurigheid van het experimentele model en de circadiane studies met enteroïden.

Kloksynchronisatie is essentieel voor circadiane studies, omdat het de interne circadiane klok van individuele cellen uitlijnt, zodat ze zich in een uniforme en gecoördineerde toestand bevinden. Deze synchronisatie is nodig voor nauwkeurige observatie en analyse van circadiane ritmiek op het niveau van een hele cultuur. In dit protocol voerden we kloksynchronisatie uit met 100 nM Dexamethason (Dex). Er kunnen enige zorgen zijn over het effect van Dex op de celstructuur of -functie. Eerder onderzoek suggereert dat corticosteroïden de epitheliale barrièrefunctie bij enteroïden verbeteren27. Het is echter belangrijk om te benadrukken dat dit fenotype wordt waargenomen na de behandeling van enteroïden met 10 μM prednisolon gedurende 12 uur. We verwachten dat een korte behandeling van 1 uur met dexamethason geen significante veranderingen zal veroorzaken met betrekking tot de structuur en functie van cellen in enteroïden.

Het monitoren van de bioluminescentie-activiteit van de organoïdecultuur in plaats van de homologe eencellige cultuur heeft unieke sterke punten. Ten eerste interageren meerdere celtypen met elkaar in een organoïdecultuur zoals in in vivo weefsel, terwijl een typische 2D-celcultuur geïnteresseerde genexpressie bewaakt in een soort geïsoleerde omgeving die bestaat uit een enkel celtype. Organoïdecultuur levert meer realistische resultaten op met meercellige interacties en signaalroutes. Cel-tot-cel interactie is van cruciaal belang, vooral voor de differentiatie en intercellulaire pathway-studies, die heterogene celkweek vereisen28. Onze resultaten geven aan dat HIE's in de gedifferentieerde toestand robuuste circadiane oscillaties vertonen, maar verstoorde circadiane ritmes in de met stamcellen verrijkte toestand. Deze gegevens suggereren een mogelijke hermodellering van circadiane klokmachines van volwassen stamcellen naar gedifferentieerde cellen. Samenvattend maken organoïden met een circadiane bioluminescente reporter onderzoek mogelijk naar circadiane ritmes in een meercellig in vitro-systeem , waarbij functies van circadiane ritmes op een meer fysiologisch relevante manier worden blootgelegd.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

De menselijke darmenteroïden werden verkregen uit het laboratorium van Dr. Michael Helmrath in het Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Dit werk werd ondersteund door R01 DK11005 (CIH) en de Pilot Funding van het University of Cincinnati Cancer Center. We zijn dankbaar voor de beeldvormingsondersteuning van de University of Cincinnati Live Microscopy Core (NIH S10OD030402).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35 x 10 Falcon tissue culture dishesFisher Scientific08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin SyringesFisher Scientific14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122GSK-3 inhibitor
DexamethasoneSigma AldrichD4902-500MG
D-Luciferin (kaliumzout)Cayman Chemical14681
Gastrin I HumanSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
Growth Factor reduced (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stemcell Technologies06010Bestaat uit IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL en Organoid Supplement, 50 mL. Meng beide in een 1:1-verhouding om als darmorganoidgroeimedium te gebruiken
Kronos Dio Luminometer MachineATTO CorporationAB-2550
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
N-Acetyl-L-cysteïneSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF reporter plasmidAddgene46824
PBS zonder calcium en magnesiumCorning21-040-CV
Penicilline-StreptomycineGibco15140122
Recombinant muur EGFPeproTech315-09
Y-27632R&D Systems1254/10ROCK-remmer

Referenties

  1. Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
  2. Ayyar, V. S., Sukumaran, S. Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions. J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).
  3. Reppert, S., Weaver, D. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  4. Takahashi, J. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).
  5. Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. Cell Rep. 42 (1), 111982(2023).
  6. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Trans Med. 10 (458), 8806(2018).
  7. Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions. STAR Protoc. 2 (2), 100416(2021).
  8. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).
  9. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).
  10. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).
  11. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters. J Vis Exp. (67), e4234(2012).
  12. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  13. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  14. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  15. Lee, S., Hong, C. I. Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments. Front Genet. 13, 874288(2022).
  16. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  17. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Rosselot, A. E., et al. Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids. EMBO J. 41 (2), 106973(2021).
  20. Corrò, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).
  21. Brown, S. A., et al. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLos Biol. 3 (10), e338(2005).
  22. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. J Vis Exp. (98), e52531(2015).
  23. Criss, Z. K., et al. Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids. Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).
  24. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput Biol. 2 (10), e136(2006).
  25. Hara-Miyauchi, C., et al. Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior. Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).
  26. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
  27. Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease. J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).
  28. AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment. Clin Transll Med. 11 (2), 308(2021).

Herprints en machtigingen

Tags

Circadiaanse ritmesmenselijke intestinale enteroidenorgano dmodelstamceldifferentiatiesynchronisatie van de moleculaire klok3D cultuurmatrixbioluminescentie assayFourier transformatieanalyse
Circadiane oscillaties monitoren met een bioluminescentiereporter in organoïden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.