Methodenartikel

High-speed atomaire krachtmicroscopie beeldvorming van DNA driepunts-stermotief zelfassemblage met behulp van fotothermisch off-resonantie tappen

DOI:

10.3791/66470

⸱

22 maart 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne, 2Programmable Biomaterials Laboratory, Institute of Materials, School of Engineering, Ecole Poly-technique Fédérale Lausanne

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier tonen we het beeldvormingsprotocol voor het observeren van biomoleculaire interacties met fotothermisch off-resonantie tappen (PORT), waar we beeldvormingsparameters hebben geoptimaliseerd, systeemlimieten hebben geïdentificeerd en mogelijke verbeteringen hebben onderzocht in de beeldvorming van driepunts-ster DNA-motiefassemblage.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High-speed atomaire krachtmicroscopie (HS-AFM) is een populaire moleculaire weergavetechniek voor het visualiseren van enkelvoudige molecuul biologische processen in real-time toe te schrijven aan zijn vermogen om onder fysiologische omstandigheden in vloeibare milieu's beeld te geven. De fotothermische off-resonantie tapping (PORT)-modus maakt gebruik van een aandrijflaser om de cantilever op een gecontroleerde manier te oscilleren. Deze directe cantilever-bediening is effectief in het MHz-bereik. In combinatie met het bedienen van de feedbacklus op de krachtcurve van het tijddomein in plaats van de resonantiamplitude, maakt PORT high-speed beeldvorming mogelijk met maximaal tien frames per seconde met directe controle over tip-sample krachten. Het is aangetoond dat PORT beeldvorming mogelijk maakt van delicate assemblagedynamiek en nauwkeurige monitoring van patronen gevormd door biomoleculen. Tot nu toe is de techniek gebruikt voor een verscheidenheid aan dynamische in vitro-onderzoeken , waaronder de DNA-assemblagepatronen met 3-punts stermotieven die in dit werk worden getoond. Door middel van een reeks experimenten identificeert dit protocol systematisch de optimale instellingen van de beeldvormingsparameter en de uiteindelijke limieten van het HS-PORT AFM-beeldvormingssysteem en hoe deze de biomoleculaire assemblageprocessen beïnvloeden. Bovendien onderzoekt het mogelijke ongewenste thermische effecten die door de aandrijflaser worden veroorzaakt op het monster en de omringende vloeistof, vooral wanneer het scannen beperkt is tot kleine gebieden. Deze bevindingen bieden waardevolle inzichten die de vooruitgang van de toepassing van de PORT-modus bij het bestuderen van complexe biologische systemen zullen stimuleren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High-speed atomaire krachtmicroscopie (HS-AFM) is een snel groeiende weergavetechniek 1,2,3,4. Het werkt met snelheden waarmee onderzoekers biomoleculaire interacties in realtime kunnen visualiseren 5,6,7,8,9. Fotothermisch off-resonantie tappen (PORT) is een off-resonantie beeldvormingsmodus vergelijkbaar met piekkrachttappen 10,11, gepulseerde krachtmodus12,13 of springmodus14. In plaats van de scanner verticaal te oscilleren, oscilleert PORT echter alleen de cantilever verticaal door een excitatielaser die is gericht op de cantilever (meestal dicht bij het klempunt). De cantilever vervormt door het bimorfe effect: een vermogensgemoduleerde excitatielaser verwarmt periodiek de gecoate cantilever, die buigt door de verschillende thermische uitzettingscoëfficiënten van de cantilever en de coatingmaterialen15. De cantilever- en sampleverwarming kunnen worden geminimaliseerd door een aandrijflaser te gebruiken die tijdens elke oscillatiecyclus periodiek wordt uitgeschakeld en weer wordt ingeschakeld, in plaats van een volledige sinusvormige aandrijvingte gebruiken 5.

DNA wordt al een aantal jaren gebruikt om biologisch relevante, structureel interessante en biochemisch bruikbare motieven te vormen 16,17,18,19,20. Bovendien zijn DNA-structuren ideaal geschikt gebleken om AFM-beeldvormingskwaliteit21 te karakteriseren en om het tip-effect van hoge snelheid AFM22 te beoordelen. Blunt-end DNA driepuntssterren (3PS) werden praktisch als een programmeerbaar modelsysteem voor het onderzoeken van de supramoleculaire organisatie van vergelijkbaar gestructureerde moleculen in anderszins complexe biologische systemen19. Voorheen werd de zelfassemblage van roosters gevormd door stompe trimere DNA-monomeren gevolgd via HS-AFM23. Uiteindelijk organiseren deze zich in grote netwerken met een zeshoekige orde. Hier wordt de zelfassemblage van DNA 3-punts sterren19 in beeld gebracht met de PORT-techniek met scansnelheden die snel genoeg zijn om de zelfassemblage en de correctiemechanismen24 te volgen, terwijl minimale verstoring van het proces of monsterschade wordt gegarandeerd. Zoals bij elke HS-AFM-modus, is er een afweging tussen haalbare beeldkwaliteit, beeldsnelheid en de ongewenste verstoring van het monster. Door het juiste compromis te kiezen, kan men de zelforganisatiepatronen van supramoleculaire assemblages beter begrijpen. Dit protocol zal daarom een vergelijkbare opstelling gebruiken met DNA 3PS als modelsysteem om de parameters die specifiek zijn voor PORT te optimaliseren. Dit maakt werken met hoge beeldsnelheden mogelijk bij scanformaten die groot genoeg zijn, terwijl de schade aan het monster tot een minimum wordt beperkt.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monster en buffers

OPMERKING: De DNA-tegel die in deze studie is gebruikt, is het 3-punts stermotief dat is ontwikkeld in het Mao-laboratorium van de Purdue University19,25. Alle oligonucleotiden die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn gekocht bij Integrated DNA Technologies, Inc. Verzamel de benodigde materialen en reagentia.

  1. Meng de enkelstrengs DNA's (ssDNA's) in een molaire verhouding van 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM voor S2 en 1,8 μM voor S3) in de gloeibuffer (5 mM TRIS, 1 mM EDTA en 10 mM MgAc2). De uiteindelijke concentratie van het DNA-motief moet 0,6 μM zijn (49 ng/μL met een molecuulgewicht van 3PS van 82020,3 g/mol).
  2. Doe de DNA-oplossing in een hittebestendige container en verwarm deze tot 80 °C. Koel de DNA-oplossing langzaam af van 80 °C tot 20 °C gedurende een periode van 4 uur. Dit gloeiproces helpt de ssDNA-oligonucleotiden om het gewenste dubbelstrengs DNA-motief te vormen.
  3. Laad voor zuivering de gegloeide DNA-oplossing op een 3% agarosegel om de overtollige ssDNA's en eventuele ongewenste bijproducten te verwijderen. Laat de 3% gel ca. 2,5 uur draaien op 60 V in een lopende buffer met 0,5x Tris-Borate-EDTA (TBE) en 10 mM Mg (CH3COO)2.
  4. Identificeer en lokaliseer de band op de gel die het DNA-motief bevat. Zorg ervoor dat de band is gemigreerd naar een specifieke positie op basis van de grootte.
  5. Snijd de band met het DNA-motief voorzichtig uit de gel. Extraheer het DNA-motief uit het uitgesneden gelfragment door het in een spinkolom voor gelextractie te plaatsen en gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 3.000 x g en 4 °C.
  6. Vervang de buffer in het geëxtraheerde DNA-motief door de gloeibuffer met behulp van een centrifugaalconcentrator. Centrifugeer bij 3000 x g bij kamertemperatuur (of lager) tot de geconcentreerde oplossing minder dan 100 μl is. Voeg vervolgens 300 μL gloeibuffer toe en herhaal deze stap twee keer om ervoor te zorgen dat de buffer wordt vervangen.
  7. Verdun het DNA-motief tot 6 nM voor beeldvormingsdoeleinden. Gebruik een spectrofotometer of andere geschikte methoden om de concentratie nauwkeurig te bepalen en aan te passen. Het DNA-motief is nu klaar voor beeldvorming.
    OPMERKING: Alle buffers in het protocol hebben een pH van 8.0. De sequentie-informatie voor de drie respectievelijke banden is als volgt:
    S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
    AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
    S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
    CGGTAACG
    S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Groei van de uitkragende punt

  1. Draagarmmontage op de SEM-draagarmhouder: Zorg ervoor dat de draagarmen schoon en vrij van verontreinigingen zijn. Monteer de uitkragingen op een geschikte houder die compatibel is met het SEM-systeem. Het op maat gemaakte ontwerp van de draagarmhouder kan op verzoek worden gedeeld.
  2. Gasinjectie: Verwarm het voorlopergas (bijv. fenantreen C14H10 voorloper voor amorfe koolstoftips) voor gebruik op het gasinjectiesysteem om de nieuwe tip te laten groeien. Zodra het vacuüm onder de 10-5 mbar is, ontlucht u de gasinjectieleiding 10 keer gedurende 2 s om er zeker van te zijn dat er geen ongewenste restlucht in de mondstukleiding zit (dat moet gebeuren met de klep naar de pistoolkamer gesloten).
  3. Aanpassing van de tippositie: Gebruik scanning-elektronenmicroscopie (SEM) om het uiteinde van de cantilever te lokaliseren. Kantel de cantileverhouder in een hoek (bijv. 11° in dit geval) die gelijk is aan de hoek die de cantilever zal presenteren wanneer deze op de AFM-cantileverhouder wordt geplaatst ten opzichte van het oppervlak, zodat de gegroeide punt tijdens de beeldvorming loodrecht op het oppervlak staat. Pas de positie en focus van de SEM aan om een duidelijk zicht te krijgen op de punt van de cantilever, waar een scherpe koolstofnanopunt zal groeien.
  4. Gefocusseerde elektronenbundel-geïnduceerde afzetting (FEBID):
    1. Stel de depositieparameters in op de geselecteerde software (in dit geval SmartFIB), zoals straalstroom (I) en versnelling voltage (V), werkafstand (WD), vergroting, blootgestelde vorm, dosis-/afzettingstijd en verblijftijd. De volgende parameters werden gebruikt om amorfe koolstofuiteinden te laten groeien, die goede mechanische eigenschappen voor AFM-weergave presenteren, wat leidt tot lengtes rond 130 nm en stralen in het bereik van 2-4 nm:
      Selecteer vlek/stip als zichtbare vorm
      WD = 5 mm
      I = 78 pA, en V = 5 kV
      Verblijftijd = 1 μs
      Dosis = 0,05 nC en depositietijd = 0,64 s
      Vergroting = 20000x
    2. Begin het afzettingsproces om de punt te laten groeien door de elektronenstraal op een plek op de uitkragende punt te bestralen en tegelijkertijd het voorlopergas te injecteren en het gas te sluiten wanneer de afzetting is voltooid. In dit geval voert de SmartFIB-software dit automatisch uit na het instellen van het hierboven genoemde recept.
  5. Analyse na de groei: Voer SEM-beeldvorming na de groei uit om de nieuw gegroeide punt te onderzoeken en de kwaliteit en kenmerken (tipradius en lengte) te waarborgen. Wacht 1-2 minuten na de groei van de punt om er zeker van te zijn dat al het voorlopergas is weggepompt om herafzetting tijdens de SEM-beeldvorming te voorkomen. Verwijder de monsterhouder uit de SEM-kamer.
  6. Vrijdragende recycling: Als er in het SEM-systeem ook een gecombineerde gefocusseerde ionenstraal (FIB) is geïnstalleerd, verwijder dan een beschadigde of vuile eerder gegroeide punt door deze met het FIB-systeem te frezen met lage FIB-stromen (bijv. 1 pA, om schade aan de uitkraging te voorkomen). Voer de puntverwijdering uit door in een dwarsdoorsnede te frezen, van het uiteinde van de punt tot de basis, om te voorkomen dat de punt instort. Dit zal het mogelijk maken om een nieuwe opnieuw te laten groeien.

3. HS-AFM-hardware

  1. De beeldvormingsopstelling bestaat uit de op maat gemaakte PORT-kop5, 26 (Figuur 1A), hogesnelheidsscanner26 met een voorbeeldschijf met mica erop, compatibele controller27, hoogspanningsversterker met de hoge bandbreedte die nodig is voor hogesnelheidsbeeldvorming, AFM-basis en pc met de vereiste software om de eerder genoemde apparatuur te besturen27.
    OPMERKING: In dit geval zijn dit open-source componenten waarvoor plannen kunnen worden verkregen bij het Laboratory for Bio- and Nano-Instrumentation op EPFL27, 28. Het is ook mogelijk om workshops bij te wonen over het bouwen van de PORT-kop en controller29, en om de op LabView gebaseerde software te downloaden en te gebruiken.
  2. Plaats voorzichtig een ultrakorte cantilever (bijv. AC10DS of gelijkwaardig) onder de veerklem op de cantileverhouder met behulp van een pincet. Zorg ervoor dat de cantilever-chip vast en stabiel is.
  3. Voeg 50 μL vloeistof toe met behulp van een spuit via de linker vloeistoftoegangspoort, zoals aangetoond in figuur 1B. Terwijl de excitatielaser nog steeds uitgeschakeld is, lijnt u de uitleeslaser op de cantilever uit met behulp van de drie speciale knoppen op de AFM-kop die worden weergegeven in afbeelding 1A. Doe dit door de schaduw van de uitkraging op een wit papier te observeren en tegelijkertijd de som te maximaliseren (schaduwmethode). Centreer vervolgens de laserspot op de fotodiode met behulp van de twee speciale knoppen.
  4. Schakel de aandrijflaser in en lijn deze uit door het vakje Excitation Enable in Excitation VI aan te vinken, zodat deze de cantilever activeert en oscilleert. Toon het cantilever-excitatiesignaal en het cantilever-afbuigingssignaal op een aangesloten oscilloscoop. Als de afbuigingsoscillatie te laag is (of niet bestaat), kan het zijn dat de aandrijflaser erg ver van de uitkraging verwijderd is. Gebruik in dat geval de schaduwmethode en schakel de afbuiglaser uit om de uitlijning te vergemakkelijken. Maximaliseer de oscillatieamplitude met behulp van de instelknoppen van de aandrijflaser die worden weergegeven in afbeelding 1A.
  5. Om de amplitude van de cantileveroscillatie in PORT aan te passen, voert u in de overeenkomstige besturing van de software de piek-tot-piekspanning in die naar het besturingscircuit van de laserdiode wordt gestuurd (vanaf nu piek-tot-piek AC-ingang) in Excitatie VI. Om de laserdiode in het geleidingsregime te houden en dus te laseren, voegt u een gelijkspanning toe aan het besturingscircuit van de laserdiode (vanaf nu DC-offset-ingang), wat ook wordt gedaan vanuit een configuratiebox in Excitation VI. Beide hebben ook invloed op het laservermogen, dat kan worden gemeten met een laservermogensmeter en wordt gebruikt om de cantilever-oscillatieamplitude af te stemmen.
  6. Bepaal de maximale fotothermische excitatiefrequentie die op de cantilever kan worden toegepast, die lager moet zijn dan de resonantiefrequentie van de cantilever. Bepaal de resonantiefrequentie door middel van een thermische tune of een frequency sweep. De in deze studie gebruikte uitkragingen (AC10DS), waarvan de resonantiefrequentie in vloeistoffen ongeveer 400 kHz is (1 MHz in lucht)30, hebben een quasistatisch buiggebied onder 300 kHz5. Er moeten dus PORT-frequenties onder die limiet (ongeveer 100-200 kHz) worden gebruikt.
  7. Pas de beeldvormingsparameters en -instellingen voor PORT-snelheid en scansnelheid aan naar de vereiste waarden in respectievelijk de excitatie- en scan-Vis (de parameters die in dit artikel worden gebruikt, worden vermeld in de afbeeldingsbeschrijvingen). Zodra de installatie- en beeldvormingsparameters zijn geconfigureerd, voert u de vereiste beeldvormingsexperimenten uit om de moleculaire interacties te observeren en te volgen.
    OPMERKING: Aangezien AC10DS-draagarmen niet meer worden verkocht, moet mogelijk een alternatief zoals Fastscan D of BioLever31 worden gebruikt totdat een equivalent beschikbaar is.

4. Het verkrijgen van de juiste interactiecurves

  1. Benader in eerste instantie het monsteroppervlak in de contactmodus door op Start te klikken op de Z-controller VI die is ingesteld op Contactmodus.
    1. In deze modus komt de AFM-tip in direct contact met het monster. Zodra het oppervlak is bereikt, voert u een kracht-tegen-afstandscurve uit in Ramp VI om de kalibratie van de uitbuigingsgevoeligheid van de cantilever te verkrijgen.
    2. Schat ook de cantileverveerconstante, hetzij op basis van de specificaties van de cantileverleverancier (minder nauwkeurig), verkregen met een interferometer, of via een op thermische afstemming gebaseerde kalibratie na de kalibratie van de doorbuigingsgevoeligheid. Een nauwkeurige cantileverkalibratie is essentieel voor een nauwkeurige krachtregeling van het tipmonster.
  2. Nadat u de Z-piëzo volledig hebt teruggetrokken van het oppervlak waar de punt het oppervlak niet kan bereiken door op Omhoog te klikken in de Z-controller VI, schakelt u over naar de PORT-modus in de Z-controller VI en schakelt u de excitatielaser in het selectievakje Excitatie VI in. Stel om te beginnen de PORT-modus in om te werken op de gewenste frequentie in Excitation VI, in dit experimentele geval 100 kHz, met behulp van een AC10DS-cantilever.
  3. Registreer de cantilevervrije oscillatie dichtbij, maar niet tegen het oppervlak. Zet vervolgens de feedback in de Z-controller AAN in contact met het oppervlak om op te nemen en klik op Corrigeren om de oscillatie van de cantilever te verkrijgen wanneer de cantilever met tussenpozen in contact komt met het oppervlak, beide in nanometers. Trek de vrije oscillatiecurve af van de intermitterende contactcurve om de ware interactiecurve te verkrijgen, en converteer deze naar pN met behulp van de cantileverveerconstante (in dit geval 0,1 N/m).

5. HS-AFM beeldvorming

  1. Bereid een oplossing van Mg(CH3COO)2 voor met een concentratie van 10 mM. Spuit met behulp van een Hamilton-spuit 50 μL van de bereide 10 mM Mg(CH3COO)2-oplossing in het vloeistofkanaal van de vrijdragende houder, waardoor een druppel vloeistof ontstaat die de cantilever omhult.
  2. Benader de cantilever geleidelijk naar het oppervlak door op Start te klikken op de Z Controller VI. Zodra het oppervlak is gedetecteerd, zet u de feedback AAN en zoekt u de piek van de interactiecurve in de ORT-krachtcurven VI. Zoek het instelpunt met de laagste kracht dat een goede tracking mogelijk maakt (onder 300 pN om beschadiging van fragiele biomonsters te voorkomen).
  3. Stel de scangrootte in de Scan VI in op 800 nm bij 800 nm en de lijnsnelheid op 100 Hz. Scan het oppervlak door op de pijl Frame (omlaag) in Scan VI te klikken om de oppervlaktekwaliteit te controleren. Als er verontreinigingen worden gedetecteerd, lost u het probleem op door het oppervlak, de uitkraging en/of de vrijdragende houder schoon te maken voordat u verder gaat.
  4. Trek na het scannen de cantilever terug van het oppervlak door op Opnemen te klikken in de Z-controller VI. Verwijder de bufferoplossing uit het gat in de vrijdragende houder met een Hamilton-spuit om problemen met het dode volume te voorkomen.
  5. Bereid een verdunde DNA 3PS-oplossing uit deel 1 van het protocol. Injecteer 50 μl van de verdunde DNA 3PS-oplossing in het daarvoor bestemde kanaal van de cantileverhouder.
  6. Start het beeldvormingsproces door de stappen 5.2-5.3 te herhalen en een gebied van 800 nm bij 800 nm te scannen met een standaardlijnsnelheid van 100 Hz (256 lijnen × 256 pixels). Pas na de eerste scan de beeldvormingsgrootte en -snelheid in Scan VI aan op de gespecificeerde waarden voor verdere gegevensverzameling.
  7. Houd het instelpunt van de ingangskracht van de tip-sample-interactie in de Z Controller VI Setpoint-box op het laagste niveau dat nodig is voor een goede tracking (minder dan 300 pN) tijdens het beeldvormingsproces om beschadiging/verstoring van het monster te minimaliseren, tenzij anders aangegeven. Herhaal dit proces voor alle vereiste monstergebieden.

6. Beeldverwerking

  1. Stel de omgeving in voor het uitvoeren van de aangepaste Pygwy (Python voor Gwyddion) batchverwerkingscode, zodat Python en alle benodigde bibliotheken. Meer informatie is te vinden op de website van Gwyddion32 zijn correct op het systeem geïnstalleerd. Dit zorgt ervoor dat de code soepel draait en toegang heeft tot de benodigde functionaliteiten.
  2. Open de aangepaste Pygwy-batchverwerkingscode (op verzoek verstrekt). Dit biedt toegang tot de tools en functionaliteiten die nodig zijn voor beeldverwerking en -analyse.
  3. Begin met de beeldverwerking door een horizontale mediaanlijncorrectie op de afbeeldingen uit te voeren. Deze stap is bedoeld om eventuele onregelmatigheden of artefacten in de scanlijnen te verwijderen en ervoor te zorgen dat de volgende verwerkingsstappen gebaseerd zijn op nauwkeurige gegevens. Pas na het verwijderen van de achtergrond van het vliegtuig de lijncorrectie toe. Gebruik littekenverwijdering om de beelden verder te verbeteren door ongewenste vlekken of onvolkomenheden veroorzaakt door externe factoren te verwijderen. Deze stap verbetert het algehele visuele uiterlijk van de afbeeldingen.
  4. Verbeter de zichtbaarheid en het contrast van de afbeeldingen door de kleurhoogtekaart aan te passen. Dit zorgt ervoor dat interessante kenmerken duidelijk worden gevisualiseerd en opvallen in de afbeeldingen.
  5. Selecteer de verwerkte afbeeldingen die moeten worden gecombineerd tot een video. Bepaal de gewenste framesnelheid voor de video. Stel deze in dit geval in op 7 frames per seconde (fps).
  6. Bereken de duur van elk frame. Gebruik Fiji (ImageJ) om de verwerkte afbeeldingen te combineren tot een video. Zorg ervoor dat de framesnelheid en frameduur correct zijn ingesteld.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit onderzoek werd het dynamische assemblageproces van DNA 3-punts stermotieven tot stabiele eilanden met succes waargenomen met behulp van de mogelijkheden van de HS-PORT AFM. Deze techniek stelde ons in staat om de assemblage van deze structuren in realtime vast te leggen. In Figuur 2A,B krijgen we een helder beeld bij het scannen met respectievelijk 100 Hz en 200 Hz lijnsnelheden voor 100 kHz PORT-snelheid (scangrootte van 800 nm bij 800 nm). Dit komt overeen met respectievelijk 3,9 en 1,95 oscillatiecycli per pixel. Beeldvorming met hogere snelheden zonder gelijktijdige verhogingen van de PORT-snelheid die minimaal één oscillatiecyclus per pixel mogelijk zou maken, zal de beeldkwaliteit echter drastisch verminderen, zoals te zien is in figuur 2C (0,78 van een oscillatiecyclus per pixel). De beeldvormingssnelheid wordt beperkt door de snelheid waarmee de cantilever het oppervlak tast met de juiste tip-sample krachtregeling, aangezien de snelheid van de topografieverandering te snel wordt om te volgen met de bemonsteringssnelheid van het oppervlak.

Naast het instellen van een voldoende hoge PORT-snelheid, is het belangrijk dat de PORT-curves de informatie bevatten die nodig is om de krachten te beheersen. Vooral de hydrodynamische weerstand en de lage detectiebandbreedte kunnen de uitgeoefende kracht verdoezelen. Figuur 3 toont de uitkragende afbuiging op verschillende afstanden van het oppervlak van het monster en de excitatiefrequenties met behulp van een gemiddelde van 4096 curven om de ruis te verminderen. De blauwe curven in Figuur 3A (voor 100 kHz PORT-snelheid) en Figuur 3D (voor 500 Hz PORT-snelheid) geven de cantileverbeweging weer wanneer de cantilever zich ver van het oppervlak bevindt en vrij oscilleert (zonder het oppervlak te raken tijdens één oscillatiecyclus). De rode curven geven de uitbuiging van de cantilever aan wanneer de cantilever dicht bij het oppervlak oscilleert en met tussenpozen in contact komt met het oppervlak, waarbij het monster wordt onderzocht. Om de ware interactiecurve en dus de tip-steekproefinteractie te verkrijgen, trekken we de blauwe curve af van de rode curve om respectievelijk Figuur 3B,E te verkrijgen. Een voorbeeld van een duidelijke interactiecurve die nodig is voor niet-destructieve beeldvorming van biomonsters wordt weergegeven in figuur 3B. Deze configuratie leidt tot de goede beeldkwaliteit die wordt weergegeven in figuur 3C, waar de PORT-snelheid 100 kHz is. Naarmate we de excitatiefrequentie dicht bij de cantileverresonantie verhogen, verslechtert op een gegeven moment de feedbackregeling, zelfs wanneer de cantilever voldoende amplitude-oscillatie vertoont om los te komen van het oppervlak na het verhogen van het vermogen van de excitatielaser (Figuur 3E). Als de PORT-frequentie te dicht bij de cantileverresonantiefrequentie ligt, beperkt de cantileverresonantie de tijdrespons van de cantileverdynamiek. De uitkragende buiging geeft daarom niet langer nauwkeurig de interactie tussen punt en monster weer en de interactiecurve die we verkrijgen wordt verdoezeld. Dit leidt tot een verslechtering van de beeldkwaliteit, zoals weergegeven in Figuur 3F.

Een gecompromitteerde interactiecurve bij hogere PORT-frequenties kan ook optreden als gevolg van de verminderde bedieningsefficiëntie bij hogere frequenties33, wat momenteel een van de beperkende factoren is van commerciële hogesnelheids-AFM-cantilevers. Deze afname bereikt uiteindelijk een drempelniveau in de roll-off, waarbij een goede beeldvorming wordt belemmerd: de oscillatieamplitude kan onvoldoende zijn om los te komen van het oppervlak en de punt is altijd in contact, waardoor de monsterstructuren worden beschadigd. Om de afname van de amplitude bij hogere PORT-snelheden tegen te gaan, hebben we een toename van het laservermogen onderzocht. We gebruikten een PORT-kop die hogere laservermogens kan bereiken om dit effect beter waar te nemen. Het laservermogen van de excitatielaser, die we hebben gemeten met een vermogensmeter, werd opgedeeld in de DC- en AC-componenten. Het totale vermogen wordt geregeld door op de software de piek-tot-piekspanning (piek-tot-piek AC-ingang) en de gelijkspanning (DC-offset-ingang) aan te passen die naar het besturingscircuit van de laserdiode wordt gestuurd. Figuur 4A geeft de piek-tot-piek cantilever-oscillatieamplitude weer die het gevolg is van een verhoogde piek-tot-piek AC-ingang. Zoals verwacht correleert de oscillatieamplitude goed met de AC-ingangswaarde. Het is belangrijk op te merken dat deze piek-tot-piekamplitudes hoger zijn dan wat normaal wordt gebruikt in PORT-beeldvorming. Bij het afbeelden van fragiele monsters ligt de AC-amplitude in de orde van grootte van 10-30 nm. Figuur 4B toont de piek-tot-piek cantilever oscillatieamplitude voor verhoogde DC-offset-ingangen. De amplitude van de piek-tot-piek oscillatie blijft redelijk constant over het bereik van de DC-offsetspanning. We schrijven de kleine variaties toe aan niet-lineariteiten in de detectie. Afbeelding 4C toont de toename van de AC- en DC-laservermogenscomponenten als gevolg van de toenemende piek-tot-piek AC. Afbeelding 4D toont de toename van de AC- en DC-laservermogenscomponenten als gevolg van de toenemende DC-ingangsoffset.

De effecten van het verhogen van de piek-tot-piek AC-ingang en DC-offset-ingang werden afzonderlijk getest om de respectievelijke effecten op het totale vermogen en de oscillatieamplitude te bepalen. Een toename van het laservermogen zorgt ervoor dat het monster wordt verstoord, waarschijnlijk door temperatuurstijging, terwijl een toename van de oscillatieamplitude de impactkracht op het monster zal vergroten5. Het uitsluitend verhogen van de piek-tot-piek AC-ingang zal minder invloed hebben op de totale toename van het laservermogen, zoals weergegeven in Figuur 4C, en zal voornamelijk de amplitude van de cantileveroscillatie (en bijgevolg de impactkracht) verhogen, zoals weergegeven in Figuur 4A. Het verhogen van de DC-offset-ingang zal een groter effect hebben op de toename van het laservermogen, zoals weergegeven in Figuur 4D, die het monster verwarmt, maar een verwaarloosbaar effect heeft op de afbuigamplitude, zoals te zien is in Figuur 4B. Beeldvormingsresultaten worden weergegeven in figuur 4E,F. Figuur 4E toont DNA 3PS voor de laagste piek-tot-piek AC-input (linker afbeelding, blauw omcirkeld) en de hoogste piek-tot-piek AC-ingang (rechter afbeelding, rood omcirkeld), wat resulteert in monsterschade, vermoedelijk door de hogere krachten. Figuur 4F toont DNA 3PS voor de laagste DC-offset-ingang (linker afbeelding, blauw omcirkeld) en de hoogste DC-offset-invoer (rechter afbeelding, rood omcirkeld), waar structuren zijn beschadigd.

figure-results-1
Figuur 1: De HS-AFM-opstelling. (A) de PORT-kop op de scanner en de basis van de AFM, met de (i) knop voor het instellen van de uitleeslaserfocus op de cantilever, (ii) knop voor het aanpassen van de uitleeslaserpositie op de cantilever, (iii) knop voor het aanpassen van de horizontale positie van de laser op de fotodiode, (iv) knop voor het aanpassen van de verticale positie van de laser op de fotodiode, en (v) knoppen voor het aanpassen van de positie van de fotothermische aandrijflaser op de cantilever. (B) Een close-up van de uitkraging in de dwarsdoorsnede van de kop met de bemonsteringstrap, waarbij (vi) de veerklem is die de uitkraging vasthoudt. Het kanaal voor vloeistofinjectie is rood gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: DNA 3PS-monster afgebeeld met AC10 bij 100 kHz PORT-snelheid bij verschillende lijnsnelheden. (A) 100 Hz (3,9 oscillatiecycli per pixel), (B) 200 Hz (1,95 oscillatiecycli per pixel) en (C) 500 Hz (0,78 oscillatiecycli per pixel). De foto's zijn gemaakt op setpoints van 350 pN of minder. Schaal staaf 200 nm. Na beeldvorming werd een krachtcurve genomen om de doorbuigingsgevoeligheid te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Cantilever-afbuiging, interactiecurve en beeldkwaliteit bij 100 KHz en 500 kHz PORT-snelheden. (A) Cantilever-afbuiging (cantilever-vrije oscillatie dichtbij maar niet rakend het oppervlak in blauw, en de oscillatie van de cantilever wanneer de cantilever met tussenpozen in contact komt met het oppervlak in rood), (B) interactiecurve en (C) respectievelijke beeldkwaliteit voor 100 kHz PORT-snelheid. (D) Cantilever-afbuiging (cantilever-vrije oscillatie dichtbij maar niet rakend het oppervlak in blauw, en de oscillatie van de cantilever wanneer de cantilever met tussenpozen in contact komt met het oppervlak in rood), (E) interactiecurve en (F) respectievelijke beeldkwaliteit voor 500 kHz PORT-snelheid. De foto's zijn gemaakt met een lijnsnelheid van 100 Hz. Schaalbalk 200 nm. Na beeldvorming werd een krachtcurve genomen om de doorbuigingsgevoeligheid te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Effect van piek-tot-piek AC-ingangsspanning DC-offset ingangsspanning. Effect van het verhogen van de (A) piek-tot-piek AC-ingangsspanning en (B) DC-offset-ingangsspanning op de piek-tot-piek-oscillatie van de cantilever. Effect van het verhogen van (C) piek-tot-piek AC-ingangsspanning en (D) DC-offset-ingangsspanning op AC- en DC-laservermogen. Beeldkwaliteit op minimaal (blauw omcirkeld) en maximaal (rood omcirkeld) (E) piek-tot-piek AC-ingangsspanning en (F) DC-offset-ingangsspanning. Bij het verhogen van de piek-tot-piek AC-ingangsspanning werd de DC-offset-ingangsspanning op 600 mV gehouden. Bij het verhogen van de DC-offset-ingangsspanning werd de piek-tot-piek AC-ingangsspanning op 200 mV gehouden. De integriteit van het monster komt in het gedrang voor de configuratie met hoog vermogen. De PORT-snelheid werd op 100 kHz gehouden en de lijnsnelheid op 100 Hz. Schaalbalk 200 nm. Na beeldvorming werd een krachtcurve genomen om de doorbuigingsgevoeligheid te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het afbeelden van delicate biologische monsters, zijn off-resonantie tikkende beeldvormingsmodi in AFM bijzonder nuttig, omdat ze de tip-sample interactiekrachten10 direct kunnen controleren. Onder hen valt de PORT-modus op door de hogere oscillatiesnelheden die het kan bereiken, waardoor hogere scansnelheden mogelijk zijn. Omdat PORT de cantilever direct en alleen met een laser bedient, maakt het excitatie mogelijk op veel hogere frequenties dan conventionele off-resonantie tapmodi, vooral bij gebruik van ultrakorte cantilevers met hoge resonantiefrequenties5. Bij het gebruik van PORT voor HS-AFM moet men echter voorzichtig zijn met de beeldvormingsparameters om een goede beeldkwaliteit te bereiken.

Zoals weergegeven in figuur 2, zal het verhogen van de scansnelheden zonder tegelijkertijd de PORT-snelheden te verhogen, leiden tot beeldvorming van slechte kwaliteit. Ten eerste zullen PORT-snelheden die resulteren in minder dan één oscillatiecyclus per pixel de beeldkwaliteit drastisch verminderen. De beeldvormingssnelheid wordt inherent beperkt door de snelheid waarmee de cantilever het oppervlak tast met de juiste krachtregeling van het tipmonster. In PORT werkt de feedbackregeling discreet aan het einde van elke oscillatiecyclus34. Deze beperkte bemonsteringsfrequentie veroorzaakt een pure vertraging in de feedbacklus, waardoor de haalbare feedbackbandbreedte wordt beperkt. Als de snelheid van de topografie te snel wordt om te volgen met de PORT-bemonsteringssnelheid, kan de topografie niet langer nauwkeurig worden gedetecteerd of gevolgd door de feedbacklus. De PORT-snelheid moet daarom worden verhoogd om het monster bij hogere oppervlaktesnelheden getrouw op te lossen. De resonantiefrequentie van de cantilever beperkt echter intrinsiek de maximale PORT-snelheid die we kunnen gebruiken. Als de PORT-snelheid dicht bij de resonantiefrequentie van de cantilever ligt, geeft de doorbuiging gemeten met de optische hefboommethode niet langer getrouw de tip-samplekrachten weer. Om een goede tip-sample interactiecurve te verkrijgen, moeten zowel de mechanische bandbreedte van de cantilever als de elektrische bandbreedte van het AFM-systeem groot genoeg zijn om Fourier-componenten van de afbuigingscurve te detecteren die meerdere keren die van de PORT-frequentie zijn. Als een van deze bandbreedtes te laag is, toont de interactiecurve niet langer de eenzijdige afkapping (Figuur 3A), maar eerder een sinusvormig gedrag (Figuur 3D) dat de werkelijke interactie met de tipsteekproef verdoezelt (Figuur 3E). Dit leidt tot een slechte krachtbeheersing in de beeldvorming (Figuur 3F). Zelfs kleinere cantilevers met een hoge resonantiefrequentie, die tegelijkertijd lage veerconstanten hebben, zijn daarom nodig om de PORT-snelheid verder te verhogen. Dergelijke hoge PORT-snelheden en scansnelheden vormen een uitdaging voor AFM-elektronica, die een zorgvuldig software- en elektronisch ontwerp vereist met de vereiste hoge bandbreedtes en geoptimaliseerde digitale signaalverwerkingsstrategieën.

Een van de voordelen van PORT in vergelijking met het aftappen van modus high-speed AFM is dat de oppervlaktebemonsteringssnelheid kan worden afgestemd. In tapmodus AFM wordt de oppervlaktebemonsteringssnelheid gegeven door de resonantiefrequentie van de cantilever. Wanneer we in PORT werken ver onder de cantilever-resonantiefrequentie, gaan we ervan uit dat elke oppervlaktebemonstering een geldig gegevenspunt oplevert. Als zodanig wordt de PORT-detectiebandbreedte gegeven door de Nyquist-frequentie met de helft van de PORT-snelheid. In het geval van de tapmodus wordt de detectiebandbreedte gegeven door f0/2Q35. Met de nieuwste ontwikkelingen op het gebied van PORT kunnen we de PORT-snelheid geleidelijk verhogen tot aan de resonantiefrequentie. In die situatie worden PORT en tapmodus bijna identiek, omdat PORT bij die frequenties de interactie tussen cantilever en tip sample niet nauwkeurig kan detecteren, zoals weergegeven in Figuur 3E. Bij gebruik op de resonantiefrequentie wordt de grotere oscillatieamplitude van PORT in vergelijking met de tapmodus een nadeel. Het doel voor het verhogen van de PORT-beeldvormingssnelheid blijft daarom om de cantilever-resonantiefrequentie te verhogen om de werking te behouden met de PORT-snelheid ver genoeg onder de resonantiefrequentie.

Naarmate we de PORT-snelheid verhogen om snellere scansnelheden mogelijk te maken, zullen we te maken krijgen met een ander probleem dat inherent is aan fotothermische cantilever-excitatie: bij hogere frequenties neemt de oscillatieamplitude af als gevolg van een afname van de fotothermische excitatie-efficiëntie, uiteindelijk tot het punt dat we het laservermogen moeten verhogen, wat resulteert in een stijging van de temperatuur van het monster. Het verhogen van de PORT-snelheid zal het balanceren van laservermogen en oscillatieamplitude belemmeren, aangezien een hoger excitatievermogen nodig is om te compenseren voor een verminderde bedieningsefficiëntie die leidt tot monsterschade. Bij hogere niveaus van laservermogen konden we het monster niet langer waarnemen, ondanks het gebruik van het laagst mogelijke instelpunt voor de kracht (rechter panelen in figuren 4E,F). We moeten voorzichtig zijn met hoe we de cantilever-oscillatieamplitude zullen vergroten en het laservermogen zullen vergroten. Er zijn twee parameters die we kunnen afstemmen om het laservermogen te vergroten. Ten eerste de piek-tot-piek AC-ingang die het sinusvormige signaal regelt dat naar de laserdiode wordt gestuurd om de geleverde laservermogensintensiteit sinusvormig te variëren. Ten tweede de DC-offset-ingangsspanning die de laserdiode op het geleidingsregime houdt en dus lasert. Een toename van de eerste moet worden gecombineerd met een toename van de tweede, aangezien een toename van de amplitude van het AC-signaal dat naar de laser wordt gestuurd, een verhoging van de DC-spanning vereist om te voorkomen dat de laserdrempel wordt overschreden. Alleen de piek-tot-piek AC-ingang beïnvloedt echter de cantilever-oscillatieamplitude, zoals weergegeven in figuur 4A. DC-spanningen leiden niet tot variaties in oscillatie-amplitudes (Figuur 4B). Dus als we sinusvormige aandrijving willen, moeten we de gelijkspanning instellen op de minimumspanning die de diodelaser in het laserregime laat zijn. Als alternatief kunnen we de opwarming minimaliseren door de laserdiode tijdens elke oscillatiecyclus periodiek uit en weer aan te zetten in plaats van een volledige sinusvormige aandrijvingte gebruiken 5. De temperatuuroscillatie die nodig is om de cantilever te activeren bij fotothermische excitatie kan efficiënter worden bereikt door de laser gedurende een deel van de cyclus uit te schakelen, waardoor de temperatuur van de cantilever daalt en dus leidt tot buiging van de cantilever. Dit minimaliseert de geleverde energie aan de cantilever en het monster en verlaagt zo de totale temperatuur in de omgeving, waardoor de schade door de hitte van het monster wordt beperkt.

In deze studie tonen we de limieten van beeldvormingsparameters in HS-PORT die schade door warmtemonsters en een goede feedbackregeling voorkomen. Het begrijpen van deze limieten zal helpen om optimaal gebruik te maken van de huidige staat van de PORT AFM-methode, waardoor een betere controle over de interactie tussen tip en monster mogelijk is en de oorspronkelijke staat van de DNA-motieven in deze metingen behouden blijft. Dankzij de hoge scansnelheden die werden bereikt in combinatie met een goede feedbackcontrole, stelde PORT ons in staat om duidelijke en gedetailleerde beelden te verkrijgen van het DNA 3PS en hun interacties 7,8,36. Met de mogelijkheid van verhoogde beeldvormingssnelheid en directe tip-sample force control23, zijn we in staat om de groei en reorganisatie van biomoleculaire assemblages nauwkeuriger te volgen en gedetailleerde dynamiek te observeren.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Raphael Zingg voor zijn hulp bij het programmeren van het Python-script voor de verwerking van afbeeldingsreeksen. GEF erkent financiering van H2020 - UE Framework Programme for Research & Innovation (2014-2020); ERC-2017-CoG; InCel; Projectnummer 773091. VC erkent dat dit project financiering heeft ontvangen van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 754354. Dit onderzoek werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation via subsidie 200021_182562.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AC10DSOlympusBL-AC10FS-A2Uit productie 
Biometra Compact XS/SBiometra GmbH846-025-199 Elektroforese  unit
Biometra TRIOBiometra GmbH207072Xthermocycler voor annealing
Custom AFM setupLaboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale LausanneVerkrijgbaar via Laboratory for Bio-Nano Instrumentation
EDTAITW ReagentsA5097In annealing buffer
Laser Power MeterThorlabsPM100DDigitaal handbediend optisch Vermogens- en energiemeterconsole
Lively 3AP Power Supply, MP-310Major ScienceMP-310Elektroforese voeding
MgAc2ABCR GmbHAB544692In annealing buffer
TBEThermo Scientific327330010Lopende buffer voor elektroforese
TRISBio-Rad1610719In annealing buffer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ando, T. High-speed atomic force microscopy and its future prospects. Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).
  2. Uchihashi, T., Scheuring, S. Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes. Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).
  3. Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy. FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).
  4. Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action. Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).
  5. Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6. Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).
  6. Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9, 4983(2018).
  7. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).
  8. Fukuda, S., Ando, T. Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes. Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).
  9. Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).
  10. PeakForce Tapping. , Available from: https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html (2023).
  11. Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021). , Springer. Singapore. 671-679 (2022).
  12. Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties. Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).
  13. Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation. Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).
  14. De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. Jumping mode scanning force microscopy. Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).
  15. Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. Scanning attractive force microscope using photothermal vibration. Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).
  16. Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).
  17. Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif. Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).
  18. Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles. Molecules. 26 (6), 1502(2021).
  19. He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays. Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).
  20. Lipid-DNA Method. , Available from: http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm (2023).
  21. Pyne, A. L. B., et al. Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides. Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).
  22. Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).
  23. Nievergelt, A. P., et al. Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control. Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).
  24. Caroprese, V., et al. Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity. bioRxiv. , (2023).
  25. Welcome to Mao Group. , Available from: https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html (2023).
  26. Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag. 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).
  27. SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/ (2023).
  28. Open Hardware. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/ (2023).
  29. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/ (2023).
  30. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW (2023).
  31. BioLever. AppNano. , Available from: https://www.appnano.com/product-page/biolever (2023).
  32. Python Scripting. , Available from: http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html (2023).
  33. Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).
  34. Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling. arXiv. , (2023).
  35. Giessibl, F. J. Advances in atomic force microscopy. Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).
  36. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). Encyclopedia of Biophysics. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

High speed AFMPORT moduszelfassemblage imagingcantilever actuatiebiomoleculaire assemblagereal time imagingkrachtcurve analyse

Gerelateerde artikelen