Snelle isolatie van stadium I eicellen in zebravissen zonder granulosacellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een aangepaste procedure voor het snel isoleren van schone fase I-eicellen in zebravissen zonder granulosacellen, waardoor een handige methode wordt geboden voor eicelspecifiek onderzoek.

Samenvatting

De studie van de ontwikkeling van eicellen heeft belangrijke implicaties voor de ontwikkelingsbiologie. De zebravis (Danio rerio) is op grote schaal gebruikt als modelorganisme om vroege ontwikkelingsprocessen van eicel tot embryo te onderzoeken. Bij zebravissen zijn de eicellen omgeven door een enkele laag somatische granulosacellen. Het scheiden van granulosacellen van eicellen vormt echter een uitdaging, aangezien het verkrijgen van zuivere eicellen cruciaal is voor nauwkeurige analyse. Hoewel er verschillende methoden zijn voorgesteld om oöcyten van zebravissen in verschillende ontwikkelingsstadia te isoleren, schieten de huidige technieken tekort in het volledig verwijderen van granulosacellen, waardoor de nauwkeurigheid van genoomanalyse die uitsluitend op eicellen is gericht, wordt beperkt. In deze studie hebben we met succes een snel en efficiënt proces ontwikkeld voor het isoleren van zuivere fase I-eicellen in zebravissen en het elimineren van granulosacelcontaminatie. Deze techniek vergemakkelijkt de biochemische en moleculaire analyse, met name bij het onderzoeken van epigenetische en genoomstructuuraspecten die specifiek zijn voor eicellen. De methode is met name gebruiksvriendelijk, minimaliseert eicelschade en biedt een praktische oplossing voor verder onderzoek en analyse.

Inleiding

De zebravis behoort tot de belangrijkste modelsystemen in de ontwikkelingsbiologie. In de afgelopen jaren hebben talloze studies de zebravis gebruikt als model om belangrijke biologische gebeurtenissen en regulerende processen van eicel tot embryo te bestuderen. Deze omvatten de ingewikkelde processen van de ontwikkeling en rijping van eicellen¹, de functionaliteit van maternale genen², de regulatie van maternale zygote overgangen³ en uitgebreide omics-analyses⁴.

Granulosacellen, de somatische cellen die de zich ontwikkelende eicel in de eierstokfollikel ^5,6 omhullen en voeden, spelen een cruciale rol in dit ontwikkelingsproces. Naarmate primordiale kiemcellen (PGC's) evolueren tot oögonen, worden ze omgeven door een monolaag van granulosacellen⁷. Samen met de uitwendige thecale cellen vormen de eicel en de omringende granulosacellen een rijpe follikel⁸. Gezien het fundamentele onderscheid tussen geslachtscellen en somatische cellen, is het verkrijgen van een zuiver eicelmonster absoluut noodzakelijk, vooral voor genoomgerelateerde analyses.

Binnen de folliculaire structuur van zebravissen vertonen granulosacellen doorgaans een diameter van slechts enkele microns⁸, wat de intieme onderlinge verbinding tussen granulosacellen en eicellen benadrukt⁹. Deze nauwe associatie vormt een uitdaging bij het bereiken van volledige scheiding vanwege het aanzienlijke verschil in zowel het aantal als het volume van granulosacellen versus eicellen (honderden granulosacellen vergeleken met een enkele eicel)^10,11. Zelfs een minimale contaminatie met een enkele granulosacel kan stroomafwaartse analyses belemmeren die specifiek gericht zijn op eicellen. Daarom is voor studies die zich richten op genomische en epigenetische kenmerken de eliminatie van granulosacellen essentieel.

Profiterend van goed gekarakteriseerde morfologische criteria, kunnen eicellen in elk stadium worden onderscheiden op basis van diameter¹¹. Het oögeneseproces in zebravissen is onderverdeeld in vijf fasen volgens morfologie en karyotype¹¹. Stadium I-eicellen (diameter 7-140 μm) omvatten eicellen vanaf het begin van de meiose tot het vroege stadium van meiose I. Cruciaal is dat deze eicellen transparant zijn, waardoor de centrale kern kan worden waargenomen door middel van doorvallend licht (Figuur 1Ai). Stadium II-eicellen (diameter 140-340 μm) worden geleidelijk schuimig en doorschijnend. Met de vergroting van de follikels en de proliferatie van corticale longblaasjes worden de kiemblaasjes in het midden moeilijk te onderscheiden¹² (Figuur 1Aii). Stadium III-eicellen (diameter 340-690 μm) accumuleren geleidelijk vitellogenine en verse follikels worden steeds ondoorzichtiger (Figuur 1Aiii). Meiose gaat verder in stadium IV oöcyten (690-730 μm diameter) terwijl chromosomen het midden van meiose II ingaan, waar ze stagneren (Figuur 1Aiv). Stadium V-eicellen (diameter 730-750 μm) zijn gerijpt en klaar voor ovulatie ^7,11 (figuur 1Av).

Op basis van de unieke kenmerken van elk van de bovengenoemde stadia is een methode voorgesteld om eicellen van stadia I tot III te isoleren door de eierstokken van zebravissen te verteren met behulp van een spijsverteringsoplossing die collagenase I, collagenase II en hyaluronidase bevat, gevolgd door filtratie door een celzeef van specifieke grootte¹³. Hoewel deze methode het mogelijk maakt om eicellen in verschillende ontwikkelingsstadia te verkrijgen, slaagt het er niet in om eicellen en granulosacellen volledig te scheiden. Andere onderzoekers hebben ook methoden voorgesteld om granulosacellen van eicellen te scheiden. Deze methoden zijn echter voornamelijk gebaseerd op mechanische benaderingen, die eicelschade kunnen veroorzaken, tijdrovend zijn en ontoereikend zijn om een aanzienlijk aantal eicellen voor analyse te verkrijgen^14,15.

Gezien de beperkingen van de bestaande methoden en specifieke onderzoeksvereisten, heeft deze studie tot doel een procedure vast te stellen om eicellen en granulosacellen grondig te scheiden en een voldoende aantal schone fase I-eicellen te verkrijgen voor analyse. Voortbouwend op de genoemde methode¹³, gebruiken we een verbeterde spijsverteringsbuffer (zie Materiaaltabel) die zachter is en de dispersie van eicellen en dissociatie van granulosacellen vergemakkelijkt. Vervolgens worden de eicellen door een celzeef geleid, gevolgd door wassen en verdere microscopische selectie, waardoor een groot aantal schone fase I-eicellen kan worden verkregen.

Protocol

Alle zebravissen werden behandeld volgens de strenge richtlijnen voor dierenverzorging die zijn opgesteld door de relevante nationale en/of lokale dierenwelzijnsinstanties. Het onderhoud en de behandeling van vissen kregen goedkeuring van zowel de lokale autoriteiten als de dierethische commissie van het West-Chinese ziekenhuis van de Universiteit van Sichuan (goedkeuring nr. 20220422003). Zebravis-eierstokken bevatten een mengsel van oöcyten in meerdere fasen, waarbij elke ontwikkelingsfase aanwezig is in de eierstokken van volwassen zebravissen. Voor deze studie werden echter juveniele zebravissen geselecteerd vanwege de dominantie van eicellen in een laat stadium (stadium II-III) in de eierstokken van volwassen vissen, die groot en ondoorzichtig zijn. Daarentegen hebben juvenielen platte en langwerpige eierstokken die voornamelijk bestaan uit stadium I eicellen (Figuur 1B) (Figuur 1B). Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de morfologische kenmerken van vroege oögenese bij volwassen en juveniele zebravissen zeer consistent zijn, wat de haalbaarheid van het gebruik van juveniele zebravissen^{ondersteunt13}. De hieronder beschreven procedures, beschreven in figuur 2, geven een gedetailleerde beschrijving van het isolatieproces, van dissectie tot het verkrijgen van schone fase I-eicellen. Voor verdere referentie worden de reagentia, buffers en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, vermeld in de Materiaaltabel.

1. Dissectie van de eierstok

1. Selecteer meerdere vrouwelijke zebravissen met een standaardlengte (SL) variërend van 10 mm tot 15 mm.
   OPMERKING: De SL, gemeten van de snuit tot de staartbasis in millimeters, dient als een betrouwbaar criterium voor het selecteren van geschikte vissen. Het wordt aanbevolen om jonge vissen tussen 5 en 7 weken na de bevruchting (wpf) te gebruiken met een SL variërend van 10 mm tot 15 mm voor deze procedure. De eierstokken van juveniele zebravissen worden voornamelijk bezet door vroege eicellen, wat optimale omstandigheden biedt voor het gemakkelijk verkrijgen van stadium I-eicellen (Figuur 1B).
2. Euthanaseer de jonge vrouwtjesvissen door ze in ijskoud water (0-4 °C) te plaatsen.
   OPMERKING: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd om euthanasie te garanderen en de pijn die zebravissen tijdens euthanasie ervaren tot een minimum te beperken: bevestig met behulp van een thermometer dat de temperatuur van het ijskoude water binnen het bereik van 0-4 °C ligt, breng de zebravissen snel over naar het ijskoude water en houd ze ten minste 10 minuten na het stoppen van de operculaire beweging in het ijskoude water^{16, 17,18}.
3. Droog overtollig water op het oppervlak van de vis af met absorberend papier.
4. Ontleed de zebravis onder een stereomicroscoop door deze stappen te volgen:
   1. Knip de kop af met een microschaar langs de achterrand van het kieuwdeksel; Snijd de staart langs de cloaca af. Breng de middelste stam over naar een schaal van 35 mm met 2 ml L-15 medium (met L-glutamine).
   2. Ontleed de middelste stam in het L-15 medium. Snijd langs de centrale as van de buik en verwijder de ingewanden en zwemblaas.
      OPMERKING: De ingewanden van zebravissen zijn met elkaar verbonden. Knijp daarom in de achterste darm in de buurt van het anale gebied en til deze op om gemakkelijk de hele viscerale massa te verwijderen.
   3. Maak de bilaterale eierstokken los van de buik met een pincet. Verwijder het vetweefsel, de schubben en andere lichaamsweefsels die aan de eierstok zijn bevestigd.
      OPMERKING: De eierstokken zijn bedekt met vetweefsel. Daarom is het het beste om ze samen te verwijderen om mechanische schade aan de eicellen te voorkomen.
      LET OP: Ga voorzichtig om met een pincet om letsel te voorkomen.

2. Spijsvertering

1. Breng de eierstokken over naar een plaat met 6 putjes met 2 ml Kinger's celdissociatieoplossing en incubeer gedurende 2-3 uur bij 28,5 °C. Schud de plaat met 6 putjes elke 30 minuten om de dispersie te bevorderen.
   OPMERKING: Gebruik een pincet om de eierstokken in kleine weefselblokken te scheiden om de spijsvertering te verbeteren. De verteringstijd is variabel; controleer regelmatig en beëindig het proces wanneer een aanzienlijk aantal stadium I-eicellen onder de stereomicroscoop wordt verspreid. De Kinger's celdissociatieoplossing is de werkende oplossing en kan direct worden gebruikt. Het kan na verpakking stabiel worden bewaard bij -20 °C en voor gebruik bij een lage temperatuur (4 °C) worden ontdooid.
2. Voeg L-15 medium voorverwarmd op 28,5 °C toe aan de spijsverteringsbuffer om de vertering te stoppen.

3. Filtratie

1. Plaats een celzeef van 100 μm in een ander putje van de plaat met 6 putjes, voeg L-15-medium toe en zorg ervoor dat het mediumniveau hoger is dan het filter.
   OPMERKING: De theoretische diameter van stadium I-eicellen is minder dan 140 μm. Eicellen met grotere diameters kunnen echter nog steeds door de celzeef gaan. Daarom werd bij deze stap een celzeef geselecteerd met een kleinere diameter dan het doelwit. De maaswijdte kan worden aangepast afhankelijk van de specifieke experimentele behoeften.
2. Zuig het spijsverteringsmedium met behulp van een pipet door de celzeef. Wacht 1-2 minuten tot alle stadium I-eicellen door de zeef zijn gegaan en verwijder deze dan. Zorg ervoor dat de eicellen tijdens het overdrachtsproces in de vloeistof blijven.
   OPMERKING: Door de eicellen in het medium te houden, blijft hun integriteit en optimale conditie behouden. Als de eicellen gedurende langere tijd aan lucht worden blootgesteld, kunnen ze uitdrogen en beschadigd raken, wat de uiteindelijke scheidingsefficiëntie beïnvloedt. Houd de pipet onder het vloeistofoppervlak wanneer u de eicellen door de celzeef overbrengt in plaats van ze op een hangende manier toe te voegen.

4. Wassen

1. Verwijder overtollig medium met een pipet. Voeg 4 ml vers L-15 medium toe en resuspendeer de eicellen voorzichtig. Wacht 1-2 minuten en verwijder dan het supernatant.
   OPMERKING: Gebruik instrumenten met lage hechtingseigenschappen om schade aan de eicellen te voorkomen.
2. Herhaal stap 4.1 5-6 keer totdat er geen andere onzuiverheden meer aanwezig zijn.
   OPMERKING: Voorzichtige behandeling tijdens het wasproces is cruciaal om eicelbeschadiging te voorkomen. Ondanks het verkrijgen van een overvloed aan stadium I-eicellen (ongeveer 200-400 stadium I-eicellen van één zebravis) na de vorige wasstappen, kunnen de eicellen nog steeds worden gemengd met celfragmenten, eicellen uit andere stadia of kleine korrels gevormd door gebroken eicellen in een laat stadium. Bovendien kunnen sommige granulosacellen zich nog steeds hechten aan het oppervlak van verschillende eicellen als gevolg van een onvolledige enzymvertering. Daarom zijn voor toepassingen die een hoger zuiverheidsniveau vereisen, zoals genoomsequencing, extra stappen nodig om volledig schone eicellen te selecteren. Ga verder met stap 5 en 6 om dit aan te pakken.

5. Selectie voor kwaliteitscontrole

1. Breng de gewassen fase I eicellen over in een schaal van 35 mm met vers L-15 medium.
2. Verwijder onder een microscoop met een vergroting gelijk aan of groter dan 10x celfragmenten, eicellen in een ander stadium en stadium I-eicellen die zijn gehecht aan granulosacellen met behulp van een hulpmiddel dat met precisie kan worden gemanipuleerd, zoals een stompe injectienaald.
   OPMERKING: Deze stap vereist geduld van de onderzoeker, maar zorgt voor de isolatie van schone en intacte eicellen.
   LET OP: Ga voorzichtig om met injectienaalden om letsel te voorkomen.

6. Bevestiging door nucleaire kleuring

OPMERKING: Voor verdere verfijning van de geïsoleerde eicellen werd kleuring met Hoechst 33342 toegepast om individuele eicellen die met granulosacellen waren gehecht te identificeren en te verwijderen die in de vorige stap mogelijk over het hoofd waren gezien.

1. Voeg een eindconcentratie van 5 μg/ml Hoechst 33342 toe aan het L-15 medium en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
2. Observeer de Hoechst-fluorescentie door een fluorescentiemicroscoop onder UV-laserexcitatie.
   OPMERKING: Hoechst wordt meestal geëxciteerd in het ultraviolette gebied, meestal op golflengten tussen 310 en 360 nm. Het wordt aanbevolen om tijdens dit proces een vergroting tussen 80x en 100x te gebruiken. Gebruik de automatische belichtingsmodus. De excitatiegolflengte en belichtingstijd kunnen worden aangepast op basis van het specifieke microscoopmodel en individuele vereisten.
3. Pluk met een naald voorzichtig de eicellen eruit die niet aan de gewenste criteria voldoen.
   OPMERKING: Bij het visualiseren van de cellen is een groot nucleair chromatine aanwezig in het midden van de eicel. Als granulosacellen aan de eicel zouden worden gehecht, zouden kleine en heldere kernen zichtbaar zijn, die zich vastklampen aan de rand van de eicel (figuur 3). Pluk ze uit onder de microscoop.
4. Was de eicellen grondig en herhaaldelijk met L-15 om overtollig Hoechst te verwijderen.
5. Gebruik de geïdentificeerde fase I-eicellen direct voor de daaropvolgende extractie of bewaar ze bij -80 °C na snelvriezen in vloeibare stikstof.
   LET OP: Draag een beschermend gezichtsmasker en cryogene handschoenen bij het hanteren van vriezers met vloeibare stikstof en ultralage temperaturen.

Resultaten

Figuur 1 illustreert de morfologie van de eierstokken die is waargenomen bij zowel volwassen als jonge zebravissen, waarbij eicellen in verschillende ontwikkelingsstadia worden getoond om als referentie te dienen. Figuur 1A geeft een grafische weergave van de morfologie en grootte van de eicel in elke ontwikkelingsfase, beginnend met het primaire groeistadium (stadium I) en eindigend met het eisprong (stadium V). Figuren 1Ai-v illustreren de diameters die overeenkomen met de stadia I tot en met V van de eicellen. Figuur 1B (linkerpaneel) toont afbeeldingen van de eierstokken bij jonge vissen (6 wpf met SL = 1,5 cm). Met name de juveniele eierstok vertoont een duidelijk lobulair uiterlijk, voornamelijk gekenmerkt door een overvloed aan transparante stadium I-eicellen, vergezeld van een kleinere populatie stadium II-eicellen. Deze prevalentie van stadium I-eicellen vergemakkelijkt hun observatie en ophalen aanzienlijk. Het rechterpaneel toont de morfologie van de eierstok van de volwassen vis (6 maanden), waar eicellen in verschillende ontwikkelingsstadia kunnen worden waargenomen. Ondoorzichtige eicellen in een laat stadium (stadium II-III) zijn echter overheersend in de eierstok.

Figuur 2 illustreert de representatieve processen van dissectie tot het verkrijgen van schone stadium I eicellen. Figuur 3 toont stadium I-eicellen die zijn verkregen met zowel de referentiemethode als de gewijzigde methode. Na de kleuring van Hoechst vertoonden de celkernen van de eicellen en granulosacellen blauwe fluorescentie onder UV-licht. In de beelden die met behulp van de referentiemethode werden verkregen (figuur 3A), was het oppervlak van de eicellen dicht omgeven door talrijke gekleurde granulosacelkernen. Daarentegen vertonen stadium I-eicellen die volgens de gewijzigde methode zijn gescheiden (figuur 3B) volledige blootstelling en reinheid, zonder dat er granulosacelkernkleuring aanwezig is.

Onze bevindingen toonden de effectiviteit aan van de voorgestelde methode voor het isoleren van fase I-eicellen. Het ontwikkelingsproces van eicellen in teleostvissen vertoont verschillende gemeenschappelijke kenmerken⁷. Om de toepasbaarheid ervan in verschillende soorten te beoordelen, werden verdere analyses uitgevoerd op andere vissoorten. Vrouwelijke modderkruipers werden op een lokale markt gekocht en eicellen in een vroeg stadium (diameter <100 μm) werden volgens dezelfde procedure geïsoleerd. De eierstoksamenstelling van de modderkruiper vertoonde ook een mengsel van eicellen in meerdere ontwikkelingsstadia, gekenmerkt door een opvallende gelijkenis in morfologie en grootte van de eicel met die van zebravissen in hetzelfde stadium. Zoals geïllustreerd in figuur 4A, werden de eierstokken van volwassen vrouwelijke modderkruipers gedomineerd door ondoorzichtige late eicellen afgewisseld met transparante vroege eicellen. Een duidelijke monolaag van granulosacellen werd waargenomen op het oppervlak van eicellen. In overeenstemming met onze waarnemingen bij zebravissen kwamen de eicellen van modderkruipers met een diameter van minder dan 100 μm overeen met het stadium voorafgaand aan het diploteenstadium. Figuur 4B toont de schone eicellen van modderkruiper (Misgurnus anguillicaudatus) die met de gewijzigde methode zijn verkregen. In vergelijking met de eierstokken van zebravissen zijn de eierstokken van modderkruiper moeilijker te dissociëren. Na 6-7 uur vertering dissociëren meer eicellen in een vroeg stadium. Toch leverde deze aangepaste aanpak de gewenste schone en naakte eicellen op. Zebravissen behoren tot de familie Cyprinidae, terwijl modderkruipers worden geclassificeerd binnen de familie Cobitidae. Deze twee families vertonen een verre taxonomische verwantschap, maar hun ovariële ontwikkelingsstadium en morfologie zijn opmerkelijk vergelijkbaar, wat aangeeft dat deze methode over het algemeen kan worden gebruikt voor het analyseren van eicellen van verschillende vissoorten.

Figuur 1: Representatieve beelden van de eierstokken en eicellen van zebravissen in verschillende stadia. (A) Morfologie en grootte van de eicellen in elk ontwikkelingsstadium (St). i-v vertegenwoordigt de beelden en de diameter van de eicellen van stadium I tot V. Schaalbalk = 200 μm. (B) Orfologie van de eierstokken van volwassen en jonge zebravissen. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve beelden van de isolatieprocedure, van dissectie tot het verkrijgen van schone fase I eicellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Stadium I-eicellen verkregen via de twee methoden. (A) Stadium (St) I-eicellen geïsoleerd volgens de methode waarnaar wordt verwezen. (B) Stadium I-eicellen geïsoleerd volgens de gewijzigde methode. De celkernen van de eicel en granulosa werden gekleurd met Hoechst en geëxciteerd met UV-licht. Schaalbalken = 100 μm. BF = helder veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Oöcyten in een vroeg stadium van modderkruiper verkregen volgens de gewijzigde methode. (A) Representatieve beelden van eierstokken en eicellen van modderkruiper. I, II vertegenwoordigen de eierstokken van modderkruipers onder verschillende vergrotingen, en III-IV vertegenwoordigen de eicellen in een vroeg stadium van modderkruipers. Schaal balken: i (500 μm); II (200 μm); III, IV (100 μm). (B) Oöcyten in een vroeg stadium, geïsoleerd uit modderkruiper. De eicellen en granulosacelkernen werden gekleurd met Hoechst en geëxciteerd met UV-licht. Schaalbalken = 100 μm. BF = helder veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In deze studie hebben we een methode ontwikkeld voor het isoleren van zuivere en schone fase I-eicellen, met uitzondering van granulosacellen, voor stroomafwaartse analyse (met name genomische analyses). Als we deze gewijzigde methode vergelijken met de methode waarnaar wordt verwezen¹³, zijn de met deze methode verkregen stadium I-eicellen morfologisch intact, voldoende in aantal en vrij van contaminatie met andere somatische cellen, waardoor ze geschikt zijn voor verschillende latere studies en analyses. Bovendien is de verbeterde methode in vergelijking met andere mechanische scheidingsmethoden^14,15 eenvoudiger te bedienen, vergemakkelijkt het de verwerving van een groter aantal eicellen en voorkomt het schade aan de eicel.

Bovendien kan deze methode niet alleen effectief stadium I zebraviseicellen isoleren, maar ook worden toegepast op modderkruipers in de vijver, wat aangeeft dat het breed toepasbaar is bij een verscheidenheid aan vissoorten. Om de impact van granulosacelcontaminatie op genexpressie en epigenetische analyse te onderzoeken, voerden we RNA-sequencing (RNA-seq) en CUT&Tag-analyse uit op eicellen verkregen met behulp van de referentie- en aangepaste methoden. Hoewel enkele differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd door RNA-seq, werden sommige genen die specifiek tot expressie werden gebracht in granulosacellen nog steeds geïdentificeerd (gegevens niet getoond). De analyse onthulde ook substantiële verschillen in histonmodificaties tussen eicellen die met verschillende methoden zijn geïsoleerd (gegevens niet getoond). Deze resultaten onderstrepen het belang van deze methode bij het volledig scheiden van eicellen en granulosacellen voor nauwkeurige genexpressie en epigenetische analyse.

Verschillende aspecten vereisen aandacht bij het implementeren van de voorgestelde methode: (1) Het selecteren van de juiste maat zebravis is cruciaal. Dit zorgt ervoor dat er voldoende eicellen worden verkregen en vermindert de daaropvolgende wasstappen. De eierstokken van zebravissen met een SL <10 mm leveren niet voldoende eicellen, waardoor een groter aantal vissen nodig is om aan de bemonsteringsvereisten te voldoen en de kweekdruk toeneemt. Omgekeerd vertonen zebravissen met een SL groter dan 15 mm de geleidelijke vorming van stadium II-III eicellen, waarvan de vliezen gemakkelijk worden gebroken tijdens de verteringsreactie. (2) Bij het gebruik van grotere vissen kan het weglekken van de celinhoud als gevolg van beschadigde eicellen tot besmetting leiden, waardoor de verteringsreactie tot op zekere hoogte wordt geremd. In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om de oude spijsverteringsbuffer te verwijderen, deze te wassen met L-15 en vervolgens een nieuwe Kinger's celdissociatie-oplossing toe te voegen voor verdere spijsvertering. (3) Als er geschikte apparatuur beschikbaar is, kan schudden tijdens de spijsvertering de scheiding bevorderen.

In stap 3.1 kunnen kleinere granulosacellen de eicellen vergezellen door de celzeef. Uit praktische waarnemingen blijkt echter dat het uiteindelijk verzamelde eicelmonster geen granulosacellen bevat. Behalve in gevallen waarin onvolledige vertering resulteerde in de aanwezigheid van resterende granulosacellen in sommige eicellen, werden er geen andere Hoechst-gelabelde granulosacellen in het systeem gedetecteerd. Hier veronderstelden we dat granulosacellen, die kleiner en lichter zijn, in het kweekmedium zouden kunnen blijven zweven en vervolgens tijdens de meerdere wasstappen werden verwijderd. De isolatie-efficiëntie werd ook gekwantificeerd door het aandeel eicellen met granulosacelaanhechting en schone eicellen na Hoechst-kleuring te berekenen. Zuivere eicelpercentages tot 98% werden waargenomen in monsters met 1000 eicellen.

Ondanks de vele voordelen had de voorgestelde aanpak ook enkele opmerkelijke beperkingen. Ten eerste werd deze methode gevalideerd voor DNA- of RNA-extractie, sequencing en onmiddellijke detectie van intacte levende cellen, maar de haalbaarheid en betrouwbaarheid van uitbreiding naar andere testgebieden moeten nog worden gevalideerd. Een andere beperking is dat de voorgestelde methode alleen kan worden toegepast voor het isoleren van stadium I-eicellen, omdat de isolatie-efficiëntie voor andere stadia onbevredigend is. Daarom zijn extra inspanningen nodig om de efficiëntie en toepasbaarheid van de voorgestelde methode te verbeteren. Bovendien moeten toekomstige studies zich richten op het onderzoeken of de voorgestelde methode kan worden toegepast om eicellen uit andere stadia efficiënt te isoleren, waardoor de toepasbaarheid ervan wordt verbreed.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Kinger's celldissociatieoplossing	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's celldissociatieoplossing kan stabiel worden bewaard bij -20 °C na verpakking en kan worden gebruikt na ontdooien bij lage temperatuur (4 °C). Het kan direct worden gebruikt voor het dissociëren van zebravis eierstokken. De optimale temperatuur is 28,5 °C, gedurende ongeveer 2-3 uur. De duur kan worden aangepast aan de specifieke dissociatiecondities, korter of langer (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell zeefjes (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescentiemicroscoop	Zeiss	Axio Zoom.V16
Pincet	Dumont	#5
Glazen capillaire naald	/	/	Gedempt door verbranding met aansteker
Hoechst	Yesen	40732ES03
Laag adsorptie pipetten tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium (met L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
IJskegel	/	/	IJskoud water wordt gebruikt om zebravissen te euthanaseren
Incubator	WIGGENS	WH-01
Jonge vissen	/	/	5–6 weken na bevruchting, standaardlengte [SL] van 10–15 mm
Kunststof schaal (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscoop	Motic	SMZ-161
Weefselkweekplaat (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas veerscharen	Fine Science Toosl	#15000-00