De TD Drive: een parametrisch, open-source implantaat voor elektrofysiologische opnames van meerdere gebieden bij zich gedragende en slapende ratten

Samenvatting

Hier presenteren we een uniek, 3D-printbaar implantaat voor ratten, genaamd TD Drive, dat in staat is tot symmetrische, bilaterale draadelektrode-opnames, momenteel in maximaal tien gedistribueerde hersengebieden tegelijk.

Samenvatting

Ingewikkelde interacties tussen meerdere hersengebieden liggen ten grondslag aan de meeste functies die aan de hersenen worden toegeschreven. Het leerproces, evenals de vorming en consolidatie van herinneringen, zijn twee voorbeelden die sterk afhankelijk zijn van functionele connectiviteit in de hersenen. Bovendien gaat het onderzoeken van hemisferische overeenkomsten en/of verschillen hand in hand met deze multi-area interacties. Elektrofysiologische studies die deze complexe processen verder proberen op te helderen, zijn dus afhankelijk van het gelijktijdig en vaak bilateraal registreren van hersenactiviteit op meerdere locaties. Hier wordt een 3D-printbaar implantaat voor ratten gepresenteerd, genaamd TD Drive, dat in staat is tot symmetrische, bilaterale draadelektrode-opnames, momenteel in maximaal tien gedistribueerde hersengebieden tegelijkertijd. Het open-sourceontwerp is gemaakt met behulp van parametrische ontwerpprincipes, waardoor toekomstige gebruikers het schijfontwerp gemakkelijk kunnen aanpassen aan hun behoeften door eenvoudig parameters op hoog niveau aan te passen, zoals anterieure-posterieure en mediolaterale coördinaten van de locaties van de opname-elektroden. Het implantaatontwerp werd gevalideerd in n = 20 Lister Hooded ratten die verschillende taken uitvoerden. Het implantaat was compatibel met tethered slaapopnames en open veldopnames (Object Exploration), evenals draadloze opnames in een groot doolhof met behulp van twee verschillende commerciële opnamesystemen en headstages. Hier wordt dus het aanpasbare ontwerp en de assemblage van een nieuw elektrofysiologisch implantaat gepresenteerd, waardoor een snelle voorbereiding en implantatie mogelijk wordt.

Inleiding

Het multi-area karakter van herseninteracties tijdens waken en slapen maakt het moeilijk om de lopende fysiologische processen uitputtend te bestuderen. Hoewel benaderingen zoals functionele MRI (fMRI) en functionele echografie (fUS) het mogelijk maken om hersenactiviteit van hele hersenen te bemonsteren ^1,2, maken ze gebruik van neurovasculaire koppeling om hersenactiviteit af te leiden uit hemodynamische activiteit, waardoor hun temporele resolutie wordt beperkt². Bovendien vereist fMRI dat de proefpersoon in een MRI-scanner wordt geplaatst, waardoor experimenten met vrij bewegende dieren verboden zijn. Optische beeldvorming van de calciumdynamiek met enkelvoudige of meervoudige beeldvorming van fotonen maakt celtypespecifieke opnames van honderden neuronen tegelijk mogelijk³. Op het hoofd gemonteerde microscopen zoals de Miniscope³, die vrij bewegend gedrag mogelijk maken, zijn echter meestal beperkt tot het afbeelden van oppervlakkige corticale gebieden in intacte hersenen⁴. Hoewel de diameter van hun gezichtsveld op de cortex in de orde van grootte van 1 mm kan liggen, kunnen de ruimtevereisten van deze op het hoofd gemonteerde microscopen het moeilijk maken om meerdere, vooral aangrenzende gebieden te richten. Daarom, om de hersendynamiek in meerdere gebieden tijdens het waken en slapen nauwkeurig vast te leggen, is extracellulaire elektrofysiologie, geregistreerd met elektroden die in de betreffende hersengebieden zijn geïmplanteerd, een van de voorkeursmethoden vanwege de hoge temporele resolutie en ruimtelijke precisie⁵. Bovendien maakt het de karakterisering van de slaapdynamiek bij dieren mogelijk die compatibel is met analyses verkregen uit menselijk EEG, waardoor de translationele waarde van deze methode toeneemt⁶.

Klassiek hebben onderzoeken die hersenactiviteit met extracellulaire elektroden registreren, individuele draadelektroden of elektrodebundels gebruikt, zoals tetrodes⁷. State-of-the-art sondes zoals de Neuropixels-sonde⁸ maken het mogelijk om meerdere gebieden tegelijk te richten, op voorwaarde dat ze zijn uitgelijnd op een as die het mogelijk maakt om de sonde langs die as te implanteren zonder het dier te schaden. Nauwkeurige gelijktijdige opnames van meerdere, ruimtelijk gescheiden gebieden blijven echter een uitdaging, waarbij bestaande methoden kostbaar of tijdrovend zijn.

In de afgelopen jaren zijn additieve productiemethoden zoals stereolithografie op grote schaal beschikbaar gekomen. Dit stelde onderzoekers in staat om nieuwe elektrode-implantaten te ontwikkelen die konden worden aangepast aan hun experimentele vereisten⁹, bijvoorbeeld vereenvoudigde herhaalbare targeting van meerdere hersengebieden. Vaak worden deze implantaatontwerpen ook gedeeld met de academische gemeenschap als open-source hardware, waardoor andere onderzoekers ze aan hun eigen doeleinden kunnen aanpassen. De mate van aanpasbaarheid van specifieke implantaten varieert zowel als gevolg van de manier waarop het implantaat is ontworpen als de manier waarop het wordt gedeeld. Parametrisch modelleren¹⁰ is een populaire benadering in computerondersteund ontwerp, waarbij verschillende componenten van het ontwerp met elkaar zijn verbonden door onderling afhankelijke parameters en een gedefinieerde ontwerpgeschiedenis. Het implementeren van een parametrische benadering voor het ontwerpen van implantaten verhoogt hun herbruikbaarheid en aanpassingsvermogen¹⁰, aangezien het wijzigen van individuele parameters automatisch het volledige ontwerp bijwerkt zonder dat er complexe hermodellering van het ontwerp nodig is. Een consequente noodzaak is dat het ontwerp zelf wordt gedeeld in een bewerkbaar formaat dat de parametrische relaties en ontwerpgeschiedenis behoudt. Bestandsformaten die alleen geometrische primitieven vertegenwoordigen, zoals STL of STEP, maken latere parametrische wijzigingen van gepubliceerde modellen onhaalbaar.

Hoewel tetrode hyperdrives 11,12,13 opnames van tientallen tetrodes mogelijk maken, zijn hun assemblage en implantatie tijdrovend en is hun kwaliteit grotendeels afhankelijk van de vaardigheid en ervaring van de individuele onderzoeker. Bovendien combineren ze meestal de geleidebuizen die de opname-elektroden naar hun doellocatie leiden in een of twee grotere bundels, waardoor het aantal en de spreiding van gebieden die efficiënt kunnen worden gericht, worden beperkt.

Andere implantaten ^14,15 leggen de hele schedel bloot en maken de vrije plaatsing van meerdere individuele microdrives mogelijk die de opname-elektroden dragen. Hoewel de plaatsing van onafhankelijke microdrives¹⁶ tijdens de operatietijd de flexibiliteit maximaliseert, verlengt het de operatietijd en kan het moeilijk zijn om meerdere aangrenzende gebieden te richten vanwege de ruimtevereisten van de afzonderlijke microdrives. Bovendien zijn de implantaten, hoewel ze open source zijn, worden ze alleen gepubliceerd als STL-bestanden, wat wijziging moeilijk maakt.

Een voorbeeld van een aandrijving met een meer inherente parametrische filosofie is de RatHat¹⁷. Door een chirurgisch sjabloon te bieden dat het hele dorsale oppervlak van de schedel bedekt, kan het nauwkeurig richten op meerdere hersendoelen zonder het gebruik van een stereotactisch frame tijdens de operatie. Er zijn meerdere implantaatvariaties voor canules, optrodes of tetrodes beschikbaar. Hoewel de schijf gratis te gebruiken is voor academische doeleinden, wordt deze niet open-source gepubliceerd, wat een hindernis vormt voor onderzoekers om het implantaat te evalueren en te gebruiken.

In dit artikel wordt de TD Drive gepresenteerd (zie figuur 1), een nieuw 3D-printbaar implantaat voor extracellulaire elektrode-opnames bij ratten. De TD Drive is bedoeld om enkele van de nadelen van bestaande oplossingen te ondervangen: het maakt het mogelijk om meerdere hersengebieden te richten, gespiegeld over beide hemisferen, met onafhankelijke draadelektroden tegelijkertijd. Door het eenvoudige ontwerp kan het in een paar uur tegen relatief lage kosten worden gemonteerd door minder ervaren onderzoekers. De TD Drive wordt open-source gepubliceerd, in gemakkelijk aanpasbare bestandsformaten om onderzoekers in staat te stellen deze aan te passen aan hun specifieke behoeften. Door vanaf het begin van het ontwerpproces van de TD Drive een parametrische 3D-modelleringsbenadering op te nemen, kunnen de parameters die nodig zijn om te worden gewijzigd, worden geabstraheerd: om doellocaties te wijzigen, kunnen onderzoekers eenvoudig de parameters bewerken die hun dorsoventrale en anteroposterieure coördinaten vertegenwoordigen, zonder dat de schijf zelf opnieuw hoeft te worden ontworpen. De bestanden om de TD-schijf aan te passen en te vervaardigen zijn te vinden op https://github.com/3Dneuro/TD_Drive.

Afbeelding 1: Overzicht van de TD-aandrijving . (A) Weergave van een TD-aandrijving met een beschermkap. (B) Rendering met getoonde interne delen. De TD Drive is voorzien van (a) meerdere, parametrisch instelbare opnamelocaties voor vaste en beweegbare elektrodedraden, een EIB met (b) een High-density Omnetics-connector die compatibel is met gangbare tethered en draadloze data-acquisitiesystemen, en (c) een intuïtieve kanaaltoewijzing die is geoptimaliseerd voor opnames met Intan/Open Ephys-systemen (zie aanvullende afbeelding 1) en (d) een dop om het implantaat te beschermen tijdens tethered opnames en wanneer er geen headstage is aangesloten. (C) Een geleidingssjabloon aan de onderkant van de TD Drive vergemakkelijkt de plaatsing van geleidecanules en dient als een redundante verificatie van implantaatlocaties tijdens de operatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het implantaatontwerp werd getest in n = 4, gevalideerd in n = 8 en bevestigd in n = 8 Lister Hooded ratten die verschillende taken uitvoerden. De eerste 4 dieren werden gebruikt om de aandrijving te ontwikkelen en parameters aan te passen. Vervolgens werd een volledige pilot uitgevoerd met 8 dieren (te zien in de resultaten). Een tweede cohort van 8 dieren werd uitgevoerd en opgenomen in de analyse van de implantaatoverleving. Het implantaat was compatibel met tethered slaapopnames en open veldopnames (Object Exploration), evenals draadloze opnames in een groot doolhof (HexMaze 9 m x 5 m) met behulp van twee verschillende commerciële opnamesystemen en headstages. De twee cohorten van 8 werden opgenomen met twee verschillende acquisitiesystemen - vastgebonden voor langere slaapopnames en draadloos voor opnames van grote doolhofverkenningen. We kunnen concluderen dat deze eenvoudige wiredrive langlopende experimenten met grotere cohorten door minder ervaren onderzoekers mogelijk maakt om slaapfase-analyse en oscillatie-analyse in meerdere hersengebieden mogelijk te maken. Dit in tegenstelling tot de meeste elektrofysiologische implantaten tot nu toe, die vanwege de moeilijkheidsgraad en tijdsintensiteit kleinere diercohorten mogelijk maken en meestal zeer ervaren onderzoekers nodig hebben. Met deze aandrijving kan echter geen individuele neuronactiviteit worden geregistreerd; het gebruik is dus beperkt tot onderzoeken naar lokale veldpotentiaal (LFP) en sommatieactiviteit.

Protocol

Het huidige onderzoek is goedgekeurd door de Centrale Commissie Dierproeven (CCD) en uitgevoerd volgens de Wet op de dierproeven (protocolcodes: 2020-0020-006 & 2020-0020-010). Mannelijke Lister Hooded ratten van 9-12 weken bij aankomst werden gebruikt. De reagentia en de apparatuur die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. Zie aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2 voor de stappen van het proces van het bouwen van aandrijvingen.

1. Aanpassen en maken van 3D-modellen en elektrode-interfacekaart (EIB)-gegevens

1. Open het ontwerp van de schijfbehuizing in Autodesk Fusion. Klik op Parameters wijzigen onder het tabblad Wijzigen . Pas de coördinaten voor de eerste opnamelocatie aan door de anteroposterieure coördinaat in anteroPosteriorSite1 en de mediolaterale coördinaat in medioLateralSite1 in te voeren. Men kan de diameter van het gat voor de geleidingsbuis of elektroden aanpassen door diameterSite1 aan te passen. Herhaal dit voor opnamelocaties 2 en 3 en het modelontwerp wordt automatisch aangepast.
   OPMERKING: De drie locaties die voor het huidige protocol worden gebruikt, zijn hippocampus (HPC), met beweegbare draadbundels, en prefrontale (PFC) en retrospleniale (RSC) cortex, beide met vaste draadbundels (de PFC-draadbundel richt zich op zowel prelimbische (PRL) als anterieure cingulate (ACC) cortex). Tabel 1 geeft de handmatig opgelegde limieten voor de parameters die de mediolaterale coördinaten van de registratieplaatsen controleren.
2. Exporteer de bijgewerkte schijfbehuizing door er met de rechtermuisknop op te klikken in de browser en Opslaan als mesh te selecteren. Selecteer het type STL (binair), eenheden mm en verfijning hoog.
3. Selecteer ofwel de voorbereide STL-bestanden voor de reguliere cap of, indien nodig (bijvoorbeeld wanneer de doelen erg lateraal zijn), de voorbereide STL-bestanden voor de large caps.
4. Afhankelijk van welke cap men kiest, selecteert u de reguliere of grote EIB voor de productie. De Gerber-productiebestanden voor beide EIB's worden geleverd als zip-archieven die rechtstreeks naar een productiedienst kunnen worden verzonden.

2. Het printen van de 3D-modellen en het vervaardigen van de EIB

OPMERKING: Voor de huidige studie werd een in de handel verkrijgbare 3D-printer gebruikt om de onderdelen te produceren (zie Materiaaltabel). Bij het gebruik van verschillende printers of het uitbesteden van de productie kan het nodig zijn om verschillende, vergelijkbare harsen voor de productie van de onderdelen te gebruiken.

1. Print de aandrijfbehuizing en shuttles met behulp van stereolithografie⁹ met een hoge resolutie in een gewone of biocompatibele hars (bijv. heldere, zwarte of witte hars) met een laaghoogte van 25 μm. Print de onderdelen voor de dop met een sterke en stevige hars (bijv. Tough 2000).
2. De EIB in eigen beheer vervaardigen of door een externe dienstverlener laten produceren. Soldeer de connector met hoge dichtheid aan de EIB met behulp van SMD-soldeertechnieken (Surface Mounted Device).
   OPMERKING: Als je geen ervaring hebt met het solderen van fijne elektronische componenten, is het aan te raden om het solderen extern te laten doen, bijvoorbeeld in de elektronicawerkplaats van de universiteit of een commerciële leverancier. Versterk de gesoldeerde connector met hoge dichtheid door een sterke epoxy rond de connector aan te brengen. Pas op dat u de gaten voor de elektroden niet afdekt met epoxy.

3. Nabewerking van de 3D-geprinte body

OPMERKING: Cap en shuttles hoeven niet te worden nabewerkt. Afhankelijk van de kwaliteit van de 3D-prints, moeten ze mogelijk licht worden geschuurd of moeten achtergebleven steunsporen worden verwijderd. Let er bij het schuren en boren op dat u de wanden van de aandrijfbehuizing niet breekt. Reinig indien nodig de nabewerkte onderdelen met isopropanol en, een zachte doek en/of perslucht.

1. Boor de gaten voor de geleidebuizen aan de boven- en onderkant van het aandrijflichaam uit met een boor van 0,5 mm die in een penbankschroef is gemonteerd. Dit zorgt ervoor dat de afmetingen correct en consistent zijn op alle locaties.
2. Boor de twee verzinkgaten (zoals in afbeelding 2E) op de aandrijfbehuizing voor het messing inzetstuk van de shuttle uit met behulp van een boor van 2 mm in een penbankschroef.
3. Reinig de verzinkgaten van boorvuil met perslucht. Tik vervolgens met een M1-kraan op de geleidingsgaten voor de pendelschroeven, die in het verlengde liggen van de verzinkgaten. Voer het tikken uit in twee of meer iteraties, verwijder vuil van de kraan en het gat tussen de iteraties. Smeer de kraan eventueel in met een druppel minerale olie.
4. Reinig de aandrijfbehuizing van boor- en tapvuil met perslucht.

Figuur 2: Weergave van de TD Drive. (A,B) TD Drive (A) zonder en (B) met een beschermkap op een rattenschedel model. (C) Polyimidegeleidebuisjes die op de juiste wijze in elk van de zes opnameplaatsen zijn geplaatst. (D) Een geïsoleerde, voltooide shuttle-assemblage met de geleideschroef, 3D-geprinte shuttle en het gesoldeerde messing inzetstuk. (E) TD Aandrijflichaam met twee geplaatste shuttles. Rood gemarkeerd: (a) verzinkgaten voor de shuttle, (b) shuttlegeleider, (c) centrale sposten van de aandrijfbehuizing, (d) geleidingssjabloon. (F,G) Belangrijke locaties aan de boven- (F) en onderkant (G) van de aandrijfbehuizing die mogelijk nabewerking nodig hebben na het 3D-printen, worden elk aangegeven met een rode pijl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Shuttle assemblages

1. Schuif een 3D-geprinte shuttle op een M1x16 schroef. Gebruik een M1 messing inzetstuk om de 3D-geprinte shuttle op zijn plaats te houden. De shuttle moet vrij kunnen draaien zonder omhoog of omlaag te bewegen nadat het inzetstuk is geplaatst.
   LET OP: De volgende stappen houden brandgevaar in (solderen). Afhankelijk van het gebruikte soldeer- en soldeervloeimiddel, kunnen ze blootstelling aan irriterende stoffen voor de luchtwegen en lood omvatten. Draag altijd oogbescherming tijdens het solderen (aangezien soldeer kan sputteren) en volg de juiste richtlijnen voor veilig omgaan met mogelijk schadelijke stoffen, inclusief een geschikte ventilatie van de werkruimte om soldeerdampen af te voeren. Volg de lokale voorschriften en operationele procedures of raadpleeg het beschikbare materiaal online^18,19.
2. Soldeer met een kleine hoeveelheid soldeerpasta het messing inzetstuk aan de schroef. Zorg ervoor dat het inzetstuk en de schroef niet oververhit raken om de 3D-geprinte shuttle niet te smelten. Afhankelijk van de hars die wordt gebruikt voor het 3D-printen van de shuttle, is een kleine hoeveelheid smelten (en vervolgens de shuttle die aan het inzetstuk blijft plakken) moeilijk te vermijden.
   NOTITIE: Bij gebruik van roestvrijstalen schroeven kan soldeerflux nodig zijn. Het wordt aanbevolen om messing of machinaal stalen schroeven te gebruiken, omdat deze gemakkelijker te solderen zijn.
3. Nadat de shuttle is afgekoeld, draait u de 3D-geprinte shuttle voorzichtig meerdere keren rond de schroef. Als de shuttle tijdens het solderen aan het inzetstuk is versmolten, zou deze moeten loskomen.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat de shuttle vrij kan draaien en niet wiebelt. Als dit het geval is, gooi dan de shuttle-eenheid weg en start een nieuwe. Probeer het messing inzetstuk voorzichtig te draaien. Als het draait ten opzichte van de schroef, herhaal dan het soldeerproces.

5. Montage van de aandrijving

1. Snijd in de handel verkrijgbare polyimidebuizen tot ongeveer 25 mm lang, maar in ieder geval lang genoeg om door de volledige aandrijfbehuizing te steken.
2. Steek de polyimidegeleidingsbuizen in de aandrijfbehuizing. Elke buis moet door één gat aan de bovenkant van de aandrijving worden gestoken en het overeenkomstige gat in het geleidingssjabloon aan de onderkant van de aandrijving ("d" in afbeelding 2E). De buizen moeten worden ingebracht totdat ze gelijk liggen met de bovenkant van de aandrijfbehuizing.
3. Breng met een dunne naald of tandenstoker een kleine hoeveelheid vloeibare cyanoacrylaatlijm aan op de gaten aan de bovenkant van de aandrijfbehuizing om de geleidebuizen op hun plaats te bevestigen. Breng de lijm aan vanaf de onderkant van het lichaam om te voorkomen dat er lijm in de geleidebuizen loopt. De lijm wordt door capillaire krachten in de ruimte tussen het aandrijflichaam en de geleidebuis getrokken en verbindt zo de twee.
4. Breng een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm aan op het raakvlak tussen de geleidingsbuizen en het geleidingssjabloon aan de onderkant van de aandrijfbehuizing. Nogmaals, zorg ervoor dat de geleidebuizen niet verstopt raken met lijm. Laat de lijm een paar minuten drogen.
   NOTITIE: De exacte hoeveelheid tijd die nodig is, is afhankelijk van het aandrijfmateriaal en de speling tussen het aandrijflichaam en de geleidebuizen. Over het algemeen zou 5-10 minuten voldoende moeten zijn.
5. Draai de aandrijfbehuizing ondersteboven en snijd de polyimidegeleidingsbuizen aan de onderkant zo af dat ze ongeveer 1 mm voorbij de middelste sleuven van de aandrijfbehuizing uitsteken ("c" in afbeelding 2E en aanvullende afbeelding 2). In deze configuratie zal het uiteinde van de geleidebuizen bij implantatie gelijk liggen met het hersenoppervlak.
   OPMERKING: De drive is ontwikkeld om zich te richten op diepere delen van de hersenen. Als oppervlakkige corticale gebieden worden aangevallen, kunnen kortere polyimidegeleidingsbuizen nodig zijn om het hersenoppervlak niet te beschadigen in geval van initiële zwelling van de hersenen.
6. Plaats twee shuttle-assemblages in de aandrijfbehuizing. Terwijl u ze in de getapte geleidingsgaten schroeft, moet u ervoor zorgen dat de schroeven evenwijdig zijn aan de pendelgeleiders ("b" in afbeelding 2E). Gebruik de vingers om de shuttles voorzichtig uit te lijnen met de shuttlegeleiders.
7. Schroef de shuttles volledig vast in de verzinkgaten om te controleren of de messing inzetstukken van de shuttle-eenheid niet vast komen te zitten in het aandrijflichaam of in botsing komen met de polyimidegeleidingsbuizen. Voor dit protocol is een minimale afstand van 16 volledige omwentelingen vereist. Als dit niet wordt bereikt, snijdt u de polyimidebuis bovenop de aandrijfbehuizing verder af om meer ruimte te creëren. Draai de shuttle in de aandrijfbehuizing niet te vast - dit kan de vastzittende schroefdraad op de aandrijfbehuizing en de soldeerverbinding van de shuttle-eenheid vernietigen.
   NOTITIE: Als een shuttle-eenheid vast komt te zitten, verwijder deze dan volledig en controleer of de soldeerverbinding is losgeraakt. Gebruik in dat geval een nieuwe shuttle-assemblage. Als de shuttle in botsing komt met een geleidebuis, kort dan de geleidebuis in zodat deze niet buiten het aandrijflichaam uitsteekt.
8. Schroef de EIB op de aandrijfbehuizing met M2.5x5 polyimideschroeven. Breng een paar druppels cyanoacrylaatlijm aan tussen de aandrijfbehuizing en EIB. Zorg ervoor dat de doorgaande gaten voor de elektrodeaansluiting niet verstopt raken.

6. Voorbereiding van de beschermkap

1. Steek een roestvrijstalen M2-moer in de extrusie op de linker dophelft en bevestig deze met cyanoacrylaatlijm.
2. Boor indien nodig het gat aan de voorkant van de linker dop uit met een M1-boor in een penbankschroef. Tik met een M1 tik op het gat aan de voorkant van de rechter dophelft.

7. Voorbereiding van de draadelektroden

1. Bereid twee metalen platen voor als oppervlak voor het maken van de elektrodedraadbundels. De platen dienen als een vlak, stabiel, maar verplaatsbaar oppervlak waarop de assemblage, het lijmen en het snijden van de draadbundel zal plaatsvinden. Bevestig plotpapier op de eerste plaat en knoop twee plakband op de tweede plaat, met het plakoppervlak naar boven.
2. Drie van de vier draden in de HPC-bundels worden in een hoek van 60 graden doorgesneden om een offset in dorsoventrale richting te creëren. Dit maakt het mogelijk om een draad respectievelijk boven, in en onder de piramidale laag van de hippocampus te plaatsen. Om het snijden te vergemakkelijken, tekent u een duidelijke lijn met een hoek van 60 graden op het plotpapier (lijn van 60 graden).
3. Knip voor elke HPC-elektrodenbundel 4 stukken elektrodedraad af met elk een lengte van 4,5 cm. Knip voor elke PFC- en RSC-elektrodebundel 4 stukken elektrodedraad af met elk een lengte van 3,5 cm.
4. Pak voorzichtig 4 draden op door ze met een vingertop aan te raken (ze blijven eraan plakken) en plaats ze zo dicht mogelijk naast elkaar op de schilderstape. Zorg ervoor dat u ze niet op elkaar legt.
5. Gebruik een pincet onder een microscoop om de draden zo dicht mogelijk bij elkaar te plaatsen. Breng een dunne laag vloeibare cyanoacrylaatlijm aan op de eerste 2 cm van de bovenkant van de bundel. Lijm voor de HPC-bundel 2 cm > en < 3,5 cm van de draad. Wacht tot de lijm droog is.
6. Raak de draden voorzichtig aan met een pincet onder een microscoop. Als ze niet scheiden, zijn ze correct gelijmd. Zorg er als gezondheidscontrole voor dat de lijmlaag glanst onder de verlichting van de microscoop.
7. Eenmaal volledig gedroogd, verwijdert u de draadbundel van de tape en brengt u deze over op de plaat met het plotpapier. Controleer onder een microscoop de draadbundel op overtollige lijm aan de bovenkant of aan de zijkanten en verwijder deze voorzichtig met een scalpelmesje.
8. Maak voor de RSC-bundels een rechte snede aan de onderkant van de array, loodrecht op de richting van de draden.
9. Voor de HPC-bundels plaatst u de array op het plotpapier zodat deze de lijn van 60 graden snijdt en gebruikt u de lijn als richtlijn om een snede te maken die onder een hoek van 60 graden ten opzichte van de richting van de draden staat.
   1. Gebruik vervolgens een scalpelmesje om de kortste van de 4 draden voorzichtig van de bundel te splitsen. Knip de draad loodrecht op de draadrichting af en verkort deze tot ongeveer 0,75 mm in vergelijking met de op een na langste draad in de bundel.
10. Splits voor de PFC-bundels de onderkant van de array in twee 2-draads bundels. Zorg ervoor dat de twee draden goed aan elkaar zijn gelijmd. Kort een van de 2-draads bundels 1 mm in door deze loodrecht op de draadrichting af te knippen. Zie aanvullende figuur 1 (onder) en aanvullende figuur 2b voor afbeeldingen van de doorgesneden draadbundels.

8. Voorbereiding van de aardingsdraad en EEG-draden

1. Duw ten minste 10 van de SIP/DIP-pennen uit een onderling verbonden SIP/DIP-stekkerdoos met een raster van 1.27 mm.
2. Knip 2 stukken van 6 cm lengte af voor de massadraad (GND). Knip 8 stukken van 6 cm lengte af voor de EEG-draad. Gebruik een scalpelmesje om voorzichtig een deel van de isolatie van beide uiteinden van alle draden te verwijderen.
3. Plaats een M1x3 roestvrijstalen schroef in een derde hand en laat zoveel mogelijk ruimte toegankelijk onder de schroefkop. Wikkel een niet-geïsoleerde kant van een GND- of EEG-draad om de schacht van de schroef, net onder de kop van de schroef.
4. Breng een kleine hoeveelheid soldeerflux aan met een kleine naald of tandenstoker. Soldeer de draad aan de schroef. Zorg ervoor dat u de gleuf van de schroefkop niet per ongeluk verstopt.
5. Plaats een SIP/DIP-pin in de derde hand zodat de vrouwelijke kant toegankelijk is. Steek het niet-geïsoleerde deel van de andere kant van de draad in de SIP/DIP-pen. Breng een kleine hoeveelheid soldeerflux aan en soldeer de draad aan de pen.
6. Verwijder de gesoldeerde schroefdraadconstructie uit de houder. Dit samenstel wordt tijdens de implantatieoperatie in de schedel geïmplanteerd.
7. Plaats een andere SIP/DIP-pin in de houder, 180 graden gedraaid (d.w.z. mannelijke zijde toegankelijk). Breng een kleine hoeveelheid soldeerflux aan en soldeer een niet-geïsoleerde kant van de andere draad aan de mannelijke kant van de pen.
8. Verwijder de gesoldeerde draadpenconstructie uit de houder. Deze assemblage zal later worden aangesloten op de EIB en de schroefdraadassemblage en de draadpenassemblage zullen tijdens de implantatieoperatie met behulp van hun twee pinnen met elkaar worden verbonden.
9. Om de gesoldeerde verbindingen te versterken, brengt u een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm aan op de verbinding tussen draden en pennen.
10. Nadat de lijm is opgedroogd, controleert u of de SIP/DIP-pennen van de twee assemblages soepel kunnen worden aangesloten. Gebruik de continuïteitscontroleoptie van een multimeter om te controleren of er een continue verbinding is tussen de schroef en het niet-geïsoleerde draaduiteinde van de draadpeneenheid wanneer beide assemblages zijn aangesloten. Optioneel kunt u elke set draden een kleurcode geven met nagellak (zie Materiaaltabel) om de juiste aansluiting tijdens implantaatchirurgie te vereenvoudigen.

9. Laden van de draadbundels in de aandrijving

1. Bevestig de schijf aan een houder. Zorg ervoor dat u in deze stap niet te veel druk uitoefent op de EIB of de connector met hoge dichtheid beschadigt.
2. Zodra de aandrijfbehuizing zich in een stabiele positie bevindt, neemt u een van de draadbundels en schuift u deze voorzichtig in de betreffende polyimidebuis, met de hand of met een fijne pincet. Zorg ervoor dat de draadarray in de juiste richting wordt geplaatst (bijv. voor de PFC-array moeten de twee langere draden van de array mediaal naar voren wijzen) en zorg ervoor dat u de draadarray niet buigt.
3. Herhaal de laatste stap voor alle andere draadbundels.
4. Gebruik een dunne tang om een van de draden vast te pakken en buig deze voorzichtig in de richting van het gat waarin men hem wil inbrengen. Eenmaal ingebracht, gebruikt u een gouden speld om deze in het EIB-gat te spelden. Herhaal dit voor alle draden van de bundel en voor alle bundels.
   1. Zorg ervoor dat de draden tijdens deze fase een mooie lus maken boven de EIB (op deze manier is er nog ruimte om de bundel op en neer door de polyimidebuis te bewegen om de lengte aan de onderkant van de buis aan te passen) en dat de array die uit de onderkant van de polyimidebuis steekt niet per ongeluk wordt gebogen. Zorg ervoor dat u noteert welke draad van elke draadbundel op elk kanaal op de EIB is aangesloten. Zie aanvullende figuur 1 voor een uitwerking van de kanaalmapping van de TD Drive.
      OPMERKING: Als alternatief kan men na het laden van elke draadbundel (stap 9.2) de draden rechtstreeks aansluiten op de EIB (stap 9.4) en vervolgens doorgaan met stap 9.2 + 9.4 voor de resterende draadbundels. Dit kan worden gevarieerd op basis van de persoonlijke voorkeuren van de onderzoekers. Zie aanvullende afbeelding 2b voor een voorbeeld van een geladen TD-aandrijving.
5. Pas de lengte van de draadbundels aan om de opnamelocaties correct te richten door de draadbundels voorzichtig in of uit de geleidingsbuis te duwen of te trekken (zie aanvullende afbeelding 2d).
   OPMERKING: Aangezien de geleidebuizen zo zijn gesneden dat ze gelijk liggen met het hersenoppervlak, komt de afstand waartoe een draadbundel zich buiten de geleidebuis uitstrekt overeen met de dorsoventrale locatie van het doelgebied. De beweegbare HPC-draadbundels moeten gelijk liggen met de onderkant van de geleidebuis, de vaste RSC-bundels moeten 1.5 mm uitsteken en de vaste PFC-bundels moeten 3.5 mm voorbij de geleidebuizen uitsteken. Let er bij het duwen of trekken van de draadassemblages op dat u geen afzonderlijke draden aan de bovenkant uit de EIB trekt of de onderkant van de draadbundel buigt.
6. Wanneer de vaste draadarrays (RSC en PFC) zijn uitgelijnd, brengt u een kleine hoeveelheid sterke epoxylijm aan op de bovenkant van de geleidingsbuizen en lijmt u de bundels op hun plaats. Terwijl de epoxy uithardt, moet u ervoor zorgen dat de draadbundels aan de onderkant nog steeds correct zijn uitgelijnd.
7. Om de beweegbare HPC-draadarrays te bevestigen, verplaatst u eerst de shuttle naar de hoogst vereiste positie (in de experimenten die in dit artikel worden beschreven, ten minste 16 volledige omwentelingen/4 mm boven de laagste positie). Duw vervolgens de draadbundels in de u-vormige opening van de shuttle en lijm ze op hun plaats met een kleine hoeveelheid van een sterke epoxylijm.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat de epoxy niet door de bundel in de polyimidebuis loopt. Wanneer de epoxy is uitgehard, breng je op dezelfde plek een tweede laag epoxy aan om de verbinding te versterken en het minder waarschijnlijk te maken dat de verbinding verbreekt wanneer de shuttle wordt verplaatst.
8. Steek het open uiteinde van de draadpenconstructie van een GND-draad voorzichtig door een van de doorlopende gaten gemarkeerd met GND. Bevestig het met een gouden pen.
   OPMERKING: Bij gebruik van een headstage waarin GND- en referentiekanalen (REF) zijn kortgesloten, kan ook een REF-kanaal worden gebruikt als dit handiger is.
9. Haal de schijf uit de houder; Zorg ervoor dat u geen van de draadassemblages buigt. Bevestig het voorste deel van de aandrijving weer in dezelfde houder en steek 4 EEG-draadpenassemblages in de doorgaande gaten voor de EEG-kanalen (gemarkeerd met 2,4, 29, 31) en bevestig ze elk met een gouden pen.
10. Gebruik voor alle GND- en EEG-draden een multimeter op de continuïteitsinstelling om de continue verbinding tussen de gouden pin op de EIB en de pin van de aangesloten draadpenassemblage te controleren.
11. Berg de schijf op. Dit kan bijvoorbeeld door de dop op de aandrijfbehuizing te bevestigen en ondersteboven op te bergen.
    NOTITIE: Steriliseer vóór de chirurgische implantatie de onderkant van de schijf met ethanol. Alle botschroeven en GND/EEG-draadassemblages moeten in ethanol worden gesteriliseerd. Chirurgische instrumenten moeten worden gesteriliseerd via een autoclaaf.

10. Aandrijving implantaat chirurgie

OPMERKING: In deze stap worden in het kort de chirurgische procedures voor het implanteren van de TD Drive beschreven. Een uitgebreider implantatieprotocol, inclusief een beschrijving van hulpmiddelen, evenals doses en concentraties van geneesmiddelen, is te vinden in Aanvullend Dossier 1.

1. Steriliseer de chirurgische instrumenten en reinig en ontsmet het operatiegebied volgens de lokale institutionele richtlijnen. Om de implantaten te steriliseren, plaatst u de delen van de elektrodedraden die in contact komen met de hersenen gedurende ten minste één minuut in ethanol.
   OPMERKING: Langdurige blootstelling aan ethanol of de dampen ervan kan de cyanoacrylaatlijm verzwakken. Als de dampen niet worden opgevangen, verleng dan de onderdompelingstijd van de draden in ethanol. Om de integriteit van de lijm te verifiëren, wordt aanbevolen om het optimale tijdstip te vinden met een testimplantaat dat niet in een echt experiment wordt gebruikt.
2. Zorg voor noodzakelijke preventieve analgesie, antibiotica en gasanesthesie (isofluraan) in overeenstemming met institutionele en lokale richtlijnen.
3. Plaats de rat in het stereotactische apparaat. Scheer de bovenkant van het hoofd en desinfecteer de huid met povidonjodium. Breng subcutaan lokale verdoving (lidocaïne) aan en maak een kleine incisie in de schedel bovenop de middellijn.
4. Leg de schedel bloot door de huid opzij te trekken. Verwijder het bindweefsel bovenop de schedel, droog het af en reinig het schedeloppervlak. Maak de spieren aan de zijkant van de schedel voorzichtig los om het plaatsen van verankeringsschroeven mogelijk te maken.
5. Meet de bregma- en lambdacoördinaten. Voor nauwkeurige targeting moet u ervoor zorgen dat het schedeloppervlak evenwijdig is aan het anteroposterieure-mediolaterale vlak van de stereotaxis door het verschil in de dorsoventrale positie van bregma en lambda te meten. Als de coördinaten verschillen, pas dan de positie van de rat in stereotaxis aan door het mondstuk omhoog of omlaag te brengen.
6. Markeer de craniotomieën rond de doellocaties (prelimbische cortex (AP +3,5 mm en ML + -1 mm), retrospleniale (AP+5,8 mm en ML +-1 mm en hippocampus (AP -3,8 mm en ML + - 2,5 mm)).
7. Boor gaten voor GND/EEG-schroeven en verankeringsschroeven. Plaats de schroeven en bedek ze met vloeibaar tandheelkundig acryl. Boor de craniotomieën en verwijder voorzichtig de dura mater. Voorkom dat craniotomieën uitdrogen door steriele zoutoplossing aan te brengen.
8. Plaats de TD Drive voorzichtig op de craniotomieën en zorg ervoor dat de geleidingsbuizen gelijk liggen met de schedel. Bescherm de geleidebuizen met vaseline en bevestig de TD Drive met tandheelkundig acrylaat aan de schedel.
9. Laat de draadarrays die gericht zijn op HPC langzaam zakken vanaf hun oorspronkelijke locatie (~1,5 mm DV vanaf het hersenoppervlak) in de richting van de piramidale laag van hippocampus CA1. De piramidale laag werd in de daaropvolgende dagen geleidelijk bereikt tijdens signaalcontroles in de herstelperiode van de ratten.
10. Plaats de beschermkap om de aandrijving.
11. Schakel de gasanesthesie uit en verwijder de rat uit het stereotactische frame. Plaats de rat in een schone kooi in een verwarmde kamer en geef nat voer en water voor herstel. Houd de rat in de gaten totdat hij weer actief is, in de kooi beweegt, eet en drinkt.
12. Breng de rat terug naar de woonkamer. Zorg voor postoperatieve analgesie en zorg volgens de institutionele richtlijnen. Zie bijvoorbeeld het voorbeeld van het operatieprotocol in Aanvullend Dossier 1.

11. Terugvordering van de EIB

1. Aan het einde van het experiment herstelt u de schijf en verwijdert u de beschermkap.
2. Verwijder de gouden pinnen en sluit de elektrodedraden voorzichtig aan. Schroef de EIB los van het aandrijflichaam. Door voorzichtig een zacht pincet tussen de EIB en de aandrijfbehuizing te duwen of de EIB voorzichtig met de hand op te tillen, maakt u de resterende cyanoacrylaatbinding los die de EIB aan de behuizing vasthoudt.
3. Reinig de EIB en gouden pinnen voor hergebruik op volgende TD Drive-implantaten. Voordat u een EIB opnieuw gebruikt, controleert u de gouden pinvia's en de connector met hoge dichtheid op slijtage. Gebruik de EIB alleen opnieuw als de via's intact genoeg zijn om een goede verbinding tussen gouden pinnen, elektrodedraden en EIB mogelijk te maken en als de verbinding van de high-density connector met de headstage nog voldoende stabiel is.

Resultaten

Met behulp van de instructies in het protocol kon de TD Drive eenvoudig worden gebouwd door meerdere experimentatoren. Na de ontwikkeling van de aandrijving (n = 4) werd een volledige pilot uitgevoerd met acht dieren. Een extra partij van acht dieren werd geïmplanteerd en er werd experimentele gegevensverzameling uitgevoerd. Omdat de gegevensanalyse van deze dieren nog niet is voltooid, zijn ze opgenomen in de overlevingsanalyse, maar niet in andere analyses (bijv. targeting of histologie). De implantaatoperatie werd 2 weken na aankomst uitgevoerd (zie figuur 3A voor de doellocaties die in de pilot werden gebruikt). Het implantaat werd uitgevoerd met de gebruikelijke chirurgische ingrepen en duurde ~3 uur. Een ervaren chirurg voerde de eerste implantaten uit en kon zowel ervaren als beginnende experimentatoren met 2-3 operaties onafhankelijkheid leren.

Afbeelding 3: Implantaatchirurgie, slaapgegevens en breedbandactiviteit. (A) Schematisch overzicht met de doellocaties voor craniotomieën (blauwe cirkels) en schedelschroeven (groen: EEG, blauw: GND, grijs: verankeringsschroeven, merk op dat er twee verankeringsschroeven aan de zijkant van de schedel zitten). (B) Foto van geïmplanteerde dieren met een vastgebonden hoofdpodium tijdens slaap en waakzaamheid. (C) Voorbeeldslaapgegevens van vastgebonden dierlijke PFC (prelimbisch) en HPC (Ca1), verdeeld in REM-slaap met theta en niet-REM-slaap met delta, spoelen en rimpelingen. Y-as: microvolt, x-as: seconden. Deze gegevens kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor het scoren van slaap of het detecteren en analyseren van oscillatiegebeurtenissen (D) Voorbeeld van draadloos geregistreerde breedbandactiviteit bij een wakker dier (luidruchtige kanalen aan de linkerkant waren niet verbonden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Duurzaamheid van het implantaat, deltadetecties en histologie. (A) Overlevingsplot voor het implantaat voor twee rondes van langlopende experimenten. Merk op dat op dag 85 n = 8 het experiment voltooiden en gepland waren om te worden geperfundeerd. (B) Voorbeeld van gegevens voor stabiliteit. Getoond is het aantal delta-detecties in het hippocampuskanaal gedurende opnamedagen (~3 dagen per week). Elk dier vertoonde een normale variatie, afhankelijk van de hoeveelheid slaap, maar er was geen algemene drift in de tijd in het signaal en dus de detecties. (C) Representatieve histologie met bilateraal doelwit voor één rat. Linkerkolom: linkerhelft, rechterkolom: rechterhelft. AP-coördinaten geven anteroposterieure coördinaten van het afgebeelde plak aan en pijlen wijzen naar laesies in gerichte gebieden. Vergroting: 1,6x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Alle dieren herstelden goed en verdroegen het implantaat (Figuur 3B). Frontale en retrospleniale elektroden waren gefixeerd, maar de hippocampusbundels waren beweegbaar. Hippocampusbundels werden geïmplanteerd op een dorsoventrale diepte van 2 mm en aangepast om de HPC-dekking te maximaliseren tijdens 2 weken van operatieherstel, waarbij het signaal live werd gecontroleerd tijdens slaapgewenningsperioden. Bij 7 van de 8 dieren werden alle doellocaties op ten minste één halfrond bereikt (Tabel 2 voor trefferpercentages, zie Figuur 4C voor representatieve histologie). Wek- en slaapopnames werden met succes uitgevoerd terwijl ze waren vastgemaakt in een opnamebox, evenals draadloze opnames in een groter doolhof (voorbeeldgegevens Figuur 3C,D). Dieren hielden de implantaten 2 maanden vast, toen individuele dieren ze begonnen te verliezen; de meerderheid van de dieren behield de implantaten echter tot de experimentele einddag 85-100 na implantatie (Figuur 4A). Gedurende deze tijd bleef de LFP stabiel, zoals te zien is in een voorbeeldanalyse waarbij delta-oscillaties werden gedetecteerd (Figuur 4B). Er was een normale variabiliteit in de tijd, maar er was geen systematische drift van het signaal in een van de geregistreerde hersengebieden (inclusief de piramidale laag van CA1). Het wordt aanbevolen om experimenten binnen 10-15 weken na de operatie te beëindigen. Alle EIB's zouden kunnen worden teruggevorderd.

We hebben dit implantaat voornamelijk toegepast om slaapstadia en slaaposcillaties te meten als reactie op leren en andere interventies. Bijvoorbeeld hoe orale inname van CBD het optreden van oscillaties en de samenhang tussen hersengebieden beïnvloedt (zie Samanta et ^al.20).

Parameter	Minimale waarde (mm)	Maximale waarde (mm)
medioLateraleSite1	0.75	2
medioLateraleSite2	1.5	5
medioLateraleSite3	0.75	2

Tabel 1: Overzicht van de handmatig opgelegde limieten voor de parameters die de mediolaterale coördinaten van de registratieplaatsen controleren.

Halfrond	PFC	RSC	CA1 pyr.
Rechts	8 van 8	5 van 8	6 van 8
Links	8 van 8	7 van 8	7 van 8

Tabel 2: Trefferpercentage voor piloot van 8 dieren. Bij 4 van de 8 dieren waren alle elektroden correct geplaatst. Bij 7 van de 8 dieren waren echter alle hersengebieden op ten minste één halfrond correct gericht (met uitzondering van 1 rat die de CA1-piramidale laag miste).

Aanvullende afbeelding 1: TD Drive-architectuur. (Boven) Overzicht van de channel mapping voor de TD Drive bij gebruik met een Intan RHD32 headstage. (Onder) Een extra illustratie van de draadbundelconfiguraties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 2: Extra foto's van de TD Drive in verschillende stadia van het bouwproces. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Een voorbeeldprotocol voor de implantatie van de TD Drive. De procedures en doellocaties worden aangepast aan de onderzoeksvragen en het institutionele beleid van de auteurs. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In dit artikel wordt een aanpasbaar implantaat gepresenteerd voor bilaterale, symmetrische meergebiedsdraadelektrode-opnames voor vrij bewegende ratten.

De mogelijkheid om het implantaat eenvoudig aan te passen door vooraf gedefinieerde parameters te wijzigen, was een van de drijfveren voor de creatie van de TD Drive. Hoewel ernaar wordt gestreefd de flexibiliteit voor veranderende parameters te maximaliseren, leggen inherente beperkingen in de relaties tussen hen noodzakelijkerwijs grenzen op aan dit aanpassingsvermogen. Er zijn standaard geen limieten ingesteld voor de anteroposterieure parameters, maar deze coördinaten worden bepaald door logische interacties tussen locaties en de totale grootte van de schijfbehuizing. De parameters die de mediolaterale coördinaten van alle registratieplaatsen bepalen, zijn onderworpen aan handmatig opgelegde limieten (zie tabel 1). Aan de basis van de vele parametrische opties liggen tal van interacties tussen de ontwerpkenmerken. Deze interacties kunnen onder bepaalde omstandigheden onsamenhangend worden. In een ideale situatie zijn alle mogelijke combinaties van parameterwaarden geldig. Bij het complexere ontwerp van de TD Drive is er echter voor gekozen om de mediolaterale coördinaten te beperken tot binnen het geteste bereik. Het kiezen van coördinaten buiten de geteste limieten is in principe mogelijk. Het aanbrengen van dergelijke wijzigingen wordt echter niet aanbevolen, omdat de integriteit van het ontwerp in het gedrang kan komen en het herstellen ervan met behoud van de buitensporige coördinaten mogelijk CAD-modelleringservaring vereist. Dit is een inherent resultaat van de afweging tussen het gemak van de productie van de aandrijving en flexibiliteit - grotere vrijheidsgraden maken de parametrische definitie van de aandrijving complexer en kunnen leiden tot te fijnmazige, ongewenste resultaten (bijvoorbeeld de noodzaak om verschillende EIB's te produceren voor kleine wijzigingen in het ontwerp van de aandrijving).

De parameterkeuzes die in deze manifestatie van de TD Drive worden gemaakt, worden geleid door de voorkeuren van de huidige experimentatoren. Er werd bijvoorbeeld gekozen om de sokkels van de TD Drive te verhogen, waardoor de implantatie tijdens de operatie gemakkelijker werd gemaakt ten koste van een iets hoger eindimplantaat. Het implantaat is echter nog steeds veel kleiner dan aandrijvingen met individueel beweegbare tetrodes en werd goed geaccepteerd door de dieren. De twee sokkels die worden gebruikt om de aandrijving te verankeren ("c" in figuur 2E) zijn opzettelijk in het middenvlak geplaatst, evenwijdig aan de middellijnhechting van de schedel van de rat. Dit beperkt de opnamelocaties tot mediolaterale coördinaten > 0,75 mm. Vaak legt de aanwezigheid van de sagittale sinus onder de middellijn anatomisch een vergelijkbare limiet op voor craniotomieën. Het huidige ontwerp van de TD Drive is gemaakt in Autodesk Fusion. Hoewel het een van de meest geavanceerde programma's is voor parametrisch 3D computerondersteund ontwerp en op het moment van publicatie een vrije licentie biedt voor academisch gebruik, vormt het commerciële en cloudgebaseerde karakter van het programma wel een risico voor de vrije beschikbaarheid van het ontwerp. Daarom kan het nodig zijn om het ontwerp over te zetten naar een echte open-source parametrische CAD-software²¹, zoals FreeCAD, voor een toekomstige iteratie.

De operatie voor de TD Drive kan in 2-3 uur worden uitgevoerd. De doellocaties van de draad worden stereotactisch gemarkeerd (PFC +3.5AP naast de middellijn, HPC -3.8AP -/+ 2.5 ML, RSC -5.8 naast de middellijn), en de schroefelektroden, GND en extra schedelschroeven voor stabiliteit worden ten opzichte van die locaties geplaatst. Hoewel het TD Drive-stencil stereotactische locaties biedt, kunnen onnauwkeurigheden in de plaatsing van de polyimidebuis en het gebruik van minder stijf slangmateriaal kleine variaties in de positie van de elektroden introduceren. Daarom wordt aanbevolen om kleine craniotomieën te boren (in plaats van braamgaten ter grootte van een geleidingsbuis van 0,5 mm) om rekening te houden met deze variabiliteit. Bij deze operatie wordt een enkele, grotere craniotomie voor de RSC- en HPC-doelen geboord. Voor PFC en RSC is gekozen om draadbundels op een vaste diepte te laten implanteren. De PFC-bundel had draden die op twee verschillende diepten waren gericht om op te nemen van zowel de prelimbische als de anterieure cingulate cortex. De HPC-bundels waren verplaatsbaar en waren gebouwd met 3 draden op verschillende hoogtes om het bereiken van de Ca1-piramidale laag en het stratum radiatum te vergemakkelijken. De laatste, kortere draad maakte opname van de PPC mogelijk. We bereikten de beste resultaten voor het richten op de hippocampus Ca1 wanneer de langste elektrodedraad tijdens de operatie naar de doeldiepte (2 mm ventraal vanaf het hersenoppervlak) werd verplaatst, met slechts kleine aanpassingen in de twee weken na de operatie tijdens live-signaalcontroles om rekening te houden met individuele variaties en zwelling van de hersenen na de operatie.

Een probleem bij grote implantaten, zoals tetrode hyperdrives, bij ratten is de kans dat de stabiliteit van het implantaat achteruitgaat en dieren het implantaat verliezen. Voor de TD Drive werden individuele defecten waargenomen als gevolg van verslechtering van de stabiliteit van het implantaat na 2 maanden (3 van de 16 dieren). Daarom wordt de TD Drive aanbevolen voor experimenten met een beoogde maximale duur van 8 weken. We laten zien dat het signaal voor deze periode stabiel is - zelfs de precieze opnames van de hippocampus piramidale laag - en dat er geen systematische drift of significante wiebeling is die de LFP-opnames beïnvloedt. Een factor bij het bereiken van deze stabiliteit op lange termijn is het gebruik van meerdere schedelschroeven (zie figuur 3A). In bepaalde situaties kan de hoeveelheid gebruikte schedelverankeringsschroeven het risico op infecties verhogen²². Dit is echter waarschijnlijk vooral relevant bij ratten met een hoofdfixatie, waar de herhaalde belasting van de hoofdfixatie op de kopplaat en de aangesloten verankeringsschroeven kan leiden tot degradatie van het implantaat die infecties in de hand werkt. Een andere factor die het risico op implantaatfalen verhoogt (en ongemak kan veroorzaken bij dieren die zich gedragen) is het gewicht van het implantaat. Een compleet TD-aandrijfimplantaat met verankeringsschroeven en tandheelkundig cement weegt ongeveer 7 g, waarbij de 3D-geprinte onderdelen en EIB ongeveer de helft van het gewicht voor hun rekening nemen. Vanwege het lage gewicht van de TD-schijf (minder dan 1/3 van andere grote tetrode-hyperdrives), is het onwaarschijnlijk dat een te hoog implantaatgewicht een significante factor is voor defecten aan de TD-schijf. Over het algemeen is de belangrijkste factor voor stabiele, infectievrije implantaten een steriele chirurgische ingreep en een goede hechting van het tandcement dat het implantaat op het implantaat bedekt, verankeringsschroeven en schedel²³. We hebben de TD Drive alleen geëvalueerd voor de registratie van lokale veldpotentialen en hebben niet geprobeerd om activiteit van één eenheid te verwerven. Hoewel we verwachten dat het implantaat over het algemeen stabiel genoeg is om dit te doen, kan het volgen van dezelfde eenheden binnen en tussen sessies een optimalisatie van de stabiliteit van de shuttle vereisen, bijvoorbeeld door de geleiderail van de shuttle te optimaliseren ("b" in figuur 2E). De toevoeging van beweegbare shuttles aan de andere opnamelocaties zou extra gebruik van beweegbare draadelektroden mogelijk maken, die de voorkeursmanier zijn om een betere signaalkwaliteit op lange termijn bij eenheidsopnames te garanderen.

Met een totale montagetijd van ongeveer 3 uur en een operatietijd van ongeveer 2-3 uur biedt de TD Drive een compromis tussen tetrode hyperdrives en eenvoudigere, minder verstelbare multidraadimplantaten²⁴. Met de gekozen doelen werden opnames van 10 hersengebieden met 6 bundels behaald. In vergelijking met andere implantaten voor niet-beweegbare draadbundels levert de symmetrische plaatsing van registratieplaatsen nog een ander voordeel op: als lateralisatie niet relevant is, verdubbelt het gelijktijdig implanteren van draden in beide hemisferen de kans om het juiste doel te raken en de dataopbrengst per dier. In de pilot hadden 4 van de 8 dieren alle 5 doellocaties (PFC inclusief prelimbische (PRL) en anterieure cingulate (ACC) cortex, RSC, PPC en Ca1 piramidale laag van HPC) correct bilateraal gericht, maar 7 van de 8 hadden ten minste elk hersengebied aan één kant geregistreerd. Deze drive is dus aan te raden voor diegenen die een snelle en eenvoudig te bouwen oplossing willen om LFP vast te leggen die kan worden toegepast door minder ervaren onderzoekers, vooral wanneer hogere dieraantallen nodig zijn, zoals in slaapstudies. Met veel high-end tetrode hyperdrives die het mogelijk zouden maken om individuele neuronale activiteit vast te leggen, kunnen zelfs zeer bekwame en ervaren onderzoekers slechts 2-6 implantaten per jaar bouwen en implanteren, waarvan er vele geen enkel interessant hersengebied met succes zullen bereiken. Het vergt vele jaren training om hogere slagingspercentages te bereiken, en zelfs dan blijft het aantal dieren dat efficiënt kan worden geregistreerd laag.

Samenvattend presenteert de TD Drive een eenvoudig en snel te bouwen draadaandrijving met 6 bundels die gemakkelijk kunnen worden aangepast om verschillende opnameplaatsen en andere implantaten zoals canules en vezels te bevatten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5 mm boortje	McMaster	2951A38
1.27 mm pitch interconnected SIP/DIP socket (Mill-Max)	Mouser Electronic	575-003101	Voor het monteren en verbinden van EEG & GND schroeven
5 minuten epoxy	Bison	Commercieel verkrijgbaar	gewone afhaalepoxi
cyanoacrylaatlijm	Loctite		Super Glue-3
EEG-draad	Science Products GmbH	7SS-2T
Elektrodendraad	Science Products GmbH	NC7620F
Ethanol	LC		Voor standaard pre-operatieve sterilisatieprocedure van de drive
Fijne pincetten (5)	FST	91150-20	Voor de voorbereiding en handhaving van draadbundels
Form 3B	Formlabs		3D-printer gebruikt om de zelfgedrukte onderdelen van de TD-drive te printen
Goudstiftjes (klein)	Neuralynx, Inc.	9885	Bevestiging van elektrodendraden op EIB-board
Aarddraad	Science Products GmbH	SS-3T/A
Hogedichtheidsconnector	LabMaker GmbH/Omnetics	A79026-001
Lister Hooded ratten	Charles River Laboratories	Crl:LIS	we gebruikten mannelijke ratten, 9-12 weken oud bij aankomst
M1 messing inzetstuk	AliExpress	Commercieel verkrijgbaar	https://aliexpress.com/item/33047616164.html
M1 tap	McMaster	2504A33
M1x16 schroef	Bossard	1096613
M1x3 roestvrijstalen schroeven	Screws and More	84213_14985
M2.5x5 polyimide schroeven	Screws and more	7985PA25S_50
Mineraal olie	McMaster	1244K14
Nailpolish	Etos	Commercieel verkrijgbaar	Voor het coderen van EEG en GND draden
schilderstape	Gamma	Commercieel verkrijgbaar	Voor de voorbereiding van draadbundels
Pin vise	McMaster	8455A16
plotting papier	Canson	Commercieel verkrijgbaar	Voor de voorbereiding van draadbundels
polyimide buizen	Amazon / Small Parts	TWPT-0159-30-50	AWG, 0.0159" ID, 0.0219" OD, 0.0030" Wand, 30" Lengte
RHD 32-kanaals headstage met versnellingsmeter	Intan Technologies, LLC	C3324	Voor vaste opnames in de slaapbox
RHD 3-ft (0.9 m) standaard SPI kabels	Intan Technologies, LLC	C3203	Van commutator naar headstage
RHD 6-ft (1.8 m) standaard SPI kabels	Intan Technologies, LLC	C3206	Van OpenEphys box naar commutator
Slip Ring met flens	Adafruit	1196	Commutator: 22 mm diameter, 12 draden
Solder flux	Griffon S-39 50 ml	Commercieel verkrijgbaar	Voor het solderen van EEG & GND schroeven
soldeerpasta	Amazon	B08CBZ5HC5
roestvrijstalen M2 moer	McMaster	93935A305
Bekabelde opname opstelling	OpenEphys	Acquasition Board
Draadloze opname logger	SpikeGadgets	miniLogger 32	Voor draadloze opnames in de taak
Draadloze opname opstelling	SpikeGadgets	Hoofdbesturingseenheid (MCU) incl. breakout board en RF-transceiver	Voor draadloze opnames in de taak