Kwantificeerbare en goedkope celvrije fluorescerende methode om het vermogen van nieuwe verbindingen om ijzer te chelaten bevestigen

Samenvatting

We beschrijven een fluorescerende test die snel en goedkoop het vermogen van nieuwe verbindingen om ijzer te cheleren kan bevestigen. De test meet het vermogen van verbindingen om de ijzerbindende activiteit van de zwakke ijzerchelaaterende fluorescerende sonde Calceïne te overtreffen, wat resulteert in een kwantificeerbare toename van de fluorescentie wanneer chelatie optreedt.

Samenvatting

Kankercellen hebben grote hoeveelheden ijzer nodig om hun proliferatie in stand te houden. Het ijzermetabolisme wordt beschouwd als een kenmerk van kanker, waardoor ijzer een geldig doelwit is voor benaderingen tegen kanker. Voor de ontwikkeling van nieuwe verbindingen en de identificatie van aanknopingspunten voor verdere modificatie is het noodzakelijk dat tests op het bewijs van het mechanisme worden uitgevoerd. Er zijn veel tests om de impact op proliferatie te evalueren; Het vermogen om ijzer te chelaten is echter een belangrijke en soms over het hoofd geziene eindpuntmaat vanwege de hoge kosten van apparatuur en de uitdaging om de sterkte van chelatie snel en reproduceerbaar te kwantificeren. Hier beschrijven we een kwantificeerbare en goedkope celvrije fluorescerende methode om het vermogen van nieuwe verbindingen om ijzer te cheleren te bevestigen. Onze test is gebaseerd op de in de handel verkrijgbare goedkope fluorescerende kleurstof Calceïne, waarvan de fluorescentie kan worden gekwantificeerd op de meeste fluorescerende microtiterplaatlezers. Calceïne is een zwakke ijzerchelator en de fluorescentie wordt gedoofd wanneer het Fe^2+/3+ bindt; fluorescentie wordt hersteld wanneer een nieuwe chelator Calceïne overtreft voor gebonden Fe^2+/3+. De verwijdering van fluorescerende afschrikking en de daaruit voortvloeiende toename van de fluorescentie maakt het mogelijk om het chelatievermogen van een nieuwe vermeende chelator te bepalen. Daarom bieden we een goedkope, high-throughput assay die een snelle screening van nieuwe kandidaat-chelatorverbindingen mogelijk maakt.

Inleiding

Fenotypische veranderingen in cellen die verband houden met de ontwikkeling van kanker door middel van een gemeenschappelijke reeks veranderde biologische vermogens, worden nu algemeen aangeduid als de kenmerken van kanker. Onder hen zijn veranderingen die het gevolg zijn van de herprogrammering van het energiemetabolisme, die wijdverbreid zijn in de kankercelbiologie¹. Een dergelijke metabole herprogrammering omvat een verhoogde behoefte aan ijzer om snelle proliferatie en tumorgroei te ondersteunen^. Deze dorst naar ijzer leidt tot een ontregeld ijzermetabolisme, dat op zichzelf wordt beschouwd als een kenmerk van kanker ^3,4, waarbij ontregeling in alle stadia optreedt⁵. De kenmerken van metastase, meer recentelijk voorgesteld door Welch en Hurst, omvatten een rol voor ijzer⁶, aangezien ijzer oxidatieve stress kan veroorzaken, en dit kan op zijn beurt veranderingen in het genoom, epigenoom en proteoom bemiddelen, waardoor de kans op metastase⁷ wordt vergroot. Een verband tussen het ijzergehalte en een verhoogd aantal gevallen van kanker is aangetoond door middel van epidemiologische studies⁸.

Omdat kankercellen grote hoeveelheden ijzer nodig hebben, zijn ze vatbaar voor ijzertekort en dus voor ijzerchelatie. We hebben onlangs een overzichtsartikel gepubliceerd waarin we de nadruk leggen op het potentieel van ijzerchelatie bij het omkeren van verschillende kenmerken van kanker door NDRG1 die de oncogene signaalroutes verstoort. Het gebruik van ijzerchelatie als op zichzelf staande kankertherapie heeft echter geen positieve resultaten opgeleverd in klinische onderzoeken vanwege hun toxiciteit, korte halfwaardetijd, snelle metabolisme en opkomende resistentiemechanismen. Desalniettemin zijn ijzerchelatoren veelbelovend gebleken in in vitro en in vivo onderzoeken, wat aangeeft dat er meer werk nodig is om effectieve ijzerchelatoren voor kankertherapie te ontwikkelen. Specifieke ijzerchelatie is een gevalideerde strategie bij de ontdekking van geneesmiddelen tegen kanker, maar tot op heden zijn er slechts een paar klassen gerapporteerd¹⁰.

De identificatie en karakterisering van nieuwe ijzerchelatoren vereist het vermogen om hun effect op verschillende eindpunten te meten. Veel van deze (zoals proliferatie, apoptose, vorming van reactieve zuurstofsoorten) worden routinematig gemeten en zijn in de literatuur uiteengezet en beoordeeld als methoden om de kenmerken van kanker te evalueren^. Bij het evalueren van een nieuwe ijzerchelator onderzoeken veel groepen routinematig het effect op antiproliferatieve en redoxactiviteiten, evenals de effecten op de instroom of efflux van ijzer. In silico voorspellingstechnieken¹² vergroten de groeiende pool van ijzerchelatoren die kunnen worden gescreend.

Hetcreëren van ijzerchelatoren vereist het vermogen om hun effect op het ijzergehalte te meten als een middel om het bewijs van het principe effectief aan te tonen. Momenteel is flowcytometrie¹³ de meest gebruikelijke methode om dit te doen, wat kostbaar, tijdrovend en slecht kwantificeerbaar is. De keuze van de test is vaak gebaseerd op de beschikbaarheid van experimentele apparatuur, de snelheid en de kosten van een test. Daarom kan het vermogen om ijzer te chelaten een over het hoofd geziene eindpunt zijn vanwege de hoge kosten van apparatuur en de uitdaging om de sterkte van chelatie snel en reproduceerbaar te kwantificeren. Hier beschrijven we een kwantificeerbare en goedkope celvrije fluorescerende methode om het vermogen van nieuwe verbindingen om ijzer te cheleren te bevestigen.

Protocol

1. Bereiding van de voorraadoplossing

1. Voorkom bij het bereiden van Calcein-bouillonoplossingen fotodegradatie door oplossingen in het donker te bewaren. Bereid een 1 mM oplossing van Calceïne in Dulbecco's PBS, zonder magnesium of calcium¹⁴. Voeg voor 5 ml 1 mM Calceïne-oplossing 3,1 mg Calceïne (622,5 g/M) toe aan 5 ml Dulbecco's PBS. Bereid met behulp van de 1 mM-sok van Calcein aliquots van 1 ml secundaire voorraadoplossingen in de microfuge-buis zoals beschreven in Tabel 1.
2. Bereid ijzerammoniumsulfaathexahydraatvoorraden voor door 19 mg FAS-hexahydraat (392,1 g/m) op te lossen in 5 ml Dulbecco's PBS om een 10 mM ijzerammoniumsulfaat (FAS)-oplossing te verkrijgen. Bereid secundaire voorraden FAS voor door verdunning. Om een bouillon van 2 mM FAS (fA) te bereiden, verdunt u 200 μL van de 10 mM FAS-voorraad met PBS met 800 μL Dulbecco's PBS. Om een voorraad van 100 μM FAS (fB) te bereiden, verdunt u 50 μL bouillon fA met 950 μL van Dulbecco's PBS.
3. Om 10 mM Deferipron-bouillon te bereiden, lost u 2,8 mg (139,15 g/M) op in 2 ml Dulbecco's PBS. Bereid secundaire voorraden van 2mM ijzerchelator voor door 200 μL van de 10 mM voorraad te verdunnen met 800 μL Dulbecco's PBS.
   OPMERKING: In deze test moet de ijzerchelator van keuze worden opgelost in Dulbecco's PBS zonder magnesium of calcium. Als werkend voorbeeld gebruikten we de ijzerchelator Deferiprone.

2. Validatie van de test door bepaling van het lineaire bereik van Calceïne-fluorescentie

1. Bereid een reeks Calceïne-voorraden van 1 mM tot 1 μM voor, zoals beschreven in de tabel met de voorraadoplossing (zie tabel 1). Bewaar voorraadoplossingen in het donker om fotochemische afbraak te voorkomen.
2. Pipette 90 μl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) naar putjes A tot H en 1 tot 12 van een plaat met 96 putjes met behulp van een eenkanaals handmatige pipet of een meerkanaals handmatige pipet.
3. Voeg 10 μl Calceïne bouillon van 1 mM toe aan kolom 12, rijen A tot en met H, van de plaat met 96 putjes met behulp van een handpipet met één kanaal.
4. Voeg 10 μl van de vooraf bereide calceïnevoorraad van 800 μm (tabel 1) toe aan een plaat met 96 putjes in kolom 11, rijen A tot H, met behulp van een handmatige pipet met één kanaal.
5. Herhaal de optelprocedure met de voorraden uit tabel 1 , zodat kolom 10 μl van de 400 μM-voorraad bevat en kolom 9 10 μl. van de 200 μM-voorraad enz. Ga verder met deze stapsgewijze procedure over de kolommen totdat kolom 2 10 μL van de 1 μM-voorraad bevat.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van calceïne in elk putje is 10 keer lager dan de voorraadoplossingen als gevolg van de verdunning van 1:10.
6. Voeg 10 μL PBS toe aan kolom 1, rij A tot E.
7. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en stel de analysator op een microplaatlezer in op een excitatie van 490 nm en detectie van 530 nm (of geschikte filterset voor Calcien-fluorescentie).

3. Analysevalidatie door Fe²⁺ ionenafschrikking om Calceïne-fluorescentie te verminderen

1. Bereid een Calceïne (cB) voorraad van 10 μM en een FAS-voorraad (fA) van 2 mM (zie Tabel met materialen). Bewaar de Calceïne bouillon in het donker om fotodegradatie te voorkomen.
2. Voeg met een eenkanaals handmatige pipet of een meerkanaals handmatige pipet 50 μl PBS toe aan de kolommen 2 tot en met 10, rijen A tot en met E. Voeg PBS niet toe aan kolom 11.
3. Voeg 100 μl van een FAS (fA)-voorraad van 2 mM toe aan een plaat met 96 putjes in kolom 11 (rijen A tot E) met behulp van een handmatige pipet met één kanaal.
4. Verwijder met een meerkanaals handmatige pipet 50 μL fA uit kolom 11 en pipetteer deze in de PBS die al in kolom 10 staat, meng grondig door te pipetteren.
5. Ga verder met deze stapsgewijze dubbele verdunningsprocedure in de kolommen 9-2, rijen A tot en met E van de plaat met 96 putjes, en meng door te pipetteren.
6. Verwijder 50 μL oplossing door te pipetteren uit kolom 2 en gooi de oplossing weg bij het afval.
7. Voeg 40 μL PBS toe aan alle putjes met een oplossing erin, kolommen 2-12, rijen A tot E.
8. Voeg 90 μL PBS toe aan putjes kolom 1, rijen A-E. Deze putjes fungeren als een positieve controle van 1 μM Calceïne en 0 μM FAS.
9. Voeg 10 μL 10 μM Calceïne bouillon (cB) toe aan elk putje met een oplossing erin (kolommen 1 t/m 12, rijen A t/m E). Dit resulteert in een topconcentratie van 1000 μM FAS in kolom 11, waarbij de FAS-concentratie halveert voor kolommen 10, 9, 8 tot kolom 2. Elk van de resulterende putjes uit de kolommen bevat 1 μM Calceïne en een verdunning van FAS.
10. Voeg 100 μL PBS toe aan rij F van kolommen 1 tot en met 5 voor de controle alleen PBS. Voeg 100 μL van 2 mM FAS toe aan rij F van kolommen 6 tot 10 voor alleen FAS-controle. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.
11. Analyseer op een microplaatlezer die is ingesteld op excitatie van 490 nm en detectie van 530 nm (of een geschikte filterset voor Calceïne-fluorescentie).

4. Analyse voor het kwantificeren van het vermogen van ijzerchelatoren om de zwakke chelator Calceïne te overtreffen voor Fe²⁺ ionen

1. Bereid een calceïnevoorraad (cB) van 10 μM, een FAS-voorraad (fB) van 100 μM en de ijzerchelatorvoorraden van 2 mM zoals aangegeven in tabel 1. Bewaar Calcein-bouillon in het donker om fotodegradatie te voorkomen.
2. Voeg met een enkelkanaals handmatige pipet of een meerkanaals handpipet 50 μl PBS toe aan de kolommen 2 tot en met 10, rijen A tot en met E, van een plaat met 96 putjes. Voeg PBS niet toe aan kolom 11.
3. Voeg 100 μl van de 2 mM voorraad (fA) van de ijzerchelatoren toe aan een plaat met 96 putjes in kolom 11, rijen A tot en met E met behulp van een handpipet met één kanaal.
4. Verwijder met een meerkanaals handmatige pipet 50 μL fA uit kolom 11 en pipetteer deze in de PBS in kolom 10, rijen A tot E, en meng grondig door te pipetteren.
5. Ga verder met deze stapsgewijze dubbele verdunningsprocedure in de overige kolommen 9-2, rijen A tot en met E van de plaat, meng elk kuiltje door te pipetteren. Verwijder 50 μL uit kolom 2 en gooi het weg. Dit zorgt voor een dubbele verdunning van 2 mM van de ijzerchelator (Deferipron) over de 96 putjes plaatkolommen 11 tot en met 2, rijen A tot E.
6. Pipeteer 30 μL PBS in alle putjes met een oplossing erin (bijv. kolommen 2-11 rijen A tot E).
7. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 10 μL 100 μM FAS-voorraad (fB) toe aan de kolommen 2-12, rijen A tot en met E. Dit resulteert in een concentratie van 1 μM Calceïne en 10 μM FAS in elk putje, en een dubbele verdunning van de chelatoren, waarbij de concentratie elke kolom over de plaat, kolommen 11-2, halveert, met de hoogste concentratie ijzerchelator op 1000 μM in kolom 11 putjes A tot E.
8. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 10 μL 10 μM Calceïne bouillon (cB) toe aan de kolommen 2-12, rijen A tot en met E.
9. Pipetteer 80 μl PBS en 10 μl calceïne bouillon (cB) en 10 μl FAS-bouillon (fB) in kolom 1, rijen A-E met behulp van een pipet. Meng monsters door te pipetteren. Dit zorgt voor de controle van 1 μM Calceïne met 10 μM FAS en geen chelator.
10. Pipetteer 100 μL PBS in rij F, kolommen 1 tot en met 5. Dit zorgt voor de PBS-negatieve controle.
11. Voeg 100 μL van 2 mM ijzerchelator (Deferipron) toe aan rij F, kolommen 6 tot en met 10. Dit geeft de chelator alleen controle.
12. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker. Analyseer op een multimodale microplaatlezer die is ingesteld op excitatie bij 490 nm en detectie bij 530 nm (of een geschikte filterset voor Calcien-fluorescentie).

5. Gegevensanalyse

1. Analyse voor testvalidatie door bepaling van het lineaire bereik van Calceïne-fluorescentie.
   1. Bereken de gemiddelde relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) van rijen A-H voor elke concentratie calceïne in de kolommen van de plaat met 96 putjes uit stap 1 en zet deze uit tegen de concentratie. Plot de lijngrafiek van de calceïneconcentratie op de x-as tegen de gemiddelde RFU op de y-as en gebruik een lineaire regressie om de lijn te geven die het beste past.
   2. Kwantificeer de statistische significantie door de calceïneconcentraties in elke kolom (2-11) te vergelijken met de controle van PBS in kolom 1, rijen A tot E. Voer een variantieanalyse (ANOVA) uit en pas post-hocanalyse toe met behulp van het minst significante verschil (LSD) met een drempel van p <0,001 om de statistische significantie te bepalen (aangeduid met ** in figuur 1).
2. Analyse voor testvalidatie door Fe²⁺ ionenafschrikking om de fluorescentie van calceïne te verminderen.
   1. Bereken de gemiddelde relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) van rijen A tot en met E voor elke concentratie FAS in de kolommen 2-11. Zet de gemiddelde RFU uit voor elke FAS-concentratie op de y-as. Plot op de x-as de concentraties van FAS met behulp van een Log2-schaal, omdat deze de gegevens beter verdeelt. Plot een lijn van best fit met behulp van een lineaire regressie.
   2. Kwantificeer de statistische significantie door de gemiddelde RFU van elke kolom van de controle van PBS te vergelijken, 1 μM Calceïne, 0 μM FAS (kolom 1 rij A tot E). Voer een ANOVA met LSD post-hocanalyse uit met een drempel van p <0,001 om de statistische significantie te bepalen.
3. Analyse voor analyse: kwantificering van het vermogen van ijzerchelatoren om de zwakke chelator Calceïne te overtreffen voor Fe^2+- ionen.
   1. Bereken de gemiddelde relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) van rijen A tot en met E voor elke concentratie chelator in de kolommen 2-11. Grafiek gemiddelde RFU voor elke chelatorconcentratie op de y-as. Plot op de x-as de concentraties van chelatoren met behulp van een Log2-schaal, omdat deze de gegevens beter verdeelt.
   2. Kwantificeer de statistische significantie door de gemiddelde RFU van elke kolom van de controle van PBS te vergelijken: 1 μM Calceïne en 10 μM FAS (kolom 1, rij A tot E). Voer een ANOVA met LSD post-hocanalyse uit met een drempel van p <0,001 om de statistische significantie te bepalen.

Resultaten

Voor de methode die in stap 2 wordt getoond, werd in dit eerste experiment (figuur 1) het lineaire bereik van de microtiterfluorescentieplaatlezer vastgesteld bij het detecteren van Calceïne-fluorescentie-emissies. Onze representatieve resultaten tonen een breed lineair bereik van Calceïne-fluorescentie van 0-100 μM. ANOVA met LSD post-hocanalyse toont aan dat er statistisch significante verschillen zijn in de gemiddelde RFU voor alle Calceïne-concentraties ...

Discussie

De overmatige afhankelijkheid van kankers van ijzer om hun metabolisme van brandstof te voorzien, maakt ijzerchelatie een mogelijke aanvulling op therapeutische regimes⁴. Er is echter een beperkt vermogen om nieuwe metaalionenchelatoren snel te screenen op hun vermogen om ijzerionen te binden. Van de veelgebruikte en algemeen verkrijgbare fluorescerende sonde Calceïne is bekend dat het werkt als een zwakke ijzerchelator en dat binding door ijzerionen de Calceïne-f...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	215406	ook bekend als FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D5652	magnesium en calcium vrij
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Sigma-Aldrich	M0812	elke optisch transparante 96 well plate zal werken