Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

MLH1 Genexpressie in perifeer bloed bij patiënten met darmkanker en hun associatie met darmkanker

977 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66387

⸱

27 september 2024

 ,  , 
1Oncology Department, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital, 2Department of Emergency, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie onderzoekt het verband tussen MLH1-genexpressie in perifeer bloed en darmkanker, waarbij gebruik wordt gemaakt van een case-control-benadering om expressieniveaus bij patiënten te vergelijken met gematchte gezonde controles.

Samenvatting

MutL-homoloog 1 (MLH1) is een component van het heterodimere complex MutLα dat mismatches tussen basen en basen en insertie-/deletielussen detecteert en repareert die worden veroorzaakt door verkeerde opname van nucleotide. Bij afwezigheid van MLH1-eiwit neemt de frequentie van niet-gerepareerde mismatches toe, wat resulteert in orgaankanker. De huidige studie probeerde MLH1-genexpressie en de relatie met tumorinvasie (T) en lymfeklierinvasie (N) te kwantificeren in bloedmonsters van patiënten met colorectale kanker (CRC). Er werden bloedmonsters genomen van 36 CRC-patiënten. RNA werd geëxtraheerd en cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van een kit. De primers werden gebouwd met behulp van de exon-exon-junctiebenadering en MLH1 - en β-actinegenen werden 3x getest met behulp van real-time polymerasekettingreactie (Real-Time PCR). Software voor genexpressie-analyse werd gebruikt om de gegevens te analyseren en een t-test werd gebruikt om de expressie van MLH1 en het verband met T- en N-variabelen te onderzoeken. In deze studie werden 36 patiënten met colorectale kanker geïncludeerd, waaronder 15 (41,6%) vrouwen en 21 (58,4%) mannen, met een gemiddelde leeftijd van 57,35 ± 4,22 jaar en in de leeftijdscategorie van 26-87 jaar. De resultaten toonden aan dat de verhouding van MLH1-genexpressie bij patiënten afnam in vergelijking met die bij gezonde personen, en dat de afname van genexpressie in verschillende stadia van de ziekte significant was. De resultaten van deze studie toonden aan dat de reductie van MLH1-genexpressie een effectieve rol speelt bij de ontwikkeling van CRC.

Inleiding

Darmkanker (CRC) is een van de meest voorkomende vormen van kanker. Het is wereldwijd de vierde belangrijkste doodsoorzaak door kanker1. CRC komt vaker voor bij mannen dan bij vrouwen, en het komt drie tot vier keer vaker voor in geïndustrialiseerde landen dan in ontwikkelingslanden. De leeftijdsgestandaardiseerde (wereldwijde) incidentie per 1 x 105 van CRC-incidentie is 19,7 bij beide geslachten, 23,6 bij mannen en 16,3 bij vrouwen2. Epidemiologische studies hebben sterke associaties met milieu en levensstijl met CRC aangetoond. Obesitas, rood/bewerkt vlees, tabak, alcohol, androgeendeprivatietherapie en cholecystectomie worden allemaal in verband gebracht met licht verhoogde CRC-risico's 2,3.

Chromosomale instabiliteit, microsatellietinstabiliteit en CpG-eilandmethylatorfenotype (CIMP) spelen een belangrijke rol bij het ontstaan van tumoren van CRC4. Volgens eerdere studies zijn ongeveer 250 verschillende mutaties geïdentificeerd bij patiënten met CRC, wat overeenkomt met ongeveer 55% van de bekende mutaties die verband houden met DNA-mismatch-reparatie (MMR)-genen. Defecten in mismatch-reparatie-eiwitten kunnen worden veroorzaakt door kiembaanmutaties in de MSH6-, MLH1-, PMS2- en MSH2-genen, en de meeste van deze mutaties worden aangetroffen in MLH1- en MSH2-genen 4,5. Het belangrijkste eiwit in het MMR-systeem, dat meestal betrokken is bij CRC, is MLH1. Recente studies hebben aangetoond dat elke verandering in MLH1-expressie het risico op CRC kan verhogen. Kiembaanmutaties in MLH1 zijn verantwoordelijk voor het syndroom van Lynch, een overgeërfd type CRC. Bovendien wordt 13%-15% van de gevallen van diffuse darmkanker veroorzaakt door MLH1-deficiëntie op basis van somatische promotorhypermethylering 6,7,8.

Het MLH1-gen bevindt zich op de korte arm van chromosoom 3 op positie 22.2 en bevat 21 exonen9. Het eiwit dat door het MLH1-gen wordt gecodeerd, kan samenwerken met een endonuclease dat betrokken is bij mismatch-reparatie, PMS2, om MutLα te genereren, dat deel uitmaakt van het MMR-systeem. MutLα is voornamelijk betrokken bij het herstel van base-base mismatches en deletie- en additielussen als gevolg van onvolledige DNA-replicatie. Bovendien is het gecodeerde eiwit betrokken bij de signalering van DNA-schade en kan het worden omgezet in de ɣMutL-vorm met het MLH3-eiwit, dat betrokken is bij DNA-mismatch-reparatie die wordt waargenomen bij meiose 10,11,12. Studies hebben aangetoond dat MLH1 betrokken is bij andere belangrijke cellulaire activiteiten, waaronder regulatie van controlepunten van de celcyclus, apoptose, crossover-recombinatie en mitotische incompatibiliteit13.

Het MLH1-gen speelt een sleutelrol in het DNA-mismatch-reparatiesysteem (MMR). Een defect in de functie van dit gen kan leiden tot de accumulatie van genetische mutaties en als gevolg daarvan de ontwikkeling van colorectale kanker14. Eerdere studies hebben aangetoond dat ongeveer 55% van de mutaties geassocieerd met MMR-genen bij patiënten met CRC gerelateerd zijn aan MLH1-genmutaties. Bovendien kan verminderde MLH1-genexpressie leiden tot het Lynch-syndroom, een erfelijke vorm van colorectale kanker15,16. Ook is MLH1-gendefect op basis van somatische promotorhypermethylering waargenomen bij 13%-15% van de sporadische gevallen van colorectale kanker17. Dit wetenschappelijke bewijs toont aan dat het MLH1-gen fungeert als een belangrijke biomarker bij colorectale kanker, en de expressieanalyse ervan kan waardevolle informatie opleveren over de functie van de BMR-route en het genetische risico van CRC18. Het meten van MLH1-expressieniveaus in het perifere bloed van patiënten met darmkanker kan waardevolle informatie opleveren over de functionaliteit van de BMR-route, die vaak verstoord is bij darmkanker. Deze methode kan worden gebruikt voor prognostische doeleinden en om genetische gevoeligheid voor darmkanker te begrijpen19,20. Een studie naar de relatie tussen MLH1 415 locus G naar C-mutatie en sporadische colorectale kanker bij Chinese patiënten wees uit dat de frequentie van het MLH1 C/C-genotype significant hoger was bij sporadische CRC-patiënten dan bij controles, wat wijst op een genetische gevoeligheid voor sporadische CRC bij Chinese patiënten21. Een andere studie vergeleek de genexpressie van CRC-genetische biomarkers in perifeer bloed en biopsiemonsters van patiënten met inflammatoire darmaandoeningen (IBD), waarbij het potentieel van genexpressieanalyse van perifeer bloed voor het begrijpen van darmkankergerelateerde biomarkers werd benadrukt22.

Gezien de belangrijke rol van het MLH1-gen en studies die de afgelopen decennia zijn uitgevoerd met moleculaire analyse door profilering van mRNA-expressie, zijn kankers met een hogere nauwkeurigheid geclassificeerd. Het doel van deze studie was om de expressie van MLH1 in perifere bloedmonsters van patiënten met CRC kwantitatief te onderzoeken met behulp van real-time PCR, en om de relatie met pathologische factoren, stadia van tumorprogressie naar de lagen van de darmwand (T) en stadia van invasie naar lymfeklieren (N) te onderzoeken. Deze studie werd uitgevoerd bij 36 CRC-patiënten om mogelijk kwantitatieve veranderingen in genexpressie vast te stellen als biomarkers voor CRC-screening, prognose en diagnose met behulp van perifere bloedmonsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Tussen april 2021 en mei 2023 is een case-control onderzoek uitgevoerd in het Affiliated Hospital 2 van Nantong University. Neem contact op met de administratieve afdeling van het ziekenhuis om het studiekader vast te stellen. Ethische goedkeuring werd verkregen door het studievoorstel in te dienen bij de ethische commissie van de Nantong University. Ethische richtlijnen werden gevolgd om vertrouwelijkheid en geïnformeerde toestemming te waarborgen.

1. Rekrutering van patiënten en opzet van de studie

  1. Bemonstering voor opname van deelnemers aan het onderzoek
    1. Onderzoek de expressie van het MLH1-gen in het perifere bloed van 36 personen met darmkanker en een controlegroep. Ontwikkel duidelijke in- en uitsluitingscriteria voor de selectie van deelnemers.
    2. Rekruteer personen bij wie specifieke soorten darmkanker zijn vastgesteld (rectosigmoïde, blindedarmkanker, stijgende, transversale en dalende darmkanker waarvan werd aangenomen dat ze colorectale tumoren hadden) en hebben geïnformeerde toestemming.
    3. Sluit personen uit met andere kankerdiagnoses of aandoeningen die genexpressieanalyse kunnen verwarren. Sluit bovendien deelnemers uit met een voorgeschiedenis van bloedtransfusie in de afgelopen 3 maanden, een voorgeschiedenis van chemotherapie of bestralingstherapie in de afgelopen 6 maanden, een voorgeschiedenis van alcohol- of drugsgebruik en een voorgeschiedenis van auto-immuunziekten of inflammatoire darmaandoeningen.
  2. Categoriseer klinische risicofactoren volgens het TNM-stadiëringssysteem (tumor, knooppunten en metastase), rekening houdend met kankermassa, tumorgrootte en invasie van aangrenzende organen23,24.
    1. Verdeel verschillende kankerstadia (0-4) op basis van beschikbare pathologiedossiergegevens.
    2. Segmenteer de snelheid van tumorgroei en -progressie in de darmwandlagen (T-index) in vier verschillende groepen (T1-4, T0-TX) en lymfeklierinvasie (N-index) in vier groepen (N1-3, N0-NX).
  3. Bereid een controlegroep voor met gezonde individuen.
    1. Koppel de controlegroep aan de patiëntengroep in termen van leeftijd en geslacht. Verzamel gedetailleerde demografische gegevens voor elke deelnemer om vergelijkbaarheid te garanderen.
  4. Proces voor geïnformeerde toestemming
    1. Bereid documenten voor geïnformeerde toestemming voor waarin het doel, de procedures en de mogelijke risico's van het onderzoek worden uitgelegd.
    2. Ga in gesprek met de deelnemers en geef hen voldoende tijd om vragen te stellen. Verzamel ondertekende formulieren voor geïnformeerde toestemming voordat u doorgaat met het verzamelen van monsters.

2. Extractie en zuivering van RNA

  1. Afname van perifere bloedmonsters
    1. Verkrijg in de handel verkrijgbare EDTA-gecoate buizen die zijn gecertificeerd voor klinisch of laboratoriumgebruik. Controleer de houdbaarheidsdatum van de tubes. Controleer de integriteit van de buisverpakking.
    2. Instrueer de deelnemer om comfortabel te zitten. Gebruik een steriele spuit om 5 ml bloed uit de antecubitale ader te zuigen. Zorg ervoor dat de deelnemer ontspannen is, met de arm gestrekt om de ader bloot te leggen. Breng de bloedmonsters onmiddellijk over in de voorbereide buisjes en zorg voor een minimale blootstelling aan lucht.
    3. Houd de monsters tijdens het transport naar het laboratorium op 4 °C om de RNA-integriteit te behouden.
  2. Gebruik een RNA-bloedminikit voor RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant.
    1. In het kort, lyseer rode bloedcellen door het volbloedmonster te incuberen met Buffer EL op ijs. Centrifugeer om de leukocyten te pelleteren en gooi de supernatant weg. Lyseer de leukocyten met Buffer RLT en homogeniseer het lysaat met behulp van een shredderkolom.
    2. Voeg ethanol toe aan het gehomogeniseerde lysaat en breng over naar een spinkolom. Was de kolom met Buffer RW1 en Buffer RPE. Elueer het gezuiverde RNA door RNase-vrij water aan de kolom toe te voegen en te centrifugeren.
  3. Beoordeling van de hoeveelheid en kwaliteit van RNA
    1. Kwantificering van RNA: Gebruik een spectrofotometer om de RNA-concentratie en zuiverheid te meten. Open de software op de aangesloten computer. Selecteer de optie Nucleïnezuur in het hoofdmenu. Breng 1 μL RNA-monster aan op het monstergebied.
    2. Test de zuiverheid en integriteit van RNA
      OPMERKING: De integriteit en grootteverdeling van het totale RNA dat is gezuiverd met de RNA-bloedminikit kan worden gecontroleerd door middel van spectrofotometrie en gelelektroforese. Ribosomale RNA's moeten verschijnen als scherpe banden of pieken. De schijnbare verhouding van 28S rRNA tot 18S rRNA zou ongeveer 2:1 moeten zijn. Als de ribosomale banden of pieken van een specifiek monster niet scherp zijn, maar verschijnen als een uitstrijkje naar kleinere RNA's; het is waarschijnlijk dat het monster vóór of tijdens de RNA-zuivering een grote degradatie heeft ondergaan.
      1. Voor spectrofotometriemeting laat u de arm van het apparaat zakken en klikt u op Meten om de A260/A280-verhouding te verkrijgen. Evalueer de zuiverheid van het RNA-monster, waarbij wordt gestreefd naar een A260/A280-verhouding tussen 1,8 en 2,0.
      2. Voer 1% agarosegelelektroforese uit zoals hieronder beschreven.
        1. Bereid de 1% agarose-oplossing voor door agarosepoeder in TAE-buffer te verwarmen tot het is opgelost. Voeg ethidiumbromide toe aan de agaroseoplossing om een uiteindelijke concentratie van 0,5 μg/ml te bereiken. Giet de agarose-ethidiumbromide-oplossing in een gelgietbakje en laat het stollen.
          OPMERKING: Ethidiumbromide is een fluorescerende kleurstof die intercaleert met RNA om visualisatie onder UV-licht mogelijk te maken.
        2. Meng de RNA-monsters met ladende kleurstof en laad ze voorzichtig in de putjes van de gestolde gel. Laat de gelelektroforese ongeveer 30 minuten op 100 V draaien om de RNA-fragmenten op grootte te scheiden. Visualiseer de RNA-banden door de gel op een UV-transilluminator of beeldvormingssysteem te plaatsen, waardoor het met ethidiumbromide gekleurde RNA fluoresceert.
  4. Opslag van geëxtraheerd RNA
    1. Neem de geëxtraheerde RNA-monsters. Aliquot het RNA in steriele microcentrifugebuisjes, met behulp van 10 μL volumes per aliquot. Bewaar de RNA-aliquots bij -80 °C of lager.
  5. Omgekeerde transcriptie van RNA in cDNA
    1. Volg het protocol van de reverse transcription kit. Ontdooi en bereid de benodigde reagentia op ijs en bij kamertemperatuur.
    2. Voer een genomische DNA-eliminatiereactie uit om eventuele genomische DNA-besmetting te verwijderen.
    3. Bereid de reverse transcription master mix on ice voor, die alle componenten bevat behalve het sjabloon-RNA.
    4. Voeg het sjabloon-RNA van de DNA-eliminatiestap toe aan de reverse transcription mastermix. Incubeer de omgekeerde transcriptiereactie bij 42 °C gedurende 15 minuten.
    5. Inactiveer het enzym reverse transcriptase door gedurende 3 minuten bij 95 °C te incuberen. Gebruik een hoeveelheid van het afgewerkte cDNA voor onmiddellijke real-time PCR of bewaar het cDNA bij -20 °C voor later gebruik.

3. Primerontwerp voor PCR in realtime

  1. Selectie van doelgenen en interne controles
    1. Kies het MLH1-gen als doelwit voor kwantificering vanwege de associatie met darmkanker. Selecteer β-actine als interne controle voor normalisatie van genexpressiegegevens.
  2. Primer ontwerpproces
    1. Start de primer-ontwerpsoftware en voer de gensequentie van MLH1 in die is verkregen uit de Ensemble- of UCSC-genoombrowser.
    2. Stel de smelttemperatuur (Tm) voor primers in op 58-60 °C, het optimale GC-gehalte op 40%-60% en de lengte van de primer op 18-24 nucleotiden.
    3. Voer de ontworpen primersequenties in de NCBI BLAST-database in om de specificiteit te bevestigen.
      1. Ga naar de BLAST-website, selecteer Nucleotide BLAST. Plak de primersequenties in het zoekvak en klik op BLAST.
      2. Analyseer de resultaten om ervoor te zorgen dat er geen off-target versterking wordt voorspeld. Zie tabel 1 voor details.

4. PCR in realtime

  1. Realtime PCR-reactie instellen. Zie tabel 2 voor meer informatie.
    1. Centrifugeer de reagentia gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 10.000 x g om de inhoud op de bodem van de buisjes op te vangen.
    2. Bereid een mastermix voor volgens het commerciële kitprotocol, dat de SYBR Green, buffer, dNTP's, MgCl2 en Taq-polymerase bevat.
    3. Wijs het mastermengsel toe aan gelabelde PCR-buisjes, waardoor consistentie in volume over de monsters wordt gegarandeerd.
    4. Voeg het juiste volume voorwaartse en achterwaartse primers voor MLH1 en β-actine toe aan hun respectievelijke tubes.
    5. Verdun de RNA-monsters tot een consistente concentratie van 100 ng/μL vóór reverse transcriptie en reverse transcriptie naar cDNA met behulp van een reverse transcriptiekit.
  2. Versterking en gegevensverzameling
    1. Plaats de PCR-buisjes in het real-time PCR-systeem.
    2. Programmeer de thermische cycler met de geoptimaliseerde cyclusomstandigheden: 95 °C gedurende 20 s voor denaturatie, 54 °C gedurende 30 s voor gloeien en 72 °C gedurende 30 s voor verlenging. Zie tabel 3 voor details.
    3. Stel de machine in op 45 cycli.
    4. Bewaak de reactie in realtime op de software-interface van het systeem en observeer de versterkingscurven voor elk monster.
    5. Voeg een negatieve controle zonder cDNA toe om te controleren op besmetting. Herhaal de PCR-run 3x voor elk monster om de betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen.
  3. Gegevensanalyse
    1. Gebruik na het voltooien van de cycli de software van het systeem om de drempelcycluswaarden (Ct) te analyseren. Exporteer de Ct-waarden naar een spreadsheetprogramma voor verdere analyse.
    2. Bereken de relatieve genexpressie met behulp van de 2-ΔΔCt-methode 25, waarbij de gegevens worden genormaliseerd naar de β-actinecontrole.

5. Immunohistochemie en genetische analyses

  1. Voer immunohistochemie uit op weefselsecties om MLH1-eiwitexpressie te correleren met genexpressieniveaus.
    1. Bereid weefselglaasjes voor en breng anti-MLH1-antilichamen aan.
    2. Gebruik een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam en DAB (3,3'-diaminobenzidine) substraatkit. Ontwikkel dia's volgens de instructies van de kit en analyseer ze met een lichtmicroscoop.
  2. Voer methylatiespecifieke PCR- en microsatellietinstabiliteitstests uit om onderscheid te maken tussen het Lynch-syndroom en sporadisch CRC.
    1. Gebruik een in de handel verkrijgbare DNA-extractiekit. Volg het kitprotocol voor zowel bloed als tumorweefsel.
    2. Behandel DNA met een bisulfietconversiekit. Gebruik methylatiespecifieke primers die zijn ontworpen voor het MLH1-promotorgebied. Voer PCR uit volgens het kitprotocol.
    3. Voer gelelektroforese uit op de PCR-producten om de methyleringsstatus te visualiseren.
    4. Voor het testen van microsatellietinstabiliteit (MSI), capillaire elektroforese met behulp van een genetische analysator. Vergelijk de lengtes van microsatellieten door fluorescerend gelabelde PCR-producten te analyseren.

6. Statistische analyse

  1. Gebruik commerciële statistische analysesoftware voor gegevensanalyse.
    1. Open de software en maak een nieuwe dataset voor genexpressie en demografische gegevens.
    2. Voer de relatieve genexpressiewaarden en bijbehorende demografische gegevens in de dataset in.
    3. Gebruik de Kolmogorov-Smirnov-test om de normaliteit van de gegevens te beoordelen.
      1. Selecteer Analyseren in het bovenste menu, kies Niet-parametrische tests en vervolgens Verouderde dialoogvensters.
      2. Klik op de Kolmogorov-Smirnov-test en voer de variabele voor genexpressie in. Voer de test uit en interpreteer de output voor het belang van de normaliteit van de verdeling.
    4. Voer T-tests uit om MLH1-genexpressie tussen patiënt- en controlegroepen te vergelijken.
      1. Selecteer Analyseren, vervolgens Gemiddelden vergelijken en kies Onafhankelijke monsters T-test.
      2. Wijs groepslidmaatschap (patiënt of controlegroep) toe als groepsvariabele en genexpressie als testvariabele. Voer de test uit en interpreteer het tweezijdige significantieniveau.
    5. Bereken vouwveranderingen in genexpressie met behulp van de 2-ΔΔCt-methode 25.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze studie werden 36 patiënten met darmkanker onderzocht op MLH1-genexpressie in het perifere bloed en de relatie met darmkanker. Analyse van demografische variabelen toonde aan dat 15 patiënten (41,6%) vrouwen waren en 21 patiënten (58,4%) mannen. De gemiddelde leeftijd van de patiënten was 57,35 ± 4,22 jaar en de leeftijdscategorie was 26-87 jaar. De body mass index (BMI)-status van de patiënten toonde aan dat 14 patiënten (38,8%) een normale BMI hadden (18,5 en 24,9 kg/m<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie werd uitgevoerd met als doel de expressie van het MLH1-gen te onderzoeken. In deze studie werd aangetoond dat het niveau van MLH1-genexpressie verlaagd was bij zieke mensen in vergelijking met gezonde mensen. Op basis van studies naar vouwverandering is aangetoond dat de expressie van het MLH1-gen in stadium II, stadium III en stadium IV bij zieke mensen in vergelijking met gezonde mensen een significante afname vertoonde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

We willen onze dankbaarheid en waardering uitspreken aan iedereen die ons heeft geholpen dit onderzoek te voltooien.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose Gel Electrophoresis EquipmentBio-RadMini-Sub Cell GT SystemsGebruikt om de RNA-kwaliteit te controleren
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE9884Gebruikt als anticoagulans voor bloedmonsters
NanoDropThermoFisher ScientificND-2000Spectrofotometer gebruikt om de RNA-zuiverheid te bepalen
Real-time PCR MachineApplied BiosystemsA34322Gebruikt voor RT-PCR reacties
RNA Extraction KitIntron Biotechnology Co#Cat 17061Gebruikt voor RNA-extractie uit bloedmonsters
SYBR Green PCR KitThermo Fisher Scientific4309155Reagentia gebruikt voor RT-PCR experimenten

Referenties

  1. Favoriti, P., et al. Worldwide burden of colorectal cancer: a review. Updates Surg. 68 (1), 7-11 (2016).
  2. Lotfollahzadeh, S., Recio-Boiles, A., Cagir, B. Colon cancer. StatPearls. , (2024).
  3. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Prz Gastroenterol. 14 (2), 89-103 (2019).
  4. Woischke, C., Michl, M., Neumann, J. Molecular pathology of colorectal cancer. Pathologie. 44 (5), 279-286 (2023).
  5. Lachit, K., Vinita, P. Study of mismatch repair protein expression by using immunohistochemistry in various carcinomas with special reference to colorectal adenocarcinomas-at a tertiary referral laboratory in India. Asian Pacific J Cancer Biol. 7 (4), 341-347 (2022).
  6. Cerretelli, G., Ager, A., Arends, M. J., Frayling, I. M. Molecular pathology of Lynch syndrome. J Pathol. 250 (5), 518-531 (2020).
  7. Tiwari, A. K., Roy, H. K., Lynch, H. T. Lynch syndrome in the 21st century: clinical perspectives. QJM. 109 (3), 151-158 (2016).
  8. Hinrichsen, I., et al. Reduced migration of MLH1 deficient colon cancer cells depends on SPTAN1. Mol Cancer. 13 (1), 1-12 (2014).
  9. Nissar, B., Shah, I. A., ul Afshan, F., Ganai, B. A. A decade in unravelling the etiology of gastric carcinogenesis in Kashmir, India - A high risk region. Gene Rep. 21 (1), 100832(2020).
  10. Reyes, G. X., Schmidt, T. T., Kolodner, R. D., Hombauer, H. New insights into the mechanism of DNA mismatch repair. Chromosoma. 124 (4), 443-462 (2015).
  11. Rogacheva, M. V., et al. Mlh1-Mlh3, a meiotic crossover and DNA mismatch repair factor, is a Msh2-Msh3-stimulated endonuclease. J Biol Chem. 289 (9), 5664-5673 (2014).
  12. Martin, S. A. The DNA mismatch repair pathway. DNA Repair Cancer Ther. , 151-177 (2016).
  13. Fukuhara, S., et al. DNA mismatch repair gene MLH1 induces apoptosis in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (22), 11297-11307 (2014).
  14. Boland, C. R., Goel, A., Patel, S. G. The genetic and epigenetic landscape of early-onset colorectal cancer. Colorectal Cancer. 9 (3), CRC23 (2020).
  15. Özdemir, Z., et al. Uncommon variants detected via hereditary cancer panel and suggestions for genetic counseling. Mutat Res. 827, 111831(2023).
  16. Sinicrope, F. A. Lynch syndrome-associated colorectal cancer. New Engl J Med. 379 (8), 764-773 (2018).
  17. Westwood, A., et al. Additional loss of MSH2 and MSH6 expression in sporadic deficient mismatch repair colorectal cancer due to MLH1 promoter hypermethylation. J Clin Pathol. 72 (6), 443-447 (2019).
  18. Chung, C. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in colorectal cancer: A 2021 update on current development, evidence, and recommendation. J Oncol Pharm Pract. 28 (4), 850-869 (2022).
  19. Yu, H., et al. The mRNA level of MLH1 in peripheral blood is a biomarker for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Cancer Res. 6 (5), 1135-1140 (2016).
  20. Kasprzak, A. Prognostic biomarkers of cell proliferation in colorectal cancer (CRC): From immunohistochemistry to molecular biology techniques. Cancers. 15 (18), 4570(2023).
  21. Tao, W., Xie, Y. Study on relationship between NILH1 gene 415 locus G→G mutation and sporadic colorectal cancer in Chinese patients. Chinese J Exp Surg. 26 (6), 752-754 (2009).
  22. Martinez, E. C., Zevallos-Delgado, C., Joseph, M. Analysis of the genetic expression of colon cancer genetic biomarkers on inflammatory bowel disease on blood and biopsy samples. Genomics Gene Func. 164, 4 Supplement S49(2023).
  23. Rahiminejad, S., Maurya, M. R., Mukund, K., Subramaniam, S. Modular and mechanistic changes across stages of colorectal cancer. BMC cancer. 22 (1), 436(2022).
  24. Alrushaid, N., Khan, F. A., Al-Suhaimi, E., Elaissari, A. Progress and perspectives in colon cancer pathology, diagnosis, and treatments. Diseases. 11 (4), 148(2023).
  25. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinfo Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  26. Jurescu, A., et al. Colorectal carcinomas: Searching for new histological parameters associated with lymph node metastases. Medicina. 59 (10), 1761(2023).
  27. Sawicki, T., et al. A review of colorectal cancer in terms of epidemiology, risk factors, development, symptoms and diagnosis. Cancers. 13 (9), 2025(2021).
  28. Cardoso, R., et al. Overall and stage-specific survival of patients with screen-detected colorectal cancer in European countries: A population-based study in 9 countries. Lancet Reg Health Eur. 21 (1), 100458(2022).
  29. Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M., Wallace, M. B. Colorectal cancer. Lancet. 394 (10207), 1467-1480 (2019).
  30. Hull, M. A., Rees, C. J., Sharp, L., Koo, S. A risk-stratified approach to colorectal cancer prevention and diagnosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (12), 773-780 (2020).
  31. Hossain, M. S., et al. Colorectal cancer: A review of carcinogenesis, global epidemiology, current challenges, risk factors, preventive and treatment strategies. Cancers. 14 (7), 1732(2022).
  32. Guyot D'Asnières De Salins, A., et al. Discordance between immunochemistry of mismatch repair proteins and molecular testing of microsatellite instability in colorectal cancer. ESMO open. 6 (3), 100120(2021).
  33. Chen, W., Swanson, B. J., Frankel, W. L. Molecular genetics of microsatellite-unstable colorectal cancer for pathologists. Diagn Pathol. 12 (1), 24(2017).
  34. Li, J., et al. Role of MLH1 methylation in esophageal cancer carcinogenesis and its clinical significance. Onco Targets Ther. 11 (1), 651-663 (2018).
  35. Iyer, R. R., Pluciennik, A. DNA mismatch repair and its role in Huntington's disease. J Huntingtons Dis. 10 (1), 75-94 (2021).
  36. Rebuzzi, F., Ulivi, P., Tedaldi, G. Genetic predisposition to colorectal cancer: How many and which genes to test. Int J Mol Sci. 24 (3), 2137(2023).
  37. Guo, L., Yu, Z., Li, Q., Liang, X., Yang, L. Correlation of MLH1 and MSH2 levels with clinicopathologic characteristics in colorectal cancer. Am J Transl Res. 15 (2), 1107-1116 (2023).
  38. Liu, Y., Yang, C., Li, W., Zhang, S., Li, L. Analysis of association of MLH1 and PMS2 gene expression with clinicopathological features in elderly patients with colorectal cancer. Chinese J Geriatrics. 1 (12), 927-930 (2020).
  39. Salem, M. E., et al. Molecular analyses of left- and right-sided tumors in adolescents and young adults with colorectal cancer. Oncologist. 25 (5), 404-413 (2020).
  40. Goshayeshi, L., et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of mismatch repair-deficient colorectal carcinoma in early onset cases as compared with late-onset cases: a retrospective cross-sectional study in Northeastern Iran. BMJ open. 8 (8), e023102(2018).
  41. Zaborowski, A. M., et al. Clinicopathological features and oncological outcomes of patients with young-onset rectal cancer. Br J Surg. 107 (5), 606-612 (2020).
  42. Paredes, S. R., Chan, C., Rickard, M. Immunohistochemistry in screening for heritable colorectal cancer: what to do with an abnormal result. ANZ J Surg. 90 (5), 702-707 (2020).
  43. Anvari, A. H., Ganji, S. M., Movahhed, T. K. Cellular MLH1 gene expression and pathologic factors in Iranian patients with colorectal cancer. Qom Univ Med Sci J. 14 (8), 62-70 (2020).
  44. Sahin, I. H., et al. Analysis of age, tumor-sidedness, and mismatch repair (MMR) genes with response to immune checkpoint inhibitors (ICIs) in MMR-deficient (dMMR) colorectal cancer (CRC) patients (pts): A multi-institutional study. J Clinl Oncol. 37 (15), e15029(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Colorectaal carcinoomReal-time PCRgenexpressieanalysetumorinvasielymfekliirinvasieRNA-extractiecDNA-synthese

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.