Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66451

⸱

22 maart 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University School of Pharmacy

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, illustreert de effectiviteit van de cAMP Difference Detector In Situ bij het meten van cAMP door middel van twee methoden. Eén methode maakt gebruik van een spectrofotometer met 96 putjes voor plaatlezen met HEK-293-cellen. De andere methode demonstreert individuele HASM-cellen onder een fluorescerende microscoop.

Samenvatting

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is een nieuwe biosensor die het mogelijk maakt om continu cAMP-niveaus in levende cellen te meten. De biosensor is gemaakt van een circulair gepermuteerd fluorescerend eiwit dat is gekoppeld aan het scharniergebied van Epac2. Dit creëert een enkele fluorofoorbiosensor die een verhoogde of verlaagde fluorescentie vertoont bij binding van cAMP. De biosensor bestaat in rode en groene opwaartse versies, evenals groene neerwaartse versies, en verschillende rode en groene versies gericht op subcellulaire locaties. Om de effectiviteit van de biosensor te illustreren, werd de groene neerwaartse versie gebruikt, die in fluorescentie afneemt bij cAMP-binding. Er worden twee protocollen gedemonstreerd die gebruik maken van deze sensor: een die gebruik maakt van een 96-well plaatleesspectrofotometer die compatibel is met high-throughput screening en een andere die gebruik maakt van single-cell beeldvorming op een fluorescentiemicroscoop. Op de plaatlezer werden HEK-293-cellen gekweekt in platen met 96 putjes gestimuleerd met 10 μM forskoline of 10 nM isoproterenol, wat een snelle en grote afname van de fluorescentie veroorzaakte in de groene neerwaartse versie. De biosensor werd gebruikt om cAMP-niveaus te meten in individuele cellen van gladde spieren van de menselijke luchtwegen (HASM) die onder een fluorescerende microscoop werden gecontroleerd. De groene neerwaartse biosensor vertoonde vergelijkbare reacties op celpopulaties wanneer deze werd gestimuleerd met forskolin of isoproterenol. Deze eencellige test maakt visualisatie van de locatie van de biosensor mogelijk bij een vergroting van 20x en 40x. Deze cAMP-biosensor is dus gevoelig en flexibel, waardoor real-time meting van cAMP mogelijk is in zowel onsterfelijke als primaire cellen, en met afzonderlijke cellen of populaties van cellen. Deze eigenschappen maken cADD een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cAMP-signaleringsdynamiek in levende cellen.

Inleiding

Adenosine 3′,5′-cyclisch monofosfaat, cAMP, speelt een centrale rol in cellulaire communicatie en de coördinatie van verschillende fysiologische processen. cAMP fungeert als een tweede boodschapper en geeft externe signalen van hormonen, neurotransmitters of andere extracellulaire moleculen door om een cascade van intracellulairegebeurtenissen op gang te brengen. Bovendien is cAMP nauw betrokken bij verschillende signaalroutes, waaronder die geassocieerd met G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) en adenylylcyclasen. Het begrijpen van de rol van cAMP in cellulaire signalering is van fundamenteel belang voor het ontrafelen van de complexe mechanismen die ten grondslag liggen aan normale cellulaire functies en de ontwikkeling van mogelijke therapieën voor een breed scala aan medische aandoeningen.

In het verleden zijn er verschillende methoden gebruikt om cAMP direct of indirect te meten. Deze omvatten radiolabeling van cellulaire ATP-pools gevolgd door kolomzuivering, HPLC, radioimmunoassays en enzymgekoppelde immunoassays 1,2. Deze legacy-assays worden beperkt door het feit dat het eindpuntmetingen zijn, waarvoor een groot aantal monsters nodig is om tijdafhankelijke responsen te construeren. Meer recentelijk werden Fluorescentie Resonantie Energie Transfer (FRET) sensoren ontwikkeld om testen in levende cellen te maken, real-time, dynamische gegevens te produceren en het mogelijk te maken om sensoren op verschillende subcellulaire locaties te richten3. FRET maakt gebruik van twee fluoroforen, een fluorescerende donor en een fluorescerende acceptor die, wanneer hij in de buurt is, de acceptorfluorofoor zal worden opgewonden door de fluorescerende output van de donor. De twee meest gebruikte fluoroforen zijn cyaan fluorescerend eiwit (CFP) en geel fluorescerend eiwit (YFP), omdat deze compatibele excitatie- en emissie-eigenschappen hebben. Naast CFP en YFP wordt het gebruik van het groen fluorescerende eiwit (GFP) en het rood fluorescerende eiwit (RFP) vaak gebruikt voor FRET-biosensoren. cAMP FRET-biosensoren werken door een donor en acceptor aan weerszijden van het Epac2 cAMP-bindende eiwit te hebben. cAMP-binding verandert de bevestiging van Epac en vergroot de afstand tussen donor- en acceptorfluoroforen 3,4. Deze conformatieverandering wordt gedetecteerd door een verlies van FRET, dat wil zeggen de excitatie van de acceptorfluorofoor door energie die wordt overgedragen door de donorfluorofoordruppels3. Hoewel het een ogenschijnlijk eenvoudig proces is, zijn er tal van beperkingen en problemen met de FRET-biosensor voor cAMP-onderzoek5. Een daarvan is de selectie van fluorescerende eiwitten, bijvoorbeeld GFP, die op natuurlijke wijze kunnen dimeriseren, waardoor de gevoeligheid wordt verminderd6. Op FRET gebaseerde cAMP-biosensoren zijn gericht op specifieke microdomeinen7, maar er kunnen beperkingen zijn vanwege de grote omvang van een constructie met twee fluoroforen6. Een ander belangrijk probleem is de lage signaal-ruisverhouding van FRET-signalen als gevolg van de overlap tussen excitatie en emissie van de fluorofoor, wat resulteert in een hoge bemonsteringsfrequentie en de analyse van de resultaten bemoeilijkt 4,5.

Meest recentelijk heeft de nieuwe biosensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, deze en andere beperkingen opgelost als het gaat om het bestuderen van de regulatie van cAMP-signalering8. Een belangrijke verbetering is de afhankelijkheid van een enkele fluorofoor. Dit zorgt voor een snel en efficiënt signaal met een groter dynamisch bereik en een hoge signaal-ruisverhouding. Als gevolg hiervan kan er meer nauwkeurigheid zijn omdat er een minder breed scala aan golflengten is om door te kammen8. Net als FRET-sondes is de biosensor gericht op subcellulaire locaties, waardoor onderzoek naar de compartimentatietheorie en exploratie in lipidevlotten en niet-vlotten en andere subcellulaire domeinen mogelijkis. Misschien wel het belangrijkste is de geschiktheid van een enkele fluorofoor biosensor voor high-throughput screening, die de gevoeligheid en reproduceerbaarheid heeft verbeterd ten opzichte van FRET-gebaseerde biosensoren. De biosensor is verpakt in een BacMam-vector voor eenvoudige transductie van een breed scala aan celtypen en nauwkeurige controle over eiwitexpressie.

Expressiecontrole via de BacMam-vector kan met name nuttig zijn bij assays met GPCR-orthologen van verschillende diersoorten om de interpretatie van gegevens uit dierstudies te vergemakkelijken. Bovendien is controle over de receptorexpressie van cruciaal belang voor het meten van de verschillende graden van werkzaamheid van geneesmiddelen (bijv. inverse agonisten en gedeeltelijke agonisten), en lage niveaus van receptorexpressie zijn nuttig om de lage niveaus na te bootsen die in dierlijk weefsel worden aangetroffen. BacMam is een baculovirusvector die is gemodificeerd om zoogdiercellen zoals primaire celculturen en HEK-293-lijnen10 te transduceren. Dominante selecteerbare markers zorgen ervoor dat BacMam meer stabiliteit biedt ten opzichte van traditionele plasmide-infecties11. Dergelijke selectieve promotors zorgen voor een efficiëntere afgifte en expressie van genen. Bovendien verhoogt het toevoegen van trichostatine A (een histondeacetylaseremmer) de reporter-eiwitspiegels11. Expressieniveaus kunnen worden gecontroleerd via de titer van het gebruikte BacMam-virus en moeten voor elk celtype worden geoptimaliseerd. In het geval van deze biosensor is een rood of groen fluorescerend eiwit gekoppeld aan de Epac bij de N- en C-termini. Wanneer cAMP bindt, verplaatst een conformationele verandering in de biosensor aminozuren naast het fluorescerende eiwit. Een dergelijke verschuiving verplaatst de absorptie van de anionische toestand naar de neutrale toestand bij 400 nm, waardoor de fluorescentie afneemt.

Er zijn 90-120 GPCR's die tot expressie komen in een enkele cel die reageren op een breed scala aan neurohumorale signalen12. Daarom kan worden verondersteld dat ten minste enkele tientallen GPCR's per cel cAMP kunnen stimuleren of remmen door respectievelijk Gs- of Gi-koppeling. Hoewel er vooruitgang is geboekt bij het monitoren van deze tweede boodschapper in realtime, zoals FRET, zijn er efficiëntere methoden nodig. De methodologie voor het monitoren van de synthese en degradatie van cAMP-signalen met behulp van cADDis in real-time wordt hier gepresenteerd. De verandering in fluorescentie kan in real-time worden gecontroleerd met behulp van een fluorescentieplaatlezer voor tests met een hoge doorvoer of met behulp van een fluorescentiemicroscoop voor tests met één cel. Deze methoden zijn nuttig voor een breed scala aan biologische vragen met betrekking tot GPCR-signalering via cAMP.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De details van alle reagentia en apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Spectrofotometer met hoge doorvoer van plaataflezing

  1. Het zaaien van HEK-293-cellen met de cADDis BacMam-vector in een plaat met 96 putjes (dag 1)
    1. Splits en infecteer cellen in een virale kap.
      1. Warm HEK media (Tabel 1) en 0,25% trypsine-EDTA in een waterbad van 37 °C.
      2. Desinfecteer de kap en de materialen door ze af te vegen met EtOH-doordrenkte tissues.
      3. Verwijder HEK-media uit de kolf en gooi deze weg met een serologische pipet.
      4. Voeg 5 ml Mg2+ en Ca2+ vrije DPBS (37 °C) toe met een serologische pipet. Kantel de kolf heen en weer om de bodem met DPBS te wassen. Verwijder DPBS en gooi het weg met een serologische pipet.
      5. Trypsiniseer de cellen door 3 ml opgewarmd 0,25% trypsine-EDTA toe te voegen met een serologische pipet. Kantel de kolf om ervoor te zorgen dat het reagens de bodem van de kolf volledig bedekt. Plaats het deksel op de kolf en laat het reagens 3-5 minuten staan zodat de cellen van de kolf kunnen loskomen.
        OPMERKING: Dit experiment is geoptimaliseerd voor een kolf van 75 cm2 ; Volumeaanpassingen voor reagentia kunnen nodig zijn als een kweekapparaat van een andere grootte wordt gebruikt.
      6. Zuig 5 ml verse media af die antibiotica bevatten. Verdrijf en trek het volume van de kolf om de wanden van de kolf te wassen en cellen fysiek los te maken.
      7. Verzamel het totale volume van de kolf (8 ml) en centrifugeer (25 °C) in een tube van 15 ml bij 200 x g gedurende 5 minuten.
      8. Verwijder na het centrifugeren het supernatans met een serologische pipet en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.
      9. Om de cellen te wassen zonder de pellet te verstoren, voegt u 500 μL DPBS zonder Mg2+ en Ca2+ DPBS toe aan de zijkant van de buis van 15 ml. Nadat u de DPBS voorzichtig hebt toegevoegd, verwijdert u zoveel mogelijk buffer en gooit u deze weg zonder de pellet te verstoren. Herhaal dit nog een keer.
      10. Tel de cellen en pas ze aan tot een celdichtheid van 250.000 cellen/ml-cellen.
      11. Maak een mastermix op basis van de reagensvolumes die nodig zijn per putje van een zwarte, transparante bodemplaat met 96 putjes. Dit wordt de 'weefselplaat' genoemd. Zie de volumes hieronder:
        OPMERKING: Voorbeeld van 1 putje (totaal volume 200 μL): 40 μL van de biosensor BacMam-vector (voorraad van 2 x 1010 virale genen/ml), 2 μL trichostatine A (voorraad van 100 μM; eindconcentratie 1 μM), 158 μL van 250.000 cellen/ml celdichtheid. Voorbeeld van 10 putjes (totaal volume 2 ml): 400 μL van de biosensor BacMam-vector (voorraad van 2 x10 10 virale genen/ml), 20 μL trichostatine A (voorraad van 100 μM), 1.580 μL media met 250.000 cellen/ml celdichtheid.
      12. Voeg 200 μL mastermix per putje toe. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur in een incubator voordat ze op de plaatafleesspectrofotometer worden uitgevoerd.
  2. Draaien op een plaatlezer
    1. Verwijder op een werkblad voorzichtig alle media in elk putje en vervang het door 180 μl DPBS met Mg2+ en Ca2+ bij 37 °C.
    2. Inspecteer cellen op een microscoop om de gezondheid van de cellen te bevestigen.
    3. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min-1 uur.
    4. Bereid de geneesmiddelen tijdens het broeden voor op de aflezing bij 1:10 verdunning (ook wel 10-voudig genoemd) voor de gewenste einddosis. Bereid dus 100 μM forskolin en 100 nM isoproterenol.
    5. Voeg 60 μL van elk geneesmiddel op een zuilvormige manier toe aan een doorzichtige plaat met 96 putjes (de "geneesmiddelplaat" genoemd).
      OPMERKING: Met de juiste verdunning van het geneesmiddel en om de meting te optimaliseren, worden de geneesmiddelen toegevoegd aan een doorzichtige plaat met 96 putjes, de "geneesmiddelplaat" genoemd, die op het moment van de meting naar de "weefselplaat" moet worden overgebracht met behulp van een 96-multi pipettor, waardoor het geneesmiddel tegelijkertijd aan alle putjes kan worden toegevoegd en snel kan worden afgelezen door de fluorescerende spectrofotometer.
  3. Instelling van de fluorescentieplaatlezer
    1. Pas de instellingen van de fluorescentieplaatlezer aan.
      1. Leesmodus: fluorescentie. Leestype: kinetisch. Aflezing golflengten: 494 nm en 522 nm.
      2. Leestijd: Voer 3 minuten in voor de basislijn fluorescerende meting en 7 minuten voor de post-toevoeging van het geneesmiddel. Interval" wordt ingevoerd als 00:00:30 gedurende 30 s tussen elke lezing.
        OPMERKING: De leestijd kan worden geoptimaliseerd en verhoogd op basis van de vereiste tijd.
  4. Data-acquisitie
    1. Haal de tissueplaat uit de couveuse, verwijder de aluminiumfolie en het plaatdeksel en plaats de tissueplaat in de plaatlezer. Sluit de lezerlade om de tissueplaat te laten rusten en in evenwicht te brengen met de temperatuur van de lezer (37 °C).
    2. Plaats de doorzichtige plaat met 96 putjes (medicijnplaat) met de geneesmiddelverdunningen onder de 96-multipipet en oefen met het trekken van 20 μl uit de putjes. Zorg ervoor dat er een gelijkmatig volume geneesmiddel in de pipettortips wordt getrokken.
    3. Start een "baseline"-meting.
      OPMERKING: 40 RFU of hoger wordt als levensvatbare gegevens beschouwd. Als de gegevens lager zijn dan deze waarde, moet het experiment worden gestopt en worden verwijderd.
    4. De weefselplaat wordt aan het einde van de basislijnrun uit de lezer geworpen. Voeg snel en voorzichtig 20 μL van de doorzichtige medicijnplaat toe aan de zwarte tissueplaat. Begin dan snel met de "behandeling" -run. De weefselplaat mag niet langer dan 30 seconden nadat de geneesmiddelen zijn toegevoegd uit de lezer zijn.
      OPMERKING: Als het medicijn te snel wordt toegevoegd, komen de cellen los van de weefselplaat, waardoor een onbruikbaar experiment ontstaat. Bovendien zijn de cellen geïnfecteerd met een lichtgevoelig groen fluorescerend eiwit; Het is dus absoluut noodzakelijk om snel en snel de medicijnen toe te voegen en met de tweede lezing te beginnen om te voorkomen dat u het eerste deel van de reactie mist.
    5. Zodra de tweede meting is voltooid, zorgt u ervoor dat de weefselplaat uit de lezer wordt geworpen en dat de gegevensverzameling is voltooid.
      OPMERKING: Voordat u de weefselplaat weggooit, is het het beste om te controleren of de cellen nog aan de plaat vastzitten. Bekijk de cellen onder een microscoop. Als de cellen loskomen, zijn de resultaten ongeldig en moeten ze worden weggegooid. Het experiment zal moeten worden herhaald.
    6. Exporteer de resulterende gegevens als een Excel-bestand.
    7. Open de geëxporteerde Excel-leesbare gegevens van de plaatlezer en kopieer en plak relevante informatie in het Excel-conversiesjabloon. De gegevens worden getransformeerd van de plaatlezer die is ingesteld naar een enkele put, kolomuitlezingen rechts van de gekopieerde gegevens.
      OPMERKING: Kolommen van fluorescentie voor een put in de loop van de tijd worden vermeld bij RFU's (getiteld kolomtransformatie) en als een decimale verandering ten opzichte van de RFU-meting bij de eerste meting (t0 getiteld Delta F). In de Excel-sjabloon is de Delta F-tabel ingesteld op de laatste basislijnwaarde vóór toevoeging van geneesmiddelen. Dit is het6e punt voor gegevensverzameling.
    8. Kopieer na gegevenstransformatie de gegevens van Delta F en plak deze in gegevensanalysesoftware als verval of relatief verval in fluorescentie in de loop van de tijd.
    9. Verander de X-titel in "tijd (s)" en de Y-titel in "ΔF/F0" voor relatieve decimale waarden.

2. Eencellige test met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop

  1. Zaaien (HASM) cellen met de cADDis BacMam-vector in een schaal van 35 mm (dag 1)
    1. Splits en infecteer cellen in een virale kap.
      1. Warme HASM-media (tabel 1), 0,25% trypsine-EDTA in een waterbad van 37 °C.
      2. Desinfecteer de kap en de materialen en veeg de kap af met EtOH-doordrenkte tissues.
      3. Verwijder HASM-media uit de kolf en gooi deze weg met een serologische pipet.
      4. Voeg 5 ml Mg2+ en Ca2+ vrij DPBS (37 °C) toe met een nieuwe serologische pipet en kantel de kolf om de bodem met de DPBS te wassen.
      5. Trypsiniseer cellen door 3 ml opgewarmd 0,25% trypsine-EDTA toe te voegen met een serologische pipet. Kantel de kolf om ervoor te zorgen dat het reagens de bodem van de kolf volledig bedekt. Laat het reagens 3-5 minuten intrekken zodat de cellen zich kunnen losmaken van de kolf.
      6. Zuig 5 ml vers materiaal met antibiotica op en verwijder de pipet om de cellen van de bodem van de kolf te verwijderen.
      7. Verzamel het totale volume van de kolf (8 ml) centrifuge in een centrifugebuis bij 200 x g gedurende 5 minuten.
      8. Verwijder na het centrifugeren het supernatans met een serologische pipet en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.
      9. Voeg zonder de pellet te verstoren 500 μL DPBS zonder Mg2+ en Ca2+ DPBS toe aan de zijkant van de centrifugebuis. Verwijder en gooi zoveel mogelijk vloeistof weg en herhaal dit nog een keer.
        OPMERKING: Dit experiment is geoptimaliseerd voor een kolf van 75 cm2 ; Volumeaanpassingen voor reagentia kunnen nodig zijn als een kweekapparaat van een andere grootte wordt gebruikt.
      10. Tel de cellen en pas de celdichtheid aan tot 40.000 cellen/ml.
      11. Maak een mastermix op basis van het benodigde reagensvolume per putje van een schaaltje van 35 mm. Zie de volumes hieronder:
        OPMERKING: Voorbeeld van 1 putje (totaal volume 500 μL): 20 μL van de biosensor BacMam-vector (voorraad van 2 x 1010 virale genen/ml), 5 μL trichostatine A (voorraad van 100 μM, eindconcentratie 1 μM), 500 μL van 40.000 cellen/ml celdichtheid. Voorbeeld voor 4 putjes (totaal volume 2 ml): 80 μL van de biosensor BacMam-vector (voorraad virale genen/ml), 20 μL trichostatine A (voorraad van 100 μM, eindconcentratie 1 μM), 2000 μL media 40.000 cellen/ml celdichtheid.
      12. Voeg 500 μL mastermix per putje toe. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur voordat u het experiment voortzet.
        OPMERKING: Het celnummer kan variëren afhankelijk van de cellijn. Gebruik een laag aantal cellen om overlappende cellen voor de analyse te voorkomen.
  2. Bereiding van farmacologische middelen (dag 2)
    1. Verwijder voorzichtig het medium in elk putje en vervang het door 450 μl DPBS door Mg2+ en Ca2+ bij 37 °C.
    2. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en broed de schijf van 35 mm uit bij 37 °C gedurende 30 min-1 uur.
    3. Inspecteer cellen op een microscoop om de gezondheid van de cellen te bevestigen.
    4. Bereid intussen de medicijnen voor op de meting 1 log-eenheid boven de gewenste eindconcentratie (10-voudig groter). Bereid dus 100 μM forskolin en 100 nM isoproterenol.
    5. Voor log-dosistiters bereidt u het geneesmiddel voor op 10 mM en gebruikt u seriële verdunningen om 100 μM forskoline en 100 nM isoproterenol te bereiken.
  3. Data-acquisitie
    OPMERKING: De volgende instellingen zijn voor een fluorescerende omgekeerde microscoop. De software die bij elke microscoop wordt geleverd, kan verschillen; De algemene instellingen die in het huidige protocol worden gebruikt, worden hier beschreven.
    1. Zet de centrale hub aan en vervolgens de omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
    2. Open de software die voor de opname wordt gebruikt en kies de optie time-lapse-opname .
    3. Plaats een schotelhouder van 35 mm in de microscooptafel.
    4. Stel de objectieflens in op x20.
    5. Gebruik autofocus en krijg een zo helder mogelijk beeld. Als het moeilijk is om individuele cellen te vinden, begin dan met een 4x objectief en ga dan naar 20x. Stel het monster handmatig scherp als de microscoop geen autofocusfunctie heeft.
      OPMERKING: De vergroting van 40x kan worden gebruikt als er meer significante celmorfologische details nodig zijn.
    6. Pas de volgende instellingen aan voor het verkrijgen van optimale gegevensverzameling: Automatische helderheid (belichting), Excitatiegolflengte, Zwartbalans (om achtergrondruis te verminderen), Autofocus.
    7. Nadat u een gezichtsgebied met verschillende cytoplasmatische fluorescerende cellen hebt gevonden, verzamelt u gegevens met behulp van time-lapse-opname gedurende 20 minuten om de 30 seconden.
    8. Klik op de go om te beginnen met lezen.
    9. Ren 3 minuten om de basislijn te verzamelen. Zodra de opname van 3 minuten is genomen, voegt u voorzichtig 50 μL van het medicijn toe aan het juiste putje. Wanneer de medicijnen worden toegevoegd, is de uiteindelijke concentratie op het gerecht 10 μM forskolin en 10 nM isoproterenol.
      OPMERKING: Het medicijn moet voorzichtig worden toegevoegd; Raak de plaat niet aan met de pipetpunt, omdat dit het gezichtsveld kan verschuiven en ervoor kan zorgen dat het monster niet kan worden geanalyseerd.
    10. Laat het experiment nog 17 minuten lopen en leg elke 30 s gegevens vast.
    11. Zodra de test is voltooid, moet u ervoor zorgen dat de gegevens klaar zijn voor analyse.
      OPMERKING: Hoewel het huidige protocol geen controle voor focale drift bevat, kan het nuttig zijn om er een in het experiment op te nemen. Het gebruik van nucleaire kleurstoffen kan bijvoorbeeld helpen bij het beheersen van focale drift tijdens microscoopanalyse, vooral bij het vastleggen van beelden van levende cellen gedurende langere tijd. cADDis-biosensoren zijn doorgaans wijd verspreid in de cel, waardoor een breed brandpuntsvlak het meest effectief is om vast te leggen en de noodzaak om focale drift te beheersen wordt verminderd9.
  4. Analyseren van de gegevens
    OPMERKING: De software die bij elke microscoop wordt geleverd, kan verschillen, dus de algemene instellingen die moeten worden gebruikt om de vastgelegde beelden te analyseren, worden hier beschreven.
    1. Open de afbeeldingsbestanden die tijdens het experiment zijn gemaakt.
    2. Gebruik de polygoon of cirkel om het interessegebied van elke cel te selecteren om de analyse uit te voeren. De analyse moet de helderheid van elke cel op elk tijdstip geven.
      OPMERKING: Het is het beste om individuele cellen te selecteren en geen cellen die de wand van de schaal of andere cellen raken. Dit zorgt voor de best mogelijke gegevensverzameling. Selecteer minimaal 5 cellen voor analyse binnen elke voorwaarde en repliceer het experiment ten minste drie keer.
    3. Nadat u de gegevens hebt geanalyseerd, opent u de gegevens in een Excel-blad en berekent u de gemiddelde helderheid voor elke aandoening bij elke foto, te beginnen bij de afbeelding net voordat u de farmacologische middelen of het medium toevoegt. In dit voorbeeld na 3 minuten of de 6efoto die met de microscoop wordt gemaakt, aangezien elke foto elke 30 s wordt gemaakt.
    4. Bereken ΔF/F0 voor elke gemiddelde waarde in elke toestand.
    5. Laad in een statistische analysesoftware en zet ΔF/F0 uit tegen de tijd in s.
      OPMERKING: Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de belangrijkste stappen van de protocollen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De huidige studie valideerde de cytosolische biosensor in zowel plaatlezer- als microscooptests. Zodra cellen de biosensor tot expressie brachten, werden ze gestimuleerd met ofwel 10 μM forskoline (een directe activator van adenylylcyclase), 10 nM isoproterenol (een agonist bij ß1AR en ß2AR) of vehiculum (Figuur 1). De daaropvolgende veranderingen in fluorescentie, indicatief voor cAMP-productie, werden elke 30 s vastgelegd.

De gegevens werde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Nauwkeurige en gevoelige meting van cAMP is cruciaal voor het begrijpen van de rol ervan in verschillende cellulaire processen en voor het bestuderen van de activiteit van cAMP-afhankelijke signaalroutes. Er zijn verschillende methoden die vaak worden gebruikt om cAMP-niveaus te meten, waaronder ELISA, radioimmunoassay, FRET-biosensoren en de GloSensor cAMP-test 14,15,16,17,18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well plate (clear)Fisherbrand21-377-203
35 mm dishGreiner Bio-One627870Celcultuur schotels met glazen bodem
96-well plate Corning3904Zwart met heldere platte bodem
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062Voor HEK en HASM media
BZ-X fluorescentiemicroscoopKeyence
Calciumchloride (IM)Quality Biological IncE506Voor HASM media
Centrifugebuis (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM (1x)Gibco11965092HEK media
DPBS met Mg2+ en Ca2+ Gibco14040-133
DPBS zonder Mg2+ en Ca2+Corning14040-133
Fetal bovien serum (FBS)R&D systemsS11195Voor HEK en HASM media
ForskolinMillipore344270Geneesmiddel
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagens
Ham's F-12K Gibco21127022Voor HASM media
HEPES (1M)Gibco15630080Voor HASM media
IsoproterenolSigmaI6504Geneesmiddel
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081Voor HASM media
Microcentrifugebuis (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibioticum voor HASM media
RNAse awayThermo Scientific700511Reagens
Natriumhydroxide oplossingSigmaS2770Voor HASM media
Spectrmax M5 plate readerMolecular Devices
Trichostatin ATCI AmericaT2477Reagens
Trypsin EDTAGibco25200-056Reagens

Referenties

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
  3. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  4. Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769(2020).
  5. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
  6. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  7. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332(2018).
  8. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
  9. Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
  10. Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
  11. Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
  12. Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
  13. Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
  14. Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
  15. Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
  16. Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
  17. Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
  18. Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
  19. Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
  20. Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
  21. Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
  22. De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646(2022).
  23. Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
  24. Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
  25. Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
  26. Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297(2022).
  27. Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

cAMP-biosensorlive-cell imagingfluorescerende biosensorcADDis-sensorglad spierweefsel van de menselijke luchtwegensingle-cell imagingfluorescentiemicroscopiehigh-throughput screening
Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.