In deze studie demonstreren we een verfijnd single fiber electromyography (SFEMG) protocol om in vivo meting van neuromusculaire junctie (NMJ) transmissie in knaagdiermodellen mogelijk te maken. Een stapsgewijze benadering van de SFEMG-techniek wordt beschreven om kwantificering van NMJ-transmissievariabiliteit en -falen in de gastrocnemius-spier van ratten mogelijk te maken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gestimuleerde elektromyografie met één vezel (SFEMG) voor het beoordelen van de overdracht van neuromusculaire juncties in knaagdiermodellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Als laatste verbinding tussen het zenuwstelsel en de spier is de overdracht op de neuromusculaire junctie (NMJ) cruciaal voor een normale motoriek. Elektromyografie met één vezel (SFEMG) is een klinisch relevante en gevoelige techniek die de potentiaalreacties van enkele spiervezels meet tijdens vrijwillige samentrekkingen of zenuwstimulaties om de overdracht van NMJ te beoordelen. De beoordeling en kwantificering van NMJ-transmissie omvat twee parameters: jitter en blokkering. Jitter verwijst naar de variabiliteit in timing (latentie) tussen opeenvolgende single-fiber action potentials (SFAP's). Blokkeren betekent het falen van NMJ-transmissie om een SFAP-reactie te initiëren. Hoewel SFEMG een gevestigde en gevoelige test is in klinische omgevingen, is de toepassing ervan in preklinisch onderzoek relatief zeldzaam geweest. Dit rapport schetst de stappen en criteria die worden gebruikt bij het uitvoeren van gestimuleerde SFEMG om jitter en blokkering in knaagdiermodellen te kwantificeren. Deze techniek kan worden gebruikt in preklinische en klinische studies om inzicht te krijgen in de NMJ-functie in de context van gezondheid, veroudering en ziekte.
Inleiding
Enkelvoudige vezelelektromyografie (SFEMG) werd oorspronkelijk ontwikkeld door Stålberg en Ekstedt in de jaren 1960 om actiepotentialen van individuele spiervezels te identificeren en te analyseren, voornamelijk om spiervermoeidheid tebestuderen. SFEMG is de meest gevoelige klinische techniek voor de beoordeling van de overdracht van neuromusculaire junctie (NMJ)2. SFEMG wordt uitgevoerd door selectief single fiber action potentials (SFAP's) te registreren3. NMJ-overdracht kan in het gedrang komen door factoren zoals veroudering 4,5 en verschillende neuromusculaire aandoeningen zoals myasthenia gravis en amyotrofische laterale sclerose6. Bovendien kunnen aandoeningen zoals ischemie, temperatuurschommelingen en het gebruik van neuromusculaire blokkers leiden tot tekortkomingen in de NMJ-overdracht, die zich manifesteren door verhoogde NMJ-transmissievariabiliteit en het optreden van NMJ-falen2.
Er zijn twee benaderingen voor het registreren van SFEMG: gestimuleerde en vrijwillige SFEMG. Vrijwillige SFEMG omvat het registreren van SFAP's van twee NMJ's die door hetzelfde motoraxon worden gevoed met behulp van een concentrische naaldelektrode die tijdens vrijwillige activering in de spier wordt ingebracht die wordt getest7. Dienovereenkomstig vereist vrijwillige SFEMG de medewerking van de proefpersoon en kan het alleen laagdrempelige motorische eenheden beoordelen (die worden geactiveerd tijdens zwakke contracties)3. Gestimuleerde SFEMG maakt gebruik van een paar stimulerende elektroden om motoraxonen te stimuleren tijdens het registreren van SFAP's met een SFEMG-naaldelektrode die in de spier wordt ingebracht die wordt getest7.
Bij zowel vrijwillige als gestimuleerde SFEMG zijn jitter en blokkering de twee parameters die worden gebruikt om NMJ-overdracht te beoordelen en te kwantificeren8. Jitter beschrijft de variabiliteit in timing (latentie) tussen opeenvolgende SFAP's. Tijdens vrijwillige SFEMG wordt jitter gekwantificeerd door de latentieverschillen te beoordelen tussen een paar SFAP's (gevoed door hetzelfde motoraxon) gedurende 50 tot 100 opeenvolgende ontladingen. Tijdens gestimuleerde SFEMG wordt jitter gekwantificeerd door de latentieverschillen te beoordelen tussen de stimulatietiming en het begin van de SFAP tijdens 50 tot 100 opeenvolgende ontladingen. Blokkeren geeft aan dat NMJ-overdracht geen SFAP-respons teweegbrengt, en het kan worden gekwantificeerd als de aan- of afwezigheid van elk paar SFAP's tijdens vrijwillige SFEMG of voor elk NMJ tijdens gestimuleerde SFEMG 2,7.
Hoewel SFEMG een gevestigde en gevoelige test is in de klinische setting, is het slechts zelden toegepast in preklinisch onderzoek 4,5,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . In dit rapport schetsen we de aanpak voor het uitvoeren en analyseren van SFEMG-opnames in preklinische knaagdiermodellen. Verder presenteren we representatieve gegevens die representatieve bevindingen over SFEMG benadrukken die wijzen op een verslechtering van de NMJ-transmissie na toediening van een niet-depolariserend neuromusculair blokkeringsmiddel, rocuronium.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle protocollen zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften die zijn opgesteld door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Missouri.
1. Voorbereiding van dieren en toediening van anesthesie
- Trek de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen aan.
- Meet voorafgaand aan de procedure het gewicht van de rat om de juiste dosis te bepalen voor op gewicht gebaseerde medicijnen en beademingsinstellingen.
- Induceer anesthesie met 3%-5% geïnhaleerde isofluraan. Zodra een adequaat niveau van anesthesie is vastgesteld, plaatst u de rat in buikligging en handhaaft u de anesthesie met 1%-3% geïnhaleerde isofluraan.
- Controleer de geschiktheid van de diepte van de anesthesie door voorzichtig met een tang op het voetkussen van de achterpoten te drukken om de afwezigheid van een terugtrekkingsreactie te observeren.
- Houd de lichaamstemperatuur op 37 °C.
- Breng door dierenartsen goedgekeurde zalf op petroleumbasis aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Bewaak de diepte van de anesthesie door de ademhalingsfrequentie te observeren en te beoordelen op terugtrekkingsreacties bij het uitoefenen van druk op het voetkussen met een pincet.
- Scheer de te beoordelen achterpoot met een tondeuse. Na voldoende ontharing, met plakband, plaatst u het te bestuderen ledemaat met de enkel gefixeerd op ongeveer 90° dorsaalflexie, de knie in extensie en de heup in abductie.
- Bewaak continu de ademhaling en hartslag van de rat gedurende het hele experiment.
OPMERKING: Een verhoging van de hartslag wordt vaak gebruikt als een indicator van onvoldoende anesthesiediepte. - Dien isofluraan toe om de rat te euthanaseren, met een dosis van 5% of hoger, totdat de ademhaling gedurende ten minste 3 minuten is gestopt. Bevestig de euthanasie door onthoofding.
2. Plaatsing en instelling van de elektroden
OPMERKING: NMJ-overdracht van de heupzenuw en gastrocnemius-spier wordt beoordeeld met behulp van het elektromyografie (EMG) -systeem. Raadpleeg de Tabel met materialen.
- Steek een paar geïsoleerde monopolaire naalden van 28 G voor het stimuleren van de heupzenuw met de kathode in het gebied van de proximale achterpoot, terwijl de anode zich meer proximaal in het onderhuidse weefsel bevindt dat het heiligbeen bedekt.
- Zorg ervoor dat de stimulerende elektroden niet in de onmiddellijke nabijheid van de heupzenuw of te diep worden geplaatst om directe schade aan de heupzenuw of andere aangrenzende structuren te voorkomen.
- Plaats een wegwerp aardelektrode op de contralaterale achterpoot of staart.
- Plaats voorzichtig een naaldelektrode van 27 gauge en 25 mm die speciaal is ontworpen voor EMG met één vezel, met een opnameoppervlak van platina-iridiummateriaal in de rechter gastrocnemiusspier. Zorg ervoor dat de SFEMG-elektroden voor elk gebruik worden geautoclaveerd om de steriliteit te behouden.
- Plaats de SFEMG-naaldelektrode parallel met de gastrocnemius-spiervezels om enkelvezelactiepotentialen (SFAP's) vast te leggen.
- Voorkom spierbeschadiging tijdens het inbrengen en manoeuvreren van de SFEMG-naald in de spier.
3. Procedure voor gestimuleerde elektromyografie met één vezel (SFEMG)
- Oefen constante stroomstimulatie uit op de rechter heupzenuw met een frequentie van 10 Hz met een intensiteitsbereik van 0,3-10 mA en een pulsduur van 0,1 ms.
- Configureer de filterinstellingen binnen een laagfrequent filter van 1 kHz en hoogfrequent filter van 10 kHz. Pas de versterking aan van 200 μV tot 1000 μV per divisie om de visualisatie van potentialen te vergemakkelijken. Stel de veegsnelheid in op 500 μs per divisie.
- Pas de stimulusintensiteit aan om SFAP's te activeren en te isoleren voor opname en daaropvolgende analyse.
- Om een respons als een FCAP te identificeren en te analyseren, moet u ervoor zorgen dat aan de specifieke criteria hieronder wordt voldaan: Zorg ervoor dat de stijgtijd van de basislijnpiek naar de negatieve fase minder is dan 500 μs, de minimale amplitude (basislijnpiek naar negatief) ten minste 200 μV is en dat de respons consequent een alles-of-niets-gedrag vertoont (stabiele grootte en vorm tussen reacties).
OPMERKING: Het is essentieel dat de terugkerende reacties consistente opwaartse fasen vertonen zonder inkepingen of buigpunten. Merk op dat het laatste criterium cruciaal is om een kwaliteitssignaal te onderscheiden van de som van meerdere signalen.
- Om een respons als een FCAP te identificeren en te analyseren, moet u ervoor zorgen dat aan de specifieke criteria hieronder wordt voldaan: Zorg ervoor dat de stijgtijd van de basislijnpiek naar de negatieve fase minder is dan 500 μs, de minimale amplitude (basislijnpiek naar negatief) ten minste 200 μV is en dat de respons consequent een alles-of-niets-gedrag vertoont (stabiele grootte en vorm tussen reacties).
- Bereken Jitter, of variabiliteit van SFAP-latentie (tijd tussen stimulatie en stijgende fase van negatieve piek van SFAP) tussen opeenvolgende ontladingen, na ten minste 50 stimulaties (50-100 stimulaties), en beoordeel en kwantificeer blokkering.
OPMERKING: Blokkering kan worden beoordeeld als de aan- of afwezigheid bij elke synaps of als het percentage stimulaties dat er niet in slaagt om het genereren van een enkele vezelactiepotentiaal te activeren. Jitter wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking7 (Jitter wordt meestal automatisch berekend door elektromyografiesystemen in klinieken):
MCD = Gemiddelde waarde van opeenvolgend verschil
IPI = interpotentiaalinterval - Herhaal het proces voor aanvullende SFAP-reacties. Beoordeel gemiddeld 10 synapsen van elk dier om de jitter te berekenen en bepaal vervolgens de gemiddelde waarden per dier.
- Sluit SFAP's met jitter van minder dan 4 μs uit van de analyses om te voorkomen dat potentialen worden opgenomen die mogelijk zijn opgeroepen door directe spierstimulatie11.
- Wanneer u potentialen registreert die intermitterende blokkering vertonen, verhoogt u de stimulusintensiteit om te controleren of SFAP-falen niet te wijten is aan submaximale stimulatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om verhoogde jitter en blokkering aan te tonen in de context van falen van NMJ-transmissie, werd gestimuleerde SFEMG uitgevoerd met en zonder intraveneuze toediening van rocuronium. Rocuronium is een middellangwerkend, niet-depolariserend neuromusculair blokkeringsmiddel dat veel wordt gebruikt in klinische omgevingen om spierverlamming te induceren tijdens operaties of medische procedures. Het werkt door competitief te binden aan nicotine-acetylcholinereceptoren in de NMJ
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
SFEMG wordt vaak gebruikt voor diagnostische tests bij patiënten met vermoedelijke auto-immuunziekten, verworven en genetische vormen van NMJ-ziekte. SFEMG wordt beschouwd als de meest gevoelige test voor de diagnose van de NMJ-stoornis, myasthenia gravis20,21. Repetitieve zenuwstimulatie (RNS) is een andere methode die vaker wordt gebruikt in klinische diagnostische tests en omvat het stimuleren van een perifere zenuw met een re...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
W. David Arnold ontving onderzoeksfinanciering van NMD Pharma en Avidity Biosciences en adviseert NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics en Catalyst Pharmaceuticals.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Dr. Martin Brandhøj Skov van NMD Pharma bedanken voor zijn waardevolle advies over rocuroniumdosering en Arash Karimi van de afdeling Biomedische Technologie van de Stony Brook University voor zijn hulp bij berekeningen. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van NIH aan WDA (R01AG067758 en R01AG078129).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 27 G Reusable Single Fiber Needle Electrode | Technomed | 202860-000 | singlefiber opname-elektrode |
| 2 mL Glass Syringe | Kent Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| Detachable Cable | Technomed | 202845-0000 | om de recorder elektrode met de elektrodiagnostische machine te verbinden |
| Disposable 2" x 2" disc electrode with leads | Cadwell | 302290-000 | aardelektrode |
| disposable monopolar needles 28 G | Technomed | 202270-000 | kathode en anode stimulerende elektroden |
| EMG needle cable (Amp/stim switch box) | Cadwell | 190266-200 | om monopolar elektroden met elektrodiagnostische stimulator te verbinden |
| Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Onderhoud van de plaatsing van de opname-elektrode |
| Isoflurane (250 mL bottle) | Piramal Healthcare | NA | |
| monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | gebruikt voor het aanbrengen van elektrode-gel |
| PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming | Kent Scientific Corporation | PS-RT | Inclusief infrarood verwarmingskussentjes, rectale sonde en kussen temperatuur sonde |
| Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | schaar voor haarverwijdering |
| Rat Endotracheal Tubes (16 G) | Kent Scientific Corporation | ||
| Rocoronium Bromide | Sigma | PHR2397-500MG | neuromusculaire blokkerende agent |
| Sierra Summit EMG system | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | NA | draagbaar elektrodiagnostisch systeem |
| SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SOMNO | Inclusief anti-spill, anti-damp flesdop adapter; Y adapter buis; actieve kool filter |
| Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | toegepast tijdens anesthesie om corneale verwonding te voorkomen |
Referenties
- Stalberg, E. Propagation velocity in human muscle fibers in situ. Acta Physiol Scand Suppl. 287, 1-112 (1966).
- Stålberg, E., Trontelj, J. V. The study of normal and abnormal neuromuscular transmission with single fibre electromyography. J Neurosci Methods. 74 (2), 145-154 (1997).
- Sanders, D. B., et al. Guidelines for single fiber EMG. Clin Neurophysiol. 130 (8), 1417-1439 (2019).
- Chugh, D., et al. Neuromuscular junction transmission failure is a late phenotype in aging mice. Neurobiol Aging. 86, 182-190 (2020).
- Padilla, C. J., et al. Profiling age-related muscle weakness and wasting: Neuromuscular junction transmission as a driver of age-related physical decline. GeroScience. 43 (3), 1265-1281 (2021).
- Selvan, V. A. Single-fiber EMG: A review. Ann Indian Acad Neurol. 14 (1), 64-67 (2011).
- Sanders, D. B., Kouyoumdjian, J. A., Stålberg, E. V. Single fiber electromyography and measuring jitter with concentric needle electrodes. Muscle Nerve. 66 (2), 118-130 (2022).
- Juel, V. C. Single fiber electromyography. Handb Clin Neurol. 160, 303-310 (2019).
- Chung, T., et al. Evidence for dying-back axonal degeneration in age-associated skeletal muscle decline. Muscle Nerve. 55 (6), 894-901 (2017).
- Iyer, C. C., et al. Follistatin-induced muscle hypertrophy in aged mice improves neuromuscular junction innervation and function. Neurobiol Aging. 104, 32-41 (2021).
- Meekins, G. D., Carter, G. T., Emery, M. J., Weiss, M. D. Axonal degeneration in the trembler-j mouse demonstrated by stimulated single-fiber electromyography. Muscle Nerve. 36 (1), 81-86 (2007).
- Gooch, C. L., Mosier, D. R. Stimulated single fiber electromyography in the mouse: Techniques and normative data. Muscle Nerve. 24 (7), 941-945 (2001).
- Chung, T., Tian, Y., Walston, J., Hoke, A. Increased single-fiber jitter level is associated with reduction in motor function with aging. Am J Phys Med Rehabil. 97 (8), 551-556 (2018).
- Sokolow, S., et al. Impaired neuromuscular transmission and skeletal muscle fiber necrosis in mice lacking na/ca exchanger 3. J Clin Investig. 113 (2), 265-273 (2004).
- Añor, S., et al. Evaluation of jitter by stimulated single-fiber electromyography in normal dogs. J Vet Intern Med. 17 (4), 545-550 (2003).
- Mizrachi, T., et al. NMO-IgG and AQP4 peptide can induce aggravation of eamg and immune-mediated muscle weakness. J Immunol Res. 2018, 5389282(2018).
- Lin, T. S., Cheng, T. J. Stimulated single-fiber electromyography in the rat. Muscle Nerve. 21 (4), 482-489 (1998).
- Finley, D. B., Wang, X., Graff, J. E., Herr, D. W. Single fiber electromyographic jitter and detection of acute changes in neuromuscular function in young and adult rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 59 (2), 108-119 (2009).
- Khan, Z. H., Hajipour, A., Zebardast, J., Alomairi, S. R. Muscle relaxants in anesthesia practice: A narrative review. Arch Anesthesiol Crit Care. 4 (4), 547-552 (2018).
- Padua, L., Caliandro, P., Stålberg, E. A novel approach to the measurement of motor conduction velocity using a single fibre emg electrode. Clin Neurophysiol. 118 (9), 1985-1990 (2007).
- Khoo, A., Hay Mar, H., Borghi, M. V., Catania, S. Electrophysiologic evaluation of myasthenia gravis and its mimics: Real-world experience with single-fiber electromyography. Hosp Pract. 50 (5), 373-378 (2022).
- Nannan, G., et al. A role of lamin a/c in preventing neuromuscular junction decline in mice. J Neurosci. 40 (38), 7203(2020).
- Alley, D. E., et al. Grip strength cutpoints for the identification of clinically relevant weakness. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 559-566 (2014).
- Juel, V. C. Clinical Neurophysiology of Neuromuscular Junction Disease. Handbook of Clinical Neurology. 161, Elsevier. 291-303 (2019).
- Rich, M. M. The control of neuromuscular transmission in health and disease. Neuroscientist. 12 (2), 134-142 (2006).
- Juel, V. C. Evaluation of neuromuscular junction disorders in the electromyography laboratory. Neurol Clin. 30 (2), 621-639 (2012).
- Arnold, W. D., Clark, B. C. Neuromuscular junction transmission failure in aging and sarcopenia: The nexus of the neurological and muscular systems. Ageing Res Rev. 89, 101966(2023).
- Kokubun, N. Reference values for concentric needle single fiber EMG. Rinsho Shinkeigaku. 52 (11), 1246-1248 (2012).
- Testelmans, D., et al. Rocuronium exacerbates mechanical ventilation-induced diaphragm dysfunction in rats. Crit Care Med. 34 (12), 3018-3023 (2006).
- Suzuki, K., et al. Intravenous infusion of rocuronium bromide prolongs emergence from propofol anesthesia in rats. PLoS One. 16 (2), e0246858(2021).
- Stålberg, E., et al. Reference values for jitter recorded by concentric needle electrodes in healthy controls: A multicenter study. Muscle Nerve. 53 (3), 351-362 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
