Methodenartikel

Op bioluminescentieresonantie energieoverdracht (BRET) gebaseerde test voor het meten van interacties van CRAF met 14-3-3-eiwitten in levende cellen

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66436

⸱

1 maart 2024

1Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 3Laboratory of Cell and Developmental Signaling, Center for Cancer Research, National Cancer Institute-Frederick

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een op BRET gebaseerde test voor het meten van de interacties van het CRAF-kinase met 14-3-3-eiwitten in levende cellen. Het protocol schetst stappen voor het voorbereiden van de cellen, het uitlezen van BRET-emissies en gegevensanalyse. Er wordt ook een voorbeeldresultaat gepresenteerd met identificatie van de juiste controles en probleemoplossing voor testoptimalisatie.

Samenvatting

CRAF is een primaire effector van RAS GTPases en speelt een cruciale rol bij de tumorigenese van verschillende KRAS-gedreven kankers. Bovendien is CRAF een hotspot voor kiembaanmutaties, waarvan is aangetoond dat ze de ontwikkelings-RASopathie, het Noonan-syndroom, veroorzaken. Alle RAF-kinasen bevatten meerdere fosforyleringsafhankelijke bindingsplaatsen voor 14-3-3 regulerende eiwitten. De differentiële binding van 14-3-3 aan deze plaatsen speelt een essentiële rol bij de vorming van actieve RAF-dimeren op het plasmamembraan onder signaalomstandigheden en bij het handhaven van RAF-autoremming onder rustomstandigheden. Begrijpen hoe deze interacties worden gereguleerd en hoe ze kunnen worden gemoduleerd, is van cruciaal belang voor het identificeren van nieuwe therapeutische benaderingen die gericht zijn op de RAF-functie. Hier beschrijf ik een op bioluminescentieresonantie energieoverdracht (BRET) gebaseerde test voor het meten van de interacties van CRAF met 14-3-3 eiwitten in levende cellen. In het bijzonder meet deze test de interacties van CRAF gefuseerd met een Nano-luciferasedonor en 14-3-3 gefuseerd met een Halo-tagacceptor, waarbij de interactie van RAF en 14-3-3 resulteert in energieoverdracht van donor naar acceptor en het genereren van het BRET-signaal. Het protocol laat verder zien dat dit signaal kan worden verstoord door mutaties waarvan is aangetoond dat ze 14-3-3-binding aan elk van zijn RAF-dockingplaatsen met hoge affiniteit voorkomen. Dit protocol beschrijft de procedures voor het zaaien, transfecteren en vervangen van de cellen, samen met gedetailleerde instructies voor het lezen van BRET-emissies, het uitvoeren van gegevensanalyse en het bevestigen van eiwitexpressieniveaus. Daarnaast worden voorbeeldanalyseresultaten, samen met stappen voor optimalisatie en probleemoplossing, verstrekt.

Inleiding

RAF-kinasen (ARAF, BRAF en CRAF) zijn de directe effectoren van RAS GTPases en de initiërende leden van de pro-proliferatieve/pro-overleving RAF-MEK-ERK-kinasecascade. Recente studies hebben aangetoond dat CRAF-expressie een sleutelrol speelt bij het ontstaan van tumoren van verschillende KRAS-gedreven kankers, waaronder niet-kleincellige longkanker en ductaal adenocarcinoomvan de pancreas 1,2,3,4,5. Bovendien veroorzaken CRAF-mutaties in de kiembaan een bijzonder ernstige vorm van de RASopathie, het Noonan-syndroom 6,7. Het begrijpen van CRAF-regulatie is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van succesvolle therapeutische benaderingen die gericht zijn op de functie ervan in cellen.

Alle RAF-kinasen kunnen worden onderverdeeld in twee functionele domeinen, een C-terminaal katalytisch (CAT) domein en een N-terminaal regulatief (REG) domein, dat de activiteit ervan regelt (Figuur 1A)8. Het REG-domein omvat het RAS-bindingsdomein (RBD), het cysteïnerijke domein (CRD) en een serine/threonine-rijk gebied (S/T-rijk). Met name het S/T-rijke gebied bevat de N'-site, die op een fosforyleringsafhankelijke manier bindt aan 14-3-3 (S259 in CRAF; Figuur 1A) 8. Het CAT-domein omvat het kinasedomein, samen met een tweede 14-3-3-dockingplaats met hoge affiniteit, de C'-site genoemd (S621 in CRAF; Figuur 1A) 8. De differentiële binding van dimeer 14-3-3-eiwitten aan de N'- en C'-plaatsen, samen met de CRD, speelt een cruciale rol bij zowel RAF-activering als -remming 9,10,11,12,13. Onder normale signaleringsomstandigheden wordt RAF-activering geïnitieerd door de rekrutering ervan naar het plasmamembraan door RAS, waardoor het actieve dimeren kan vormen, waarvan het BRAF-CRAF-heterodimeer de overheersende actieve vormis 14,15. Biochemische testen met BRAF en CRAF, samen met cryogene elektronenmicroscopie (Cryo-EM) structuren van dimeer BRAF, geven aan dat een 14-3-3 dimeer actieve RAF-dimeren stabiliseert door gelijktijdig te binden aan de C'-plaats van beide RAF-protomeren (Figuur 1B)9,13,16,17. Omgekeerd hebben studies aangetoond dat RAF onder rustige omstandigheden een cytosolische, auto-geremde bevestiging aanneemt, waarbij het REG-domein bindt aan het CAT-domein en de activiteit ervan remt 12,18,19,20. Deze gesloten toestand wordt gestabiliseerd door een 14-3-3 dimeer dat gebonden is aan de CRD- en N'-site in het REG-domein en aan de C'-site in het CAT-domein (Figuur 1B)10,13,21. In BRAF wordt dit model ondersteund door recente Cryo-EM-structuren van auto-geremde BRAF-monomeren en door onze eerdere biochemische studies 10,12,13,21,22. Hoewel is aangetoond dat 14-3-3 een remmende rol speelt bij CRAF-regulatie23, kan een BRAF-achtige auto-geremde toestand een mindere rol spelen bij CRAF-regulatie12; daarom zijn verdere studies nodig om de mechanismen te verduidelijken waarmee 14-3-3-eiwitten de CRAF-activiteit reguleren. De 14-3-3-gemedieerde regulatie van RAF-kinasen vereist een overvloed aan RAF-fosforylerings- en defosforyleringsgebeurtenissen, de binding aan verschillende regulerende eiwitten en interacties met het plasmamembraan8. Daarom is het van cruciaal belang dat 14-3-3-RAF-interacties worden gemeten onder fysiologisch relevante omstandigheden en in aanwezigheid van een intacte lipidedubbellaag.

Om dit probleem aan te pakken, werd NanoBRET (vanaf hier aangeduid als N-BRET; zie Tabel van Materialen voor kitdetails) technologie gebruikt om een nabijheidsgebaseerde test te ontwikkelen voor het meten van de interacties van CRAF met 14-3-3 eiwitten in levende cellen (Figuur 1C). Dit op BRET gebaseerde systeem meet de interacties van twee interessante eiwitten (POI), waarbij het ene eiwit wordt gelabeld met een nanoluciferase (Nano) donor en het andere met een Halo-tag, voor labeling met de Halo618-energieacceptorligand 22,24. Interactie van de eiwitten van belang resulteert in energieoverdracht van donor naar acceptor, die op zijn beurt het BRET-signaal genereert (Figuur 1C). Het extreem heldere Nano-donoreiwit (emissie (em) 460 nm) en het Halo618-ligand (em 618 nm) zorgen voor een grotere spectrale scheiding en gevoeligheid ten opzichte van conventionele BRET, waardoor het een ideaal platform is voor het bestuderen van zwakkere interacties en het detecteren van subtiele veranderingen in binding24. Inderdaad, we ontwikkelden eerder een op N-BRET gebaseerde test voor het meten van de autoremmende interacties van de RAF REG- en CAT-domeinen, die essentieel was voor de karakterisering van een panel van RASopathy-mutaties in de BRAF CRD en het cruciale belang van dit domein aantoonde voor het handhaven van auto-remming en het voorkomen van constitutieve BRAF-activering12.

De hier beschreven test meet de interacties van CRAF, gefuseerd met een N-terminale Nano-tag (Nano-CRAF), en de zeta-isovorm van 14-3-3 gefuseerd met C-terminale Halo-tag (14-3-3ζ-Halo; Figuur 1C). We tonen aan dat de interacties van Nano-CRAF met 14-3-3ζ-Halo een robuust BRET-signaal genereert, dat op zijn beurt kan worden verstoord door mutaties die 14-3-3-binding aan de N'-site (S259A) en/of de C'-site (S621A) verhinderen. Het volgende protocol biedt gedetailleerde stappen voor het uitvoeren, optimaliseren en oplossen van problemen met deze test.

Protocol

OPMERKING: Deze test wordt uitgevoerd in 293FT-cellen. Een goed gekarakteriseerde en gemakkelijk te transfecteren epitheellijn afgeleid van menselijke embryonale niercellen. Een enkel confluent kweekschaaltje van 10 cm van deze cellen levert doorgaans voldoende cellen voor het zaaien van 20 putjes weefselkweekplaten met 6 putjes. Stappen 1-3 moeten worden uitgevoerd met behulp van een steriele techniek in een biologische veiligheidskast.

1. Cel zaaien (dag 1)

OPMERKING: In deze stap worden de cellen losgemaakt van de weefselkweekschaal(en), geteld en gezaaid in weefselkweekplaten met 6 putjes voor transfectie in stap 2 (Figuur 2).

  1. Zuig het medium op uit de cellen in de schaal van 10 cm. Was de cellen met 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en zuig ze op.
  2. Voeg 1 ml trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe en incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 °C om de cellen los te maken van de schaal.
  3. Voeg 9 ml van het volledige gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) van Dulbecco toe aan de cellen om trypsine te neutraliseren en pipetteer herhaaldelijk op en neer om een homogene eencellige suspensie te genereren.
  4. Breng onmiddellijk 20 μl cellen over in een buisje van 1,7 ml en meng met 20 μl trypanblauwe kleurstof. Tel cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller (materiaaltabel) of hemocytometer.
  5. Verdun de cellen tot 2 x 105 cellen/ml in volledige DMEM-media en voeg 2 ml toe aan elk putje van een weefselkweekplaat met 6 putjes (4 x 105 cellen/putje). Incubeer cellen bij 37 °C en 10% CO2 's nachts.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 293FT-cellen te gebruiken die minder dan 20x zijn gepasseerd. We hebben eerder ontdekt dat het gebruik van cellen met grotere passagenummers kan resulteren in verminderde BRET-ratio's en verhoogde well-to-well-signaalvariabiliteit.

2. Celtransfectie (dag 2)

OPMERKING: Hier worden de cellen getransfecteerd met de pCMV5-NanoLuc-CRAF- en pCMV5-14-3-3ζ-Halo-expressieconstructies, samen met pCDNA3.1 lege vector (Figuur 2).

  1. Verdun voorafgaand aan transfectie de N-BRET-plasmiden tot 5 ng/μL en pCDNA3.1 tot 100 ng/μL en nummer een set steriele buisjes van 1,7 ml.
  2. Voeg 100 μL transfectiemedia (zie Tabel met materialen voor details) toe aan elke buis, samen met 5 ng pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng pCMV5-14-3-3ζ en 200 ng PCDNA3.1.
  3. Voeg 2 μL transfectiereagens toe (zie de materiaaltabel voor details) en draai voorzichtig om te mengen. Pulseer de buisjes kort in een microcentrifuge om ervoor te zorgen dat alle vloeistof op de bodem van de buisjes wordt opgevangen en incubeer vervolgens gedurende 15 minuten bij ongeveer 25 °C.
  4. Voeg druppelsgewijs transfectiecomplexen toe aan de cellen en incubeer bij 37 °C/10% CO2 gedurende 16-20 uur om de halo- en nano-gelabelde eiwitten tot expressie te brengen.
    OPMERKING: De toevoeging van DNA van een lege vector (pCDNA3.1) is essentieel voor het bereiken van een hoge transfectie-efficiëntie van de N-BRET-expressieconstructies. Het niet toevoegen van een lege vector resulteert in verminderde expressieniveaus van de 14-3-3ζ-Halo- en Nano-CRAF-eiwitten en resulteert op zijn beurt in zwakke en inconsistente BRET-verhoudingen, zoals eerder besproken22.

3. Cel relateren (dag 3)

OPMERKING: In deze stap worden de cellen overgebracht naar een plaat met 384 putjes en ofwel Halo 618-ligand (+ligand; Tabel met materialen) of DMSO (+voertuig) wordt toegevoegd voor het aflezen van de BRET-emissies in stap 4. De resterende cellen worden overgebracht naar verse kweekplaten met 6 putjes voor western blot-analyse in stap 5 (figuur 2).

  1. Verzamel de volgende materialen en bereid het werkgebied voor zoals hieronder beschreven.
    1. Met behulp van een waterbad van 37 °C, trypsine-EDTA voorverwarmen, samen met zowel serumvrije assay media als 10% FBS-gesupplementeerde assay media (zie Materiaaltabel voor details).
    2. Op basis van het aantal te meten monsters, labelt u vooraf drie sets steriele buisjes van 1,7 ml (set 1-3) en één set steriele conische bodembuisjes van 15 ml. Rust een centrifuge met zwenkemmer uit met slanginzetstukken van 15 ml en koel voor tot 4 °C.
    3. Plaats de volgende items in de weefselkweekkap: reagentiareservoirs, weefselkweekplaten met 384 putjes, weefselkweekplaten met 6 putjes, een multikanaalspipet en tips, objectglaasjes/kamers voor het tellen van cellen en trypan blauwe beits (materiaaltabel), samen met 1.7 ml buissets 1-3.
  2. Oogst en tel de cellen zoals hieronder beschreven.
    1. Zuig de media van de 6-wells platen op en voeg 250 μL trypsine-EDTA toe aan de cellen. Incubeer de platen met 6 putjes bij 37 °C tot de cellen beginnen los te laten (3-5 min).
    2. Voeg 1 ml 10% FBS-gesupplementeerd testmedium toe aan elk putje om de trypsine te neutraliseren en de pipet krachtig op en neer te bewegen om een eencellige suspensie te genereren.
    3. Breng 1 ml van de celsuspensie over naar de vooraf geëtiketteerde buisjes van 15 ml. Voeg nog eens 1 ml 10% FBS-gesupplementeerd analysemedium toe aan elk van de buisjes van 15 ml.
    4. Keer de buisjes 5x om om te mengen en breng onmiddellijk 20 μL celsuspensie over naar buisset 1.
    5. Centrifugeer in de voorgekoelde zwenkemmer gedurende 5 minuten op ~250 x g. Meng tijdens de centrifugatiestap 20 μL trypanblauwe bloedcelkleuring met de cellen in buisset 1 en tel vervolgens de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of hemocytometer. Een opbrengst van 6-8 x 105 cellen/ml is typisch.
    6. Verwijder de buisjes van 15 ml uit de centrifuge en zuig de media uit de celpellets op. Resuspendeer de celpellets tot 2 x 105 cellen/ml in serumvrije testmedia en pipetteer krachtig om een enkelcellige suspensie te genereren.
      OPMERKING: Het gebruik van serumvrije Assay Media wordt gebruikt om normale celsignaleringsroutes tot rust te brengen.
  3. Cellen opnieuw platen in platen met 384 putjes en 6 putjes zoals hieronder beschreven.
    1. Keer de buisjes van 15 ml meerdere keren om een homogene celsuspensie te garanderen en breng 500 μl over naar buisjes van 1,7 ml set 2 en set 3.
    2. Voeg 0,5 μl DMSO (+voertuig) toe aan set 2 en 0,5 μl Halo 618-ligand (+ligand) aan buisset 3 en pipet om te mengen.
    3. Breng de +voertuig- en +ligandcelsuspensies over naar afzonderlijke putjes met reagensreservoirs. Breng met behulp van de meerkanaalspipet (materiaaltabel) 40 μl van de +voertuigcelsuspensie over van de reagensreservoirs naar viervoudige putjes van de kweekplaat met 384 putjes. Herhaal deze stap voor de +ligandcelsuspensies.
    4. Breng de resterende cellen over in verse kweekplaten met 6 putjes. Incubeer de platen met 384 putjes en 6 putjes een nacht bij 37 °C en 5% CO2 .

4. Uitlezen van BRET-emissies (dag 4)

OPMERKING: In deze stap wordt het nanoluciferasesubstraat (zie de materiaaltabel voor details) toegevoegd aan de cellen in de kweekplaat met 384 putjes en worden de N-BRET-acceptor (618 nm) en donoremissies (460 nm) afgelezen (Figuur 2). De gecorrigeerde BRET-verhoudingen worden vervolgens berekend.

  1. Verwarm serumvrije testmedia voor in een waterbad van 37 °C en ontdooi het nanoluciferasesubstraat bij 25 °C. Verdun het nanoluciferasesubstraat 1:100 in serumvrije analysemedia en breng het over naar een reagensreservoir. Bereid voldoende van dit mengsel voor om 10 μL toe te voegen aan elk putje van de plaat met 384 putjes, plus 10%-15% extra volume.
  2. Breng met behulp van een meerkanaalspipet (materiaaltabel) 10 μl van het substraatmengsel over naar elk van de putjes die cellen bevatten in de kweekplaat met 384 putjes. Draai de plaat voorzichtig gedurende 1 minuut, handmatig of met behulp van een orbitale schudder.
  3. Plaats de plaat met 384 putjes in de multimode-plaatlezer en noteer de emissies van 460 nm en 618 nm voor alle putjes die cellen bevatten.
    OPMERKING: Voor de multimode plaatlezer die voor deze stap wordt gebruikt (zie Materiaaltabel voor details), werd een leeshoogte van 6,5 mm gebruikt, met een leestijdmeting van 0,1 s, maar verdere optimalisatie kan nodig zijn als u andere plaatlezers gebruikt.
  4. Bereken de ruwe BRET-verhoudingen voor +voertuig en +ligand in milliBRET-eenheden (mBU) afzonderlijk, met behulp van de volgende vergelijking:
    figure-protocol-1
  5. Bereken de gecorrigeerde BRET-ratio door de +voertuig-BRET-ratio af te trekken van die van de +Ligand (aanvullende tabel 1).
    OPMERKING: Bij het vergelijken van de resultaten van meerdere experimenten kunnen de gecorrigeerde BRET-ratio's worden samengevoegd en genormaliseerd naar het gemiddelde van het Wildtype (WT) N-BRET-paar, bestaande uit Nano-CRAFWT en 14-3-3ζWT-Halo (aanvullende tabel 1).

5. Bevestiging van eiwitexpressieniveaus (dag 4 en 5)

OPMERKING: In deze stap worden de cellen in de 6-wells platen gelyseerd en worden de eiwitexpressieniveaus van de Nano-CRAF- en 14-3-3ζ-Halo-eiwitten bepaald door western blot-analyse met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor de Halo- en Nano-tags. (Figuur 2).

  1. Voeg protease- en fosfataseremmers toe aan de NP40-lysisbuffer (materiaaltabel), zodat 200 μL lysisbuffer per monster ontstaat.
  2. Aspireer media op van platen met 6 putjes die cellen bevatten. Was de cellen één keer met 1 ml koude PBS en zuig op.
  3. Voeg 125 μL NP40-lysisbuffer toe aan elk putje en incubeer 6-putjes platen bij 4 °C op een schommelplatform gedurende 15 minuten om de cellen te lyseren.
  4. Breng lysaten over in buisjes van 1,7 ml op ijs en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Plaats de geklaarde lysaten terug op ijs en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van in de handel verkrijgbare tests, zoals Bradford- of Bicinchoninic acid (BCA)-assays.
  5. Normaliseer de eiwitconcentratie in alle monsters door een geschikt volume lysaat en NP40-lysisbuffer over te brengen naar verse buisjes van 1,7 ml tot een totaal volume van 100 μl.
  6. Kook 5x eiwitmonsterbuffer (materiaaltabel) gedurende 1 minuut en voeg 25 μL toe aan elk monster. Kook monsters gedurende 5-6 minuten en pulscentrifugeer de buisjes vervolgens kort om ervoor te zorgen dat al het monster zich in de bodem van de buis verzamelt.
  7. Laad 25 μL monster in elk putje met dubbele eiwitgels (Gel 1 en Gel 2) en breng vervolgens eiwitten over naar nitrocellulose- of PVDF-membranen met behulp van standaard western blotting-procedures, zoals eerder beschreven22.
  8. Blokkeer membranen in 3% BSA-PBS bij 25 °C gedurende 30 minuten en incubeer de membranen vervolgens een nacht met Halo-antilichaam (1:1.000 verdunning; Gel 1) en nanoluciferase of CRAF-antilichaam (verdunning 1:500; Gel 2) in tris-gebufferde zoutoplossing, aangevuld met 0,2% Tween-20 (TBST; Tabel met materialen).
  9. Was de membranen 1x gedurende 5 minuten in 10 ml TBST en incubeer vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met anti-muis HRP secundair antilichaam, verdund 1:10.000 in TBST.
  10. Was de membranen 3x op een schommelplatform in 10 ml TBST op 25 °C gedurende 5 minuten elk. Verwijder TBST en visualiseer eiwitbanden met behulp van ECL-reagentia en een röntgenfilmprocessor of een ander geschikt beeldvormingssysteem.

Resultaten

Wanneer uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol (Figuur 2), zou de interactie van Nano-CRAFWT en 14-3-3ζ-Halo gecorrigeerde BRET-verhoudingen van 50-60 mBU moeten opleveren (Figuur 3A; Aanvullende tabel 1). CRAF bevat twee fosforyleringsafhankelijke 14-3-3 dockingplaatsen, de N'-locatie en de C'-locatie (figuur 1)8. Daarom omvatten geschikte controles voor het verminderen van CRAF:14-3-3ζ-binding S259A en S621A, die fosforylering, en op zijn beurt 14-3-binding, aan de N'- en C'-plaatsen voorkomen, respectievelijk25. Zoals te zien is in figuur 3A, vermindert Nano-CRAFS259A het BRET-signaal met ~45% en Nano-CRAFS621A met ~25%, terwijl de S259A/S621A (SS/AA) dubbele mutant het CRAF:14-3-3 BRET-signaal bijna volledig ablateert. Bovendien kunnen de resultaten van meerdere onafhankelijke experimenten worden vergeleken door eerst de resultaten van elk experiment te normaliseren naar de gemiddelde gecorrigeerde BRET-ratio (aanvullende tabel 1) en vervolgens de gegevenspunten van alle drie de experimenten samen te voegen (figuur 3B). De relatieve expressieniveaus van de gelabelde eiwitten moeten ook worden bevestigd door western blot-analyse (figuur 3). Merk op dat de expressieniveaus van mutante eiwitten kunnen variëren van die van WT, waardoor de getransfecteerde hoeveelheden mutante DNA-vectoren dienovereenkomstig moeten worden aangepast (aanvullende tabel 1).

Er moet ook worden opgemerkt dat optimalisatie van dit protocol nodig kan zijn, vooral bij gebruik van een alternatieve plaatlezer, cellijnen of transfectiereagentia. Figuur 4A toont de resultaten van een voorbeeld van een optimalisatie-experiment, waarbij het verhogen van de getransfecteerde hoeveelheid van het pCMV5-14-3-3ζ-Halo-acceptorplasmide, terwijl de hoeveelheid pCMV5-NanoLuc-CRAF-donor constant wordt gehouden, dosisafhankelijk het BRET-signaal verhoogt, dat vervolgens wordt verminderd door de aanwezigheid van de 14-3-bindende deficiënte CRAFSS/AA-mutant . Als de verhouding tussen acceptor en donor echter te hoog is, zal het verschil in signaal tussen 14-3-3ζ-Halo-binding aan Nano-CRAFWT versus de Nano-CRAFSS/AA-negatieve controle worden verminderd, waarschijnlijk als gevolg van bindingsverzadiging van Nano-CRAFWT. Bovendien is een verdere verhoging van de verhouding tussen acceptor en donor niet nodig zodra een BRET-ratio is bereikt die reproduceerbare waarden met een lage standaardfout genereert. Een van de grote voordelen van deze tests is inderdaad de mogelijkheid om de interacties van eiwitten op fysiologische expressieniveaus te meten. Bij het ontwikkelen van nieuwe N-BRET assays is een andere belangrijke overweging de plaatsing van de tag. Figuur 4B toont het effect van het veranderen van de Halo-tag van de C-terminus naar de N-terminus van 14-3-3ζ op de gecorrigeerde BRET-verhoudingen gegenereerd door 14-3-3ζ-binding aan Nano-CRAFWT en Nano-CRAFSS/AA. Hiertoe moeten DNA-expressieconstructen voor elk van de mogelijke taglocaties worden gegenereerd (Figuur 4C), en hun effecten op de BRET-ratio's van zowel het WT-paar als die van een bekende negatieve controle voor binding moeten worden geëvalueerd.

figure-results-1
Figuur 1: RAF-regulatie door 14-3-3 eiwitten. (A) Schema van de RAF-kinasedomeinstructuur met geconserveerde 14-3-3 dockingplaatsen aangegeven. (B) Modellen van RAF-regulatie door 14-3-3 eiwitten. (C) N-BRET-test voor het meten van de interacties van 14-3-3ζ gefuseerd met een C-terminale Halo-tagacceptor en CRAF gefuseerd met een N-terminale Nano-donor. De energieoverdracht van donor naar acceptor genereert het BRET-signaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Belangrijkste stappen voor het uitvoeren van de CRAF:14-3-3 live cell BRET-gebaseerde test. Getoond worden de vijf belangrijkste stappen die in dit protocol worden beschreven, waaronder: zaaien, transfecteren en herstellen van de cellen, samen met methoden voor het lezen van het BRET-signaal en het bevestigen van de expressieniveaus van de halo- en nano-gelabelde eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: CRAF:14-3-3 BRET-gebaseerde analyse. N-BRET-test waarin de interacties van 14-3-3ζ-Halo met Nano-CRAF-WT of de -S259A, -S621A en -S259A/S621A (SS/AA) mutante vormen worden vergeleken, waarvan eerder is aangetoond dat ze de CRAF:14-3-3-binding25 aantasten. Expressieniveaus van de 14-3-3ζ-Halo (MW: 64 kDa.) en de Nano-CRAF-varianten (MW: 93 kDa.) werden onderzocht door middel van western blot-analyse. (A) Gecorrigeerde BRET-metingen van vier duplicaatputten uit een enkel experiment ± standaarddeviatie (SD). (B) Gecorrigeerde BRET-metingen van drie onafhankelijke experimenten werden samengevoegd en genormaliseerd naar Nano-CRAFWT (ingesteld op 100) ± SD. Statistische significantie werd berekend door de t-test van Student (tweestaart, uitgaande van gelijke variantie). blz<0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Stappen voor de optimalisatie van de analyse. De effecten van het co-transfecteren van toenemende hoeveelheden (A) 14-3-3ζ-Halo of (B) Halo-14-3-3ζ met een constante hoeveelheid Nano-CRAF -WT of -SS/AA (S259A/S621A) op het BRET-signaal ± SD. (C) Schema van alle mogelijke N-BRET-paren die worden gegenereerd door de Halo- of Nano-tag op de N-terminus of C-terminus van elk interessant eiwit (A en B) te plaatsen. n = 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Voorbeeldgegevens van de CRAF:14-3-3 BRET-gebaseerde test. De aangegeven expressieconstructen werden op dag 2 (bovenste sectie) in de cellen getransfecteerd. De ruwe, gecorrigeerde en genormaliseerde BRET-metingen werden gemeten en berekend op dag 4 (onderste gedeelte). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Eerdere studies hebben aangetoond dat 14-3-3-eiwitten een cruciale rol spelen bij zowel de activering als de remming van RAF-kinasen. Inzicht in hoe deze bindingsgebeurtenissen worden gereguleerd en de effecten van het moduleren van deze interacties op RAF-signalering en RAF-gestuurde oncogenese, kan nieuwe therapeutische kwetsbaarheden aan het licht brengen die gericht zijn op de CRAF-functie. De Raf-activeringscyclus wordt echter ondersteund door een overvloed aan geassocieerde eiwitten, posttranslationele modificaties en veranderingen in subcellulaire lokalisatie8, en daarom moeten de interacties van RAF met zijn regulatoren worden gemeten onder levende celomstandigheden, om deze omstandigheden volledig te recapituleren. Dit protocol beschrijft een nieuwe, op nabijheid gebaseerde test die gebruik maakt van de superieure signaal-ruisverhouding en spectrale resolutie van het nanoluciferase-Halo N-BRET paar voor het meten van de interacties van 14-3-3ζ en CRAF in levende cellen.

Hoewel deze test een broodnodig platform biedt voor het bestuderen van de complexe interacties van 14-3-3 en CRAF onder fysiologisch relevante omstandigheden, heeft het een aantal beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. Ten eerste, gezien het feit dat is aangetoond dat 14-3-3 een rol speelt bij zowel RAF-autoremming als dimerisatie8, kunnen aanvullende controles en experimentele benaderingen worden opgenomen om onderscheid te maken tussen deze toestanden. Deze test kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd in combinatie met de eerder ontwikkelde N-BRET auto-inhibitie-assay die een directe uitlezing van veranderingen in RAF-auto-inhibitie 12,22 biedt. Bovendien kunnen controles zoals de CRAF R401H-mutatie, waarvan is aangetoond dat deze de dimerisatie van CRAF met andere RAF-protomers15,26 verstoort, ook nuttig zijn bij het ontleden van deze functies. Ten slotte is de plaatsing van de Halo- en Nano-tags geoptimaliseerd voor het meten van de CRAF:14-3-3-interactie, maar kan niet garanderen dat de interacties van CRAF of 14-3-3 met andere eiwitten hierdoor niet worden beïnvloed, noch kan deze test de affiniteit van CRAF:14-3-3-binding bepalen, de effecten van deze interacties op CRAF-activiteit of de locatie in de cel waar deze interacties plaatsvinden. Daarom kan het ook nodig zijn om andere complementaire benaderingen op te nemen, zoals in vitro bindingstesten, CRAF-kinasetesten en subcellulaire lokalisatiestudies 12,27,28,29.

Bij het uitvoeren van deze test, of zelfs een op N-BRET gebaseerde assay, zijn er een aantal factoren waarmee rekening moet worden gehouden. Zoals aangetoond in dit manuscript en in eerder werk22, is de juiste transfectieverhouding van de pCMV5-Halo (acceptor) en de pCMV5-Nanoluciferase (donor) constructies, samen met een passende negatieve controle, zoals een mutant waarvan bekend is dat deze de binding van de POI's verstoort, van cruciaal belang voor het optimaliseren en testen van deze tests. Het verhogen van de expressie van de Halo-gelabelde POI, terwijl de niveaus van Nano-gelabelde POI constant blijven, resulteert in verhoogde BRET-ratio's. Zodra de binding echter verzadigd is, zal het signaal afvlakken en op zijn beurt zal de delta tussen de WT en de door binding verminderde POI's worden verminderd, waardoor optimalisatie van de acceptor-donor nodig is. Een andere kritische factor bij het optimaliseren van de test is het gebruik van een leeg vectordrager-DNA, zoals pCDNA3.1. De opname van 200 ng pCDNA3.1. in de transfectiemix verhoogt de expressieniveaus van de Halo- en Nano-gelabelde POI's aanzienlijk en vermindert de variabiliteit tussen replicatieputjes en experimenten22. Aangezien de transfectie-efficiëntie echter kan variëren tussen reagentia en cellijnen, kan het ook nodig zijn om de hoeveelheid drager-DNA te titreren om een optimale expressie van het N-BRET-paar te bereiken, zoals eerder beschreven22. Een andere factor die een grote invloed heeft op de BRET-ratio's is de plaatsing van tags. Inderdaad, welke POI is gefuseerd met de Halo-tag versus de Nano-tag en of deze tag op de N- of C-terminus van het eiwit wordt geplaatst, kan zowel de amplitude van de BRET-ratio als het vermogen van negatieve controles om dit signaal te verminderen, beïnvloeden. Daarom is het ook belangrijk om elk van de mogelijke N-BRET-paren te testen bij het ontwikkelen van nieuwe tests.

De verbeterde gevoeligheid en spectrale resolutie die door N-BRET wordt bereikt ten opzichte van conventionele BRET, maakt het mogelijk om zwakkere interacties en subtiele veranderingen in binding te meten in levende cellen. Het nut van deze tests voor het bestuderen van celsignaleringsgebeurtenissen is echter niet volledig gerealiseerd. Deze test zou waarschijnlijk kunnen worden aangepast voor het bestuderen van de interactie van 14-3-3 met andere kinasen, zoals collega-RAF-kinasen ARAF en BRAF, en in combinatie met eerder gepubliceerde N-BRET-assays voor het bestuderen van RAS:RAF-binding en RAF-autoremming22,30, zal het de basis vormen van een toolkit voor het meten van RAF-regulatie onder levende celomstandigheden. Bovendien is N-BRET veelbelovend gebleken als een platform voor het screenen van levende celgeneesmiddelen30, en daarom kan deze test ook nuttig zijn voor het identificeren van verbindingen die ofwel de remmer stabiliseren met interacties van 14-3-3 en RAF of die betrokken zijn bij RAF-activering verstoren. Gezien de hoge stabiliteit van het nanoluciferasesignaal en het vermogen van moderne plaatlezers om tegelijkertijd acceptor- en donoremissies te detecteren, zou het ook volgen dat deze assays kunnen worden aangepast voor het meten van de interacties van signalerende eiwitten in realtime, wat van cruciaal belang zal zijn voor het begrijpen van de dynamiek van deze interacties als reactie op stroomopwaartse stimulatie of medicamenteuze behandelingen.

Openbaarmakingen

Niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit project is gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder projectnummer ZIA BC 010329.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen 
HaloTag® muis monoklonaal antilichaamPromegaG9211 Antilichaam voor het detecteren van HaloTag gelabelde  eiwitten door immunoblot
NanoLuc® muis monoklonaal antilichaamR&D SystemsMAB10026Antilichaam voor het detecteren van Nano-gelabelde eiwitten door immunoblot
CRAF muis monoklonaal antilichaam (E10) Santa Crus Biotechnologysc-7267Antilichaam voor directe detectie van CRAF eiwitten door immunoblot
ECL anti-muis HRP secundair antilichaamAmershamNA931-1ML Secundair HRP geconjugeerd muis antilichaam (van schapen)
Reagentia
X-tremeGENE™ 9Roche/Sigma6365809001
NanoBRET™ kit PromegaN1661 NanoBRET kit met Halo 618 ligand en NanoGlo (nanoluciferase) substraat 
DPBS, zonder Ca++ en Mg++ Quality Biologicals 114-057-101
Trypsine-EDTA (0,05%), fenol rood Life Technologies25300120
DMEM celkweekmediumLife Technologies11995073Hoge glucose, L-glutamine, fenol rood, natrium  pyruvaat; zonder HEPES, aanvullingsmedium met 10% FBS, 2 mM L-glutamine en 100U penicilline-streptomycine
L-Glutamine (200 mM)  Life Technologies25030164
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) Life Technologies  15140163
Opti-MEM™ I gereduceerd serum medium Gibco31985062Voor celtransfectie 
Opti-MEM gereduceerd serum medium, zonder fenol roodGibco11058021Voor het opnieuw plateren van cellen op dag 3. Aanvullen met 2 mM L-glutamine en 100U penicilline-streptomycine, samen met 10% FBS (waar aangegeven). 
Invitrogen Trypan Blue Stain Thermo Scientific T10282 
NP40 lyse buffer N/AN/A20 mM Tris (pH 8,0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternatief (Milipore, Cat# 492016). Bewaren bij 4 graden C.. Voeg het volgende protease en fosfatase direct voor gebruik toe: 20 µM leupeptine, 0,5 mM natrium orthovanadate, 0,15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel monster bufferN/AN/A240 mM Tris (pH 8,0), 9,5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM broomfenolblauw. Bewaren bij -20 graden C. 
Cellijnen 
293FT cellen (mens)Thermo Scientific R70007 
DNA vectoren 
pCMV5-Nano-CRAF WT en mutant N/AN/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo  N/AN/A
Apparatuur
EnVision 2104 Multimode Plate ReaderPerkinElmer 21042104-0010 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emissie filters,  Luminescentie 404 spiegel, 6,5 mm meethoogte en 0,1 s meettijd
Invitrogen Countess™ II Automatische Celteller Thermo ScientificAMQAX1000 
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multikanaals  Pipettor Thermo Scientific  4672070
Software
GraphPad Prism (versie 10.0.3) GraphPad www.graphpad.com
Overige 
ThermoFisher ClipTip Multikanaals pipettips Thermo Scientific 94410153
Reagens Reservoir, 25 mL Verdeeld, Steriele Thomas Scientific1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™PerkinElmer6007680Wit, polystyreen, behandeld voor weefselkweek 
Countess Celtelling Kamer SlidesThermo Scientific C10228

Referenties

  1. Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
  2. Blasco, M. T., et al. Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF. Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).
  3. Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D). Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).
  4. Lito, P., et al. Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors. Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).
  5. Sanclemente, M., et al. c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling. Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).
  6. Razzaque, M. A., et al. Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).
  7. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).
  8. Terrell, E. M., Morrison, D. K. Ras-mediated activation of the Raf family kinases. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746(2019).
  9. Kondo, Y., et al. Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases. Science. 366, 109-115 (2019).
  10. Park, E., et al. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).
  11. Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394, 88-92 (1998).
  12. Spencer-Smith, R., et al. RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation. Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).
  13. Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat Commun. 13, 486(2022).
  14. Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. The importance of Raf dimerization in cell signaling. Small GTPases. 4, 180-185 (2013).
  15. Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling. Mol Cell. 49, 751-758 (2013).
  16. Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O'Neill, E., Kolch, W. Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization. Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).
  17. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Mol Cell. 20, 963-969 (2005).
  18. Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms. J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).
  19. Chong, H., Guan, K. L. Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction. J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).
  20. Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).
  21. Park, E., et al. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat Commun. 14, 4580(2023).
  22. Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay. STAR Protoc. 4, 102461(2023).
  23. Clark, G. J., et al. 14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain. J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).
  24. Machleidt, T., et al. NanoBRET--A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).
  25. Hekman, M., et al. Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites. J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).
  26. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, 431-435 (2010).
  27. Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity. Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).
  28. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).
  29. Roy, S., et al. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).
  30. Durrant, D. E., et al. Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction. Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).

Herprints en machtigingen

Tags

BRET assayCRAF 14 3 3 interactielive cell assayRAF kinase regulatieRAS MAPK kinaseeiwit eiwitinteractienano luciferase tagHaloTag fusieWestern blot
Op bioluminescentieresonantie energieoverdracht (BRET) gebaseerde test voor het meten van interacties van CRAF met 14-3-3-eiwitten in levende cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.