Dit protocol beschrijft een aangepaste procedure voor het snel isoleren van schone fase I-eicellen in zebravissen zonder granulosacellen, waardoor een handige methode wordt geboden voor eicelspecifiek onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle isolatie van stadium I eicellen in zebravissen zonder granulosacellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De studie van de ontwikkeling van eicellen heeft belangrijke implicaties voor de ontwikkelingsbiologie. De zebravis (Danio rerio) is op grote schaal gebruikt als modelorganisme om vroege ontwikkelingsprocessen van eicel tot embryo te onderzoeken. Bij zebravissen zijn de eicellen omgeven door een enkele laag somatische granulosacellen. Het scheiden van granulosacellen van eicellen vormt echter een uitdaging, aangezien het verkrijgen van zuivere eicellen cruciaal is voor nauwkeurige analyse. Hoewel er verschillende methoden zijn voorgesteld om oöcyten van zebravissen in verschillende ontwikkelingsstadia te isoleren, schieten de huidige technieken tekort in het volledig verwijderen van granulosacellen, waardoor de nauwkeurigheid van genoomanalyse die uitsluitend op eicellen is gericht, wordt beperkt. In deze studie hebben we met succes een snel en efficiënt proces ontwikkeld voor het isoleren van zuivere fase I-eicellen in zebravissen en het elimineren van granulosacelcontaminatie. Deze techniek vergemakkelijkt de biochemische en moleculaire analyse, met name bij het onderzoeken van epigenetische en genoomstructuuraspecten die specifiek zijn voor eicellen. De methode is met name gebruiksvriendelijk, minimaliseert eicelschade en biedt een praktische oplossing voor verder onderzoek en analyse.
Inleiding
De zebravis behoort tot de belangrijkste modelsystemen in de ontwikkelingsbiologie. In de afgelopen jaren hebben talloze studies de zebravis gebruikt als model om belangrijke biologische gebeurtenissen en regulerende processen van eicel tot embryo te bestuderen. Deze omvatten de ingewikkelde processen van de ontwikkeling en rijping van eicellen1, de functionaliteit van maternale genen2, de regulatie van maternale zygote overgangen3 en uitgebreide omics-analyses4.
Granulosacellen, de somatische cellen die de zich ontwikkelende eicel in de eierstokfollikel 5,6 omhullen en voeden, spelen een cruciale rol in dit ontwikkelingsproces. Naarmate primordiale kiemcellen (PGC's) evolueren tot oögonen, worden ze omgeven door een monolaag van granulosacellen7. Samen met de uitwendige thecale cellen vormen de eicel en de omringende granulosacellen een rijpe follikel8. Gezien het fundamentele onderscheid tussen geslachtscellen en somatische cellen, is het verkrijgen van een zuiver eicelmonster absoluut noodzakelijk, vooral voor genoomgerelateerde analyses.
Binnen de folliculaire structuur van zebravissen vertonen granulosacellen doorgaans een diameter van slechts enkele microns8, wat de intieme onderlinge verbinding tussen granulosacellen en eicellen benadrukt9. Deze nauwe associatie vormt een uitdaging bij het bereiken van volledige scheiding vanwege het aanzienlijke verschil in zowel het aantal als het volume van granulosacellen versus eicellen (honderden granulosacellen vergeleken met een enkele eicel)10,11. Zelfs een minimale contaminatie met een enkele granulosacel kan stroomafwaartse analyses belemmeren die specifiek gericht zijn op eicellen. Daarom is voor studies die zich richten op genomische en epigenetische kenmerken de eliminatie van granulosacellen essentieel.
Profiterend van goed gekarakteriseerde morfologische criteria, kunnen eicellen in elk stadium worden onderscheiden op basis van diameter11. Het oögeneseproces in zebravissen is onderverdeeld in vijf fasen volgens morfologie en karyotype11. Stadium I-eicellen (diameter 7-140 μm) omvatten eicellen vanaf het begin van de meiose tot het vroege stadium van meiose I. Cruciaal is dat deze eicellen transparant zijn, waardoor de centrale kern kan worden waargenomen door middel van doorvallend licht (Figuur 1Ai). Stadium II-eicellen (diameter 140-340 μm) worden geleidelijk schuimig en doorschijnend. Met de vergroting van de follikels en de proliferatie van corticale longblaasjes worden de kiemblaasjes in het midden moeilijk te onderscheiden12 (Figuur 1Aii). Stadium III-eicellen (diameter 340-690 μm) accumuleren geleidelijk vitellogenine en verse follikels worden steeds ondoorzichtiger (Figuur 1Aiii). Meiose gaat verder in stadium IV oöcyten (690-730 μm diameter) terwijl chromosomen het midden van meiose II ingaan, waar ze stagneren (Figuur 1Aiv). Stadium V-eicellen (diameter 730-750 μm) zijn gerijpt en klaar voor ovulatie 7,11 (figuur 1Av).
Op basis van de unieke kenmerken van elk van de bovengenoemde stadia is een methode voorgesteld om eicellen van stadia I tot III te isoleren door de eierstokken van zebravissen te verteren met behulp van een spijsverteringsoplossing die collagenase I, collagenase II en hyaluronidase bevat, gevolgd door filtratie door een celzeef van specifieke grootte13. Hoewel deze methode het mogelijk maakt om eicellen in verschillende ontwikkelingsstadia te verkrijgen, slaagt het er niet in om eicellen en granulosacellen volledig te scheiden. Andere onderzoekers hebben ook methoden voorgesteld om granulosacellen van eicellen te scheiden. Deze methoden zijn echter voornamelijk gebaseerd op mechanische benaderingen, die eicelschade kunnen veroorzaken, tijdrovend zijn en ontoereikend zijn om een aanzienlijk aantal eicellen voor analyse te verkrijgen14,15.
Gezien de beperkingen van de bestaande methoden en specifieke onderzoeksvereisten, heeft deze studie tot doel een procedure vast te stellen om eicellen en granulosacellen grondig te scheiden en een voldoende aantal schone fase I-eicellen te verkrijgen voor analyse. Voortbouwend op de genoemde methode13, gebruiken we een verbeterde spijsverteringsbuffer (zie Materiaaltabel) die zachter is en de dispersie van eicellen en dissociatie van granulosacellen vergemakkelijkt. Vervolgens worden de eicellen door een celzeef geleid, gevolgd door wassen en verdere microscopische selectie, waardoor een groot aantal schone fase I-eicellen kan worden verkregen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle zebravissen werden behandeld volgens de strenge richtlijnen voor dierenverzorging die zijn opgesteld door de relevante nationale en/of lokale dierenwelzijnsinstanties. Het onderhoud en de behandeling van vissen kregen goedkeuring van zowel de lokale autoriteiten als de dierethische commissie van het West-Chinese ziekenhuis van de Universiteit van Sichuan (goedkeuring nr. 20220422003). Zebravis-eierstokken bevatten een mengsel van oöcyten in meerdere fasen, waarbij elke ontwikkelingsfase aanwezig is in de eierstokken van volwassen zebravissen. Voor deze studie werden echter juveniele zebravissen geselecteerd vanwege de dominantie van eicellen in een laat stadium (stadium II-III) in de eierstokken van volwassen vissen, die groot en ondoorzichtig zijn. Daarentegen hebben juvenielen platte en langwerpige eierstokken die voornamelijk bestaan uit stadium I eicellen (Figuur 1B) (Figuur 1B). Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de morfologische kenmerken van vroege oögenese bij volwassen en juveniele zebravissen zeer consistent zijn, wat de haalbaarheid van het gebruik van juveniele zebravissenondersteunt13. De hieronder beschreven procedures, beschreven in figuur 2, geven een gedetailleerde beschrijving van het isolatieproces, van dissectie tot het verkrijgen van schone fase I-eicellen. Voor verdere referentie worden de reagentia, buffers en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, vermeld in de Materiaaltabel.
1. Dissectie van de eierstok
- Selecteer meerdere vrouwelijke zebravissen met een standaardlengte (SL) variërend van 10 mm tot 15 mm.
OPMERKING: De SL, gemeten van de snuit tot de staartbasis in millimeters, dient als een betrouwbaar criterium voor het selecteren van geschikte vissen. Het wordt aanbevolen om jonge vissen tussen 5 en 7 weken na de bevruchting (wpf) te gebruiken met een SL variërend van 10 mm tot 15 mm voor deze procedure. De eierstokken van juveniele zebravissen worden voornamelijk bezet door vroege eicellen, wat optimale omstandigheden biedt voor het gemakkelijk verkrijgen van stadium I-eicellen (Figuur 1B). - Euthanaseer de jonge vrouwtjesvissen door ze in ijskoud water (0-4 °C) te plaatsen.
OPMERKING: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd om euthanasie te garanderen en de pijn die zebravissen tijdens euthanasie ervaren tot een minimum te beperken: bevestig met behulp van een thermometer dat de temperatuur van het ijskoude water binnen het bereik van 0-4 °C ligt, breng de zebravissen snel over naar het ijskoude water en houd ze ten minste 10 minuten na het stoppen van de operculaire beweging in het ijskoude water16, 17,18. - Droog overtollig water op het oppervlak van de vis af met absorberend papier.
- Ontleed de zebravis onder een stereomicroscoop door deze stappen te volgen:
- Knip de kop af met een microschaar langs de achterrand van het kieuwdeksel; Snijd de staart langs de cloaca af. Breng de middelste stam over naar een schaal van 35 mm met 2 ml L-15 medium (met L-glutamine).
- Ontleed de middelste stam in het L-15 medium. Snijd langs de centrale as van de buik en verwijder de ingewanden en zwemblaas.
OPMERKING: De ingewanden van zebravissen zijn met elkaar verbonden. Knijp daarom in de achterste darm in de buurt van het anale gebied en til deze op om gemakkelijk de hele viscerale massa te verwijderen. - Maak de bilaterale eierstokken los van de buik met een pincet. Verwijder het vetweefsel, de schubben en andere lichaamsweefsels die aan de eierstok zijn bevestigd.
OPMERKING: De eierstokken zijn bedekt met vetweefsel. Daarom is het het beste om ze samen te verwijderen om mechanische schade aan de eicellen te voorkomen.
LET OP: Ga voorzichtig om met een pincet om letsel te voorkomen.
2. Spijsvertering
- Breng de eierstokken over naar een plaat met 6 putjes met 2 ml Kinger's celdissociatieoplossing en incubeer gedurende 2-3 uur bij 28,5 °C. Schud de plaat met 6 putjes elke 30 minuten om de dispersie te bevorderen.
OPMERKING: Gebruik een pincet om de eierstokken in kleine weefselblokken te scheiden om de spijsvertering te verbeteren. De verteringstijd is variabel; controleer regelmatig en beëindig het proces wanneer een aanzienlijk aantal stadium I-eicellen onder de stereomicroscoop wordt verspreid. De Kinger's celdissociatieoplossing is de werkende oplossing en kan direct worden gebruikt. Het kan na verpakking stabiel worden bewaard bij -20 °C en voor gebruik bij een lage temperatuur (4 °C) worden ontdooid. - Voeg L-15 medium voorverwarmd op 28,5 °C toe aan de spijsverteringsbuffer om de vertering te stoppen.
3. Filtratie
- Plaats een celzeef van 100 μm in een ander putje van de plaat met 6 putjes, voeg L-15-medium toe en zorg ervoor dat het mediumniveau hoger is dan het filter.
OPMERKING: De theoretische diameter van stadium I-eicellen is minder dan 140 μm. Eicellen met grotere diameters kunnen echter nog steeds door de celzeef gaan. Daarom werd bij deze stap een celzeef geselecteerd met een kleinere diameter dan het doelwit. De maaswijdte kan worden aangepast afhankelijk van de specifieke experimentele behoeften. - Zuig het spijsverteringsmedium met behulp van een pipet door de celzeef. Wacht 1-2 minuten tot alle stadium I-eicellen door de zeef zijn gegaan en verwijder deze dan. Zorg ervoor dat de eicellen tijdens het overdrachtsproces in de vloeistof blijven.
OPMERKING: Door de eicellen in het medium te houden, blijft hun integriteit en optimale conditie behouden. Als de eicellen gedurende langere tijd aan lucht worden blootgesteld, kunnen ze uitdrogen en beschadigd raken, wat de uiteindelijke scheidingsefficiëntie beïnvloedt. Houd de pipet onder het vloeistofoppervlak wanneer u de eicellen door de celzeef overbrengt in plaats van ze op een hangende manier toe te voegen.
4. Wassen
- Verwijder overtollig medium met een pipet. Voeg 4 ml vers L-15 medium toe en resuspendeer de eicellen voorzichtig. Wacht 1-2 minuten en verwijder dan het supernatant.
OPMERKING: Gebruik instrumenten met lage hechtingseigenschappen om schade aan de eicellen te voorkomen. - Herhaal stap 4.1 5-6 keer totdat er geen andere onzuiverheden meer aanwezig zijn.
OPMERKING: Voorzichtige behandeling tijdens het wasproces is cruciaal om eicelbeschadiging te voorkomen. Ondanks het verkrijgen van een overvloed aan stadium I-eicellen (ongeveer 200-400 stadium I-eicellen van één zebravis) na de vorige wasstappen, kunnen de eicellen nog steeds worden gemengd met celfragmenten, eicellen uit andere stadia of kleine korrels gevormd door gebroken eicellen in een laat stadium. Bovendien kunnen sommige granulosacellen zich nog steeds hechten aan het oppervlak van verschillende eicellen als gevolg van een onvolledige enzymvertering. Daarom zijn voor toepassingen die een hoger zuiverheidsniveau vereisen, zoals genoomsequencing, extra stappen nodig om volledig schone eicellen te selecteren. Ga verder met stap 5 en 6 om dit aan te pakken.
5. Selectie voor kwaliteitscontrole
- Breng de gewassen fase I eicellen over in een schaal van 35 mm met vers L-15 medium.
- Verwijder onder een microscoop met een vergroting gelijk aan of groter dan 10x celfragmenten, eicellen in een ander stadium en stadium I-eicellen die zijn gehecht aan granulosacellen met behulp van een hulpmiddel dat met precisie kan worden gemanipuleerd, zoals een stompe injectienaald.
OPMERKING: Deze stap vereist geduld van de onderzoeker, maar zorgt voor de isolatie van schone en intacte eicellen.
LET OP: Ga voorzichtig om met injectienaalden om letsel te voorkomen.
6. Bevestiging door nucleaire kleuring
OPMERKING: Voor verdere verfijning van de geïsoleerde eicellen werd kleuring met Hoechst 33342 toegepast om individuele eicellen die met granulosacellen waren gehecht te identificeren en te verwijderen die in de vorige stap mogelijk over het hoofd waren gezien.
- Voeg een eindconcentratie van 5 μg/ml Hoechst 33342 toe aan het L-15 medium en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Observeer de Hoechst-fluorescentie door een fluorescentiemicroscoop onder UV-laserexcitatie.
OPMERKING: Hoechst wordt meestal geëxciteerd in het ultraviolette gebied, meestal op golflengten tussen 310 en 360 nm. Het wordt aanbevolen om tijdens dit proces een vergroting tussen 80x en 100x te gebruiken. Gebruik de automatische belichtingsmodus. De excitatiegolflengte en belichtingstijd kunnen worden aangepast op basis van het specifieke microscoopmodel en individuele vereisten. - Pluk met een naald voorzichtig de eicellen eruit die niet aan de gewenste criteria voldoen.
OPMERKING: Bij het visualiseren van de cellen is een groot nucleair chromatine aanwezig in het midden van de eicel. Als granulosacellen aan de eicel zouden worden gehecht, zouden kleine en heldere kernen zichtbaar zijn, die zich vastklampen aan de rand van de eicel (figuur 3). Pluk ze uit onder de microscoop. - Was de eicellen grondig en herhaaldelijk met L-15 om overtollig Hoechst te verwijderen.
- Gebruik de geïdentificeerde fase I-eicellen direct voor de daaropvolgende extractie of bewaar ze bij -80 °C na snelvriezen in vloeibare stikstof.
LET OP: Draag een beschermend gezichtsmasker en cryogene handschoenen bij het hanteren van vriezers met vloeibare stikstof en ultralage temperaturen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 illustreert de morfologie van de eierstokken die is waargenomen bij zowel volwassen als jonge zebravissen, waarbij eicellen in verschillende ontwikkelingsstadia worden getoond om als referentie te dienen. Figuur 1A geeft een grafische weergave van de morfologie en grootte van de eicel in elke ontwikkelingsfase, beginnend met het primaire groeistadium (stadium I) en eindigend met het eisprong (stadium V). Figuren...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie hebben we een methode ontwikkeld voor het isoleren van zuivere en schone fase I-eicellen, met uitzondering van granulosacellen, voor stroomafwaartse analyse (met name genomische analyses). Als we deze gewijzigde methode vergelijken met de methode waarnaar wordt verwezen13, zijn de met deze methode verkregen stadium I-eicellen morfologisch intact, voldoende in aantal en vrij van contaminatie met andere somatische cellen, waardoor ze geschikt zijn voo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32170813 en 31871449) en de afdeling Wetenschap en Technologie van Sichuan (2024NSFSC0651), en het 1·3·5-project voor excellente disciplines - Clinical Research Fund, West China Hospital, Sichuan University (2024HXFH035). De auteurs willen Zhao Wang en Yanqiu Gao van het Laboratorium voor Kinderchirurgie bedanken voor het fokken van zebravissen die verband houden met dit werk. De auteurs willen ook alle recensenten bedanken die hebben deelgenomen aan de review, evenals MJEditor (www.mjeditor.com) voor het leveren van Engelse redactiediensten tijdens de voorbereiding van dit manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Kinger's celldissociatieoplossing | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's celldissociatieoplossing kan stabiel worden bewaard bij -20 °C na verpakking en kan worden gebruikt na ontdooien bij lage temperatuur (4 °C). Het kan direct worden gebruikt voor het dissociëren van zebravis eierstokken. De optimale temperatuur is 28,5 °C, gedurende ongeveer 2-3 uur. De duur kan worden aangepast aan de specifieke dissociatiecondities, korter of langer (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell zeefjes (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescentiemicroscoop | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Pincet | Dumont | #5 | |
| Glazen capillaire naald | / | / | Gedempt door verbranding met aansteker |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Laag adsorptie pipetten tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium (met L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| IJskegel | / | / | IJskoud water wordt gebruikt om zebravissen te euthanaseren |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Jonge vissen | / | / | 5–6 weken na bevruchting, standaardlengte [SL] van 10–15 mm |
| Kunststof schaal (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscoop | Motic | SMZ-161 | |
| Weefselkweekplaat (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas veerscharen | Fine Science Toosl | #15000-00 |
Referenties
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304(2021).
- Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385(2020).
- Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).
- Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014(2022).
- Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
- Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).
- Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
- Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
- Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
- Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
- Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
- Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
- Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
