Een chirurgische ingreep wordt beschreven om injecties uit te voeren in de lumbale stortbak van de jonge rat. Deze benadering is gebruikt voor de intrathecale toediening van gentherapievectoren, maar er wordt verwacht dat deze benadering kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan therapieën, waaronder cellen en medicijnen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intrathecale vectortoediening bij jonge ratten via lumbale stortbakinjectie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gentherapie is een krachtige technologie om nieuwe genen aan een patiënt af te leveren voor de behandeling van ziekten, of het nu gaat om het introduceren van een functioneel gen, het inactiveren van een toxisch gen of het leveren van een gen waarvan het product de biologie van de ziekte kan moduleren. De toedieningsmethode voor de therapeutische vector kan vele vormen aannemen, variërend van intraveneuze infusie voor systemische toediening tot directe injectie in het doelweefsel. Voor neurodegeneratieve aandoeningen is het vaak wenselijk om de transductie naar de hersenen en/of het ruggenmerg te verschuiven. De minst invasieve benadering om het hele centrale zenuwstelsel aan te pakken, is injectie in de cerebrospinale vloeistof (CSF), waardoor het geneesmiddel een groot deel van het centrale zenuwstelsel kan bereiken. De veiligste manier om een vector in de liquor af te leveren, is de lumbale intrathecale injectie, waarbij een naald in de lumbale stortbak van het ruggenmerg wordt ingebracht. Deze techniek, ook wel lumbaalpunctie genoemd, wordt veel gebruikt bij neonatale en volwassen knaagdieren en in grote diermodellen. Hoewel de techniek vergelijkbaar is tussen soorten en ontwikkelingsstadia, vereisen subtiele verschillen in grootte, structuur en elasticiteit van weefsels rond de intrathecale ruimte aanpassingen in de aanpak. Dit artikel beschrijft een methode voor het uitvoeren van lumbaalpunctie bij jonge ratten om een adeno-geassocieerde serotype 9-vector af te leveren. Hier werd 25-35 μL vector in de lumbale stortbak geïnjecteerd en werd een groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter gebruikt om het transductieprofiel van elke injectie te evalueren. De voordelen en uitdagingen van deze aanpak worden besproken.
Inleiding
De belofte van viraal-gemedieerde gentherapieën is de afgelopen jaren eindelijk gerealiseerd met de FDA-goedkeuring van behandelingen voor spinale musculaire atrofie, retinale dystrofie, factor IX hemofilie, kanker en meer 1,2,3,4. Talloze andere therapieën zijn momenteel in ontwikkeling. Gentherapie heeft tot doel een therapeutisch gen af te leveren aan de cellen van een patiënt. De producten van dit nieuwe gen kunnen de ontbrekende activiteit van een gebrekkig endogeen gen vervangen, een toxisch gen remmen, kankercellen doden of een andere gunstige functie bieden.
Voor ziekten die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantasten, is het vaak wenselijk om de gentherapievector rechtstreeks aan het doelweefsel af te leveren. Niet-systemische benaderingen bieden twee voordelen: ze minimaliseren off-target bijwerkingen die kunnen worden veroorzaakt door perifere transductie, en ze verminderen de hoeveelheid vector die nodig is om adequate niveaus van transductie in hetdoelweefsel te bereiken aanzienlijk.
Er zijn verschillende benaderingen voor het afleveren van gentherapievectoren aan het CZS. Intraparenchymale injectie, de injectie van een vector rechtstreeks in het ruggenmerg of hersenweefsel, kan worden gebruikt voor toediening aan een bepaald gebied. Voor veel ziekten is echter een brede transductie van het CZS gewenst. Dit kan worden bereikt door een vector af te leveren aan de cerebrospinale vloeistof (CSF)5, de vloeistof die in en rond de hersenen en het ruggenmerg stroomt. Er zijn drie primaire manieren om vectoren aan de CSF te leveren. De meest invasieve benadering is intracerebroventriculaire toediening, waarbij een braamgat door de schedel wordt geboord en een naald door de hersenen in de laterale ventrikels wordt gebracht. Dit levert transductie op door de hele hersenen. De procedure kan echter intracraniële bloeding veroorzaken en de aanpak produceert over het algemeen slechts een beperkte transductie van het ruggenmerg6. Injectie in de cisterna magna aan de basis van de schedel is minder invasief, maar brengt het risico van schade aan de hersenstam met zich mee. Hoewel injectie in de cisterna magna vaak wordt gebruikt in dieronderzoek5, wordt het niet langer routinematig gebruikt in de kliniek7. Lumbaalpunctie is de minst invasieve benadering om toegang te krijgen tot de CSF. Dit omvat het plaatsen van een naald tussen twee lendenwervels en in de lumbale stortbak.
Lumbaalpunctie voor vectorafgifte wordt routinematig uitgevoerd bij volwassen ratten en muizen en bij neonatale muizen 8,9. De auteurs van deze studie hebben onlangs lumbaalpuncties uitgevoerd bij jonge ratten (28-30 dagen oud) om adeno-geassocieerde virusserotype 9 (AAV9) vectoren af te leveren. Bij volwassen ratten werd een neonatale lumbaalpunctienaald verticaal tussen de wervels L3 en L4 9geplaatst. De juiste plaatsing resulteert in een staartbeweging en CSF die omhoog stroomt in het naaldreservoir. Bij jonge ratten kon echter geen van deze uitlezingen worden bereikt. De auteurs probeerden vervolgens een procedure voor volwassen muizen aan te passen met behulp van een insulinespuit van 27 G die onder een hoek tussen L5 en L6 werd ingebracht10. Bij volwassen muizen, die doorgaans kleiner zijn dan P28-ratten, produceert dit geen staartbeweging, maar een onjuiste plaatsing van de naald is duidelijk te zien aan de terugstroming van het injectiemiddel. Bij juveniele ratten leidde deze aanpak er echter uniform toe dat het injectaat epiduraal werd toegediend, waarschijnlijk als gevolg van een verschillende elasticiteit tussen volwassen muizen en juveniele ratten van de weefsellagen rond het ruggenmerg. Vervolgens werden katheterbenaderingen geëvalueerd. In het bijzonder werd een katheter ingebracht via een incisie in de dura van de lumbale stortbak en tot aan het midden van het thoracale ruggenmerg; Deze aanpak leidde echter tot een aanzienlijke terugvloeiing van het injectaat uit de incisieplaats tijdens de bevalling. Pogingen om de katheter percutaan in de intrathecale ruimte te plaatsen met behulp van een geleidingsnaald waren ook niet succesvol. Vanwege de smalheid van de interlaminaire breedte zou de katheter waarschijnlijk de rostrale lamina raken en niet vooruitgaan.
Hier wordt een methode beschreven om een succesvolle en reproduceerbare toediening van de oplossing te bereiken via een lumbaalpunctie bij de jonge rat. Deze aanpak kan worden gebruikt voor virale vectoren, en waarschijnlijk ook voor cellen, geneesmiddelen en andere therapieën.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Sprague-Dawley-ratten (28-30 dagen oud, massa in het bereik van ongeveer 90-135 g, mannetjes en vrouwtjes) werden in de huidige studie gebruikt.
1. Voorbereiding van de vector
- Ontdooi de AAV9-vector (zie Tabel met materialen) op ijs aan het begin van de procedure.
- Centrifugeer de microcentrifugebuis met de vector kort in een tafelcentrifuge om ervoor te zorgen dat alle vloeistof op de bodem van de buis zit.
- Tik voorzichtig op de microcentrifugebuis om ervoor te zorgen dat de oplossing goed gemengd is.
2. Voorbereiding van de herstelkooi
- Plaats een schone kooi op een elektrische deken (zie Materiaaltabel) zodat slechts de helft van de kooi in contact komt met de deken.
- Stel de temperatuur van de deken in op ~37 °C.
3. Voorbereiding van het chirurgisch platform
- Verwarm een isothermisch kussen (zie Materiaaltabel) tot 39 °C in een magnetron of een waterbad zodat de inhoud vloeibaar wordt.
- Plaats het isotherme kussen op het chirurgische platform en bedek het met een schoon absorberend bankkussen.
4. Voorbereiding van dieren
- Verdoof de ratten met isofluraan in een doorzichtige doos (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Begin de anesthesie-inductie met 5% isofluraan en verlaag 1% per minuut tot het 2% bereikt. Houd het dier nog 3 minuten op 2%.
- Verplaats de doos met het dier naar een zuurkast en open de doos.
OPMERKING: Dit beperkt de blootstelling van de chirurg aan de verdoving. - Verwijder het haar van de rug van het dier met behulp van een elektrische tondeuse.
OPMERKING: Als alternatief kan een ontharingscrème of handmatig scheermes en scheerschuim worden gebruikt. - Plaats het dier op het operatieplatform met zijn snuit in de neuskegel van de anesthesie.
OPMERKING: Het dier kan weer bij bewustzijn komen terwijl de vacht van de operatieplaats wordt verwijderd. Als dit gebeurt, verdoof het dan opnieuw zoals hierboven beschreven. - Breng bevochtigende oogzalf aan op elk oog om uitdroging van de hoornvliezen tijdens de procedure te voorkomen.
- Desinfecteer het operatiegebied met behulp van drie afwisselende toepassingen van povidonjodium- en isopropanoldoekjes.
- Injecteer de pijnstiller(s) subcutaan.
OPMERKING: Buprenorfine wordt over het algemeen gebruikt in een dosis van 0,01-0,05 mg/kg, elke 12 uur toegediend. Als alternatief kan een vorm met langzame afgifte van dit medicijn eenmaal worden gegeven in een dosis van 1 mg/kg om gedurende 72 uur voldoende pijnbestrijding te bieden. Raadpleeg de IACUC van de instelling voor hun richtlijnen met betrekking tot pijnbestrijding. - Injecteer 100 μL 1% lidocaïne subcutaan boven de processus spinosus L2 tot L6 om lokale anesthesie te bieden.
- Leg een rol keukenpapier of een buis met een diameter van 1,5 cm onder het dier, net rostraal tot aan de heupen. Dit helpt de wervelkolom te buigen, waardoor het gemakkelijker wordt om de naald tussen de twee laminae te steken.
- Plaats een gefenestreerd laken (zie Materiaaltabel) op het dier en centreer het venster over de lumbale wervelkolom.
5. Blootleggen van de lumbale wervelkolom
- Bevestig de diepte van de anesthesie door in elk van de poten van het dier te knijpen en te zoeken naar de afwezigheid van een ontwenningsreactie.
- Maak met een #11 scalpelmesje een incisie van ongeveer 3 cm lang in de huid langs de middellijn van L2 naar L6.
- Maak de huid los van de spier door een steriel gebogen chirurgische schaar tussen de spier en de huid te steken en vervolgens de punten te openen.
- Verwijder de fascia die de processus spinosus L2-L5 bedekt.
6. Laden van de spuit
- Pipetteer 25-35 μL van de vector (om de gewenste dosis te bereiken) in de dop van een steriele microcentrifugebuis.
- Zuig het volledige volume op in de insulinespuit.
NOTITIE: Zorg ervoor dat er tijdens dit proces geen lucht wordt aangezogen.
7. Uitvoeren van de injectie
- Identificeer de processus spinosus L5 en L4.
OPMERKING: L6 bevindt zich direct tussen de twee darmbeenkammen en de processus spinosus moet gemakkelijk te identificeren zijn door te sonderen met een stomp instrument. Het instrument kan dan voorzichtig naar achteren worden geleid om de grenzen van de L5- en L4-processen te vinden. - Plaats een hand zo dat de duim zachtjes op de staart en een poot van het dier rust. Gebruik een vinger om de spuit stabiel te houden.
- Plaats de naald van de spuit zo dat deze zich links van de processus spinosus L5 bevindt en uitgelijnd is met het caudale uiteinde. Plaats de spuit zo dat deze zich ongeveer 30° ten opzichte van de middellijn en 30° boven het vlak van de tafel bevindt.
OPMERKING: Het kan nuttig zijn om een chirurgische microscoop te gebruiken om oriëntatiepunten beter te identificeren en de punt van de naald te positioneren. - Schuif de naald van de spuit ongeveer 8 mm naar voren, over de bovenkant van de L5-lamina en vervolgens onder de L4-lamina in de lumbale stortbak totdat het bot wordt geraakt. Correcte plaatsing zal resulteren in een spiertrekkingen van het been en/of de staart die kan worden gezien of gevoeld door de duim die op het been/de staart rust. Als er geen spiertrekkingen zijn, verwijder dan de naald en probeer de procedure vanaf de linkerkant. Als er nog steeds geen spiertrekkingen zijn, herhaal dan de procedure tussen L4/L3 en L3/L2 indien nodig.
- Druk de zuiger langzaam ongeveer 5 s in.
OPMERKING: Er kan een spiertrekkingen in het been of de staart optreden tijdens de injectie. - Houd de spuit ongeveer 30 s op zijn plaats nadat u de zuiger volledig hebt ingedrukt, zodat de druk in evenwicht kan komen en het terugvloeien van de injectie wordt geminimaliseerd wanneer de naald wordt teruggetrokken.
- Verwijder langzaam de naald.
8. Sluiten van de incisie
- Benader de randen van de incisie.
- Begin aan het ene uiteinde van de wond en gebruik een 4-0 hechting (zie Materiaaltabel) of chirurgische nietjes om de incisie te sluiten.
9. Herstel en monitoring
- Plaats het dier in de voorverwarmde kooi.
- Controleer het dier minstens elke 15 minuten totdat het volledig ambulant is.
OPMERKING: Dit duurt tussen de 15 minuten en 45 minuten. - Voer de komende drie dagen minstens dagelijks welzijnscontroles uit. Geef pijnstillers gedurende de eerste 2 dagen na de operatie of zoals vereist door de IACUC.
- Verwijder een week na de operatie de hechtingen of nietjes.
10. Vervolgprocedure
OPMERKING: Om de nauwkeurigheid van de injectietechniek te bepalen, injecteert u trypanblauwe kleurstof zoals hierboven beschreven en euthanaseert u het dier onmiddellijk (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) en voert u een laminectomie uit om het resultaat te visualiseren.
- Terwijl het dier onder narcose blijft, euthanaseert u het door een dodelijke dosis pentobarbital toe te dienen via intraperitoneale injectie in een dosis van 150 mg/kg.
- Zodra de ademhaling en hartactiviteit stoppen, opent u de borstholte om de dood te verzekeren. Verleng de chirurgische incisie langs de rug naar de nek.
- Maak een incisie van 4 cm lang in de spier evenwijdig aan de wervelkolom aan beide zijden van de processus spinosus en blijf zo dicht mogelijk bij de processen.
- Verwijder met een fijne pincet of schaar de spier tussen de processus spinosus.
- Verwijder de processus spinosus van L6 tot aan de onderste thoracale wervelkolom met behulp van een rongeur (zie Materiaaltabel). Vermijd draaiende bewegingen, omdat dit de rongeuren kan beschadigen.
- Steek de onderste punt van de rongeur onder de L5 lamina en verwijder het bot dat over het ruggenmerg ligt door er meerdere "happen" uit te nemen.
OPMERKING: Door de processus spinosus L6 terug te trekken, kan het gemakkelijker worden om de punt van de rongeur in te brengen. Er moet voor worden gezorgd dat schade aan het ruggenmerg wordt voorkomen. - Ga door met het uitbreiden van de laminectomie ten minste vier laminae rostraal. Inspecteer het binnenoppervlak van de laminae op tekenen van kleurstof, wat kan duiden op een mislukte injectie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de nauwkeurigheid van de injectietechniek te bepalen, werd een kleurstof, trypanblauw, gebruikt als surrogaat voor het therapeutische. Deze kleurstof bindt zich gemakkelijk aan eiwitten, dus het blijft over het algemeen binnen de structuur waarin het is geïnjecteerd. Dit betekent dat de kleurstof de distributie van het geneesmiddel na injectie mogelijk niet nauwkeurig voorspelt; Het wordt alleen gebruikt om de nauwkeurigheid van de injectie aan te tonen. Wanneer het met succes in de lumbale stortbak wordt ingebracht, ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een breed scala aan ziekten tast het CZS aan. Het verstrekken van een functionele kopie van het relevante gen via een virale vector is een aantrekkelijke behandelingsstrategie voor recessieve en monogene genen, zoals spinale musculaire atrofie. De bloed-hersenbarrière (BBB) sluit echter de meeste gentherapievectoren uit die intraveneus worden toegediend11. Degenen die de BBB kunnen kruisen, zoals AAV9, moeten in hoge doses worden gegeven om het vectorverlies als gevolg van perifere transductie te ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Dr. Donsante is een uitvinder van een aangevraagd patent met betrekking tot CSF-toediening van AAV9-vectoren.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi en Lacey Stearman van UT Southwestern bedanken voor een productieve discussie over de uitdaging van jonge ratten voor intrathecale injectie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van Jaguar Gene Therapy (aan JLFK).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 200 µL gefilterde pipettipjes | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetten virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector die GFP tot expressie brengt |
| Absorbeerbare hechtdraad met naald gecoat Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Cirkel omgekeerd snijdend naaldformaat 4 - 0 gevlochten | McKesson | J422H | Hechtdraad |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Chirurgie |
| Braintree Scientific isothermische kussens, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Houdt lichaamstemperatuur vast |
| Buprenorfine | McKesson | 1013922 | Analgeticum |
| Buprenorfine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Uitgebreid afgifte analgeticum | |
| Wattenstaafjes | Fisher Scientific | 19-365-409 | Bloedverwijdering |
| Muisdoekje, helder plastic, 12" x 12", met zelfklevende opening | Steris | 1212CPSTF | Chirurgisch doekje |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electrische deken | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Verwarmingskussen | |
| Eppendorf Research plus, 1-kanaals pipet, variabel, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetten virus |
| Fijne schaar | Fine Science Tools | 14059-11 | Gebogen chirurgische schaar |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomie |
| Halsey naaldhouders | Fine Science Tools | 12001-13 | Naaldaandrijving |
| Insulieninjectiespuit met ultrafijne naald 12,7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Injectiespuit |
| Isofluraan | McKesson | 803250 | Verdoving |
| Isopropanoldoekjes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Huiddesinfectie |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Lokaal anestheticum |
| Microcentrifugebuizen: 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | De spuit vullen |
| Povidon-jodium | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Huiddesinfectie |
| Scalpelhandgreep - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpelbladhouder |
| Sure-Seal Inductiekamer | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesiebox |
| Chirurgische mesjes Miltex koolstofstaal nr. 11 steriele wegwerpbaar individueel verpakt | McKesson | 4-111 | Nr. 11 scalpelmesje |
| SYSTANE NIGHTTIME Oogzalf | Alcon | Oogzalf | |
| Trypan Blauw | VWR | 97063-702 | Injectie |
Referenties
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685(2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14(2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
