Onderzoekstoepassing van laser-geïnduceerde schokgolf voor het bestuderen van door ontploffing geïnduceerd cochleair letsel

Samenvatting

Hier beschrijven we experimentele protocollen voor het maken van een diermodel van door ontploffing geïnduceerd cochleair letsel met behulp van laser-geïnduceerde schokgolf (LISW). Blootstelling van het slaapbeen aan LISW maakt de reproductie van door blasten geïnduceerde cochleaire pathofysiologie mogelijk. Dit diermodel zou een platform kunnen zijn voor het ophelderen van cochleaire pathologie en het verkennen van mogelijke behandelingen voor ontploffingsverwondingen.

Samenvatting

Het oor is het orgaan dat het meest vatbaar is voor overdruk door explosies en cochleaire verwondingen treden vaak op na blootstelling aan explosies. Blootstelling aan ontploffingen kan leiden tot perceptief gehoorverlies (SNHL), een onomkeerbaar gehoorverlies dat de kwaliteit van leven negatief beïnvloedt. Gedetailleerde door blast geïnduceerde cochleaire pathologieën, zoals het verlies van haarcellen, spiraalvormige ganglionneuronen, cochleaire synapsen en verstoring van stereocilia, zijn eerder gedocumenteerd. Het bepalen van cochleaire perceptieve verslechtering na een ontploffingsverwonding is echter een uitdaging, omdat dieren die worden blootgesteld aan overdruk door ontploffing meestal tympanische membraanperforatie (TMP) ervaren, wat gelijktijdig conductief gehoorverlies veroorzaakt. Om pure perceptieve cochleaire disfunctie te evalueren, ontwikkelden we een experimenteel diermodel van blast-geïnduceerd cochleair letsel met behulp van een laser-geïnduceerde schokgolf. Deze methode vermijdt TMP en daarmee gepaard gaande systemische letsels en reproduceert de functionele achteruitgang van de SNHL-component op een energie-afhankelijke manier na blootstelling aan LISW. Dit diermodel zou een platform kunnen zijn voor het ophelderen van de pathologische mechanismen en het verkennen van mogelijke behandelingen voor door blast geïnduceerde cochleaire disfunctie.

Inleiding

Gehoorverlies en tinnitus behoren tot de meest voorkomende handicaps, gerapporteerd bij tot 62% van de veteranen^. Verschillende door blast geïnduceerde auditieve complicaties, waaronder perceptief gehoorverlies (SNHL) en trommelvliesperforatie (TMP), zijn gemeld bij personen die werden blootgesteld aan blastoverdruk². Bovendien suggereert onderzoek bij personen die zijn blootgesteld aan ontploffingen dat blootstelling aan ontploffingen vaak leidt tot defecten in de auditieve temporele resolutie, zelfs wanneer de gehoordrempels binnen het normale bereik liggen, wat bekend staat als "verborgen gehoorverlies (HHL)"³. Het is algemeen bekend dat er een aanzienlijk verlies van cochleaire synapsen is tussen binnenste haarcellen (IHC's) en auditieve neuronen (AN's) bij blastgerelateerde cochleaire pathologie⁴. Synaptische degeneratie leidt tot een verminderde auditieve verwerking en is een belangrijke factor die bijdraagt aan de ontwikkeling van HHL⁵. Gehoororganen zijn dus fragiele componenten die complexe en sterk georganiseerde structuren bevatten. Het precieze mechanisme waarmee ontploffingsgolven het binnenoor op cellulair niveau beïnvloeden, blijft echter onduidelijk. Dit komt door de uitdagingen bij het repliceren van de precieze klinische en mechanische fijne kneepjes van ontploffingsletsels in laboratoriumomgevingen en de complexiteit van door ontploffing geïnduceerde cochleaire pathologieën.

Het belangrijkste bestanddeel van een ontploffingsverwonding is de schokgolf (SW), gekenmerkt door een snelle en hoge toename van de piekdruk⁶. De complexiteit van verwondingen door ontploffingen is uitgebreid onderzocht in tal van retrospectieve studies ^7,8,9. Er zijn verschillende apparaten voor het genereren van ontploffingen, zoals gecomprimeerd gas¹⁰, schokbuizen¹¹ en explosieven met een kleine omvang¹², op verschillende drukniveaus. De drukgolfvorm van de SW die door recent ontwikkelde apparaten werd gegenereerd, leek sterk op die van een echte explosie. Een belangrijk concept bij het opstellen van een diermodel van door ontploffing geïnduceerd perceptief gehoorverlies is het minimaliseren van bijkomende verwondingen, anders dan auditieve schade, om de dood van dieren te verminderen. Zo zijn er studies naar ontploffingsletsel ontwikkeld waarbij schokbuizen zijn geminiaturiseerd en de output nauwkeurig kan worden geregeld, zodat blootgestelde dieren zelden sterven. Hoewel deze diermodellen meestal complicaties ontwikkelen, zoals TMP, is de evaluatie van de cochleaire functie moeilijk vanwege gelijktijdig conductief^{gehoorverlies.} We hebben eerder een oorbeschermde dierstudie uitgevoerd naar ontploffingsletsel met behulp van oordopjes en vonden geen incidentie van TMP¹³. De oordoppen kunnen ernstige cochleaire schade gedeeltelijk verzachten, maar niet de ontwikkeling van centrale auditieve neurodegeneratie of tinnitus. Zo beschermen oordoppen zowel het slakkenhuis als het trommelvlies. Er is echter een diermodel nodig van door ontploffingen geïnduceerde pure cochleaire schade zonder TMP om de cochleaire pathofysiologie veroorzaakt door ontploffingsletsels te bestuderen.

Eerder ontwikkelden we een topisch blast injury model van het binnenoor bij ratten en muizen met behulp van een laser-geïnduceerde schokgolf (LISW)^14,15. Deze methode kan veilig en gemakkelijk worden uitgevoerd op standaard laboratoriumniveau en is gebruikt om modellen van long- en hoofdontploffingsletsels te genereren^16,17. De energie van de LISW kan worden aangepast door het lasertype en vermogen te wijzigen, waardoor controle over de mate van cochleaire schade mogelijk is. Het LISW-geïnduceerde cochleaire letselmodel is waardevol voor het bestuderen van de mechanismen van SNHL veroorzaakt door ontploffingsletsels en het onderzoeken van mogelijke behandelingen. In deze studie beschrijven we gedetailleerde experimentele protocollen voor het maken van een muismodel van door ontploffing geïnduceerde cochleaire schade met behulp van LISW en demonstreren we cochleaire degeneratie, inclusief het verlies van haarcellen (HC's), cochleaire synapsen en spiraalvormige ganglionneuronen (SGN's), op een energie-afhankelijke manier bij muizen na blootstelling aan LISW.

Protocol

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het National Defense Medical College (goedkeuring #18050) en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan. Alles werd in het werk gesteld om het aantal dieren en hun lijden tot een minimum te beperken.

1. Dieren

1. Gebruik mannelijke CBA/J-muizen van 8 weken oud om dit protocol te volgen. Onderwerp de muizen vóór het experiment aan een gehoorfunctietest en endoscopische observatie van het trommelvlies om normaliteit te garanderen.
2. Verdeel 27 CBA/J-muizen in drie groepen: (1) 2,0 J/cm^{, 2} blootgestelde groep (n = 9 muizen); (2) 2,25 J/cm^{, 2} blootgestelde groep (n = 9 muizen); en (3) 2,5 J/cm² blootgestelde groep (n = 9 muizen). Verwijder alle oren voor beoordeling 1 maand na de LISW-blootstelling.

2. Experimentele instellingen van LISW-blootstelling

1. Het laserdoel is een zwarte, natuurlijke rubberen schijf met een diameter van 10 mm en een dikte van 0,5 mm. Om de LISW-impuls te verhogen, gebruikt u een laslijm van acrylhars om een 1,0 mm dikke, transparante polyethyleentereftalaatplaat (PET) aan de bovenkant van het doelgebied te hechten. Bestraal een 532 nm Q-switched Nd: YAG-laser om de LISW achter het doel te genereren (Figuur 1A).
2. Stel de laserpuls met een plano-convexe lens scherp op een plek met een diameter van 3,0 mm op het laserdoel.
3. Gebruik de LISW-bestraling om plasma te genereren op het hechtoppervlak van de twee materialen en verdamp het rubber (plasma-gemedieerde ablatie), waardoor verdampt rubber in de holte achterblijft.
4. Gebruik een hydrofoon om de drukgolf van LISW te meten op 1,0 mm onder water, niet in levend weefsel. Plaats een glasvezelhydrofoon met een diameter van 0,25 mm onder het zwarte rubber 1,0 mm onder het wateroppervlak om de LISW-drukgolfvormen op te nemen en te meten met behulp van een digitale oscilloscoop.
   OPMERKING: De drukgolfvormen vertoonden stabiele kenmerken met een vergelijkbare maximale druk en impuls als weergegeven in figuur 1B.
5. Voer alle dierproeven uit onder algemene anesthesie met behulp van intraperitoneale injecties van 1 mg/kg medetomidinehydrochloride en 75 mg/kg ketamine. Breng een oogzalf aan op beide ogen van de muis om uitdroging te voorkomen en warmteondersteuning te bieden.
6. Scheer de postauriculaire gebieden zorgvuldig om te voorkomen dat de ingesloten lucht in de vacht wordt vastgehouden. Bevestig de muizen op een plaat en plaats de postauriculaire gebieden in het brandpunt van de LISW in verticale opwaartse richting.
7. Bevestig een zwart rubberen doel percutaan aan het postauriculaire gebied van het oor van de muis. Om ervoor te zorgen dat de akoestische impedantie op elkaar afkomt, gebruikt u een ultrasone geleidende gel tussen het laserdoel en het huidoppervlak.
8. Breng een enkele LISW-puls aan op het slakkenhuis via het slaapbeen. Stel de uitgangen van de laserpulsen in op drie energiedichtheden: 2.0 J/cm² , 2.25 J/cm² en 2.5 J/cm².

3. Cochleaire functietest

OPMERKING: Auditieve hersenstamrespons (ABR)-tests werden uitgevoerd zoals eerder gerapporteerd ^14,15.

1. Voer de ABR-meting 1 dag voor en 1 dag en 1 maand na LISW-blootstelling uit.
2. ABR is een auditief opgeroepen potentiaal als reactie op auditieve stimuli en wordt vaak gebruikt om gehoordrempels te beoordelen op vier frequenties (12.0 kHz, 16.0 kHz, 20.0 kHz en 24.0 kHz).
3. Presenteer het stimulatiegeluid via een kleine oortelefoon en meet het geluidsdrukniveau in de buurt van het trommelvlies van de muis met behulp van een kleine microfoon die in de buurt van de oortelefoon is geplaatst. Voer burst-stimuli uit van een geluidsgenerator met 37 cycli/s en versterk de geluidsdruk van een geluidsdrukniveau van 20 dB (SPL) tot 80 dB SPL in stappen van 5 dB SPL.
4. Plaats een roestvrijstalen naaldelektrode voor elektro-encefalogramopname onder de gehoorgang en het frontale gebied van het oor en plaats een aardelektrode onder het caudale gebied van de staart.
5. Evalueer de cochleaire functies door de amplitude van de ABR-piek I (P1) te meten. Analyseer automatisch de ABR-golfvormen met betrekking tot de gehoordrempels en ABR P1-amplitude met behulp van de ABR-piekanalysesoftware zoals eerder gerapporteerd¹⁸.
6. Bereken de verschuivingen van de ABR-drempel door de drempels af te trekken die vóór de blootstelling zijn verkregen. Vergelijk de ABR-drempelverschuivingen in de drie blootgestelde groepen met die van de niet-blootgestelde contralaterale oren (controle). Meet ABR-amplitudes met behulp van ABR-golfvorm tijdens 80 dB SPL-stimulatie.

4. Histologische beoordeling

OPMERKING: Histologische beoordeling werd uitgevoerd zoals eerder beschreven^14,15.

1. HC's en cochleaire synaps
   1. Voer het pathologisch onderzoek van het slakkenhuis 1 maand na blootstelling aan LISW uit.
   2. Bevestig de diepte van de anesthesie door de teen te knijpen vóór de perfusie. Voer na hemoperfusie met Ringer-lactaatoplossing transcardiale perfusie uit met 1 ml/g 4% paraformaldehyde (PFA). Verwijder na onthoofding het slakkenhuis en doordrenk het direct met 4% PFA, gevolgd door fixatie bij 4 °C 's nachts.
   3. Ontkalk het slakkenhuis na fixatie door het gedurende 2 dagen te schudden in een oplossing van 0,5 mol/l ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA).
   4. Verdeel het gedemineraliseerde slakkenhuis in vier stukken. Nadat u elk stuk slakkenhuis gedurende 10 minuten op droogijs hebt ingevroren, voert u de blokkering uit bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in 5% normaal paardenserum eenvoudig geconjugeerd met 0,3% Triton X voor permeabilisatie.
   5. Gebruik anti-myosine 7a (Myo7A), anti-C-terminaal bindend eiwit (CtBP2) en anti-neurofilament (NF) antilichamen als primaire antilichamen en 's nachts geïncubeerd bij 37 °C. Gebruik Myo7A-, CtBP2- en NF-antilichamen om respectievelijk HC's, presynaptische linten en cochleaire zenuwvezels te evalueren.
   6. Spoel het ongebonden primaire antilichaam af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 x 3 minuten. Incubeer de monsters met de juiste secundaire antilichamen bij 37 °C gedurende 2 uur. Was de preparaten na het kleuren 3 x 5 minuten met PBS en kapsel de preparaten op het glaasje in met een in water oplosbaar inkapselingsmiddel met behulp van afdekglas.
   7. Voor evaluatie verkrijgt u het volledige beeld van het slakkenhuis (verdeeld in vier stukken) met een vergroting van 10x en berekent u de cochleaire frequentiekaart met behulp van de ImageJ-softwareplug-in waarnaar wordt verwezen om de specifieke cochleaire gebieden nauwkeurig te lokaliseren op de frequentie van 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz en 24,0 kHz.
   8. Bereken de overlevingspercentages van HC en het aantal synapsen bij elke frequentie.
      1. Om de overlevingspercentages van HC te berekenen, telt u het aantal overlevende en ontbrekende HC's per 200 μm lengte bij elke frequentie en berekent u het overlevingspercentage van de HC's met behulp van vergelijking (1) hieronder:
         HC-overlevingspercentage (%) = (Aantal overlevende HC's / Aantal overlevende en ontbrekende HC's) × 100 (1)
      2. Om het aantal synapsen te berekenen, verkrijgt u z-stack-beelden met hoge resolutie van het binnenste HC-gebied met behulp van een objectieflens met olie-onderdompeling (63×) met een 3,1x digitale zoom en een stapgrootte van 0,25 μm onder confocale fluorescentiemicroscopie. Importeer de afbeeldingsstapels naar ImageJ en tel automatisch de CtBP2-puncta per IHC binnen een bereik van 50 μm in elke afbeeldingsstapel. Bereken het overlevingspercentage van de synaptische linten met behulp van vergelijking (2):
         Overlevingspercentage synaptische linten (%) = (Aantal synaptische linten in LISW-blootgestelde oren / Aantal synaptische linten in controleoren) × 100 (2)
   9. Voor scanning-elektronenmicroscopie (SEM) verwijdert u het slakkenhuis, zoals eerder beschreven, en fixeert u het vervolgens met 2% PFA en 2,5% glutaaraldehyde samen bij 4 °C gedurende een nacht. Na ontkalking van het slakkenhuis door schudden in 0,5 mol/L EDTA-oplossing bij 4 °C gedurende 7 dagen, ontleedt u het slakkenhuis in vier stukken voor de bereiding in zijn geheel.
   10. Fixeer de weefsels met 1% osmiumtetroxide bij 4 °C gedurende 30 minuten, dehydrateer in 50% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, herhaal met 70%, 80%, 95% en vervolgens 100% ethanol, sputtercoating met osmium en onderzoek onder een elektronenmicroscoop bij 5,0 kV, zoals eerder gerapporteerd¹⁴.
   11. Voer een kwantitatieve analyse uit van stereociliaire bundelverstoring in buitenste haarcellen (OHC's) door de verhouding van verstoorde stereocilia (aantal verstoorde OHC-stereocilia/totaal aantal OHC-stereocilia) in elke energiegroep te berekenen met behulp van de SEM-beelden¹⁴. Tel het aantal stereocilia per 100 μm in het midden van de 16,0 en 24,0 kHz gebieden. Wijs een of meer rijen OHC-bundels aan die naar de zijzijde zijn gebogen, in de knoop zijn of waarvan de basis ontbreekt , als verstoord.
2. SGN's
   1. Om het aantal SGN's 1 maand na blootstelling aan LISW kwantitatief te beoordelen, voert u transcardiale perfusie uit met 4% PBS, onthoofdt, verwijdert u het slakkenhuis en voert u posterieure fixatie uit onder dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven. Ontkalk het slakkenhuis in 0,5 M EDTA gedurende 1 week.
   2. Dompel de slakkenhuizen na het ontkalken een nacht onder in 30% sucrose, plaats ze in de cryosectieverbinding, vries ze in vloeibare stikstof in om secties in de buurt van het kanaal van Rosenthal voor te bereiden op een dikte van 15 μm, kleur ze met hematoxyline en eosine en bekijk ze onder een lichtmicroscoop¹⁴.
   3. Voor SGN-dichtheidsmeting telt u het aantal SGN's in de middelste bocht van het Rosenthal-kanaal en berekent u de SGN-overleving per controlegroep.

5. Statistische analyse

1. Statistische analyses uitvoeren met behulp van de software van uw keuze.
2. Analyseer statistische verschillen in ABR-drempelverschuiving, HC, SGN en synaptische tellingen met behulp van tweerichtingsmetingen met herhaalde metingen ANOVA ["frequentie of cochleaire delen (apicaal/midden/basis)" × "diergroepen"], tweerichtingsanalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door post-hoc Tukey's meervoudige vergelijkingstest.
3. Presenteer alle gegevens als gemiddelde ± standaardfout en stel het statistische significantieniveau in op p < 0,05.

Resultaten

LISW-golfvorm
De reproduceerbaarheid van de LISW-drukgolfvorm werd 5x gemeten bij 2,0 J/^cm2 als volgt. De golfvormen waren over het algemeen vergelijkbaar en stabiel en vertoonden een sterke toename met tijdbreedte, piekdruk en impuls van 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa en 14,1 ± 1,9 Pa∙s (mediaan ± SD), wat overeenkomt met SW-kenmerken (Figuur 1B). LISW's worden gekenmerkt door een snelle stijgtim, hoge piekdruk, korte duur en positieve drukdominantie. Wanneer het op biologisch weefsel wordt aangebracht, wordt het doelwit via de gelei rechtstreeks op het levende weefsel geplaatst, en kan worden aangenomen dat het SW bijna dezelfde kenmerken heeft als het gemeten SW dat op het weefsel wordt aangebracht. Na blootstelling aan LISW werd het vóórkomen van TMP beoordeeld met behulp van een kleine digitale endoscoop. Geen van de muizen in de LISW-energiegroep vertoonde TMP na blootstelling (Figuur 1C).

Auditieve beoordeling
Er werd een ABR-onderzoek uitgevoerd om de auditieve functie te bepalen. ABR is een meting van de door geluid opgewekte potentiaal in het auditieve pad, en ABR P1 vertegenwoordigt de geaccumuleerde neurale activiteit in de cochleaire zenuw. Een dag na blootstelling aan LISW vertoonde het blootgestelde oor een significant verschil in de ABR-drempelverschuiving tussen de verschillende LISW-groepen (tweerichtings-ANOVA, p < 0,0001; Figuur 2A). Deze toename van de ABR-drempelverschuiving hield aan tot 1 maand na blootstelling aan LISW in de groepen van 2,25 en 2,5 J/cm² (tweezijdig ANOVA, 2,25 J/cm², p < 0,0001; 2,5 J/cm², p < 0,0001). Met name het hoogfrequente gebied vertoonde een opmerkelijke toename van de ABR-drempelverschuiving. De ABR-drempels herstelden zich echter tot een niveau dat niet significant verschilde van prebestraling in de 2,0 J-groep (tweezijdige ANOVA, 2,0 J/cm², p = 0,76), wat aangeeft dat de drempelverhoging energieafhankelijk was. Wat de ABR P1-amplitudes betreft, vertoonden alle LISW-bestraalde groepen een significante afname van de ABR P1-amplitudes bij alle frequenties 1 dag en 1 maand na blootstelling aan LISW (tweezijdige ANOVA, p < 0,0001; Figuur 2B). Het niet-blootgestelde oor (controle; linkeroor) vertoonde geen merkbare veranderingen in de ABR-gehoordrempel na blootstelling aan LISW (gegevens niet getoond).

Overleving van HC's en SGN
Microscopische observatie van aan LISW blootgestelde oren toonde geen mechanische schade aan de slakkenhuizen, zoals breuk en dislocatie van de gehoorbeentjes, breuk van het ronde raammembraan of intracochleaire bloeding, na blootstelling aan LISW (gegevens niet getoond), wat consistent is met eerdere bevindingen ^6,14.

Fluorescerende immunokleuring van HC's met Myo7A, synaptische linten met CtBP2 en de cochleaire zenuw met NF wordt weergegeven in figuur 3A. In geen van de groepen werd ernstige cochleaire schade, zoals het verlies van HC's of zenuwvezels, waargenomen. De kwantitatieve beoordeling van de overleving van Myo7A-positieve OHC's verschilde echter significant tussen de groepen (tweerichtings-ANOVA, p = 0,002; Figuur 3B). De groep met 2,5 J/^cm2 vertoonde significant lagere overlevingspercentages van OHC's dan de controlegroep, vooral in het hoogfrequente gebied (tweezijdige ANOVA, 2,5 J/cm², p = 0,0002). De overlevingskansen van IHC's waren echter vergelijkbaar tussen de groepen, wat aangeeft dat OHC's kwetsbaar zijn voor hoogenergetische LISW (tweerichtings-ANOVA, p = 0,76). Een kwantitatieve beoordeling van de overleving van het synaptische lint wordt weergegeven in figuur 3C. Synaptische linten waren significant verminderd in zowel de 2,25 als de 2,5 J/cm² groepen in vergelijking met de controle (tweezijdig ANOVA, 2,25 J/cm², p < 0,0001; 2,5 J/cm², p < 0,0001), en de hogere frequenties vertoonden een sterkere neiging om af te nemen, vergelijkbaar met die van ABR-drempelverschuiving en OHC-overleving.

Vervolgens werd de SGN-dichtheid beoordeeld, zoals weergegeven in figuur 3D. Er was een significant verschil in SGN-dichtheid tussen de groepen (tweezijdige ANOVA, p = 0,76), en de 2,5 J/cm^2-groep vertoonde significant lagere overlevingspercentages van SGN in vergelijking met de controlegroepen (tweerichtings-ANOVA, 2,5 J/cm², p = 0,007). De groepen van 2,0 en 2,25 J/^cm2 vertoonden echter een vergelijkbare SGN-overleving in vergelijking met de controles. Dit resultaat geeft aan dat de ernst van cochleaire degeneratie en gehoorstoornissen afhangt van de blootstelling aan LISW-energie, wat consistent is met de ABR- en HC-overlevingsresultaten.

Stereociliaire bundel
We zagen een opmerkelijke toename van de ABR-drempel, ongeveer 30 dB, in zowel de 2,25- als de 2,5 J/^cm2-groep bij frequenties boven 20 kHz, die aanhield tot 1 maand na blootstelling aan LISW (zoals weergegeven in figuur 2A). De drempelverschuiving van 30 dB die we hebben waargenomen, kan echter niet uitsluitend worden toegeschreven aan het verlies van OHC's, degeneratie van cochleaire synapsen of een verminderd aantal SGC's (figuur 3). Een eerdere studie gaf aan dat de ABR-drempelverschuivingen minimaal waren wanneer het aantal synaptische linten met 50% ^afnam19. Daarom hebben we SEM uitgevoerd om de oorzaak van de verhoging van de ABR-drempel te onderzoeken. Na blootstelling aan LISW met een intensiteit van 2,5 J/^cm2 leken sommige stereociliaire bundels van OHC's verstoord te zijn, met name in gebieden met een hoge frequentie (figuur 4A), wat een van de oorzaken kan zijn van een verhoogde ABR-drempel na blootstelling aan LISW. Uit een kwantitatieve beoordeling van stereociliaire disruptie bleek dat de disruptieverhouding op een energieafhankelijke manier hoger was in het gebied met een hogere frequentie (figuur 4B).

Figuur 1: Experimentele instellingen en drukprofiel van LISW. (A) Experimentele opstelling voor het genereren van LISW bij dieren. (B) Karakteristieken van de LISW-drukgolfvormen vastgesteld op 2,0 J/cm². (C) Representatieve beelden van het trommelvlies. TMP's werden niet waargenomen in een van de LISW-blootgestelde oren. Ter referentie wordt representatieve door ontploffing geïnduceerde TMP (gele pijlpunten) weergegeven met behulp van een ontploffingsbuis. Afkortingen: LISW = laser-induced shock wave; PET = polyethyleentereftalaat; TMP = perforatie van het trommelvlies; YAG = yttrium aluminium granaat; SHG = tweede harmonische generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: ABR-resultaten na blootstelling aan LISW. (A) Significante ABR-drempelverschuivingen werden waargenomen in alle groepen 1 dag na blootstelling aan LISW. De ABR-drempelverschuivingen in de groepen van 2,25 en 2,5 J/^cm2 bleven significant verhoogd tot 1 maand na blootstelling aan LISW. (B) De ABR P1-amplitude 1 dag en 1 maand na blootstelling aan LISW nam significant af in alle groepen. Sterretjes duiden op significante verschillen tussen groepen in vergelijking met de waarden van vóór blootstelling (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Afkortingen: ABR = auditieve hersenstamrespons; LISW = laser-geïnduceerde schokgolf; P1 = piek 1; SPL = geluidsdrukniveau. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Cochleaire pathologie na blootstelling aan LISW. (A) Confocale fluorescentiebeelden van het orgaan van Corti in het 20 kHz-gebied gekleurd met Myo7A (blauw), CtBP2 (rood) en NF (groen) na blootstelling aan LISW. (B) De gemiddelde percentages overlevende HC's worden weergegeven in de cytocochleogrammen. Kwantitatieve beoordeling toonde een significant verlies van OHC's bij 2,5 J/^cm2, hoewel er geen significant verschil was in IHC-overleving tussen de groepen. (C) Het overlevingspercentage van presynaptische linten in vergelijking met pre-blootstellingswaarden was significant verlaagd in de groepen van 2,25 en 2,5 J/^cm2 . (D) Representatieve microfoto's van SGN's in alle groepen 1 maand na blootstelling aan LISW. De SGN-overlevingskans nam significant af bij 2,5 J/^cm2. Sterretjes geven significante verschillen aan in vergelijking met waarden vóór blootstelling (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Schaalbalken = 5 μm (A), 100 μm (D). Afkortingen: LISW = laser-induced shock wave; IHC = binnenste haarcel; NF = neurofilament; OHC = buitenste haarcel; SGN = spiraalvormig ganglion neuron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Oppervlaktestructuren van OHC's. (A) Representatieve scanning-elektronenmicroscopiebeelden van OHC-stereocilia in de 16 kHz- en 24 kHz-regio's van het orgaan van Corti één maand na blootstelling aan LISW. Stereociliaire verstoring is te zien in vergrote afbeeldingen van het omkaderde gebied in de 2,5 J/^cm2 (24 kHz-gebied) groep. Schaalbalk -= 2 μm. (B) De stereociliaire disruptiesnelheid was hoger met een toename van de LISW-overdruk. Afkortingen: LISW = laser-induced shock wave; OHC = buitenste haarcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Deze studie was gericht op het valideren van een muismodel van door ontploffing veroorzaakte cochleaire schade met behulp van LISW. Onze bevindingen toonden aan dat na LISW-toepassing via het slaapbeen, het blootgestelde muizenoor een consistente pathologische en fysiologische achteruitgang in het slakkenhuis vertoonde, wat gepaard ging met een toename van LISW-overdruk. Deze resultaten geven aan dat dit muismodel geschikt is voor het repliceren van verschillende cochleaire pathologieën door de LISW-output aan te passen. In het bijzonder zou dit LISW-geïnduceerde muismodel voor cochleaire disfunctie kunnen dienen als een goed model voor cochleair letsel vanwege zijn gecontroleerde, reproduceerbare en kwantificeerbare aard, evenals zijn vermogen om pathofysiologische cochleaire achteruitgang onder gecontroleerde omstandigheden te reproduceren.

Onze vorige studie gebruikte een rattenmodel en observeerde LISW-geïnduceerde cochleaire degeneratie, waaronder verhoging van gehoordrempels, verlies van synaptische linten en verstoring van de stereociliaire bundel¹⁴. Een andere studie onderzocht pathofysiologische cochleaire degeneratie na ontploffingsletsel bij muizen met behulp van twee soorten ontploffingen met verschillende kenmerken: laagfrequent dominant met behulp van een blastbuis en hoogfrequent dominant met behulp van LISW¹⁵. Ze stelden vast dat de dominante frequentie van het spectrum van de ontploffing de belangrijkste factor was bij het bepalen van het gebied van cochleaire schade, zoals eerder gerapporteerd¹⁵. Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die de gedetailleerde methodologie van LISW-cochleaire blootstelling en de energie- en frequentieafhankelijke LISW-geïnduceerde cochleaire degeneratie aantoont.

We gebruikten LISW-blootstelling om het slakkenhuis te beschadigen via het postauriculaire slaapbot in plaats van via de uitwendige gehoorgang om een model te creëren dat uitsluitend cochleaire schade betrof zonder enige stopzetting van TMP of ossiculaire keten. Onze bevindingen impliceren dat de gehoorbeschadiging die in deze studie werd aangetoond, te wijten was aan de verslechtering van de perceptieve componenten in het auditieve pad. Recente studies hebben aangetoond dat de TMP kan dienen als een buffer tegen schade aan het slakkenhuis door SW-energie te absorberen ^2,20,21. Dit LISW-model was niet in staat om TMP te induceren, zelfs niet met LISW met hoge intensiteit, omdat de SW rechtstreeks in het binnenoor werd bestraald en niet door het trommelvlies. Om gemengd gehoorverlies met TMP en SNHL te analyseren, is een explosie met hoge intensiteit die wordt gegenereerd met behulp van een echte explosie of schokbuis daarom ideaal. De keuze van het type ontploffing hangt af van het specifieke gebruik of doel van het onderzoek. Daarom is dit op LISW gebaseerde dierletselmodel nuttig voor het ophelderen van pure, door blast geïnduceerde cochleaire pathofysiologie zonder TMP, wat resulteert in conductief gehoorverlies. Vanuit een ander perspectief vereiste LISW-bestraling 1 uur per dier, inclusief het instellen van de apparatuur en het controleren van het trommelvlies na bestraling. Als meerdere dieren binnen 1 dag achter elkaar aan LISW zijn blootgesteld, is het daarom moeilijk om LISW-bestraling en ABR op dezelfde dag te meten met een enkele anesthesiedosis. Vanwege het risico op overlijden van dieren bij het verhogen van de anesthesiedosis, hebben we in deze studie besloten om ABR-metingen de volgende dag uit te voeren, niet onmiddellijk na de bestraling op dezelfde dag.

Bij de ontploffingsverwonding wordt de primaire fase veroorzaakt door de fysieke krachten van de explosie en snelle SW-transmissie met significante veranderingen in weefseldichtheid, zoals weefsel-luchtovergangen²². Daarom wordt aangenomen dat de meeste door blast geïnduceerde cochleaire letsels voortkomen uit de SW tijdens de primaire fase⁶, wat suggereert dat studies naar aan SW blootgestelde cochleaire letsels cruciaal zijn voor het begrijpen van de mechanismen van door blast geïnduceerde cochleaire disfunctie. Het maken van een SW met behulp van een hoogenergetische laserpuls op een vast materiaal staat bekend als LISW. Eerdere studies hebben LISW gebruikt om diermodellen te ontwikkelen van door ontploffingen geïnduceerde traumatische hersen- en longletsels^16,17. De voordelen van het gebruik van LISW voor ontploffingsgerelateerde onderzoeken zijn onder meer het laserintensiteitsafhankelijke, herhaalbare schademodel en specifieke targeting van het gewonde orgaan, omdat LISW geen invloed heeft op gebieden buiten het beoogde gebied.

In deze studie ontdekten we dat LISW pathologische veranderingen teweegbrengt in cochleaire HC's, SGN's, hun synapsen en de stereociliaire bundel, vergelijkbaar met de schade veroorzaakt door echte ontploffingsschade^. De schade die wordt toegebracht door verschillende vormen van cochleaire beledigingen, zoals door lawaai veroorzaakt gehoorverlies, kan worden toegeschreven aan twee fundamentele factoren: directe mechanische stress en secundaire metabole verstoring. We stellen voor dat verstoring van de stereociliaire bundel de primaire pathologie is die het gevolg is van directe mechanische stress van de LISW. Stereociliaire stoornissen zijn veel voorkomende pathologieën die verband houden met leeftijdsgebonden en door lawaai veroorzaakte gehoorstoornissen^23,24. Het exacte mechanisme dat ten grondslag ligt aan deze stereociliaire verstoring is nog niet opgehelderd. Uit een eerdere studie bleek dat stereociliaire verstoring 1 week na blootstelling aan de ontploffing werd waargenomen¹². Een mogelijke reden voor deze unieke morfologische verandering kan de ontkoppeling zijn van de tipschakels en zijschakels tussen de verstoorde stereocilia van de buitenste rij en de stereocilia van de middelste rij¹⁴. Bovendien worden worteltjes van de buitenste rij stereocilia, die bestaan uit actine en bundelende eiwitten, zoals TRIOBP, ook mechanisch beschadigd¹⁵.

Cochleaire beledigingen leiden meestal tot verdere verstoring van metabolische processen die dagen of zelfs maanden kunnen aanhouden¹⁹. Met name de synapsen in het slakkenhuis, die verantwoordelijk zijn voor de verwerking van auditief geluid, zijn zeer kwetsbaar voor blootstelling aan ontploffingen²⁵. Onze diermodellen toonden aan dat de degeneratie van de AN-functie, zoals aangetoond door de afname van ABR P1-amplitudes, werd veroorzaakt door LISW-geïnduceerde cochleaire schade. Een mogelijk mechanisme van LISW-geïnduceerde cochleaire synaptopathie is overmatige afgifte van glutamaat door de IHC's, zoals glutamaat-ototoxiciteit²⁶. Blootstelling aan LISW zorgt ervoor dat het basilaire membraan hevig trilt, waardoor overmatige afgifte van glutamaat uit het IHC ontstaat, wat resulteert in AN-degeneratie. LISW kan het type glutamaattoxiciteit repliceren dat het slakkenhuis aantast, wat leidt tot cochleaire synaptopathie en een afname van het aantal synapsen zonder HC's te beschadigen. Een ander mogelijk mechanisme is dat blootstelling aan LISW cochleaire ondersteunende cellen kan beschadigen, wat bijdraagt aan de overleving van ANF's, afhankelijk van de afgifte van^{neurotrofines27}. Bovendien kan LISW rechtstreeks worden overgedragen op ANF's en neurale schade veroorzaken. Bijgevolg kunnen onze LISW-geïnduceerde modellen voor cochleaire schade waardevol zijn voor zowel blastonderzoek als het onderzoek naar diverse vormen van cochleaire degeneratie waarbij cochleaire synaptopathie betrokken is.

Er is dringend behoefte aan therapeutische interventies om door ontploffing veroorzaakt gehoorverlies aan te pakken, wat het belang benadrukt van behandelingsstrategieën die gericht zijn op cochleaire synaptopathie of verstoring van de stereociliaire bundel bij OHC. Deze benaderingen kunnen ook worden toegepast op andere soorten gehoorstoornissen met vergelijkbare pathologische mechanismen. Cochleaire synaptopathie werd waargenomen in ons blast-geïnduceerde cochleaire dysfunctiemodel, wat suggereert dat het een veelbelovend therapeutisch doelwit kan zijn. LISW kan worden gebruikt om muismodellen te maken die de cochleaire pathofysiologie veroorzaakt door ontploffingen nauwkeurig nabootsen, en deze modellen kunnen worden gebruikt om verschillende soorten cochleaire disfuncties te bestuderen.

Onze studie heeft verschillende beperkingen. Eerst hebben we de ABR-drempels gemeten op 12-24 kHz. Volgens een eerdere studie leidt LISW-geïnduceerde cochleaire schade tot hoogfrequent gehoorverlies bij dieren vanwege de kenmerken van SW en de kwetsbaarheid van de cochleaire base. Verdere ABR-studies zijn nodig in bredere frequentiegebieden (>24 kHz). Ten tweede hebben we in deze studie alleen een histologische evaluatie van het slakkenhuis uitgevoerd en niet de centrale auditieve route. Slechthorendheid bij ontploffingsletsel is niet alleen beperkt tot het slakkenhuis, maar is een gecompliceerde aantasting van de hersenstam en het centrale auditieve systeem. In de toekomst zou het wenselijk zijn om het auditieve centrum te evalueren in LISW-blootgestelde diermodellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
532 nm Q-switched Nd:YAG laser	Quantel	Brilliant b
ABR peak analysis software	Mass Eye and Ear	N/A	EPL Cochlear Function Test Suite
Acrylic resin welding adhesive	Acrysunday Co., Ltd	N/A
confocal fluorescence microscopy	Leica	TCS SP8
cryosectioning compound	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 antibody	BD Transduction	#612044
Dielectric multilayer mirrors	SIGMAKOKI CO.,LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Digital oscilloscope	Tektronix	DPO4104B
Earphone	CUI	CDMG15008-03A
Hydrophone	RP acoustics e.K.	FOPH2000
Image J software plug-in	NIH	measurement line	https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Light microscope	Keyence Corporation	BZ-X700
Myosin 7A antibody	Proteus Biosciences	#25–6790
Neurofilament antibody	Sigma	#AB5539
Plano-convex lens	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Prism software	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Scanning electron microscope	JEOL Ltd	JSM-6340F
Small digital endoscope	AVS Co. Ltd	AE-C1
Ultrasonic jelly	Hitachi Aloka Medical	N/A
Variable attenuator	Showa Optronics Co.	N/A	Currenly avaiable successor: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Water-soluble encapsulant	Dako	#S1964