Methodenartikel

DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66461

⸱

9 februari 2024

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

In dit artikel

Samenvatting

De op DNAzyme gebaseerde nanomachines kunnen worden gebruikt voor zeer selectieve en gevoelige detectie van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het ontwerp van op DNA gebaseerde nanomachines met een 10-23-kern met behulp van gratis software en hun toepassing bij de detectie van een Epstein-Barr-virusfragment als voorbeeld.

Samenvatting

Op DNAzyme gebaseerde nanomachines (DNM) voor de detectie van DNA- en RNA-sequenties (analyten) zijn multifunctionele structuren gemaakt van oligonucleotiden. Hun functies omvatten strakke analytbinding, zeer selectieve analytherkenning, fluorescerende signaalversterking door meerdere katalytische splitsingen van een fluorogeen reportersubstraat en fluorogene substraataantrekkingskracht voor een toename van de sensorrespons. Functionele eenheden zijn bevestigd aan een gemeenschappelijke DNA-steiger voor hun coöperatieve actie. De RNA-splitsende 10-23 DNM's hebben een verbeterde gevoeligheid in vergelijking met niet-katalytische hybridisatiesondes. De stabiliteit van de DNM en de verhoogde kans op substraatherkenning worden geleverd door een dubbelstrengs DNA-fragment, een tegel. DNM kan twee analyten onderscheiden met een enkel nucleotideverschil in een gevouwen RNA en een dubbelstrengs DNA en analyten detecteren bij concentraties ~1000 keer lager dan andere eiwitvrije hybridisatiesondes. Dit artikel presenteert het concept achter het diagnostische potentieel van DNA-nanomachine-activiteit en geeft een overzicht van het DNM-ontwerp, de assemblage en de toepassing in nucleïnezuurdetectietests.

Inleiding

Een van de vroegste methoden voor nucleïnezuurdetectie is complementaire binding van selectieve oligonucleotiden aan de geanalyseerde RNA- of DNA-sequenties. Deze methode maakt gebruik van nucleïnezuurfragmenten (sondes) die Watson-Crick-basenparen kunnen vormen met een gerichte DNA- of RNA-analyt1. Het complex wordt vervolgens onderscheiden van de analyt en de ongebonden sonde door middel van een verscheidenheid aan technieken. Bepaalde methoden, zoals Northern blotting, in situ hybridisatie of qPCR, zijn gebaseerd op het fenomeen van complementaire binding2. De meest voorkomende hybridisatiesondes hebben twee belangrijke nadelen: lage gevoeligheid (ze kunnen micromolaire tot nanomolaire niveaus bereiken) en lage selectiviteit voor single nucleotide variaties (SNV), waaronder puntmutaties. Het probleem vereist een uitgekiende aanpak, aangezien de oplossingen voor deze nadelen met elkaar in strijd zijn3. Om de beste selectiviteit te bieden, moet het detecterende oligonucleotide kort genoeg worden gehouden om onstabiele hybriden te vormen met niet-overeenkomende analyten. Dergelijke korte oligonucleotiden zijn niet in staat om gerichte nucleïnezuren stevig te binden en hun secundaire structuren af te wikkelen, waardoor ze vaak geen detecteerbaar signaal afgeven. Het is vooral een uitdaging om CG-rijke fragmenten in biologisch RNA of dubbelstrengs DNA (dsDNA) te detecteren. Aan de andere kant zijn lange sondes ongevoelig voor SNV3. Om de impasse te doorbreken is het concept van een binaire sonde ontwikkeld4.

Binaire sensoren splitsen een enkele detectiesonde in twee stukken en specialiseren de fragmenten, waardoor een ervan lang blijft om de haarspeldbochten af te wikkelen of het dsDNA binnen te dringen. Het tweede binaire sondefragment blijft kort om gevoelig te zijn voor een niet-overeenkomende base, waardoor het een middel biedt om SNV te detecteren. Het signaal wordt geproduceerd als de twee binaire sensordelen met elkaar worden verbonden4. Het volledige complex kan worden gevisualiseerd via FRET5, moleculaire bakensonde 6,7 of G-quadruplexen met peroxidase-achtige activiteit 8,9,10, of anders RNA-splitsing 11,12,13 DNAzyme. Binaire sensoren met een 10-23 DNAzyme kern zijn ruimschoots beschreven. Ze zijn aangepast om enkelstrengs nucleïnezuurfragmenten te detecteren die synthetisch zijn gemaakt11, of enkelstrengs amplificatieproducten14,15. Detectie zonder amplificatie is ook mogelijk, bijvoorbeeld in het geval van 16S rRNA geëxtraheerd uit een celcultuur, aangezien dit molecuul overvloedig aanwezig is in cellen12,16. Binaire sensoren met een 10-23 DNAzyme-kern kunnen ook worden aangepast voor de detectie van niet-nucleïnezuur, zoals voor loodionen17. Desalniettemin wordt een lage gevoeligheid nog steeds beschouwd als een van de grootste nadelen van binaire 10-23 DNAzyme-sensoren, en er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld, waaronder cascades18 of alternatieve signaalversterkende methoden19, om dit probleem aan te pakken. Helaas verhogen de bovenstaande technieken de kosten en instabiliteit van de sensorcomponenten drastisch, en daarom zijn ze niet in de praktijk gekomen.

Het experiment dat in dit werk wordt beschreven, maakt gebruik van 10-23 DNAzyme-gebaseerde DNA-nanosensoren die DNA-nanomachines (DNM) worden genoemd20,21. Deze structuren omvatten binaire sensoren en ook (1) DNA-facilitators die de binaire sonde flankeren, de gestructureerde gebieden afwikkelen en binnendringen in dubbelstrengs DNA's, en (2) een DNA-tegel die alle DNM-delen dicht bij elkaar houdt en de kans op signaalvorming vergroot (Figuur 1). Al met al verlagen de 10-23 DNAzyme-gebaseerde DNM's de detectielimiet (LOD) tot het picomolaire bereik21; ze kunnen worden gebruikt om 16rRNA in cellysaten22 te detecteren of de aanwezigheid van viraal RNA te melden zonder amplificatie 23,24. Tegelijkertijd blijven de DNM's gevoelig voor de SNV en kunnen ze zelfs worden gebruikt om allelen in heterozygote organismen te genotyperen25. De DNM-methode kan worden gebruikt als een aanvullende techniek voor elk type amplificatie voor productvisualisatie of identificatie van het product in een complex mengsel met een hoge selectiviteit. De DNM's vereisen, in tegenstelling tot conventionele TaqMan- en beacon-sondes, geen verwarming van het monster en kunnen dus worden gebruikt in eindpuntdetectieprotocollen, waardoor de algehele detectie kosteneffectief is.

Dit artikel beschrijft de in silico ontwikkeling van een DNM en demonstreert procedures voor assemblage en functionele karakterisering van DNM. Het werk werd uitgevoerd met behulp van een synthetisch fragment van het Epstein-Barr-virus (EBV) dat overeenkomt met de posities 13972-14154 van het virale DNA (OR652423.1) (zie Tabel met materialen).

Protocol

1. DNM-ontwerp

  1. Selecteer een uniek gebied binnen het genoom van interesse.
    OPMERKING: Dit werk maakt gebruik van een gebied van het genoom van het Epstein-Barr-virus (EBV) in posities 13972-14154 (OR652423.1).
  2. Maak een primerset voor de versterking van het geselecteerde fragment, bijvoorbeeld via de Primer3-tool die is ingebed in Ugene26.
  3. Open de UNAFold-webtool27 (zie Materiaaltabel) en voer het geselecteerde gebied in. Verander de vouwtemperatuur naar 55 °C en de ionische omstandigheden naar 250 mM monovalente ionen en 200 mM Mg2+.
    1. Open de resulterende secundaire structuur van het ssDNA-fragment en selecteer een stabiele haarspeld. Lokaliseer de bindingsplaats van de DNA-nanomachines in de ongestructureerde regio's of, als alternatief, op de lussen van de haarspeldstructuren om een sterkere binding van het doelwit te bereiken.
  4. Als de beoogde analytplaats in een stam-lusstructuur is gevouwen, plaatst u arm 1 en 2 als volgt: Zorg ervoor dat arm 2 één kant van de stengel, de lus en 3-5 nt van de tweede stengelzijde bindt; Arm 1 bindt een fragment van de tweede steelzijde.
  5. Open de DinaMelt-tool28 (zie Tabel met materialen) en analyseer de sequenties van de armen en hun omgekeerde complementsequenties. Gebruik de DinaMelt-tool om ervoor te zorgen dat de Tm van armen 2 en 3 boven 65 °C is: minimaal 10 °C boven de analysetemperatuur (55 °C).
    1. Houd de Tm van arm 1 ten minste 1-3 °C boven de reactietemperatuur (55 °C) als een hoge herkenningsselectiviteit moet worden bereikt29.
  6. Combineer de sequenties van armen 1 en 2 met de helften van de DNAzyme-kern en de F-sub-bindingsfragmenten13.
  7. Analyseer de secundaire structuur van de ontworpen DNA-strengen met behulp van UNAFold27.
    OPMERKING: 55 °C (analysetemperatuur), 200 mM Mg2+, 250 mM monovalente ionen (HEPES, Na+, K+).
    1. Gebruik het ontwerp alleen als de opvouwbare ΔG lager is dan - 4 kcal/mol. Probeer lange CG-rijke sequenties te vermijden. Als de secundaire structuur te stabiel is, introduceer dan een mutatie in de arm om de vouwing ΔG30 te verhogen. Als alternatief is het plaatsen van arm 3 2-3 nt weg van arm 2 een andere strategie om de sequentie van arm 3 te veranderen om stabiele intermoleculaire structuren te vermijden.
  8. Maak een willekeurige sequentie voor het DNA-tegelfragment zo lang als arm 3. Combineer de sequentie van arm 3 met de DNA-tegelsequentie via (dT)4-6 of ethyleenglycol (bijv. triethyleenglycol (TEG) of hexaethyleenglycol (HEG)). De DNM-versie die in het experiment wordt gepresenteerd, maakt gebruik van (dT)6.
  9. Koppel arm 2 via een linker aan de sequentie die complementair is aan het in stap 1.8 geselecteerde DNA-tegelfragment.
  10. Analyseer de secundaire structuur van de ontworpen DNA-strengen met behulp van de UNAFold-webapp. Zorg ervoor dat de vouwenergie van elke DNA-streng hoger is dan 4 kJ/mol bij 55 °C en vermijd lange CG-verrijkte sequenties. Verander bij voorkeur de volgorde van de DNA-tegels.
  11. Teken de structuur met behulp van alle beschikbare software voor vectorafbeeldingen. In dit artikel worden Biorender en Pixelmator Pro gebruikt voor visualisatie (zie Tabel met materialen). Controleer de nauwkeurigheid in de richtingen van 5'->3' voor elke streng.
    OPMERKING: Verkrijg de sequenties van een betrouwbare commerciële verkoper.

2. Functionele test van de DNM

  1. Bereiding van buffer en reagentia
    1. Bereid de reactiebuffer voor die bestaat uit 50 mM HEPES (pH 7,5-7,8), 50 mM NaCl, 150 mM KCl en 200 mM MgCl2. Vul met het gedeïoniseerde water tot 50 ml.
    2. Bereid 10 μM aliquots van Dzb-Tile en Tile-Arm3 oligonucleotiden voor. Bereid 1 μM-oplossing van de Dza, een 100 μM F-sub, en 1 nM, 10 nM, 100 nM-analyten in RNase/vrij water of steriel gedeïoniseerd water. De details van de oligonucleotidesequenties zijn opgenomen in de Tabel met materialen.
  2. DNM-assemblage
    1. Ontdooi de oligonucleotideoplossingen volledig voor gebruik. Voorzichtig mengen door te tikken (niet intensief vortexen). Draai de oplossing (snel, gedurende enkele seconden) naar beneden met behulp van een microcentrifuge.
    2. Meng 1 μM van Dzb-Tile en Tile-Arm3 in 200 μL van de reactiebuffer in microcentrifugebuisjes van 0,5 ml.
    3. Meng de tube voorzichtig en draai de oplossing naar beneden.
    4. Wikkel het deksel van de gesloten buis in met paraffinefolie. U kunt ook buizen met schroefdop gebruiken.
    5. Broed de buis 2 minuten in een bekerglas van 500 ml met kokend water, zet dan de verwarming uit en laat de temperatuur een nacht passief afkoelen.
    6. Bereid de 12% native PAGINA voor: Meng 1 ml 10х TBE-buffer, 3 ml 40% AA:BA, gedeïoniseerd water tot 10 ml, 50 μl APS en 5 μl TEMED (zie materiaaltabel). Verplaats het mengsel naar de gelcassette en laat het polymeriseren.
    7. Meng 1 μL van elk monster, namelijk de geassembleerde DNM, Dzb-Tile en Tile-arm3, met 1 μL 4x laadkleurstof en laad ze in de gel.
    8. Plaats de cassette in de kamer, vul deze met 1x TBE-buffer en laat de gel 90 minuten draaien op 80 V.
    9. Verf de gel met ethidiumbromide en visualiseer het met behulp van een gel-documenterend systeem (zie Materiaaltabel).
  3. LOD-test
    1. Bereid 160 μL 200 nM F-sub in de reactiebuffer. Dit wordt gedaan om de basisachtergrond van de stabiliteit van het substraat te beoordelen.
    2. Bereid 7 aliquots van 160 μL voorgemonteerde DNM, F-sub en Dza voor in concentraties van 20 nM DNM en Dza en 200 nM F-sub in de reactiebuffer. Van de zeven buisjes, houd buis #1 als lege achtergrond om de spontane assemblage van de DNAzyme-kern te beoordelen.
    3. Voeg de analyt toe aan buisjes #2-7 in de eindconcentraties van 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM en 1000 pM.
    4. Meng voorzichtig, draai de buisjes door en verdeel de oplossingen in drie porties van 50 μL op een zwarte plaat met 96 putjes. Sluit de plaat af met een optisch transparante film.
    5. Incubeer de plaat in een waterbad bij 55 °C gedurende 1 uur. Draai de plaat naar beneden.
    6. Meet de fluorescentie bij 525 nm (λex = 495 nm). Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elk punt.
    7. Bereken de verhouding tussen blanco en basislijn door het signaal van de buis die F-sub en DNM bevat te delen door het signaal van de buis die alleen F-sub bevat. Zorg ervoor dat de verhouding binnen het bereik van 1.1-1.5 ligt.
    8. Bereken de signaal-tot-blanco-verhouding door het signaal van de buis die F-sub, DNM en de analyt bevat, te delen door het signaal van de buis die alleen F-sub en DNM bevat. Beschouw het signaal als echt positief als het hoger is dan het achtergrondgemiddelde plus drie standaarddeviaties.
    9. Herhaal het experiment twee keer en zorg ervoor dat de standaarddeviatie tussen de analytische herhalingen minder dan 0,5 is.

Resultaten

Het doel van het eerste experiment was om de assemblage van de DNM vóór het synthetische fragment van de analyt aan te tonen. Alle samenstellende DNM-strengen werden aan de reactiebuffer toegevoegd en in de beker geassembleerd. Het geassembleerde DNM-complex werd door native PAGE beoordeeld op zijn juiste grootte en homogeniteit. Native PAGE toont de geassembleerde DNM met de analyt in baan 1 en twee DNM-strengen in baan 2 en 4. Als de DNA-nanomachine niet in elkaar zou worden gezet, zouden er 2 of 3 afzonderlijke banden zichtbaar zijn in plaats van een enkele band met lage mobiliteit (baan 2 in figuur 2A).

Het tweede deel van het protocol impliceert de functionele karakterisering van de DNM-prestaties en de detectie van doelnucleïnezuren. In dit onderzoek is gebruik gemaakt van het synthetische fragment van EBV 13972-14154. Daartoe werden de fragmenten van de voorgemonteerde DNM's, samen met de Dza, geïncubeerd met verschillende concentraties van de analyt gedurende 1 uur bij 55 °C. Er werden twee controlewaarden voor fluorescerende signalen gemeten: die van de voorgemonteerde DNM-fragmenten en Dzb zonder de analyt (blanco) en die van de achtergrond van F-sub (basisch). Er werden drie technische metingen gedaan. Voor de statistiek zijn er ook drie onafhankelijke onderzoeken uitgevoerd. Het is opmerkelijk dat de magnesiumconcentratie in dit onderzoek hoger is dan wat in de literatuur te vinden is30. Hoge niveaus van magnesiumionen verhogen het signaal in alle testbuizen, omdat ze een spontane F-sub-splitsing bevorderen31. We hebben de samenstelling van de reactiebuffer geoptimaliseerd tijdens de voorbereidende fasen van de technologische ontwikkeling en hebben dit proces niet bij elke uitgevoerde studie herhaald.

Na 1 uur incubatie werd de fluorescentie van het monster gemeten met behulp van een spectrofluorometer (zie Tabel met materialen). Om de detectie van het geanalyseerde DNA door de DNM te bevestigen, hebben we het fluorescerende signaal van de geassembleerde sensor vergeleken met het geanalyseerde DNA en dat van de negatieve controle, waaraan geen analyt is toegevoegd. De signaal-tot-blanco-verhouding (een verhouding tussen de gemiddelde relatieve fluorescentie-eenheden van de putjes die de analyt bevatten en de putjes zonder analyt) mag niet minder dan 1,5 zijn om een succesvolle detectie te bevestigen32. De verhouding tussen blanco en basislijn (fluorescentie van de sensorrespons in afwezigheid van analyt gedeeld door die van de F-sub-controle) moet tussen 1,1 en 1,5 liggen; deze verhouding kan worden aangepast door DNM's en Dzb-concentraties te wijzigen (het typische concentratiebereik voor elk is 5-20 nM). In onze praktijk wordt LOD gekwantificeerd als het snijpunt van de trendlijn en drie standaarddeviaties boven de gemiddelde lege ruimte (figuur 2B). De DNM is effectief als de LOD <100 pM33 is. De DNM moet opnieuw worden ontworpen als de LOD hoger is dan 100 pM.

figure-results-1
Figuur 1: De driearmige DNM die in dit onderzoek is gebruikt. Drie oligonucleotiden, Dza, Dzb-Tile en Tile-Arm3, zijn gemarkeerd als respectievelijk groen, blauw en paars. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: DNM-karakterisering. (A) Assemblage van de DNM via natuurlijke elektroforese in 12% polyacrylamidegel, 80 V, 1 uur, met behulp van een 50 bp+ DNA-ladder. B) de aantoonbaarheidsgrens van synthetisch DNA na 60 minuten incubatie bij 55 °C. De horizontale lijn staat voor de drempel en de verticale lijn is de LOD. De gemiddelde waarden van drie onafhankelijke metingen worden weergegeven met één standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het ontwerp van DNA-machines is eenvoudig, maar vereist enige ervaring met het ontwerpen van hybridisatiesondes of functionele DNA-nanostructuren. Het is aangewezen om het analytfragment zo kort mogelijk te houden om het aantal mogelijke secundaire structuren te verminderen en DNM-invasie naar de secundaire structuur te vereenvoudigen. Het CG-gehalte moet bij voorkeur lager zijn dan 60% om stabiele intramoleculaire structuren te voorkomen. Succesvolle assemblage van de DNM wordt bereikt bij langzame afkoelsnelheden. In sommige gevallen kunnen DNM's spontaan in de buis worden gemonteerd en kan de gloeistap worden geëlimineerd. DNM-assemblage kan worden uitgevoerd in een thermische cycler met 0,1-0,3 °C/min of in grote hoeveelheden koelwater. In het geval van onjuiste DNM-assemblage raden we aan om de temperatuurverandering tijdens de gloeistap te vertragen.

Om de LOD te meten, zijn ten minste zeven analytconcentratiepunten nodig: de 0 pM analytconcentratie, dat is F-sub + DNM, en zes verschillende analytconcentraties, bijvoorbeeld in het bereik van 1 nM tot 1 pM om de lineaire afhankelijkheid waar te nemen (Figuur 2B). Vaak werden meer dan zeven concentratiepunten gebruikt voor een hogere nauwkeurigheid. Voor elk concentratiepunt moeten drie technische proeven (elk 50 μl) worden uitgevoerd. Daarom was het totale volume voor elke concentratie 160 μl (10 μl overmaat, rekening houdend met de pipetfout).

De DNM-techniek heeft een hogere gevoeligheid voor SNV's dan andere op hybridisatie gebaseerde systemen. Hoge selectiviteit voor SNV kan relevant zijn voor bepaalde doelstellingen, zoals de identificatie van puntmutaties die verband houden met bacteriële genotypering22 of de selectie van heterozygoten in planten25. Niet-specifieke analyten zouden dezelfde experimentele procedure vereisen. Om elk begrip van SNV voor een lage concentratie van analyt te voorkomen, stellen we voor om het signaal van de experimentele onbekende analyt te vergelijken met dat van het signaal van een bekende volledig complementaire analyt van dezelfde concentratie.

De methode kan met succes worden toegepast op ssDNA-, miRNA-, gevouwen RNA- of dsDNA-amplicons. Lange RNA- of dsDNA-fragmenten, vooral de CG-rijke, kunnen DNM vereisen die is uitgerust met 4-6 analytbindende armen, terwijl twee analytbindende armen voldoende zijn voor enkelstrengs analyten met een onstabiele secundaire structuur (ΔG-vouwing boven -10 kcal/mol). De methode kan worden toegepast voor de detectie van PCR-, SDA- of LAMP-amplicons. DNM kan worden gebruikt voor amplificatievrije detectie van rRNA in gekookte monsters van bacteriecultuur zonder totaal RNA 22,34,35 te isoleren. De techniek werkt mogelijk niet goed met concentraties zo laag als het femtomolaire niveau en met dsDNA-fragmenten, waarvan het CG-gehalte in de flankerende regio's hoger is dan 65%. Het CG-gehalte kan bijvoorbeeld worden geschat met de Biologics CG-inhoudscalculator36. We stellen voor om haakdelen37 toe te voegen aan de DNM-ontwerpen om de gevoeligheid te verhogen of het dsDNA om te zetten in ssDNA in gevallen van een hoog CG-gehalte. Een andere beperking van de methode is dat de DNM's gevoelig zijn voor de kwaliteit van de monsters, dus de nucleïnezuren moeten zorgvuldig worden gezuiverd. Hetzelfde geldt voor de kwaliteit van de oligonucleotidesequenties van DNM's. Daarom wordt voorgesteld om de stabiliteit en zuiverheid van elke oligonucleotidevoorraad te verifiëren. In vergelijking met conventionele versterkingstechnieken vereist het ontwerp van de DNM's vaardigheden en is het op de datum van de publicatie van het artikel bijna volledig handmatig. De DNM's hebben een aantal voorbereidende tests op synthetische fragmenten nodig voordat ze worden onderworpen aan echte DNA- of RNA-monsters, waardoor de totale duur van de ontwikkeling van het testsysteem wordt verlengd.

De methode is veelzijdig en kan verschillende soorten reportersondes gebruiken. Het kan worden gemultiplext38, en de techniek kan worden omgezet in een colorimetrische versie als de F-sub wordt vervangen door een G-quadruplexvormend substraat39. De aanwezigheid van polymerase wordt geassocieerd met fouten in de groei van de streng; daarom is deze methode voordelig ten opzichte van conventionele real-time PCR en digitale PCR, evenals andere nuclease-afhankelijke technieken, zoals SHERLOCK en DETECTR, vanwege het ontbreken van bederfelijke eiwitenzymen en de robuuste en eenvoudige detectieprocedure40,41.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Ekaterina V. Nikitina bedanken voor het vriendelijk verstrekken van gDNA van EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya en Maria S. Rubel bedanken het ministerie van Onderwijs en Wetenschap van de Russische Federatie (subsidie nr. FSER-2022-0009) en het Priority 2030-programma.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL tubeBiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µL pipetteKirgenKG-Pro1000
10-100 µL pipetteKirgenKG-Pro100
1-10 µL pipetteKirgenKG-Pro10
20-200 µL pipetteKirgenKG-Pro200
2-20 µL pipetteKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonium persulfateCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Boric AcidTechSnabH-0202
ChemiDoc imaging systemBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Ethidium bromideBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Magnesium chlorideAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µL tipsKirgenKG1111-L
pipette 1000 µL tipsKirgenKG1636
pipette 200 µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chlorideCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Sealing film for PCR platesSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Spark multimode microplate readerTecanSpark- 10M
T100 amplificatorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bathLOIPLB-140
Oligos used
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogendirect order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogendirect order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezdirect order, HPLC purification

Referenties

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232(2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252(2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132(2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. GC Content Calculator. , Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023).
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

DNAzyme nanomachinesRNA splitsend DNAzymehybridisatiesondesenkelnucleotidepolymorfismefluorescentie signaalversterkingdubbelstrengs DNADNA steigernative PAGEDNA nanotechnologie
DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.