Op afstand geactiveerde LAD-occlusie met behulp van een ballonkatheter bij spontaan ademende muizen

Samenvatting

Dit artikel presenteert een unieke techniek met gesloten borstkas voor het induceren van myocardischemie-reperfusieletsel (IRI) bij muizen. De gepresenteerde methode stelt muizen in staat om spontaan te ademen terwijl ze op afstand myocardischemie induceren. Dit biedt toegang tot het dier voor het bestuderen van de dynamische processen van ischemie en reperfusie in situ en in real-time via niet-invasieve beeldvorming.

Samenvatting

Acuut myocardinfarct (AMI) is een veel voorkomende cardiovasculaire aandoening met een hoge mortaliteit. Ondanks de vooruitgang in revascularisatiestrategieën voor AMI, leidt het vaak tot myocardischemie-reperfusieletsel (IRI), waardoor hartschade wordt versterkt. Muizenmodellen dienen als essentiële hulpmiddelen voor het onderzoeken van zowel acuut letsel als chronische myocardiale remodellering in vivo. Deze studie presenteert een unieke techniek met gesloten borstkas voor het op afstand induceren van myocardiale IRI bij muizen, waardoor de zeer vroege fase van occlusie en reperfusie kan worden onderzocht met behulp van in-vivo beeldvorming zoals MRI of PET. Het protocol maakt gebruik van een occlusiemethode op afstand, waardoor nauwkeurige controle mogelijk is over de initiatie van ischemie na sluiting van de borstkas. Het vermindert chirurgisch trauma, maakt spontane ademhaling mogelijk en verbetert de experimentele consistentie. Wat deze techniek onderscheidt, is het potentieel voor gelijktijdige niet-invasieve beeldvorming, inclusief echografie en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), tijdens occlusie- en reperfusie-evenementen. Het biedt een unieke kans om weefselreacties in bijna realtime te analyseren, waardoor cruciale inzichten worden verkregen in processen tijdens ischemie en reperfusie. Deze innovatieve aanpak werd uitgebreid systematisch getest, waarbij cardiale necrosemarkers voor infarct werden gemeten, het risicogebied werd beoordeeld met behulp van contrastversterkte MRI en kleurinfarcten in het stadium van de littekenrijping. Door middel van deze onderzoeken werd de nadruk gelegd op de waarde van het voorgestelde hulpmiddel bij het bevorderen van onderzoeksbenaderingen van myocardischemie-reperfusieschade en het versnellen van de ontwikkeling van gerichte interventies. Voorlopige bevindingen die de haalbaarheid aantonen van het combineren van het voorgestelde innovatieve experimentele protocol met niet-invasieve beeldvormingstechnieken worden hierin gepresenteerd. Deze eerste resultaten benadrukken het voordeel van het gebruik van de speciaal gebouwde dierenwieg om op afstand myocardischemie te induceren en tegelijkertijd MRI-scans uit te voeren.

Inleiding

Acuut myocardinfarct (AMI), een veel voorkomende wereldwijde cardiovasculaire aandoening, wordt in verband gebracht met hoge sterftecijfers en morbiditeit¹. Ondanks technologische vooruitgang die vroege en effectieve revascularisatiestrategieën voor AMI-patiënten mogelijk maakte, ervaren patiënten na deze interventies nog steeds myocardischemie-reperfusieletsel (IRI)². Daarom is het van cruciaal belang om de fundamentele mechanismen te begrijpen en benaderingen te formuleren om IRI te verminderen. IRI vertegenwoordigt een complexe pathofysiologische toestand waarbij een veelheid aan ingewikkelde biologische processen betrokken is. Deze omvatten gereguleerde celdood, oxidatieve stressreacties, ontsteking, wondgenezing, fibrose en ventriculaire remodellering. Diermodellen, zoals muizen, zijn van groot belang geweest voor IRI-onderzoek en worden op grote schaal gebruikt vanwege hun kosteneffectiviteit, snelle fokkerij en de rijkdom aan mechanistische informatie van transgene modellen³.

Dit protocol presenteert een innovatieve techniek om op afstand IRI te induceren bij spontaan ademende muizen met een gesloten borstkas, waardoor de menselijke pathologie beter wordt nagebootst. Occlusie op afstand werd bereikt door gebruik te maken van een ballonkatheter die op een afstand van het myocardium was geplaatst om de linker voorste dalende slagader (LAD) af te sluiten. Deze benadering biedt continue toegang tot het kloppende hart op de exacte momenten van occlusie en reperfusie, waardoor gelijktijdige beeldvormingsmodaliteiten mogelijk worden, waaronder echografie of magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). Deze niet-invasieve methoden kunnen cruciale inzichten verschaffen in weefselreacties voor, tijdens en na occlusie- en reperfusiegebeurtenissen.

Er bestaan verschillende chirurgische technieken om IRI te induceren in muizenmodellen. Chirurgisch trauma als gevolg van thoracotomie in open-borstmodellen van coronaire ligatie veroorzaakt een immuunrespons die invloed heeft op verschillende mechanismen die verband houden met ischemie en reperfusie. Activering van het aangeboren immuunsysteem heeft het potentieel om de omvang van een hartinfarct te beïnvloeden⁴. De voorgestelde aangepaste techniek biedt een mogelijke benadering voor het onderzoeken van myocardiale pre- en postconditionering en mogelijk het verminderen van de impact van de aangeboren immuunrespons op chirurgisch trauma in IRI-onderzoeken bij muizen door het tijdsbestek van de open thorax te minimaliseren tot maximaal 5 minuten. Bovendien kan de nieuw ontwikkelde techniek ook bijdragen aan het verminderen van de pro-inflammatoire gevolgen veroorzaakt door door beademing geïnduceerd longletsel^. De gecombineerde effecten van deze nieuwe gesloten borstmethode zouden echter verder diepgaand onderzoek vereisen.

Grondige validatie van de voorgestelde techniek werd uitgevoerd door deze te vergelijken met de traditionele methode, waarbij de LAD gedurende 30 minuten wordt blootgesteld door middel van chirurgische borstdissectie en ligatuur-geïnduceerde occlusie. De resultaten van beide technieken werden vergeleken, waaronder troponinemetingen die de grootte van het hartinfarct weerspiegelden, beoordelingen van het risicogebied met behulp van MRI met gadoliniumcontrastverbetering, histologische trifenyltetrazoliumchloride (TTC)-kleuring en de bepaling van de uiteindelijke littekengrootte via Sirius Red (SR) kleuring. De uitkomst toont de robuustheid en doeltreffendheid aan van de voorgestelde aanpak voor het bestuderen van ischemie-reperfusieschade in muizenmodellen.

Protocol

Dit dierprotocol is goedgekeurd door en is in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Ethische Commissie voor Dierproeven (ECD) van de Katholieke Universiteit Leuven. Al het beleid dat door de lokale ECD wordt ontwikkeld, volgt de regelgeving van de Europese Unie met betrekking tot het welzijn van proefdieren zoals vastgelegd in Richtlijn 2010/63/EU. Alle hieronder beschreven tests zijn uitgevoerd op mannelijke C57BL/6-muizen van 8-12 weken oud (lichaamsgewicht = 20-23 g). De acute experimenten vertegenwoordigen dieren die onmiddellijk na de operatie werden geofferd. De overlevingsexperimenten vertegenwoordigden een follow-up van vier weken, inclusief troponinemeting, MRI en SR-kleuring.

1. Anesthesie en endotracheale intubatie

1. Pre-anesthesiemedicatie toedienen met een mix van ketamine (7,5 mg/kg; Nimatek 100 mg/ml), xylazine (1 mg/kg; Rompun, 20 mg/ml) en acepromazine (0,1 mg/kg; Placivet, 10 mg/ml) (KXA) (zie materiaaltabel) met 0,9 % zoutoplossing verdunningsmiddel intraperitoneaal. Dit zorgt voor een vlottere en minder invasieve intubatie.
2. Plaats de muis in een inductiekamer (zie Materiaaltabel) en roep anesthesie op met 2,5% isofluraan in zuivere zuurstof met een stroomsnelheid van 1 l/min tot verlies van rechtrichten en teenknijpreflex.
3. Leg het dier op een verwarmd kussen (±38 °C) en leg het op de rug met de kop naar de chirurg toe. Bevestig de staart en voorpoten met tape op het kussen. Zorg ervoor dat de voorste ledematen niet te ver worden uitgerekt, omdat dit de ademhaling in gevaar kan brengen.
4. Plaats een 2-0 zijden hechtdraad (zie Materiaaltabel) rond de bovenste snijtanden en plak de hechting op de rand van het kussentje om de muis strak te trekken. Bevestig indien nodig een naaldhouder om de spanning op de hechtdraad te houden. Houd het dier verdoofd met 2% isofluraan in 100% zuurstof met een debiet van 1 l/min met behulp van een neuskegel.
5. Plaats een lichtbron net rostraal van het borstbeen, verwijder de neuskegel en plaats de isofluraantoevoer op de ventilator. Intubeer de muis met een pincet door de tong omhoog te tillen en een zelfgemaakte laryngoscoop vast te houden om het basale deel van de tong verder op te tillen en de stembanden te visualiseren.
6. Plaats een zelfgemaakte tracheale tube met behulp van een katheter van 18 G op een botte naald tussen de stembanden. Beweeg de katheter omhoog, verwijder de botte naald en sluit de slang aan op de muisventilator (zie Materiaaltabel).
7. Gebruik een aangepaste Y-vormige connector (zie Materiaaltabel) om de intubatieslang op de ventilator aan te sluiten. De juiste positionering van de tracheale tube kan worden bevestigd door de symmetrische borstuitzetting te beoordelen.
8. Stel het ademvolume (ml) in op lichaamsgewicht (BW) (g) x 7 en de ventilatiesnelheid op 53,5 x (BW (g)^-0,26) slagen per minuut en pas het^{indien nodig aan} het lichaamsgewicht van een bepaalde muis aan 6 (bijv. voor een muis van 25 g is het teugvolume 175 ml bij 140 slagen per minuut).
9. Verminder de isofluraan tot 1% in 100% zuurstof, omdat het dier door de premedicatie verdoofd blijft. Beoordeel echter regelmatig de diepte van de anesthesie door een teenknijp uit te voeren. Pas de isofluraanconcentratie aan op basis van de diepte van de anesthesie.
10. Breng een druppel oogzalf aan om uitdroging onder narcose te voorkomen.

2. Installatie van de IRI-tool

NOTITIE: Verwijder alle tape en plaats het dier op de basisplaat van het speciaal gebouwde IRI-gereedschap. Details over de eigenschappen van de IRI-tool worden vermeld in aanvullend bestand 1.

1. Bevestig de basisplaat van het speciaal gebouwde IRI-gereedschap op afstand in een zijwaartse positie voor de chirurg. Bevestig de staart en poten met tape. Bevestig het hoofd met behulp van de 2-0 zijden hechtdraad rond de bovenste snijtanden om onbedoelde beweging te voorkomen (Figuur 1).
2. Plaats de rectale thermische sonde (zie Materiaaltabel) om de lichaamstemperatuur te controleren en gebruik een infrarood verwarmingslamp boven het dier om de temperatuur rond de 37 °C te houden. Let op voldoende afstand tussen het dier en de lamp om oververhitting te voorkomen.
3. Plaats de ECG-naaldelektroden in alle vier de poten om de hartslag en ECG-golfvorm te observeren en vast te leggen. Bevestig de rectale sonde en ECG-elektroden met tape aan het platform.
4. Breng ontharingscrème aan op de linkerkant van de thorax om haar te verwijderen en een helder operatieveld te creëren.
   OPMERKING: Beperk de inwerktijd en besteed aandacht aan de volledige verwijdering van de crème om chemische brandwonden te voorkomen.

3. Thoracotomie

1. Voer een aseptische voorbereiding van de huid uit met behulp van Betadine Solution, plaats daarna een chirurgisch laken op de linker thorax om een steriele omgeving te garanderen. Gebruik gesteriliseerde apparatuur om de procedure uit te voeren. Maak een verticale incisie in de huid in het midden van de borstspier, ongeveer 1 cm lang en 2 mm verwijderd van de linker borstrand.
2. Spuug de borstspier uit om de ribben eronder bloot te leggen. Voorkom onbedoeld letsel aan het vaartuig. Als er een bloeding optreedt, gebruik dan katoenen applicators om het bloeden te stoppen.
3. Visualiseer de ribben en identificeer de intercostale ruimtes door de opblazende long door de dunne, semi-transparante borstwand te observeren. Open de borstholte met een chirurgische schaar door een incisie van 6-8 mm te maken in de derde intercostale ruimte. Zorg ervoor dat de incisie zich minimaal 2 mm van de borstrand bevindt waar de interne thoracale slagader zich bevindt.
4. Plaats een klein speculum voor rattenogen (zie Tabel met materialen) in de intercostale ruimte. Deze zal fungeren als een rib-retractor (Figuur 1A).
5. Til het hartzakje voorzichtig op met een gebogen pincet en trek het uit elkaar.
6. Leg een klein stukje katoen op de long en duw het voorzichtig naar beneden.

4. LAD voorbereiding

1. De LAD ziet er helderrood uit en loopt van de aorta onder de linker oorschelp naar de apex. De ideale positionering voor de ligatuur is ongeveer 2 mm lager dan de punt van de linker oorschelp. Gebruik de longstam als markering om de linker oorschelp te identificeren en de LAD-visualisatie te optimaliseren met behulp van lichtinstroom (Figuur 2).
2. Gebruik een taps toelopende naald om een 7-0 polypropyleen hechting rond de LAD te halen. Plaats de naald niet te diep, omdat deze de linker ventrikel kan binnendringen, en ook niet te ondiep, omdat dit de LAD kan beschadigen.
3. Verwijder het kleine stukje katoen en controleer of de linkerlong nog geventileerd is.
4. Verwijder de riboprolmechanisme.
5. Zorg ervoor dat de hechting aan beide uiteinden een minimale lengte van 15 cm heeft. Knip de naald af.
6. Plaats een stuk PE-50 slang van 1 mm over een stuk PE-10 slang van 15 mm (zie Materiaaltabel). Leid beide uiteinden van de hechtdraad door de PE-10-slang en schuif de PE-slang met het dikkere uiteinde tegen het hart.

5. Borstsluiting en extubatie

1. Breng wat fusidinezuurgel aan op de open tussenribruimte en laat de resterende intrathoracale lucht voorzichtig ontsnappen door de uitstroom van het beademingsapparaat kort te belemmeren. Extra fusidinezuurgel kan aan het externe deel van de PE-buis worden toegevoegd om te voorkomen dat er lucht in de thorax komt.
2. Sluit de borstspier met een 5-0 polypropyleen X-steek boven en onder het niveau van de PE-buis en zorg ervoor dat het verdikte deel van de PE-buis zich onder het niveau van de spier bevindt.
3. Sluit de huid met twee 5-0 polypropyleen X-steken boven en twee onder de PE-buis (Figuur 1B en Figuur 3).
4. Met een gesloten borstkas kan het dier weer spontaan ademen. Speen het dier van de ventilator door het ademvolume en de ademhalingsfrequentie langzaam te verminderen. Wanneer het dier begint te ademen, koppelt u spontaan voorzichtig de ventilatorbuis los, maar houdt u deze op zijn plaats totdat een stabiel ademhalingspatroon wordt waargenomen.
5. Sluit de isofluraanvoeding aan op een neuskegel die over de neus van het dier wordt geplaatst en op de grondplaat wordt bevestigd.

6. Montage van het IR-gereedschap op afstand

1. Plaats het verticale zijdeel in de grondplaat door het in de sleuven te steken.
2. Gebruik een fijne haak om de twee hechtdraaduiteinden op te halen en trek ze door het centrale gat in het zijgedeelte achter de ballon (zie Materiaaltabel).
3. Leid een van de uiteinden van de hechtingen boven en rond de ballon. Ga verder met het andere hechtdraaduiteinde onder en rond de ballon. Breng fusidinezuurgel aan voor een soepelere geleiding van de hechtdraad.
4. Leid de hechtdraaduiteinden door de sleuven aan de bovenkant van het zijdeel. Breng op het distale deel van de hechtdraad een gewicht van 2,1 g aan om elk uiteinde van de hechting op zijn plaats te houden (Figuur 1C en Figuur 4).
   OPMERKING: De configuratie van de juiste gewichten kan worden gewijzigd en moet vooraf worden getest. Zie aanvullende figuur 1 en aanvullend bestand 1 voor details. Het ontwerp van de IRI-tool op afstand is weergegeven in aanvullende afbeelding 2.

7. Inductie van ischemie en reperfusie

1. Ischemie induceren door de ballon onmiddellijk op te blazen met behulp van de vasculaire ballonpomp tot 2 bar. Vergrendel de pomp. Controleer visueel of de ballon is opgeblazen en de gewichten zijn opgetild (Figuur 4).
2. Bevestig de ischemie door de verandering in het ECG-spoor te observeren.
3. Laat de ballon opgeblazen gedurende de ingestelde tijd volgens het specifieke onderzoeksprotocol (30 minuten in de gepresenteerde experimenten).
4. Stop de occlusie door simpelweg de pomp te ontgrendelen. Laat de ballon voorzichtig leeglopen. Controleer visueel of de ballon is leeggelopen en de gewichten zijn neergelaten.

8. Demontage van het IR-gereedschap op afstand

1. Knip de hechtdraad en buis tussen het dier en het zijdeel door en verwijder voorzichtig het zijdeel.
2. Breng fusidinezuurgel aan op de inbrengplaats van de slang in de thorax. Gebruik een gebogen pincet om de huid voorzichtig tegen de buis te duwen en gebruik een andere tang om de buis eruit te halen. Knip eventuele resterende hechting dicht bij de huid af.
3. Plaats een extra hechting van 5-0 polypropyleen om de uitgangsplaats van de buis af te sluiten en het risico op het binnendringen van lucht in de thorax te minimaliseren.

9. Einde van narcose en herstel

1. Stop de toevoer van isofluraan en laat het dier wakker worden in een stille, warme en zuurstofrijke omgeving.
2. Controleer of de muis niet in ademnood verkeert door hem te observeren tot hij volledig hersteld is. Geef 0,3 ml steriele zoutoplossing (op lichaamstemperatuur) via intraperitoneale injectie om uitdroging te voorkomen.
3. Voor postoperatieve analgesie dient u een opioïde analgeticum (buprenorfine, 0,1 mg/kg) subcutaan toe voordat het dier ambulant is. Controleer de muizen elke 4-6 uur gedurende de volgende 24-48 uur wanneer buprenorfine wordt verstrekt om er zeker van te zijn dat de muizen reageren op pijnstillers en om te bepalen of aanvullende pijnstillers nodig zijn. Aanvullende ondersteuning moet bestaan uit een standaard aanbevolen ondersteunende zorg, dieetgel of puree die postoperatief op de bodem van de kooi wordt geplaatst.

Resultaten

Validatie van het vermogen om ischemie te induceren is uitgevoerd door middel van vier tests: trifenyltetrazoliumchloride (TTC) en Sirius Red (SR) kleuring, cardiale troponine I-meting en late gadoliniumversterking (LGE) MR-beeldvorming. Statistische significantie werd geëvalueerd met behulp van de niet-parametrische Mann-Whitney-test, rekening houdend met de beperkte steekproefomvang. Statistische significantie werd toegeschreven aan p < 0,05.

Acute experimenten (TTC-kleuring, n = 15) hadden geen technische storing en alle dieren werden opgenomen. Deze acute experimenten omvatten onmiddellijke follow-upexperimenten (cardiale troponine I, LGE MRI, Sirius-roodkleuring, n = 12) en hadden een overlevingspercentage van 85% en 80% voor respectievelijk de externe en standaard occlusietechnieken gedurende een periode van 4 weken.

Kleuring van trifenyltetrazoliumchloride
TTC-kleuring (trifenyltetrazoliumchloride) in een muismodel van ischemie-reperfusieletsel in het hart meet macroscopisch het fenomeen van myocardiale levensvatbaarheid door het functieverlies van het dehydrogenase-enzym aan te tonen. Deze kleuringsmethode helpt onderscheid te maken tussen de delen van het hart die nog levensvatbaar (levend) zijn en de delen die niet-levensvatbaar zijn geworden als gevolg van ischemie. Het levensvatbare myocardium kleurt rood met TTC, terwijl het ischemische gebied bleek of ongekleurd blijft omdat het enzym dehydrogenase niet meer functioneel is. Dit levert cruciale informatie op over de omvang van weefselbeschadiging vroeg na het begin van ischemie. De kleuring werd uitgevoerd voor standaard IRI (n = 7) en remote IRI (n = 8) groepen onmiddellijk na 30 minuten ischemie. Figuur 5 toont representatieve gekleurde plakjes voor één dier, met weefselplakjes die van de basis naar de top lopen. De resultaten van TTC-kleuring worden weergegeven in figuur 6 en laten geen significant verschil zien tussen de twee IRI-technieken. TTC-kleuring werd uitgevoerd zoals beschreven door Fishbein et ^al.7.

Late gadoliniumversterking MRI
Om de omvang van het ischemische gebied niet-invasief te meten, werd LGE MRI 24 uur na occlusie gebruikt voor standaard IRI (n = 5) en remote IRI (n = 5) groepen. Gedetailleerde overnamedetails zijn te vinden in Aanvullend Dossier 1. Het risicogebied wordt gemeten als het % weefsel van de linkerventrikel in de drie meest apicale plakjes dat de drempelcriteria overschrijdt die zijn beschreven in aanvullend dossier 1. De grafische weergave in figuur 7 laat zien dat er geen significante verschillen werden waargenomen tussen de nieuw voorgestelde occlusietechniek op afstand en de conventionele 'open borst'-methode bij het beoordelen van het risicogebied.

Sirius Rood kleuring
Myocardinfarct, een gevolg van myocardischemie, vormt een ernstig probleem voor mensen met ischemie, omdat het resulteert in een vermindering van de contractiele massa van het hart, waardoor het vermogen om bloed efficiënt te pompen wordt aangetast. Figuur 8 legt de bevindingen verder uit door 4 weken na de occlusie Sirius Red-kleuring te gebruiken om de locatie van littekenvorming te bevestigen op basis van het risicogebied dat wordt afgebeeld door LGE MRI en om de omvang van het littekenweefsel te meten. De kleuring werd uitgevoerd voor standaard IRI (n = 5) en remote IRI (n = 5) groepen. Felrode gebieden markeren de necrotische kern van het infarct, terwijl de oranje delen het levensvatbare weefsel markeren. Ten slotte rapporteert Figuur 9 de uiteindelijke littekengroottes gemeten met behulp van Sirius Red-kleuring op beide technieken. De grootte van het litteken wordt berekend door de oppervlakte van het gekleurde infarct te delen door de totale oppervlakte van de vrije wand van de linkerventrikel in de apicale weefseldoorsnede met een dikte van 2,4 mm. De kleuring van Sirius Red werd uitgevoerd volgens Rittié⁸.

Cardiale troponine I
Naast beeldvormings- en kleuringstechnieken beoordeelde de studie ook hartschade met behulp van cardiaal troponine I als marker. Bloedmonsters werden 24 uur na de operatie verzameld voor standaard IRI (n = 8) en remote IRI (n = 8) groepen. Figuur 10 toont de cardiale troponine I-waarde en toont geen significante verschillen aan bij het vergelijken van de nieuwe techniek voor occlusie op afstand met de standaard IRI-techniek.

Als demonstratie van de haalbaarheid van het voorgestelde concept worden ook voorlopige resultaten verstrekt van het induceren van ischemie vanaf een afgelegen locatie met gelijktijdige niet-invasieve beeldvorming. Dit werd bereikt door gebruik te maken van de op maat gemaakte occlusietool op afstand, die in de MRI-dierenwieg werd geplaatst en in het midden van de MR-scanner werd geplaatst. De resultaten in figuur 11 tonen verschillen in beeldcontrast (helderheidsniveaus) tussen de infarct- en niet-infarctgebieden. ECG-spoor dat typische ST-elevatie laat zien als een marker die succesvolle occlusie van de LAD bevestigt terwijl het dier zich in de MR-scanner bevindt, wordt weergegeven in figuur 12B, terwijl figuur 12A het ECG-spoor vóór de occlusie toont.

Deze alomvattende benadering biedt een gedetailleerd inzicht in de effecten van de nieuw voorgestelde techniek voor occlusie op afstand op ischemie, necrose en hartbeschadiging in het experimentele model in vergelijking met de conventionele 'open borst'-methode.

Figuur 1: Representatieve beelden van de voorbereiding van het dier zoals beschreven in het protocol. (A) Thoracotomie met het inbrengen van de ribretractor. (B) Sluiting van de borstkas met een PE-10-buis die de thorax verlaat en de hechting rond de LAD geleidt. (C) Het dier in het gemonteerde IRI-gereedschap op afstand plaatsen. Let op de twee gewichten van 2.1 g die elk uiteinde van de hechtdraad vastklemmen en aan de zijkant van de IRI-wieg op afstand rusten. Het zijdeel wordt gepositioneerd en op zijn plaats gehouden door de uitsparingen in de grondplaat van het gereedschap. De vasculaire ballonkatheter is leeggelopen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Ex vivo visualisatie van de LAD (witte pijl) en de linker oorschelp (zwarte pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Schematische bovenaanzicht van de experimentele opstelling, ter illustratie van de positie van het instrument dat wordt gebruikt voor occlusie op afstand. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Schema ter illustratie van het gebruik van het hulpmiddel voor occlusie op afstand vanuit een zijaanzicht. (A) Vanaf het begin van de operatie wordt het dier op het onderste deel geplaatst. Na het sluiten van de kist wordt het zijdeel op zijn plaats geïnstalleerd. Op dit punt is de ballon nog steeds leeggelopen en rusten de gewichten op het onderste deel. (B) Het opblazen van de ballonkatheter zal de gewichten optillen (gemarkeerd met pijlen) en occlusie van de LAD veroorzaken met daaropvolgende ischemie van het myocardium. Succesvolle occlusie is te zien aan de veranderingen in het ECG-spoor. Door de ballon leeg te laten lopen, wordt de bloedstroom door de LAD hersteld. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve afbeeldingen van met trifenyltetrazoliumchloride (TTC) gekleurde hartschijfjes van muizen. Plakjes lopen van links naar rechts van de basis naar de top, beginnend in de bovenste rij. (A) Standaard IRI. (B) IRI op afstand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: TTC-kleuringsresultaten. TTC-kleuring werd 24 uur na occlusie uitgevoerd om de grootte van het infarct te meten. Datapunten worden gepresenteerd als gemiddelden met SEM van standaard IRI (n = 7) en remote IRI (n = 8) groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Late gadoliniumversterking MRI. Risicogebied 24 uur na occlusie zoals afgebakend op drie meest apicale plakjes (exclusief apex zelf) verkregen met LGE MRI. Datapunten worden gepresenteerd als gemiddelden met SEM van standaard IRI (n = 5) en remote IRI (n = 5) groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Validatie van het apparaat voor occlusie op afstand door MRI na de ischemie/reperfusieprocedure. Representatieve vergelijking tussen het risicogebied zoals afgebakend in de LGE MR-beelden 1 dag na occlusie en definitief littekenweefsel gekleurd met Sirius Red 4 weken na occlusie. (A-B) Plakjes met korte as van een dier met respectievelijk occlusie op afstand en op de bank. De pijl markeert het afgebakende risicogebied. (C-D) Histologische plakjes gekleurd met Sirius Red van dezelfde respectievelijke dieren bevestigen dat de uiteindelijke littekenvorming overeenkomt met de afbakening van het risicogebied met MRI 24 uur na occlusie. LV = linker ventrikel. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Resultaten van de kleuring van Sirius Rood. Sirius Red-kleuring werd 4 weken na occlusie uitgevoerd om de mate van littekenvorming te meten. Datapunten worden gepresenteerd als gemiddelden met SEM van standaard IRI (n = 5) en remote IRI (n = 5) groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Kwantificering van de cardiale troponine I-concentratie in muizenserum verkregen 24 uur na occlusie. Datapunten van cTnI worden gepresenteerd als gemiddelden met SEM van standaard IRI (n = 8) en remote IRI (n = 8) groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Voorlopige resultaten verkregen door gebruik te maken van de voorgestelde occlusietool op afstand in combinatie met gelijktijdige MRI-acquisitie worden getoond. Dezelfde middenventrikelschijf in de korte-asoriëntatie van één dier vóór, op het moment van en kort na de occlusie wordt gepresenteerd. Aan de linkerkant toont de representatieve afbeeldingsschijf de myocardiale grenzen aan het begin van het experiment (voordat IRI wordt geactiveerd). In het midden wordt dezelfde korte-as plak getoond na 30 minuten op afstand geïnduceerde ischemie. Mangaanchloride (MnCl) werd gebruikt als contrastmiddel om het (geel gemarkeerde) infarctgebied te markeren. De helderheid werd handmatig aangepast en verzadigd om de verschillende weefselregio's te markeren. Let op het helderheidsverschil tussen het septum en de laterale vrije wand (geel gemarkeerd). Aan de rechterkant, met dezelfde helderheidsinstellingen als voorheen, wordt dezelfde korte as segment weergegeven 20 minuten na occlusie (reperfusiefase). De pijl geeft het gebied aan met verhoogde helderheid in vergelijking met het tijdstip van occlusie, waarbij de opname van het contrastmiddel in de reperfusiefase en de krimp van het initiële hypo-intense gebied zoals afgebakend op het moment van occlusie wordt bepaald. LV = linker ventrikel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 12: ECG-spoor vastgelegd met behulp van het MRI-bewakingssysteem om het begin van ischemie te bevestigen. (A) Normaal ECG-spoor vastgelegd vóór de occlusie op afstand. (B) ECG-spoor dat net na het opblazen van de ballon bij hetzelfde dier is vastgelegd. De pijl geeft de hoogte aan in het ST-segment, dat doorgaans wordt beschouwd als een marker voor een succesvol begin van ischemie. Een toename van de hart- en ademhalingsfrequentie, naast een afname van de signaalamplitude, wordt ook waargenomen. Het dier wordt in het midden van de MR-scanner geplaatst tijdens de occlusie- en reperfusiefasen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende afbeelding 1: Configuratie van gewichten. Grafiek van alle gewichten in de functie van de verplaatsing van de dynamometer met behulp van het ballonafstandsbedieningssysteem (blauw) vs. Het originele katrolsysteem (oranje). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 2: Ontwerp van IRI-tool op afstand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Details over de eigenschappen van de IRI-tool en beeldacquisitie- en analysetechnieken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De nieuwe techniek voor teleocclusie die in deze studie is geïntroduceerd, biedt een uniek platform om onderzoek op het gebied van ischemie-reperfusieletselmodellering te bevorderen door de noodzaak van directe vaatmanipulatie tijdens de eerste operatie te vermijden en gelijktijdige multimodale beeldvorming van het vroeg geresterfeerde myocardium mogelijk te maken. Uitgebreide karakterisering, inclusief troponine-I-metingen, LGE-contrast-MRI, TTC en SR-kleuring, toont aan dat de voorgestelde techniek equivalent is aan de huidige gouden standaard (d.w.z. open borst LAD-ligatie)⁹.

De voorgestelde techniek heeft meerdere voordelen ten opzichte van de traditionele 'open' LAD-ligatiebenadering. In de eerste plaats verkort het de tijd van een open borstkas tijdens de operatie tot slechts 15 minuten, in tegenstelling tot de occlusietijd (30-60 minuten) plus de operatietijd (15 minuten) die nodig is bij de traditionele aanpak. Deze geminimaliseerde openhartoperatie kan weefselbeschadiging en ontsteking verminderen, maar moet verder worden onderzocht. Bovendien maakt vroege sluiting van de thoracotomie het spenen van de ventilator mogelijk, waardoor spontane ademhaling onder isofluraan mogelijk wordt tijdens ischemie-reperfusie-experimenten. Dit heeft het potentieel om door beademing geïnduceerd longletsel en bijbehorende ontsteking te verminderen, terwijl het ook een fysiologisch nauwkeurigere reactie op myocardischemie en reperfusie mogelijk^maakt10.

Bovendien biedt de techniek van occlusie op afstand verbeterde controle over de exacte timing van ischemie-inductie. Als proof of concept werden de haalbaarheid en voorlopige resultaten van het op afstand induceren en beheersen van myocardischemie aangetoond, terwijl het dier in het midden van de MR-scanner werd geplaatst. Het vermogen om ischemie nauwkeurig te initiëren na het sluiten van de borstkas, stelt onderzoekers in staat om therapeutische interventies of aanvullend onderzoek te timen en de ischemische belediging tussen experimentele proefpersonen te synchroniseren. Deze verhoogde controle kan leiden tot een nauwkeurigere en consistentere inductie van IRI, wat van cruciaal belang is voor mechanistische en therapeutische studies. Desalniettemin kan de marginale uitbreiding van de inhalatie van isofluraan tijdens de cardiale MRI-opstelling een beperking vormen voor deze studie. Langdurige blootstelling aan isofluraan kan namelijk aanvullende cardioprotectieve effecten hebben, zoals aangetoond in studies bij muizen, en zou verder onderzoek vereisen voor het voorgestelde model¹¹.

Variatie in de omvang van geïnduceerd letsel is een veel voorkomende uitdaging in IRI-modellen, vaak als gevolg van verschillen in chirurgische uitvoering of variabele anatomie¹². Belangrijk is dat een adequate training van de chirurg van invloed zal zijn op de sterftecijfers in dit model, naast andere erkende variabelen zoals LAD-plaatsing, experimentele duur, muizenstammen en genetische^{achtergronden13}. De keuze van anesthetica en pijnstillers kan ook de resultaten beïnvloeden. Uit ervaring blijkt dat dit model een algemeen sterftecijfer van bijna 15% vertoont. Het implementeren van rigoureuze pijnbestrijding en waakzame monitoring van dieren kan de sterfte nog verder verminderen.

Een van de overtuigende richtingen die door dit werk worden aangegeven, is de mogelijke toepassing van de techniek van occlusie op afstand bij het evalueren van therapeutische interventies in de vroege fasen van occlusie of reperfusie.

Concluderend betekent de techniek van occlusie op afstand een veelbelovende vooruitgang in IRI-modellering, waardoor mechanistische studies mogelijk worden verfijnd en gerichte therapieën worden versneld. Het vermogen om chirurgisch trauma te verminderen, de controle over de timing van ischemie te verbeteren en de experimentele consistentie te verbeteren, onderstreept het belang ervan. Door het aanpassingsvermogen van de techniek verder te onderzoeken, kunnen onderzoekers het volledige potentieel ervan ontsluiten en bijdragen aan een nauwkeuriger begrip van de vroege fasen van ischemie-inductie, reperfusie en de daarmee gepaard gaande ischemie-reperfusieschade. Ook kan het effect van verschillende behandelingsstrategieën nu tijdens deze beginfasen worden waargenomen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-0 zijdedraad	Sharpoint Products	DC-2515N
5-0 polypropyleendraad	Ethicon	8710H
7-0 polypropyleendraad	Ethicon	8206H
ACCLARENT Ballonnenblaasapparaat	Johnson&Johnson MedTech	BID30
Acepromazine	Kela
BD Vialon 18 G	BD	381347
BD Vialon 20 G	BD	381334
Betadine-oplossing	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprenorfine (Buprenex injecteerbaar)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Loodlood 2,1 g (loden visgewichten)	Visdeal.nl
Dumont #3 Pincet	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Pincet	Fine Science Tools	11251-30
Fijne schaar	Fine Science Tools	14040-10
Fucidine-gel	Leo Pharma
Isofluraan	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Muis/Rattenoogspreider	World Precision Instruments	501897
KD muis/rattenoogspreider	World Precision Instruments	501897
Ketamine	Dechra
Lichtbron	Zeiss	KL 1500 LCD
MRI-systeem	Bruker BioSpin, Ettlingen, Duitsland	BioSpec 70/30
Natriumchloride 0,9%	Baxter
Nachtelijke infrarood-warmtelamp	Zoo Med Laboratories, Inc.	RS-75
ParaVision-software	Bruker BioSpin	versie 6.0.1
polyethyleenbuis PE-10	SAI Infusion technologies	PE-10
polyethyleenbuis PE-50	SAI Infusion technologies	PE-50
extern IRI-gereedschap (PMMA)	zelfgemaakt
Rodent Surgical Monitor	Indus instruments
Segment v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Zelf-getriggerde gradiënt-echosequentie	Bruker BioSpin, Ettlingen, Duitsland	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Slanke verlengde naaldhouder	Fine Science Tools	12005-15
Sure-Seal Muis/Ratteninductiekamer	World Precision Instruments	EZ-178
Slangverbindingen, poly, Y-vorm	Westlab	072025-0001
Ultraverse 035 PTA-dilatatiekatheter: 5mm x 40mm, 17 ATM RBP-ballon op 130 cm lange katheter	Bard Peripheral Vascular, Inc.	00801741092671
Veet (ontharingscreme)	Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xylazin	Bayer