Methodenartikel

Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

DOI:

10.3791/66423

⸱

29 december 2023

 ,  , 
1Graduate School of Engineering, Kochi University of Technology, 2School of Engineering Science, Kochi University of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De interacties van biomoleculen, zoals eiwit-eiwitinteracties, vormen de moleculaire basis van biologische functies. Als interactie-nulle/gestoorde mutanten die specifiek de relevante interactie missen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze enorm helpen om de functie(s) van deze interactie te begrijpen. Dit artikel presenteert een efficiënte manier om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwitinteracties zijn een van de meest basale processen die ten grondslag liggen aan biologische verschijnselen. Een van de eenvoudigste en beste manieren om de rol(len) en functie(s) van een specifieke eiwit-eiwitinteractie te begrijpen, is door het fenotype van het wildtype (met de relevante eiwit-eiwitinteractie) te vergelijken met die van mutanten die de relevante interactie missen. Daarom, als dergelijke mutanten kunnen worden geïsoleerd, zullen ze helpen om de gerelateerde biologische processen op te helderen. De gist-twee-hybride (Y2H) procedure is een krachtige aanpak, niet alleen om eiwit-eiwitinteracties te detecteren, maar ook om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren. In dit artikel wordt een protocol gepresenteerd om interactie-null/gestoorde mutanten te isoleren met behulp van Y2H-technologie. Eerst wordt een mutatiebibliotheek geconstrueerd door de polymerasekettingreactie te combineren met efficiënte naadloze kloontechnologie, die de lege vector efficiënt uit de bibliotheek uitsluit. Ten tweede worden interactie-null/gestoorde mutanten gescreend door de Y2H-test. Door een truc in de Y2H-vector worden ongewenste mutanten, zoals mutanten met frameshift en nonsense-mutaties, efficiënt uit het screeningproces geëlimineerd. Deze strategie is eenvoudig en kan daarom worden toegepast op elke combinatie van eiwitten waarvan de interactie kan worden gedetecteerd door het twee-hybride systeem.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interacties tussen biomoleculen zijn het meest basale onderdeel van biologische fenomenen. Eiwit-eiwitinteracties vormen een aanzienlijk deel van dergelijke interacties. Daarom is identificatie van de interactiepartner(s) van een interessant eiwit van cruciaal belang om de functie van het eiwit/gen van belang verder op te helderen. De gist-twee-hybride (Y2H) methode is een populaire techniek om eiwit-eiwitinteracties in vivo1 te identificeren. In dit systeem worden twee eiwitten (X en Y) waarvan de interactie moet worden getest, gefuseerd met respectievelijk het DNA-bindende (DB) domein en het transcriptionele activeringsdomein (AD). Het DB-X-fusie-eiwit bindt aan een herkenningssequentie van het DB-domein; daarom, wanneer eiwitten X en Y interageren, komt het AD-Y-fusie-eiwit in de buurt van de herkenningssequentie. Bijgevolg wordt transcriptie van het reporter-gen stroomafwaarts van de herkenningssequentie geactiveerd. Daarom kan de aan- of afwezigheid van activiteit van reportergen worden gebruikt om de aan- of afwezigheid van de eiwit-eiwitinteractiete bepalen 1.

Zodra een specifieke interactiepartner van het betreffende eiwit is geïdentificeerd, moeten verdere analyses worden uitgevoerd om de biologische functie van de interactie op te helderen. Voor dit doel, als mutanten van de eiwitten die de specifieke eiwit-eiwitinteractie aantasten of verwijderen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze dienen als krachtige hulpmiddelen. Het Y2H-systeem kan direct worden gebruikt om dergelijke mutanten te isoleren door 'interactie-negatieve' klonen te screenen, te beginnen met de wild-type 'interactie-positieve' kloon. Om dit proces te versnellen werden 'omgekeerde' Y2H (rY2H) systemen ontwikkeld 2,3. In rY2H-systemen herbergen de gastheergiststammen contra-selecteerbare markergenen als reportergenen, wat betekent dat gistcellen alleen groeien als de AD-Y- en DB-X-eiwitten niet op elkaar inwerken.

Hoewel zowel de Y2H- als de rY2H-systemen de isolatie van interactie-negatieve mutanten mogelijk maken, is het proces van het isoleren van de mutanten moeizaam omdat niet alle kandidaten die door screening worden verkregen, het gewenste type mutaties dragen (meestal missense-mutaties). Het ernstigste probleem is dat een aanzienlijk deel van de kandidaten frameshift- of onzinmutaties herbergt, en het is noodzakelijk om western blotting uit te voeren om ongewenste klonen uit te sluiten. Om dit probleem op te lossen, zijn nieuwe plasmidevectoren ontwikkeld4. In deze vectoren wordt KanMX, een marker voor geneesmiddelresistentie, out-of-frame downstream van het DB-domein of AD gepositioneerd. Het markergen wordt pas in-frame met het DB-domein of AD wanneer het gen van interesse wordt ingebracht. Wanneer een willekeurige mutatie of mutaties wordt geïntroduceerd in het gen van belang, kunnen ongewenste mutanten, zoals mutanten met frameshift of nonsense-mutaties, gemakkelijk worden geëlimineerd door selectie van geneesmiddelresistentie uit te voeren, en kandidaten met gewenste missense-mutaties kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met de Y2H-screening4. Dit artikel presenteert een protocol om interactie-null/verminderde mutanten van een eiwit van belang te isoleren met behulp van deze strategie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bouw van de mutantenbibliotheek

  1. Stel de polymerasekettingreactie (PCR) in (een voorbeeld wordt hieronder weergegeven). Bereid over het algemeen 50 μL van de reactie voor, die wordt verdeeld in tien aliquots van 5 μL, en amplificeer het doelgenfragment in een PCR-machine4.
    OPMERKING: Gebruikers moeten een geschikte polymerase kiezen om mutaties efficiënt te introduceren. Als het te amplificeren DNA-fragment kort is, is een polymerase met een hoger foutenpercentage nodig, zoals Taq-polymerase, dat geen proefleesactiviteit heeft. Als het te amplificeren DNA-fragment lang is, is een polymerase met een hogere getrouwheid nodig om het aantal mutaties te verminderen. Mutaties treden om de paar honderd basenparen op na 30 cycli van amplificatie met regulier Taq-polymerase4. In de representatieve resultaten werd een ander Taq-polymerase gebruikt (zie Materiaaltabel), dat een hogere betrouwbaarheid heeft dan regulier Taq-polymerase, en de mutatiesnelheid was één op 600 basenparen. Een voorbeeld van de PCR-mengsels, de details van de primer en de reactieomstandigheden vindt u in aanvullend dossier 1.
  2. Wanneer de PCR is voltooid, combineert u alle aliquots van de reactie, bevestigt u dat de DNA-fragmenten van belang zijn geamplificeerd met behulp van agarosegelelektroforese, enz., en zuivert u het DNA5.
  3. Stel het in stap 1.2 gegenereerde DNA-fragment samen met de juiste Y2H-vector met behulp van een 'naadloze' kloonstrategie (Figuur 1).
    OPMERKING: Het naadloze kloonsysteem, zoals Gibson assembly6, minimaliseert vervuiling van de geconstrueerde mutantenbibliotheek door lege vectoren die via zelfligatie worden gegenereerd. Een lijst van Y2H-vectoren is opgenomen in tabel 1. Ze kunnen worden bereid door BamHI-vertering voordat ze worden geassembleerd. Alle plasmiden zijn verkrijgbaar bij het National BioResource Project - gist (zie Tabel met materialen).
  4. Breng het in stap 1.3 gegenereerde reactiemengsel in Escherichia coli-competente cellen die zijn bereid volgens een zeer efficiënt E. coli-transformatieprotocol (bijv. Inoue et al.7). Verspreid alle competente cellen over verschillende LB-platen (1% trypton, 0,5% gistextract, 1% NaCl en 2% agar) die geschikte antibiotica bevatten (zie Materiaaltabel). Verdeel nu een kleine hoeveelheid (~1/100 van de totale reactie) op hetzelfde selectieplaatje om de bibliotheektiter te berekenen. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
  5. Zodra een groot aantal E. coli-kolonies is verschenen, schraapt u alle cellen van het oppervlak van de plaat met behulp van een plastic wegwerplus. Herstel plasmide-DNA van deze cellen met behulp van populaire methoden, zoals alkalische lysis8. Tel tegelijkertijd het aantal kolonies dat verschijnt na het verspreiden van kleine hoeveelheden van het transformatiemengsel op de plaat. Maak aan de hand van dit getal een schatting van het totale aantal onafhankelijke klonen in de bibliotheek.
    OPMERKING: Pak nu een paar onafhankelijke kolonies (4-6) op die op de plaat verschijnen waarop de kleine aliquots van de transformatiereactie zijn verspreid, kweek ze afzonderlijk en isoleer plasmiden ervan om te bevestigen dat vrijwel alle klonen de gewenste DNA-fragmenten dragen5. Er zijn veel commerciële kits beschikbaar om plasmiden uit E. coli te isoleren. Het aantal kolonies dat op de plaat verschijnt na het verspreiden van kleine aliquots kan handmatig worden geteld.
  6. Meet de concentratie van de DNA-pool van de bibliotheek. Gewoonlijk is een paar honderd nanogram bibliotheek-DNA voldoende om in de volgende stap enkele duizenden transformaties te verkrijgen.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de DNA-concentratie te meten met behulp van een fluorescerende kleurstof die zich aan DNA bindt, omdat de meting van A260 vaak onnauwkeurig is.

2. Transformatie van gist met de mutantenbibliotheek en replica plating

  1. Introduceer de mutantenbibliotheek in de gastheergiststam (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) voor de Y2H-test met behulp van ongeveer 100 ng DNA. Transformeer de gastheercellen vooraf met het 'aas'-plasmide.
    1. Na de transformatieprocedure suspendeert u de gistcellen in steriel water en verspreidt u aliquots van verschillende hoeveelheden op geschikte platen (meestal SC-medium zonder leucine en tryptofaan: SC-LW [0,67% giststikstofbasis, 2% glucose, 1,546 g/L SC dubbele drop-out mix -Leu -Trp en 2% agar, zie Materiaaltabel]). Incubeer deze platen een nacht bij 30 °C.
      OPMERKING: Het standaardprotocol, zoals de lithiumacetaat-PEG-methode11 met ~5 × 106 logaritmisch groeiende cellen, is voldoende voor de transformatie van gist. Een andere methode met een hoge transformatie-efficiëntie, zoals elektroporatie, kan ook worden gebruikt.
  2. De volgende dag, wanneer kleine kolonies verschijnen, selecteert u de platen met een geschikt aantal cellen (500-2000) en maakt u er als volgt replicaten van.
  3. Leg twee vellen filtreerpapier op een replicablok om meerdere replica's te maken (medium is SC-LW en SC-LW bevattend kanamycine) (zie Materiaaltabel). Incubeer bij 30 °C gedurende 1-2 dagen.
    OPMERKING: De concentratie kanamycine (G418) is 600 μg/ml. Gebruik geen fluweel voor replica-plating, omdat de resolutie van kolonies verloren gaat.
  4. Zodra de kolonies zijn gegroeid, vergelijk je borden en kies je kandidaten. Voer een Y2H-kleurentest uit (zie stap 3) als lacZ als verslaggever wordt gebruikt.
    OPMERKING: Voor de Y2H-verslaggever is lacZ meestal beter in het detecteren van een zwakke interactie dan HIS3.

3. Y2H-kleurentest

  1. Leg een vel filtreerpapier dat van tevoren op de juiste maat is gesneden op de replicaplaat die met stap 2 is voorbereid. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan tussen het filterpapier en de plaat.
    OPMERKING: Gebruik filterpapier nr. 4A of filterpapier van klasse 50 (zie materiaaltabel). Elke SC-LW of SC-LW bevattende kanamycine-platen, die zijn gemaakt door middel van replicaplating, kunnen worden gebruikt voor de kleurentest.
  2. Wanneer het filterpapier op de plaat volledig bevochtigd is (wanneer de kleur van het filtreerpapier volledig verandert), leg je er meerdere vellen keukenpapier op en zorg je ervoor dat het in contact komt met het filterpapier om overtollig vocht te verwijderen. Verwijder het keukenpapier wanneer het water is opgenomen en van kleur verandert. Herhaal dit proces twee of drie keer.
  3. Pak de randen van het filterpapier op met een pincet, trek het snel van de plaat, dompel het onder in vloeibare stikstof en vries het in. Als er geen vloeibare stikstof beschikbaar is, leg het filterpapier dan op een plastic bakje met de koloniekant naar boven en plaats het onmiddellijk in een vriezer (-20 °C tot -80 °C) om volledig te bevriezen.
  4. Verwijder het bevroren filtreerpapier en leg het, met de koloniekant naar boven, op een droge papieren handdoek om te ontdooien. Plaats het filtreerpapier onmiddellijk na het ontdooien met de koloniezijde naar boven op een ander filtreerpapier dat op een plastic bakje of afsluitbare container is geplaatst en gedrenkt is met Z-buffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl en 1 mM MgSO4, pH 7,0) bevattend X-gal (5-broom-5-chloor-3-indolyl-β-D-galactoside) en 2-mercaptoethanol9 (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan tussen het bovenste en onderste filterpapier.
  5. Dek het plastic bakje met het filterpapier af en doe het in een luchtdichte verpakking of plastic zak. Sluit de luchtdichte verpakking of plastic zak en broed deze uit bij 37 °C tot er een blauwe kleur verschijnt.
  6. Wanneer er een blauwe kleur verschijnt, plaatst u het filtreerpapier met de koloniezijde naar boven op ongeveer 500 μL stopoplossing (1 M Na2CO3) op een schone plastic bak. Stopoplossing trekt snel in; Verwijder het filter daarom onmiddellijk, leg het op een schone papieren handdoek met de koloniekant naar boven en laat het drogen.
  7. Nadat de papieren handdoek is vervangen en het filter droog genoeg is, gebruikt u een scanner of ander apparaat om de gegevens vast te leggen.

4. Herstel en bevestiging van kandidaat-klonen

  1. Selecteer witte en KanR kandidaat-klonen van de originele plaat van de replica (of de gerepliceerde plaat die niet is gebruikt voor de kleurentest). Voorbeelden zijn weergegeven in figuur 1C. Controleer of kandidaat-klonen wit en KanR zijn door ze opnieuw te strepen als een klein vlekje op SC-LW-medium dat kanamycine bevat en ze gedurende 1-2 dagen bij 30 °C te incuberen. Maak minstens twee sets of maak de volgende dag replica's.
    OPMERKING: Witte kolonies moeten worden geselecteerd omdat lichtblauwe kolonies de interactie kunnen behouden.
  2. Zodra kandidaat-klonen goed zijn hergroeid, herhaalt u de kleurentest met ten minste één plaat die in stap 4.1 is gegenereerd, zoals beschreven in stap 3, en controleert u of ze wit blijven en niet blauw worden (Figuur 2A).
    OPMERKING: Wanneer u de kandidaten opnieuw uitstrooit, draag dan geen grote hoeveelheden cellen over. Te veel cellen maken het onmogelijk om KanR - en KanS-klonen te onderscheiden.
  3. Neem klonen die nog wit zijn en KanR gegenereerd in stap 4.2 van de plaatresten en kweek ze zelfstandig in 1 ml selectiemedium (SC-L of SC-W, afhankelijk van welke vector wordt gebruikt voor de bibliotheekconstructie) 's nachts bij 30 °C.
  4. Breng de cultuur over naar een microbuis en verzamel cellen door centrifugeren (~15.000 × g, gedurende 10-30 seconden bij kamertemperatuur). Isoleer het hele DNA van de celpellet als volgt.
  5. Suspendeer de celpellet in 400 μl lysisbuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8.0) en 1 mM EDTA) met elk 1 μl 2-mercaptoethanol en 20 mg/ml Zymolyase 100T (zie materiaaltabel) en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om de celwanden te verteren. Meng op dit moment voorzichtig door de tube elke 5-10 minuten om te keren.
  6. Wanneer de celsuspensie ondoorzichtig of doorschijnend is geworden, voeg dan een gelijk volume van een mengsel van fenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1) toe en meng goed door 10-20 s op matige snelheid te vortexen.
  7. Centrifugeer de microbuisjes in een microcentrifuge gedurende 5 minuten op volle snelheid (~15.000 × g, bij kamertemperatuur) en herstel de waterige fase met DNA in een nieuwe microbuis. Voeg 0,8 volume isopropanol toe en meng goed door de tube om te keren.
  8. Laat de buis 2-3 minuten op kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens 4-5 minuten in een microcentrifuge op volle snelheid (~15.000 × g, bij kamertemperatuur) om het DNA neer te slaan.
  9. Verwijder het supernatans en was het neerslag met ongeveer 500 μL 70% ethanol. Verwijder de ethanol volledig en droog het neerslag kort.
  10. Voeg 20 μL TE-buffer (10 mM Tris-Cl (8.0) en 1 mM EDTA) toe aan het neerslag, meng kort en laat de buis een nacht op kamertemperatuur staan om het neerslag op te lossen.
    OPMERKING: Als gebruikers haast hebben, houd de buizen dan op 37-50 °C. Het DNA-neerslag lost binnen een paar uur op.
  11. Zodra de pellet volledig is opgelost, transformeert u E. coli met een kleine hoeveelheid van deze DNA-oplossing.
    OPMERKING: Ongeveer 0,5 μL DNA-oplossing is voldoende als E. coli met een hoge transformatie-efficiëntie wordt gebruikt.
  12. Wanneer E. coli-kolonies verschijnen, kies dan verschillende onafhankelijke kolonies, kweek ze en herstel plasmiden met behulp van standaardmethoden, zoals alkalische lysis.
  13. Introduceer het plasmide-DNA dat in stap 4.12 is verkregen in Y2H-gastheercellen die het aasplasmide herbergen. Wanneer transformanten verschijnen, controleer ze dan aan de hand van de kleurtest (ze moeten wit lijken) en western blotting4 (ze moeten een eiwit van de gewenste grootte tot expressie brengen).
    OPMERKING: De post-alkalische methode12 is een gemakkelijke en snelle manier om een extract van hele cellen uit gist te bereiden.
  14. Als aan de bovenstaande twee criteria is voldaan, bepaal dan de mutatieplaats van de klonen door nucleotidesequencing4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onlangs werd ontdekt dat de C-terminale helft van het Pol2-eiwit (Pol2-C) interageert met Mcm10. Beide eiwitten zijn essentieel voor het op gang brengen van DNA-replicatie en dus voor de celgroei in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Om de biologische betekenis van deze interactie te helpen begrijpen, werden Pol2-C-mutanten die geen/verminderde interactie met Mcm10 hebben, geïsoleerd met behulp van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel wordt beschreven hoe je interactie-null/gestoorde mutanten kunt isoleren met behulp van de Y2H-test. Dergelijke mutanten zijn krachtige hulpmiddelen om de functie van een interessant eiwit te analyseren. Om dergelijke mutanten te isoleren, werden eerder rY2H-assays ontwikkeld door de Y2H-gastheerstam 2,3 te modificeren. Ze hebben de hoeveelheid arbeid echter niet sterk verminderd. Daarentegen kunnen mutanten met deze methode worden geïsoleerd zonde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y. Tanaka voerde de technische verbetering van Y2H uit. Dit werk wordt ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 en het Institute for Fermentation, Osaka.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA (8.0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
10% SDS SolutionFujifilm Wako Pure Chemical Corp.313-90275
2-mercaptoethanolFujifilm Wako Pure Chemical Corp.135-07522
2-propanolKishida Chemical Co. Ltd.110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.021-07852
AgarFormediumAGR60
Ampicillin SodiumFujifilm Wako Pure Chemical Corp.68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT  Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.M180-7
DNA from salmon testesMerck KGaA.D1626
EthanolMerck KGaA.9-0770-4-4L-J
Filter paper for colony lift (Grade 50)Whatman, Cytiva1450-090
Filter paper for colony lift (No.4A)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.01411090
Filter paper for replicaplating (No.1)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.00011150
G-418 SulfateFujifilm Wako Pure Chemical Corp.075-05962
Hydrochloric acidKishida Chemical Co. Ltd.230-37585
KClFujifilm Wako Pure Chemical Corp.163-03545
Lithium Acetate DihydrateNacalai Tesque Inc.20604-22
MgSO4•7H2OFujifilm Wako Pure Chemical Corp.131-00405
Na2HPO4•12H2ONacalai Tesque Inc.10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4•2H2ONacalai Tesque Inc.31717-25
Paper towelAS ONE Corp.7-6200-02
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1Nacalai Tesque Inc.25970-56
Plasmid DNAsthe National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Plasmid isolation KitNippon Genetics Co. Ltd.FG-90502
Polyethylene Glycol #4,000Nacalai Tesque Inc.11574-15
SC double drop-out mix -Leu -TrpFormediumDSCK172
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )Takara Bio Inc.#639648
Skim milk powderFujifilm Wako Pure Chemical Corp.190-12865
Streptomycin SulfateFujifilm Wako Pure Chemical Corp.3810-74-0
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)Promega Corp.M7122
TRIS (hydroxymethyl) aminomethaneFormediumTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
TryptoneThermoFisher scientific Inc.211705
Tween 20Nacalai Tesque Inc.35624-15
Yeast ExtractThermoFisher scientific Inc.212750
Yeast Nitrogen Base (YNB)FormediumCYN0210
Zymolyase 100TNacalai Tesque Inc.07665-55

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Leanna, C. A., Hannink, M. The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions. Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).
  3. Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).
  4. Tanaka, S. An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique. Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).
  5. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  6. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  7. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  8. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  9. Bartel, P. L., Fields, S. Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system. Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).
  10. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
  11. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).
  12. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  13. Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation. EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).
  14. Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins. Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).
  15. Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer. EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Protein Protein InteractionInteraction Null MutantsMutant ScreeningMutation LibrarySeamless CloningPolymerase Chain ReactionCell Cycle RegulationCyclin Dependent KinasesDNA Replication

Gerelateerde artikelen