Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Knaagdiermodel van volumetrisch spierverlies van kauwspieren voor het bestuderen van bio-engineeringmaterialen

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66450

⸱

31 mei 2024

 ,  , 
1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, University of California San Francisco (UCSF)

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor de chirurgische creatie van een volumetrisch spierverlies (VML) letsel in de rattenkauwer, waardoor een reproduceerbaar en toegankelijk model wordt geboden voor de studie van craniofaciale spierletsels en hun behandeling met behulp van biomaterialen zoals de nieuwe hydrogel.

Samenvatting

Craniofaciale volumetrische spierverlies (VML) letsels kunnen optreden als gevolg van ernstig trauma, chirurgische excisie, ontsteking en aangeboren of andere verworven aandoeningen. Behandeling van craniofaciale VML omvat chirurgische, functionele spieroverdracht. Deze procedures zijn echter niet in staat om de normale functie, sensatie of expressie te herstellen, en vaker blijven deze aandoeningen onbehandeld. Er is zeer weinig onderzoek gedaan naar de regeneratie van skeletspieren in diermodellen van craniofaciale VML. Dit manuscript beschrijft een rattenmodel voor de studie van craniofaciale VML-beschadiging en een protocol voor de histologische evaluatie van biomaterialen bij de behandeling van deze verwondingen. Vloeibare hydrogel en gevriesdroogde steigers worden aangebracht op het moment dat de chirurgische VML wordt gemaakt, en kauwspieren worden tot 12 weken op terminale tijdstippen weggesneden met hoge retentiepercentages en verwaarloosbare complicaties. Hematoxyline en eosine (HE), Masson's Trichrome en immunohistochemische analyse worden gebruikt om parameters van skeletspierregeneratie te evalueren, evenals biocompatibiliteit en immunomodulatie. Hoewel we de studie van een hydrogel op basis van hyaluronzuur demonstreren, biedt dit model een middel voor het evalueren van latere iteraties van materialen in VML-verwondingen.

Inleiding

Ernstig trauma, chirurgische excisie, ontsteking en andere verworven aandoeningen kunnen leiden tot een mate van weefselverlies die de endogene herstelmechanismen van de skeletspieren overweldigt. Verlies van residente cellen en structuren die het primaire regeneratieve proces bevorderen, kan leiden tot pathologische remodellering en weefselfibrose, resulterend in langdurige functie- en gevoelsstoornissen en wordt volumetrisch spierverlies (VML) genoemd1,2,3. De ontstekingsreactie op VML-letsels omvat een goed gedocumenteerd en complex mechanisme waarbij macrofagen, cytokines en myogene cellen betrokken zijn en dat veel theoretische doelen biedt in de regeneratieve geneeskunde4. Hoewel veel in vitro studies deze doelen hebben gebruikt in diermodellen van VML-behandeling van extremiteiten, is er een gebrek aan onderzoek naar skeletspierregeneratie in diermodellen van craniofaciale VML 5,6,7.

Verlies van craniofaciale weefsels kan het gevolg zijn van aandoeningen zoals eerder beschreven, en gebrekkig craniofaciale weefsel kan ook optreden bij aangeboren aandoeningen zoals schisis, wat in sommige gevallen een echte volumetrische deficiëntie van spierweefsel met zich meebrengt 8,9. Omdat de spieren van het craniofaciale gebied belangrijk zijn voor zowel het functioneren als het esthetische uiterlijk, kunnen langetermijneffecten van VML aanzienlijke psychologische aandoeningen hebben. Verschillende aspecten van de craniofaciale skeletspier verschillen van de van somiet afgeleide skeletspier die in ledematen wordt aangetroffen, waaronder variaties in genexpressie, embryonale oorsprong, fenotype van satellietcellen, hoeveelheid satellietcellen, vezelsamenstelling en architectuur 10,11,12,13. Deze variaties kunnen leiden tot VML-letsels die de craniofaciale spier anders aantasten dan van somiet afgeleide spier14,15. Tot op heden hebben weefselmanipulatiebenaderingen waarvan is aangetoond dat ze de regeneratie verhogen in diermodellen van VML aan de extremiteit, zich niet voldoende vertaald naar craniofaciale VML-diermodellen16. Dit onderstreept de noodzaak om in vivo benaderingen van craniofaciale VML-modellen bij dieren te optimaliseren.

Hoewel er verschillende in vivo onderzoeken naar craniofaciale VML zijn uitgevoerd, zijn de onderzoeken klein en is het creëren van een robuust craniofaciale spierdefect in diermodellen een uitdaging 8,13. Kim et al. rapporteerden de ontwikkeling van een VML-model voor muismasseter. Deze studie evalueerde echter alleen histologie tot 28 dagen na het letsel en had een onduidelijk vermogen om verschillen in histologische uitkomsten tussen tijdstippen17 te detecteren. Rodriguez et al. rapporteerden de ontwikkeling van een craniofaciale VML-model voor schapen. Ze rapporteerden echter een hoge variabiliteit binnen experimentele groepen, wat wijst op heterogeniteit in de ernst van het initiële chirurgische letsel16. Hier rapporteren we het protocol van ons VML-model voor rattenkauwspieren en demonstreren we het nut ervan bij het evalueren van weefselmanipulatiebenaderingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met alle toepasselijke regelgeving, inclusief het naleven van de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Het UCSF Institutional Animal Care and Use Program heeft alle dierprocedures en postoperatieve zorg goedgekeurd (IACUC-protocol #AN195944-01).

1. VML-operatie

  1. Verdoof mannelijke Sprague-Dawley-ratten op de leeftijd van 12 weken met een gewicht van 276-300 g in een afgesloten container met behulp van isofluoraan algemene anesthesie met een snelheid van 1%-5% voordat ze worden overgebracht naar een steriel chirurgisch veld.
    1. Plaats de knaagdieren op hun linkerzij zodanig dat de nek in een neutrale positie is gestrekt en de neus in de verdovende neuskegel wordt geplaatst, zodat ze aan de rechterkant van het gezicht kunnen worden blootgesteld.
    2. Conisch isofluordebiet van inductie naar onderhoudsdebiet (ongeveer 2%).
  2. Breng oogzalf aan op de ogen van de knaagdieren.
  3. Maak de operatieplaats, begrensd door een lijn tussen de rechterhoek van de mond, de basis van het rechteroor superieur en de hoek van de onderkaak inferieur, vrij van de vacht met behulp van ontharingscrème.
    1. Desinfecteer de operatieplaats meerdere keren in een cirkelvormige beweging met zowel ethanol als betadine scrub.
      OPMERKING: Steriel afdekken wordt in dit protocol niet gebruikt, gezien de grootte en locatie van de toegang. De procedure wordt uitgevoerd met behulp van een aseptische techniek in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenverzorging.
  4. Maak een longitudinale incisie van 3-4 cm lang die zich uitstrekt van het rechter snorhaarkussentje onder tot het rechteroor.
    1. Breng een huidflap omhoog, waardoor zowel de rechter kauwspier als de buccale en mandibulaire takken van de aangezichtszenuw kunnen worden gevisualiseerd (Figuur 1A).
    2. Maak de huid vrij van de onderliggende fascia door middel van stompe scheiding en houd de huidranden in een ingetrokken positie met behulp van chirurgische klemmen voor een optimale visualisatie van de onderliggende spier.
  5. Maak een transversale incisie van 1-2 cm lang in de fascia die over het voorste deel van de kauwspier ligt. Gebruik een botte scheiding om de ruimte tussen de fascia en de kauwspier voorzichtig uit te breiden om de algehele integriteit van de resterende fascia te behouden.
  6. Gebruik de fasciale incisie als een venster naar de oppervlakkige kauwspier om een cirkelvormige verwonding in de spier te creëren van 5 mm breed en 5 mm diep met behulp van een gesteriliseerde wegwerpponsbiopsie. Zorg ervoor dat het defect gecentreerd is tussen de buccale en mandibulaire takken van de aangezichtszenuw, met zorg om trauma aan de zenuwen te voorkomen (Figuur 1B).
  7. Voeg het biomateriaal toe aan de cirkelvormige kauwspierverwonding (Figuur 1C).
  8. Zodra het middel goed op zijn plaats zit, hecht u het spierversterkende fasciale venster met behulp van een enkele 5-0 monofilament hechtdraad om migratie te voorkomen.
    OPMERKING: Vaste vormstoffen worden direct in de wond geplaatst en het weefsel kan worden verstoord om de verzadiging met bloed te bevorderen, terwijl vloeibare middelen worden toegevoegd en indien nodig worden gefermenteerd of onmiddellijk op hun plaats worden gesloten met behulp van fascia om ongewenste beweging te voorkomen. In het hier gedemonstreerde experiment wordt een cryogel op basis van acrylaat hyaluronzuur toegediend.
  9. Sluit de huid met behulp van een eenvoudige onderbroken of lopende subcuticulaire techniek met 5-0 monofilament.
    1. Breng huidlijm aan op de hechtingen om postoperatieve incisiedehiscentie te helpen voorkomen.
  10. Laat de ratten herstellen in een kooi met een externe verwarmingsbron (verwarmingskussen onder de kooi of steriele handwarmers in de kooi) en observeer gedurende 30 minuten na de operatie.
  11. Verdun het antibioticum trimethoprim-sulfamethoxazol (200 mg trimethoprim en 40 mg sulfamethoxazol in 5 ml) in drinkwater (5 ml/200 ml water) en dien het gedurende 7 dagen na de operatie toe in het drinkwater van knaagdieren. Zorg ervoor dat perioperatieve analgesie wordt uitgevoerd volgens institutionele protocollen.
    OPMERKING: In deze studie werd 0,25% SC bupivacaïne gegeven voorafgaand aan de chirurgische incisie, 0,05 mg/kg SC buprenorfine werd toegediend voorafgaand aan herstel van anesthesie, en 2 mg/kg IP meloxicam werd toegediend voorafgaand aan herstel van anesthesie en opnieuw de volgende ochtend.

2. Kauwspieren oogsten, invriezen en analyseren

  1. Offer de ratten op vooraf bepaalde tijdstippen door een overdosis van een chemisch middel (bijv. CO2 of verdovingsmiddel) in de anesthesie-inductiekamer te induceren.
  2. Bevestig het offeren van knaagdieren door een bilaterale thoracotomie uit te voeren met behulp van een enkele scalpelincisie door de 4erib ventraal om de longen te doorboren (bilaterale thoracotomie).
  3. Open de chirurgische incisie opnieuw om visualisatie van de kauwspier mogelijk te maken en verwijder de huid die over de kauwspier ligt voor gemakkelijke toegang.
  4. Ontleed en verwijder de kauwspier van de onderkaak, te beginnen met scheiding in de onderkaakhoek. Zorg ervoor dat de dissectie langs het botoppervlak plaatsvindt om de volledige dikte van de kauwspier vast te leggen.
    1. Ontleed anterieur langs de onderkaak en snijd het bevestigingspunt van de pees door. Ontleed vervolgens langs de jukbeenboog naar achteren (Figuur 1D). Ontleed ten slotte de achterste aanhechting, want er is een verhoogd risico op bloedingen.
  5. Spoel de uitgesneden kauwspier in 1x PBS bij kamertemperatuur (RT) en verwijder overtollig vocht door het monster grondig te deppen met keukenpapier.
  6. Plaats de spier in een cryomold en dompel deze onder in inbeddingsmedia met een optimale snijtemperatuur (OCT), met het voorste uiteinde naar beneden en het achterste uiteinde naar boven.
  7. Voeg isopentaan toe aan een metalen beker en koel deze af door deze voorzichtig onder te dompelen in vloeibare stikstof om te voorkomen dat er vloeibare stikstof in komt.
    1. Zodra het isopentaan de optimale temperatuur heeft bereikt (-140 tot -149 °C) en iets is ingedikt, houdt u de cryomold met OCT en de kauwspier gedeeltelijk ondergedompeld in het isopentaan totdat de OCT is doorgevroren. Bewaar de bevroren cryomold op droogijs totdat deze naar een vriezer bij -80 °C wordt overgebracht.
  8. Cryosectie ingevroren kauwspiermonsters met een zodanige oriëntatie dat de voorste pool eerst wordt doorgesneden en naar achteren door het monster beweegt. Stel de temperatuur van het weefselblok in op -20 °C en de temperatuur van het cryosectieblad op -15 °C. Snijd voor elke 200 μm 4 dia's (2 met secties van 10 μm, 2 met secties van 6 μm) voordat u 200 μm verder gaat, snijd 4 extra dia's en herhaal dit gedurende het hele monster.
  9. Gebruik de 10 μm-secties voor histologieanalyse (Masson's Trichrome, Hematoxyline en Eosin, Picrosirius Red, enz.) en de 6 μm-secties voor immunohistochemie.
    OPMERKING: Voor histologie kunnen ook secties van 6 μm worden gebruikt.
  10. Leg beelden vast met behulp van licht- of fluorescentiemicroscopie.
  11. Meet de dwarsdoorsnede van ~200 spiervezels van de kauwspier met behulp van Image J-software.

3. Immunohistochemische analyse

  1. Voor immunohistochemische analyse van de embryonale myosine zware keten, fixeer dia's in 4% PFA gedurende 1 uur bij RT.
  2. Was de dia's 3 keer in PBS bij RT, laat elke wasbeurt 10 minuten staan.
  3. Permeabiliseer weefsel door de objectglaasjes gedurende 15 minuten te incuberen met 0,5% Triton X-100 bij RT.
  4. Was de dia's 3 keer in PBS bij RT, laat elke wasbeurt 10 minuten staan.
  5. Incubeer met primair monoklonaal antilichaam van gastheermuizen (1:200) in 2% normaal geitenserum (NGS) bij 4 °C 's nachts.
  6. Was de dia's in PBS-Tween 3 keer bij RT, laat elke wasbeurt 10 minuten staan.
  7. Incubeer met fluorofoor-gelabeld anti-muis secundair antilichaam van konijnengastheer (1:500) in 2% NGS bij RT gedurende 2 uur.
  8. Was de dia's in PBS-Tween 3 keer bij RT, laat elke wasbeurt 10 minuten staan.
  9. Monteer de dia's met 3 druppels DAPI fluorescerende houder voordat u een dekglaasje plaatst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Resultaten voor de evaluatie van craniofaciale VML en weefselregeneratie met behulp van biomaterialen omvatten zowel kwantitatieve als kwalitatieve resultaten.

Figuur 2 geeft een voorbeeld van kwalitatieve evaluatie met behulp van het eerder beschreven model. De observatie van de novo spiervezelgroei in onze hydrogel is een kwalitatief positief resultaat (Figuur 2A) en suggereert dat een biom...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol waarbij speciale aandacht nodig is om tot een optimaal resultaat te komen. Stap 1.4 beschrijft de eerste incisie en stompe scheiding van de huid van de oppervlakkige kauwfascia. Stompe dissectie moet direct langs de huid worden gedaan met een schaar die wegwijst van de onderliggende spier en fascia om inkepingen te voorkomen en onbedoeld een venster door de fascia te creëren. Het caudale aspect van de oppervlakkige kauwspier moet wo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek wordt ondersteund door het UCSF Yearlong Research Fellowship Program en het C-Doctor Interdisciplinary Translational Project Program. Dank aan de leden van het Pomerantz Lab en het Craniofacial Biology Program aan de Universiteit van Californië San Francisco voor hun bijdragen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
F1.652 Myosin heavy chain (embryonisch) monoklonaal antilichaamDSHBF1.652
Geit anti-muis IgG2b Geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21242
Geit anti-konijn IgG (H+L) Sterk geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
Integra Standaard Biopsie Punches, Wegwerp Standaard biopsie punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cmIntegra12460411
Montagemedium met DAPI - Waterig, FluoroshieldAbcamab104139
Konijn Anti-muis IgG H&L (Alexa Fluor 647) gepreadsorbeerdAbcamab150127
Sulfamethoxazol/Trimethoprim orale suspensie, kersenaroma, 473 mLMed-Vet InternationalSKU: RXBAC-SUSP

Referenties

  1. Gilbert-Honick, J., Grayson, W. Vascularized and innervated skeletal muscle tissue engineering. Adv Healthc Mater. 9 (1), 1900626(2020).
  2. Aguilar, C. A., et al. Multiscale analysis of a regenerative therapy for treatment of volumetric muscle loss injury. Cell Death Discov. 4, 33(2018).
  3. Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
  4. Kiran, S., Dwivedi, P., Kumar, V., Price, R., Singh, U. Immunomodulation and biomaterials: Key players to repair volumetric muscle loss. Cells. 10 (8), 2016(2021).
  5. Greising, S. M., Corona, B. T., McGann, C., Frankum, J. K., Warren, G. L. Therapeutic approaches for volumetric muscle loss injury: A systematic review and meta-analysis. Tissue Eng Part B: Rev. 25 (6), 510-525 (2019).
  6. Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. N Engl J Med. 347 (24), 1924-1931 (2002).
  7. Testa, S., et al. The War after war: Volumetric muscle loss incidence, implication, current therapies and emerging reconstructive strategies, a comprehensive review. Biomedicines. 9 (5), 564(2021).
  8. Emara, A., Shah, R. Recent update on craniofacial tissue engineering. J Tissue Eng. 12, 204173142110037(2021).
  9. Dado, D. V., Kernahan, D. A. Anatomy of the orbicularis oris muscle in incomplete unilateral cleft lip based on histological examination. Ann Plast Surg. 15 (2), 90-98 (1985).
  10. Stål, P., Eriksson, P. O., Eriksson, A., Thornell, L. E. Enzyme-histochemical and morphological characteristics of muscle fibre types in the human buccinator and orbicularis oris. Arch Oral Biol. 35 (6), 449-458 (1990).
  11. Raposio, E., Bado, M., Verrina, G., Santi, P. Mitochondrial activity of orbicularis oris muscle in unilateral cleft lip patients. Plast Reconstr Surg. 102 (4), 968-971 (1998).
  12. Cheng, X., Shi, B., Li, J. Distinct embryonic origin and injury response of resident stem cells in craniofacial muscles. Front Physiol. 12, 690248(2021).
  13. Carvajal Monroy, P. L., et al. A rat model for muscle regeneration in the soft palate. PLoS One. 8 (3), e59193(2013).
  14. Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Dev Biol. 337 (1), 29-41 (2010).
  15. Pavlath, G. K., Thaloor, D., Rando, T. A., Cheong, M., English, A. W., Zheng, B. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Dev Dyn. 212 (4), 495-508 (1998).
  16. Rodriguez, B. L., Vega-Soto, E. E., Kennedy, C. S., Nguyen, M. H., Cederna, P. S., Larkin, L. M. A tissue engineering approach for repairing craniofacial volumetric muscle loss in a sheep following a 2, 4, and 6-month recovery. PLoS One. 15 (9), e0239152(2020).
  17. Kim, H., et al. Real-time functional assay of volumetric muscle loss injured mouse masseter muscles via nanomembrane electronics. Adv Sci. 8 (17), e2101037(2021).
  18. Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet Muscle. 5, 22(2015).
  19. Agarwal, M., et al. Myosin heavy chain-embryonic regulates skeletal muscle differentiation during mammalian development. Development. 147 (7), (2020).
  20. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), e51586(2014).
  21. Kim, J. H., et al. Neural cell integration into 3D bioprinted skeletal muscle constructs accelerates restoration of muscle function. Nat Commun. 11 (1), 1025(2020).
  22. Anderson, S. E., et al. Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps. Tissue Eng Part C Methods. 25 (2), 59-70 (2019).
  23. Kim, J. T., Kasukonis, B. M., Brown, L. A., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Recovery from volumetric muscle loss injury: A comparison between young and aged rats. Exp Gerontol. 83, 37-46 (2016).
  24. Guédat, C., Stergiopulos, O., Kiliaridis, S., Antonarakis, G. S. Association of masseter muscles thickness and facial morphology with facial expressions in children. Clin Exp Dent Res. 7 (5), 877-883 (2021).
  25. VanSwearingen, J. M., Cohn, J. F., Bajaj-Luthra, A. Specific impairment of smiling increases the severity of depressive symptoms in patients with facial neuromuscular disorders. Aesthetic Plast Surg. 23 (6), 416-423 (1999).
  26. Versnel, S. L., Duivenvoorden, H. J., Passchier, J., Mathijssen, I. M. J. Satisfaction with facial appearance and its determinants in adults with severe congenital facial disfigurement: A case-referent study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63 (10), 1642-1649 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Craniofaciale spierletselmasseterspiermodelregeneratie van skeletspierenweefseltechniekevaluatie van biomaterialenhistologische analyseimmunohistochemische analysehydrogelsteiger
Knaagdiermodel van volumetrisch spierverlies van kauwspieren voor het bestuderen van bio-engineeringmaterialen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.