Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66461

⸱

9 februari 2024

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

In dit artikel

Samenvatting

De op DNAzyme gebaseerde nanomachines kunnen worden gebruikt voor zeer selectieve en gevoelige detectie van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het ontwerp van op DNA gebaseerde nanomachines met een 10-23-kern met behulp van gratis software en hun toepassing bij de detectie van een Epstein-Barr-virusfragment als voorbeeld.

Samenvatting

Op DNAzyme gebaseerde nanomachines (DNM) voor de detectie van DNA- en RNA-sequenties (analyten) zijn multifunctionele structuren gemaakt van oligonucleotiden. Hun functies omvatten strakke analytbinding, zeer selectieve analytherkenning, fluorescerende signaalversterking door meerdere katalytische splitsingen van een fluorogeen reportersubstraat en fluorogene substraataantrekkingskracht voor een toename van de sensorrespons. Functionele eenheden zijn bevestigd aan een gemeenschappelijke DNA-steiger voor hun coöperatieve actie. De RNA-splitsende 10-23 DNM's hebben een verbeterde gevoeligheid in vergelijking met niet-katalytische hybridisatiesondes. De stabiliteit van de DNM en de verhoogde kans op substraatherkenning worden geleverd door een dubbelstrengs DNA-fragment, een tegel. DNM kan twee analyten onderscheiden met een enkel nucleotideverschil in een gevouwen RNA en een dubbelstrengs DNA en analyten detecteren bij concentraties ~1000 keer lager dan andere eiwitvrije hybridisatiesondes. Dit artikel presenteert het concept achter het diagnostische potentieel van DNA-nanomachine-activiteit en geeft een overzicht van het DNM-ontwerp, de assemblage en de toepassing in nucleïnezuurdetectietests.

Inleiding

Een van de vroegste methoden voor nucleïnezuurdetectie is complementaire binding van selectieve oligonucleotiden aan de geanalyseerde RNA- of DNA-sequenties. Deze methode maakt gebruik van nucleïnezuurfragmenten (sondes) die Watson-Crick-basenparen kunnen vormen met een gerichte DNA- of RNA-analyt1. Het complex wordt vervolgens onderscheiden van de analyt en de ongebonden sonde door middel van een verscheidenheid aan technieken. Bepaalde methoden, zoals Northern blotting, in situ hybridisatie of qPCR, zijn gebaseerd op het fenomeen van complementaire binding2. De meest voorkomende hybridisatiesondes hebben twee belangrijke nadelen: lage gevoeligheid (ze kunnen micromolaire tot nanomolaire niveaus bereiken) en lage selectiviteit voor single nucleotide variaties (SNV), waaronder puntmutaties. Het probleem vereist een uitgekiende aanpak, aangezien de oplossingen voor deze nadelen met elkaar in strijd zijn3. Om de beste selectiviteit te bieden, moet het detecterende oligonucleotide kort genoeg worden gehouden om onstabiele hybriden te vormen met niet-overeenkomende analyten. Dergelijke korte oligonucleotiden zijn niet in staat om gerichte nucleïnezuren stevig te binden en hun secundaire structuren af te wikkelen, waardoor ze vaak geen detecteerbaar signaal afgeven. Het is vooral een uitdaging om CG-rijke fragmenten in biologisch RNA of dubbelstrengs DNA (dsDNA) te detecteren. Aan de andere kant zijn lange sondes ongevoelig voor SNV3. Om de impasse te doorbreken is het concept van een binaire sonde ontwikkeld4.

Binaire sensoren splitsen een enkele detectiesonde in twee stukken en specialiseren de fragmenten, waardoor een ervan lang blijft om de haarspeldbochten af te wikkelen of het dsDNA binnen te dringen. Het tweede binaire sondefragment blijft kort om gevoelig te zijn voor een niet-overeenkomende base, waardoor het een middel biedt om SNV te detecteren. Het signaal wordt geproduceerd als de twee binaire sensordelen met elkaar worden verbonden4. Het volledige complex kan worden gevisualiseerd via FRET5, moleculaire bakensonde 6,7 of G-quadruplexen met peroxidase-achtige activiteit 8,9,10, of anders RNA-splitsing 11,12,13 DNAzyme. Binaire sensoren met een 10-23 DNAzyme kern zijn ruimschoots beschreven. Ze zijn aangepast om enkelstrengs nucleïnezuurfragmenten te detecteren die synthetisch zijn gemaakt11, of enkelstrengs amplificatieproducten14,15. Detectie zonder amplificatie is ook mogelijk, bijvoorbeeld in het geval van 16S rRNA geëxtraheerd uit een celcultuur, aangezien dit molecuul overvloedig aanwezig is in cellen12,16. Binaire sensoren met een 10-23 DNAzyme-kern kunnen ook worden aangepast voor de detectie van niet-nucleïnezuur, zoals voor loodionen17. Desalniettemin wordt een lage gevoeligheid nog steeds beschouwd als een van de grootste nadelen van binaire 10-23 DNAzyme-sensoren, en er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld, waaronder cascades18 of alternatieve signaalversterkende methoden19, om dit probleem aan te pakken. Helaas verhogen de bovenstaande technieken de kosten en instabiliteit van de sensorcomponenten drastisch, en daarom zijn ze niet in de praktijk gekomen.

Het experiment dat in dit werk wordt beschreven, maakt gebruik van 10-23 DNAzyme-gebaseerde DNA-nanosensoren die DNA-nanomachines (DNM) worden genoemd20,21. Deze structuren omvatten binaire sensoren en ook (1) DNA-facilitators die de binaire sonde flankeren, de gestructureerde gebieden afwikkelen en binnendringen in dubbelstrengs DNA's, en (2) een DNA-tegel die alle DNM-delen dicht bij elkaar houdt en de kans op signaalvorming vergroot (Figuur 1). Al met al verlagen de 10-23 DNAzyme-gebaseerde DNM's de detectielimiet (LOD) tot het picomolaire bereik21; ze kunnen worden gebruikt om 16rRNA in cellysaten22 te detecteren of de aanwezigheid van viraal RNA te melden zonder amplificatie 23,24. Tegelijkertijd blijven de DNM's gevoelig voor de SNV en kunnen ze zelfs worden gebruikt om allelen in heterozygote organismen te genotyperen25. De DNM-methode kan worden gebruikt als een aanvullende techniek voor elk type amplificatie voor productvisualisatie of identificatie van het product in een complex mengsel met een hoge selectiviteit. De DNM's vereisen, in tegenstelling tot conventionele TaqMan- en beacon-sondes, geen verwarming van het monster en kunnen dus worden gebruikt in eindpuntdetectieprotocollen, waardoor de algehele detectie kosteneffectief is.

Dit artikel beschrijft de in silico ontwikkeling van een DNM en demonstreert procedures voor assemblage en functionele karakterisering van DNM. Het werk werd uitgevoerd met behulp van een synthetisch fragment van het Epstein-Barr-virus (EBV) dat overeenkomt met de posities 13972-14154 van het virale DNA (OR652423.1) (zie Tabel met materialen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. DNM-ontwerp

  1. Selecteer een uniek gebied binnen het genoom van interesse.
    OPMERKING: Dit werk maakt gebruik van een gebied van het genoom van het Epstein-Barr-virus (EBV) in posities 13972-14154 (OR652423.1).
  2. Maak een primerset voor de versterking van het geselecteerde fragment, bijvoorbeeld via de Primer3-tool die is ingebed in Ugene26.
  3. Open de UNAFold-webtool27 (zie Materiaaltabel) en voer het geselecteerde gebied in. Verander de vouwtemperatuur naar 55 °C en de ionische omstandigheden naar 250 mM monovalente ionen en 200 mM Mg2+.
    1. Open de resulterende secundaire structuur van het ssDNA-fragment en selecteer een stabiele haarspeld. Lokaliseer de bindingsplaats van de DNA-nanomachines in de ongestructureerde regio's of, als alternatief, op de lussen van de haarspeldstructuren om een sterkere binding van het doelwit te bereiken.
  4. Als de beoogde analytplaats in een stam-lusstructuur is gevouwen, plaatst u arm 1 en 2 als volgt: Zorg ervoor dat arm 2 één kant van de stengel, de lus en 3-5 nt van de tweede stengelzijde bindt; Arm 1 bindt een fragment van de tweede steelzijde.
  5. Open de DinaMelt-tool28 (zie Tabel met materialen) en analyseer de sequenties van de armen en hun omgekeerde complementsequenties. Gebruik de DinaMelt-tool om ervoor te zorgen dat de Tm van armen 2 en 3 boven 65 °C is: minimaal 10 °C boven de analysetemperatuur (55 °C).
    1. Houd de Tm van arm 1 ten minste 1-3 °C boven de reactietemperatuur (55 °C) als een hoge herkenningsselectiviteit moet worden bereikt29.
  6. Combineer de sequenties van armen 1 en 2 met de helften van de DNAzyme-kern en de F-sub-bindingsfragmenten13.
  7. Analyseer de secundaire structuur van de ontworpen DNA-strengen met behulp van UNAFold27.
    OPMERKING: 55 °C (analysetemperatuur), 200 mM Mg2+, 250 mM monovalente ionen (HEPES, Na+, K+).
    1. Gebruik het ontwerp alleen als de opvouwbare ΔG lager is dan - 4 kcal/mol. Probeer lange CG-rijke sequenties te vermijden. Als de secundaire structuur te stabiel is, introduceer dan een mutatie in de arm om de vouwing ΔG30 te verhogen. Als alternatief is het plaatsen van arm 3 2-3 nt weg van arm 2 een andere strategie om de sequentie van arm 3 te veranderen om stabiele intermoleculaire structuren te vermijden.
  8. Maak een willekeurige sequentie voor het DNA-tegelfragment zo lang als arm 3. Combineer de sequentie van arm 3 met de DNA-tegelsequentie via (dT)4-6 of ethyleenglycol (bijv. triethyleenglycol (TEG) of hexaethyleenglycol (HEG)). De DNM-versie die in het experiment wordt gepresenteerd, maakt gebruik van (dT)6.
  9. Koppel arm 2 via een linker aan de sequentie die complementair is aan het in stap 1.8 geselecteerde DNA-tegelfragment.
  10. Analyseer de secundaire structuur van de ontworpen DNA-strengen met behulp van de UNAFold-webapp. Zorg ervoor dat de vouwenergie van elke DNA-streng hoger is dan 4 kJ/mol bij 55 °C en vermijd lange CG-verrijkte sequenties. Verander bij voorkeur de volgorde van de DNA-tegels.
  11. Teken de structuur met behulp van alle beschikbare software voor vectorafbeeldingen. In dit artikel worden Biorender en Pixelmator Pro gebruikt voor visualisatie (zie Tabel met materialen). Controleer de nauwkeurigheid in de richtingen van 5'->3' voor elke streng.
    OPMERKING: Verkrijg de sequenties van een betrouwbare commerciële verkoper.

2. Functionele test van de DNM

  1. Bereiding van buffer en reagentia
    1. Bereid de reactiebuffer voor die bestaat uit 50 mM HEPES (pH 7,5-7,8), 50 mM NaCl, 150 mM KCl en 200 mM MgCl2. Vul met het gedeïoniseerde water tot 50 ml.
    2. Bereid 10 μM aliquots van Dzb-Tile en Tile-Arm3 oligonucleotiden voor. Bereid 1 μM-oplossing van de Dza, een 100 μM F-sub, en 1 nM, 10 nM, 100 nM-analyten in RNase/vrij water of steriel gedeïoniseerd water. De details van de oligonucleotidesequenties zijn opgenomen in de Tabel met materialen.
  2. DNM-assemblage
    1. Ontdooi de oligonucleotideoplossingen volledig voor gebruik. Voorzichtig mengen door te tikken (niet intensief vortexen). Draai de oplossing (snel, gedurende enkele seconden) naar beneden met behulp van een microcentrifuge.
    2. Meng 1 μM van Dzb-Tile en Tile-Arm3 in 200 μL van de reactiebuffer in microcentrifugebuisjes van 0,5 ml.
    3. Meng de tube voorzichtig en draai de oplossing naar beneden.
    4. Wikkel het deksel van de gesloten buis in met paraffinefolie. U kunt ook buizen met schroefdop gebruiken.
    5. Broed de buis 2 minuten in een bekerglas van 500 ml met kokend water, zet dan de verwarming uit en laat de temperatuur een nacht passief afkoelen.
    6. Bereid de 12% native PAGINA voor: Meng 1 ml 10х TBE-buffer, 3 ml 40% AA:BA, gedeïoniseerd water tot 10 ml, 50 μl APS en 5 μl TEMED (zie materiaaltabel). Verplaats het mengsel naar de gelcassette en laat het polymeriseren.
    7. Meng 1 μL van elk monster, namelijk de geassembleerde DNM, Dzb-Tile en Tile-arm3, met 1 μL 4x laadkleurstof en laad ze in de gel.
    8. Plaats de cassette in de kamer, vul deze met 1x TBE-buffer en laat de gel 90 minuten draaien op 80 V.
    9. Verf de gel met ethidiumbromide en visualiseer het met behulp van een gel-documenterend systeem (zie Materiaaltabel).
  3. LOD-test
    1. Bereid 160 μL 200 nM F-sub in de reactiebuffer. Dit wordt gedaan om de basisachtergrond van de stabiliteit van het substraat te beoordelen.
    2. Bereid 7 aliquots van 160 μL voorgemonteerde DNM, F-sub en Dza voor in concentraties van 20 nM DNM en Dza en 200 nM F-sub in de reactiebuffer. Van de zeven buisjes, houd buis #1 als lege achtergrond om de spontane assemblage van de DNAzyme-kern te beoordelen.
    3. Voeg de analyt toe aan buisjes #2-7 in de eindconcentraties van 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM en 1000 pM.
    4. Meng voorzichtig, draai de buisjes door en verdeel de oplossingen in drie porties van 50 μL op een zwarte plaat met 96 putjes. Sluit de plaat af met een optisch transparante film.
    5. Incubeer de plaat in een waterbad bij 55 °C gedurende 1 uur. Draai de plaat naar beneden.
    6. Meet de fluorescentie bij 525 nm (λex = 495 nm). Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elk punt.
    7. Bereken de verhouding tussen blanco en basislijn door het signaal van de buis die F-sub en DNM bevat te delen door het signaal van de buis die alleen F-sub bevat. Zorg ervoor dat de verhouding binnen het bereik van 1.1-1.5 ligt.
    8. Bereken de signaal-tot-blanco-verhouding door het signaal van de buis die F-sub, DNM en de analyt bevat, te delen door het signaal van de buis die alleen F-sub en DNM bevat. Beschouw het signaal als echt positief als het hoger is dan het achtergrondgemiddelde plus drie standaarddeviaties.
    9. Herhaal het experiment twee keer en zorg ervoor dat de standaarddeviatie tussen de analytische herhalingen minder dan 0,5 is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het doel van het eerste experiment was om de assemblage van de DNM vóór het synthetische fragment van de analyt aan te tonen. Alle samenstellende DNM-strengen werden aan de reactiebuffer toegevoegd en in de beker geassembleerd. Het geassembleerde DNM-complex werd door native PAGE beoordeeld op zijn juiste grootte en homogeniteit. Native PAGE toont de geassembleerde DNM met de analyt in baan 1 en twee DNM-strengen in baan 2 en 4. Als de DNA-nanomachine niet in elkaar zou worden gezet, zou...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het ontwerp van DNA-machines is eenvoudig, maar vereist enige ervaring met het ontwerpen van hybridisatiesondes of functionele DNA-nanostructuren. Het is aangewezen om het analytfragment zo kort mogelijk te houden om het aantal mogelijke secundaire structuren te verminderen en DNM-invasie naar de secundaire structuur te vereenvoudigen. Het CG-gehalte moet bij voorkeur lager zijn dan 60% om stabiele intramoleculaire structuren te voorkomen. Succesvolle assemblage van de DNM wordt bereikt ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Ekaterina V. Nikitina bedanken voor het vriendelijk verstrekken van gDNA van EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya en Maria S. Rubel bedanken het ministerie van Onderwijs en Wetenschap van de Russische Federatie (subsidie nr. FSER-2022-0009) en het Priority 2030-programma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL tubeBiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µL pipetteKirgenKG-Pro1000
10-100 µL pipetteKirgenKG-Pro100
1-10 µL pipetteKirgenKG-Pro10
20-200 µL pipetteKirgenKG-Pro200
2-20 µL pipetteKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonium persulfateCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Boric AcidTechSnabH-0202
ChemiDoc imaging systemBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Ethidium bromideBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Magnesium chlorideAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µL tipsKirgenKG1111-L
pipette 1000 µL tipsKirgenKG1636
pipette 200 µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chlorideCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Sealing film for PCR platesSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Spark multimode microplate readerTecanSpark- 10M
T100 amplificatorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bathLOIPLB-140
Oligos used
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogendirect order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogendirect order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezdirect order, HPLC purification

Referenties

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232(2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252(2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132(2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. GC Content Calculator. , Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023).
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

DNAzyme-nanomachinesRNA-splitsend DNAzymehybridisatiesondesenkelnucleotidepolymorfismefluorescentie-signaalversterkingdubbelstrengs DNADNA-steigernative PAGEDNA-nanotechnologie
DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.