Karakterisering van multidrug effluxsystemen in Acinetobacter baumannii met behulp van een efflux-deficiënte bacteriestam en een single-copy genexpressiesysteem

Summary

We beschrijven een eenvoudige procedure voor de single-copy chromosomale complementatie van een effluxpompgen met behulp van een mini-Tn7-gebaseerd expressiesysteem in een gemanipuleerde efflux-deficiënte stam van Acinetobacter baumannii. Dit nauwkeurige genetische hulpmiddel maakt gecontroleerde genexpressie mogelijk, wat essentieel is voor de karakterisering van effluxpompen in multiresistente pathogenen.

Abstract

Acinetobacter baumannii wordt erkend als een uitdagende Gram-negatieve ziekteverwekker vanwege de wijdverbreide resistentie tegen antibiotica. Het is van cruciaal belang om de mechanismen achter deze weerstand te begrijpen om nieuwe en effectieve therapeutische opties te ontwerpen. Helaas wordt ons vermogen om deze mechanismen in A. baumannii te onderzoeken belemmerd door het gebrek aan geschikte genetische manipulatie-instrumenten. Hier beschrijven we methoden voor het gebruik van een chromosomaal mini-Tn7-gebaseerd systeem om genexpressie met één kopie te bereiken in een A. baumannii-stam die geen functionele RND-type effluxmechanismen heeft. Het inbrengen van één kopie en de expressie van de induceerbare effluxpomp zijn vrij voordelig, aangezien de aanwezigheid van RND-operonen op plasmiden met een hoog aantal kopieën vaak slecht wordt verdragen door bacteriële cellen. Bovendien helpt het opnemen van recombinante mini-Tn7-expressievectoren in het chromosoom van een surrogaat A. baumannii-gastheer met verhoogde effluxgevoeligheid interferentie van andere effluxpompen te omzeilen. Dit systeem is niet alleen waardevol voor het onderzoeken van niet-gekarakteriseerde bacteriële effluxpompen, maar ook voor het beoordelen van de effectiviteit van potentiële remmers die zich op deze pompen richten.

Introduction

Acinetobacter baumannii is een ziekteverwekker met de hoogste prioriteit van de Wereldgezondheidsorganisatie vanwege zijn alomvattende resistentie tegen alle klassen antibiotica¹. Het is een opportunistische ziekteverwekker die vooral gehospitaliseerde, gewonde of immuungecompromitteerde mensen treft. A. baumannii ontwijkt antibiotica grotendeels via effluxpompen, de meest relevante is de Resistance-Nodulation-Division (RND)-familie van exporteurs². Door te begrijpen hoe deze effluxpompen mechanistisch werken, kan men gerichte therapeutische opties ontwikkelen.

Een veel voorkomende manier waarop cellulaire processen specifiek kunnen worden onderscheiden, is door middel van genetische manipulatie. De instrumenten die beschikbaar zijn voor genetische studies van A. baumannii zijn echter beperkt, en om het experimentele ontwerp verder te verwarren, zijn klinische isolaten vaak resistent tegen de antibiotica die routinematig worden gebruikt voor selectie bij genetische manipulaties³. Een tweede hindernis die men tegenkomt bij het specifiek bestuderen van effluxpompen is dat ze strikt worden gereguleerd - vaak door onbekende factoren - waardoor het moeilijk is om een enkele pomp nauwkeurig te isoleren en functie toe te schrijven⁴. Omdat we deze noodzaak zagen om de onderzoekstoolbox uit te breiden, ontwikkelden we een mini-Tn7-gebaseerd, single-copy-insertion, induceerbaar expressiesysteem dat een Flp-recombinasedoelcassette (FRT) bevat, waarmee de selectiemarker ^5,6,7 kan worden verwijderd (Figuur 1). Dit elegante kloon- en expressiesysteem, dat voor het eerst werd ontwikkeld voor Pseudomonas ^8,9,10, werd gebruikt om enkelvoudige efluxpompcomplementen te genereren in een RND-effluxpomp-deficiënte stam van A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: hierna A. baumannii AB258) genoemd die we¹¹. Omdat men in staat is om één effluxpomp tegelijk te bestuderen en de bacteriële cellen niet te overweldigen met expressie met hoge kopieën (zoals over het algemeen wordt gezien bij op plasmiden gebaseerde expressiesystemen), kan men beter leren over de kritische, fysiologische aspecten van elke effluxpomp met minimale interferentie en minder complicaties.

Dit artikel beschrijft hoe het mini-Tn7-systeem kan worden gebruikt om een verwijderd gen van belang, RND-effluxpomp adeIJK, aan te vullen in het chromosoom van A. baumannii AB258 door middel van een reeks ongecompliceerde stappen die in de loop van 9 dagen worden uitgevoerd⁷. De eerste reeks stappen herintroduceert de verwijderde effluxpompgenen die zijn gekloond in het mini-Tn7-gebaseerde insertieplasmide (Figuur 2A) op de enkele attTn7-insertieplaats stroomafwaarts van het goed geconserveerde glmS-gen (Figuur 3A). Dit proces wordt vergemakkelijkt door een niet-replicatief helperplasmide (Figuur 2B) dat codeert voor de transposasegenen die nodig zijn voor Tn7-gestuurde insertie. De tweede reeks stappen maakt gebruik van een excisieplasmide (Figuur 2C) voor Flp-recombinase-gemedieerde verwijdering van het gentamicine-gen geflankeerd door FRT-plaatsen (Figuur 3B) om een ongemarkeerde stam te creëren. Hoewel dit systeem wordt gebruikt om de essentiële rollen en mogelijke remmers van RND-effluxpompen met betrekking tot antibioticaresistentie op te helderen, kan het worden gebruikt om elk interessant gen te onderzoeken.

Protocol

1. Experimentele voorbereiding

1. Zuiver het plasmide pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (insertieplasmide, figuur 2A) met het gen van belang.
   OPMERKING: Hier is het gen van belang adeIJK. De uiteindelijke plasmideconcentratie moet ≥100 ng/μL zijn.
2. Zuiver het helperplasmide (pTNS2)⁹ en het excisieplasmide (pFLP2^ab)⁶ (respectievelijk figuur 2B,C), idealiter tot een uiteindelijke plasmide-DNA-concentratie van ≥100 ng/μL.
3. Bereid 50 ml steriel ultrapuur water en 25 ml steriele LB (Lennox) bouillon (zie Materiaaltabel).
4. Bereid minimaal 10 LB-agarplaten, elk met de volgende additieven: gewoon (geen toevoegingen), gentamicine (Gm) in een dosis van 50 μg/ml, carbenicilline (Cb) in een dosis van 200 μg/ml (voor selectie via het ampicillineresistentiegen) en 5% sucrose (zie materiaaltabel).
5. Streep de stam uit die moet worden gebruikt voor het inbrengen op LB-agar en incubeer gedurende 16-18 uur bij 37 °C. Hier wordt A. baumannii AB258 gebruikt.
   LET OP: Dit protocol moet zoveel mogelijk in een steriele omgeving worden uitgevoerd door gebruik te maken van een bunsenbrander op de werkbank of een biologische veiligheidskast. Alle verbruiksartikelen (pipetpunten, inoculatielussen, microfuge-buisjes, enz.) moeten steriel zijn.

2. Voorbereiding van de cultuur

1. Inoculeer een enkele kolonie A. baumannii AB258 in 4 ml LB-bouillon in een steriele kweekbuis van 13 ml met behulp van een steriele inoculatielus of steriele houten inoculatiestok.
   OPMERKING: Een enkele kweek van 4 ml wordt gebruikt voor één monster en één controle. Verhoog het aantal culturen, afhankelijk van het aantal benodigde monsters.
2. Incubeer een nacht bij 37 °C met schudden (250 rpm).
3. Zet een fles steriel gedestilleerd water (25-50 ml) 's nachts op 4 °C voor gebruik in stap 3.

3. Bereiding van elektrocompetente cellen

1. Plaats alle steriele microfugebuisjes van 1,5 ml (twee per cultuur) en steriele elektroporatiecuvetten (twee per cultuur) op ijs (zie materiaaltabel). Bewaar de monsters tijdens de procedure zoveel mogelijk op ijs.
2. Plaats de fles steriel water die bij 4 °C is bewaard op ijs.
3. Breng 1,5 ml van de bacteriecultuur 's nachts over in een van de 1,5 ml microfuge-buisjes.
4. Centrifugeer op 13.000 x g gedurende 2 minuten om de cellen te pelleteren.
   OPMERKING: Centrifugeren zou idealiter worden uitgevoerd bij 4 °C, maar centrifugeren bij kamertemperatuur is acceptabel en niet schadelijk.
5. Verwijder met een pipet van 1 ml al het supernatans zonder de celpellet te verstoren.
6. Voeg nog eens 1,5 ml bacteriecultuur toe aan dezelfde microfuge-buis. Centrifugeer op 13.000 x g gedurende 2 minuten en verwijder vervolgens al het supernatant.
7. Herhaal stap 3.6 nog een laatste keer met de resterende 1 ml kweek.
8. Voeg 1 ml ijskoud steriel water toe aan de celpellet en resuspendeer met voorzichtig pipetteren totdat de pellet niet meer op de bodem van de microfuge-buis zit.
9. Centrifugeer de geresuspendeerde cellen bij 13.000 x g gedurende 2 min.
10. Verwijder het supernatans voorzichtig met een pipet van 1 ml. Giet het supernatant niet af, vooral niet in de volgende wasstappen wanneer de cellen de neiging hebben om minder compacte pellets te vormen.
11. Herhaal deze wasstap met ijskoud steriel water, stap 3.8 tot en met stap 3.10, nog twee keer.
12. Resuspendeer de uiteindelijke celpellet voorzichtig in 200 μL ijskoud steriel water.
13. Breng 100 μL van de uiteindelijke celsuspensie over in de tweede ijskoude microfugebuis van 1,5 ml. Dit tweede aliquot wordt de negatieve controle voor elektroporatie. Bewaar de celmonsters op ijs.

4. Elektroporatie

1. Verwarm 1 ml LB-bouillon en een LB + Gm⁵⁰ agarplaat (bereid in stap 1.4) voor elk monster en controleer in een statische incubator die is ingesteld op 37 °C.
2. Voeg in een gecombineerd volume van 5 μL of minder 100-200 ng van het pTNS2-helperplasmide en het pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK-insertieplasmide toe aan een aliquot elektrocompetente cellen.
3. Meng met zacht tikken met de vingertoppen om ervoor te zorgen dat de plasmiden volledig worden gemengd met de elektrocompetente cellen zonder luchtbellen te introduceren.
4. Voeg een gelijkwaardige hoeveelheid steriel gedestilleerd water toe aan de negatieve controlecel aliquot en meng voorzichtig zoals hierboven.
5. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten op ijs.
6. Breng het hele celmonster over in een ijskoude elektroporatiecuvet en plaats de cuvet vervolgens terug op ijs. Herhaal dit voor het monster van de negatieve controlecel.
7. Elektropoleren van het celmonster.
   1. Schakel de elektroporator in en stel deze in op 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (zie Materiaaltabel).
   2. Veeg het oppervlak van de cuvet af met een zachte tissue om aanhangend ijs of vocht te verwijderen.
   3. Steek de cuvet in de elektroporator en geef de elektrische schok af.
   4. Voeg onmiddellijk 0,9 ml voorverwarmde LB-bouillon toe aan de cellen in de cuvet en pipetteer voorzichtig op en neer om de cellen met de media te mengen.
   5. Breng de hele celsuspensie over in een nieuwe microfuge-buis van 1,5 ml (kamertemperatuur).
   6. Controleer de tijdconstante waarde op de elektroporator; Voor de beste resultaten moet deze waarde tussen 4 en 6 liggen.
8. Herhaal de elektroporatieprocedure (stappen 4.7.1 tot en met 4.7.6) voor het negatieve controlecelmonster.
9. Incubeer de geëlektropoleerde monsters bij 37 °C gedurende 1 uur bij 250 tpm om celherstel mogelijk te maken.
10. Verspreid met behulp van een inoculatieverspreider 100 μL van elk geëlektropoleerd celmonster op een voorverwarmde LB + Gm⁵⁰ agarplaat.
    1. Centrifugeer de resterende monsters gedurende 2 minuten bij 13.000 x g om de cellen te pelleteren.
    2. Nadat u al het supernatans met een pipet hebt verwijderd, resuspendeert u de cellen in 100 μL LB-bouillon.
    3. Verdeel elk volledig monster over afzonderlijke voorverwarmde LB + Gm⁵⁰ agarplaten.
       OPMERKING: De efficiëntie van elektroporatie kan afhankelijk zijn van de spanning. Wanneer een stam voor de eerste keer wordt geëlektropoleerd, kan het informatief zijn om verschillende volumes, of zelfs verdunningen, van het elektroporatiemonster uit te brengen om ervoor te zorgen dat de resulterende platen geïsoleerde kolonies hebben.
11. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 16-18 uur.

5. Selectie van getransformeerde kolonies voor PCR-gebaseerde screening

1. Controleer de elektroporatieplaten. De negatieve controle mag geen kolonies hebben; Het monster moet verschillende kolonies hebben.
   OPMERKING: Platen met kolonies kunnen bij deze stap en bij alle volgende stappen waarbij agarplaten met kolonies of pleisters worden geproduceerd, maximaal 3 dagen bij 4 °C worden bewaard voordat ze verder gaan.
2. Pak met steriele tandenstokers tot 10 enkele kolonies van de LB + Gm⁵⁰ agarplaten en plak ze op een verse LB + Gm⁵⁰ agarplaat.
3. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 16-18 uur.

6. Verificatie van chromosomale insertie door middel van kolonie-PCR

1. Haal de LB + Gm⁵⁰ agarplaten met de gepatchte kolonies uit de broedmachine.
2. Verwijder met een steriele tandenstoker of steriele pipetpunt een kleine portie (ongeveer zo groot als een grote kolonie) uit een pleister in 20 μL steriel gedestilleerd water in een PCR-buisje van 0,2 ml; goed mengen. Het watermonster moet zichtbaar troebel worden als de cellen uit de tandenstoker vrijkomen. Bereid een willekeurig aantal monsters voor dat moet worden gescreend, maar 6 zou voldoende moeten zijn.
3. Incubeer het PCR-buisje met de bacteriële suspensie bij 100 °C gedurende 5-10 minuten.
4. Gebruik een minicentrifuge (zie Materiaaltabel) om het monster gedurende 2 minuten op de vaste maximale snelheid te laten draaien om celresten te pelleteren.
5. Breng het supernatans over in een nieuw PCR-buisje van 0,2 ml en plaats het op ijs. Dit monster bevat het sjabloon-DNA voor de PCR-reactie.
   OPMERKING: Dit sjabloon-DNA kan worden opgeslagen bij -20 °C voordat verder wordt gegaan met PCR.
6. Bereid een PCR-reactiemengsel met 1x polymerasebuffer, 200 μM dNTP's, 0,18 μM ABglmS2_F_New voorwaartse primer, 0,18 μM Tn7R omgekeerde primer (tabel 1), 1 U Taq-DNA-polymerase en 1 μL van het bereide sjabloon-DNA in een totaal volume van 25 μL. Bereid een no-template control (NTC) voor, met inbegrip van al het DNA behalve het sjabloon (zie Materiaaltabel).
7. Voer de reactiecondities in een thermische cycler in: 95 °C gedurende 2 min; 95 °C gedurende 30 s, 49 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s gedurende in totaal 35 cycli; 72 °C gedurende 10 min; 12 °C vasthouden. Voer de voorbeelden uit.
8. Na toevoeging van DNA-laadkleurstof tot een eindconcentratie van 1x, laadt u 10 μL van elke PCR-reactie op een agarosegel van 2% en laat u deze gedurende 40 minuten op 80 V draaien. De verwachte amplicongrootte voor dit primerpaar is 382 bp. De NTC zou geen bands moeten hebben.
9. Identificeer de monsters die het verwachte PCR-product hebben geproduceerd. Bereid een streepplaat voor op LB + Gm⁵⁰ agarplaten van een van de PCR-positieve pleisters; incubeer bij 37 °C gedurende 16-18 uur. Het doel is om een plaat met enkele kolonies te genereren voor de bereiding van een glycerolvoorraad om deze gemarkeerde stam te behouden en als uitgangspunt voor het creëren van een niet-gemarkeerde stam (hieronder beschreven).

7. Verwijdering van de Gm^R-marker met behulp van pFLP2^ab

1. Volg de procedure vermeld in stap 2: Kweekvoorbereiding. Het monster dat wordt gebruikt om de nachtcultuur te bereiden, is een enkele kolonie van de LB + Gm⁵⁰ agarplaten die zijn voorbereid om discrete kolonies te genereren in stap 6.9.
2. Volg de procedure vermeld in stap 3: Bereiding van elektrocompetente cellen. Bereid de cellen van de nachtkweek voor op elektroporatie.
3. Volg de procedure vermeld in stap 4: Elektroporatie. Hier is het plasmide dat in de cellen moet worden geïntroduceerd pFLP2^ab (100-200 ng), dat het gentamicine-resistentiegen zal verwijderen, naast het chromosomaal ingebrachte gen van belang.
4. Nadat de cellen gedurende 1 uur zijn hersteld (stap 4.9), verdeel 100 μl van het geëlektropoleerde celmonster op een voorverwarmde LB + Cb²⁰⁰ agarplaat (bereid in stap 1.4). Deze selectiedruk zorgt ervoor dat alleen cellen die het pFLP2 ab-excisieplasmide herbergen, zullen groeien.
5. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 16-18 uur.
6. Controleer de plaat op kolonies. De negatieve controleplaat mag geen kolonies hebben; de LB + Cb²⁰⁰ agar-monsterplaat moet verschillende kolonies hebben.
7. Gebruik steriele tandenstokers om tot 20 geïsoleerde kolonies te kruisen op een LB + Cb²⁰⁰ agarplaat en een LB + Gm⁵⁰ agarplaat.
8. Incubeer de platen gedurende 16-18 uur bij 37 °C.
9. Controleer de platen op vlekken. Bij klonen die groeien op de LB + Cb²⁰⁰ agarplaat maar niet op de LB + Gm⁵⁰ agarplaat is het gentamicine-resistentiegen verwijderd uit de oorspronkelijke insert.
10. Selecteer de pleisters die carbenicillineresistent zijn en gentamicine die vatbaar zijn voor strepen op individuele LB-agarplaten aangevuld met 5% (w/v) sucrose, waardoor het pFLP2-abplasmide uit de bacteriën wordt verdreven. Kies maximaal 10 kolonies.
11. Incubeer de platen gedurende 16-18 uur bij 37 °C.
12. Controleer de platen op kolonies.
13. Als laatste bevestiging van het verlies van pFLP2 ab-plasmide, kruis je 4-6 geïsoleerde kolonies van de 5% sucroseplaten op een LB + Cb²⁰⁰ agarplaat en een LB-agarplaat.
14. Incubeer de platen gedurende 16-18 uur bij 37 °C.
15. Kies een kloon die groeit op de LB-agarplaat en die carbenicilline gevoelig is voor de bereiding van een glycerolvoorraad om deze ongemarkeerde stam te behouden.
    1. Genetische verificatie van de niet-gemarkeerde stam kan worden uitgevoerd met kolonie-PCR (stap 6: Chromosomale insertie verifiëren door kolonie-PCR) met behulp van de primers die zich richten op het gentamicine-resistentiegen.
    2. Bereid een PCR-reactiemengsel met 1x polymerasebuffer, 200 μM dNTP's, 0,18 μM Gm_F voorwaartse primer, 0,18 μM Gm_R omgekeerde primer (tabel 1), 1 U Taq-DNA-polymerase en 1 μL van het bereide sjabloon-DNA in een totaal volume van 25 μL. Bereid een no-template control (NTC) voor, met inbegrip van al het DNA behalve het sjabloon, en een positieve controle met behulp van DNA van de gemarkeerde stam.
    3. Voer de reactiecondities in een thermische cycler in: 95 °C gedurende 2 min; 95 °C gedurende 30 s, 50 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 40 s gedurende in totaal 35 cycli; 72 °C gedurende 10 min; 12 °C vasthouden. Voer de voorbeelden uit.
    4. Na toevoeging van DNA-laadkleurstof tot een eindconcentratie van 1x, laadt u 10 μL van elke PCR-reactie op een 1% agarosegel en laat u deze gedurende 40 minuten op 80 V draaien. De verwachte amplicongrootte voor dit primerpaar is 525 bp. De positieve controle moet één band hebben; de samples en de NTC mogen geen banden hebben.

Results

De chromosomale insertieprocedure duurt in totaal slechts 2 uur gedurende 3 dagen om een resultaatkolonie te zien groeien op een selectieve agarplaat (Figuur 1A-C). Het verwachte aantal kolonies op de transformatieplaat is afhankelijk van de stam: men kan 20-30 of zelfs honderden kolonies zien, aangezien het inbrengen van Tn7 op Tn7-locaties specifiek en efficiënt is⁹. Door transformatieplaatkolonies op selectieve media te patchen (Figuur 4A) blijft de getransformeerde stam behouden en wordt uitgangsmateriaal opgeleverd voor PCR-screening van kolonies (Figuur 1E en Figuur 4B). Screening van kolonies door PCR kan tot een minimum worden beperkt - er hoeven niet meer dan 10 kolonies te worden verwerkt en de meeste moeten een positief resultaat opleveren voor insertie. Het PCR-product voor de screeningsprimers, ABglmS2_F_New en Tn7R (tabel 1), is 382 bp (figuur 4B, baan 4); negatieve controles voor de reactie zijn onder meer wildtype A. baumannii ATCC 17978 (Figuur 4B baan 2), AB258 (Figuur 4B baan 3) en geen sjabloon (Figuur 4B baan 5). Kolonies die PCR-positief zijn, vertegenwoordigen aangevulde, gemarkeerde stammen.

Verwijdering van het gentamicine-resistentiegen (niet-markering) duurt minder dan 3 uur, verspreid over 6 dagen, aangezien cellen die met het excisieplasmide zijn getransformeerd, moeten worden gekozen door middel van selectieve plating, en vervolgens moet het excisieplasmide worden genezen van de bacteriën (Figuur 1F). Excisie op basis van Flp-FRT-recombinatie is nauwkeurig en effectief en zou moeten resulteren in ≥20 kolonies op de transformatieplaat. Kolonies die worden gekruist met carbenicilline (selecteren op β-lactamresistentie verleend door het excisieplasmide) en gentamicine (op zoek naar verlies van gentamicineresistentie) moeten allemaal respectievelijk carbenicillineresistent en gentamicine-gevoelig zijn. Het excisieplasmide wordt uit de bacteriën geperst door groei op 5% sucrose-agarplaten. Groei op sucrose dwingt de cellen om pFLP2^ab te elimineren, aangezien het sacB-gen op het plasmide de omzetting van sucrose in levans bevordert, een polysacharide dat giftig is voor de bacterie^12,13. Alle kolonies die groeien op 5% sucrosemedia mogen dan alleen groeien op gewone LB-agarplaten; Er mag geen groei zijn op carbenicilline-agarplaten. Kolonies die op de gewone LB-agarplaten groeien, vertegenwoordigen ongemarkeerde stammen. Bevestiging van het verlies van de gentamicine-marker kan worden bereikt door kolonie-PCR met behulp van de Gm_F en Gm_R primers (tabel 1 en figuur 5). Dit primerpaar levert alleen een amplicon van 525 bp op in de positieve controle (de aanvankelijk gecreëerde gemarkeerde stam, figuur 5 baan 4); wildtype ATCC 17978 (Figuur 5 baan 2), AB258 (Figuur 5 baan 3), elke geteste kolonie (Figuur 5 baan 5) en de no-template controle (Figuur 5 baan 6) mogen geen versterking vertonen.

Zodra de niet-gemarkeerde stam is bevestigd, kan worden begonnen met functionele tests met fenotypische tests. Hier is de voor de hand liggende eerste keuze het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC) van een reeks antibiotica: ciprofloxacine is een bekend substraat van AdeIJK, tetracycline kan worden verwijderd door AdeIJK (de belangrijkste effluxpomp is AdeAB) en kanamycine heeft een relatief gering effect op A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. Met behulp van de bouillon-microverdunningsmethode volgens de CLSI-richtlijnen¹⁵ werd de gecomplementeerde ongemarkeerde stam AB258::adeIJK uitgedaagd met elk antibioticum in de afwezigheid en aanwezigheid van 50 μM IPTG; wildtype stam ATCC 17978 en RND efflux-deficiënte stam AB258 werden opgenomen als controles (tabel 2). Over het algemeen geeft de trend die te zien is in de MIC-waarden de verwachte verhaal-verminderde gevoeligheid van AB258::adeIJK voor ciprofloxacine en tetracycline met geïnduceerde expressie van de effluxpomp, wat verifieert dat de insertie van adeIJK succesvol was.

Figuur 1: Overzicht van de procedure. (A) Er wordt een 's nachts aan te vullen cultuur van de A. baumannii-stam voorbereid. (B) De cellen van de nachtcultuur worden 3 keer met water gewassen via centrifugeren en op ijs bewaard. (C) De toedienings- en helperplasmiden worden aan de cellen toegevoegd en gedurende 20 minuten op ijs geïncubeerd. Het monster wordt geëlektroporeerd, LB-media worden toegevoegd en de cellen mogen gedurende 1 uur bij 37 °C herstellen. Een aliquot van 100 μl cellen wordt verspreid over LB + Gm⁵⁰ agarplaten en 's nachts bij 37 °C geïncubeerd. (D) Kolonies van de transformatieplaat worden gepatcht op een LB + Gm⁵⁰ agarplaat en 's nachts gekweekt bij 37 °C. (E) Gepatchte kolonies worden voorbereid op PCR om te screenen op de aanwezigheid van een amplificatieproduct dat de chromosomale insertieplaats overspant. PCR-amplificatie wordt gevisualiseerd door agarosegelelektroforese. PCR-positieve monsters vertegenwoordigen een succesvolle insertie van het gen van belang in het chromosoom en de creatie van een gemarkeerde stam. (F) Een kolonie die positief is voor gentamicine wordt bereid zoals in stap (A-C), met elektroporatie van het pLFP2^ab-plasmide om de gentamicinecassette uit de chromosomale insertie te verwijderen. Selectieve uitplating op LB + Cb²⁰⁰ agar bevestigt de opname van het plasmide. Duplicaat patchen op LB + Cb²⁰⁰ en LB + Gm⁵⁰ agarplaten onthult kolonies die Cb^R en Gm^S zijn, wat het verlies van de gentamicinecassette vanaf het inbrengen bevestigt. Groei van geselecteerde Cb^R-kolonies op 5% sucrose geneest het pLFP2 ab-plasmide uit de cellen. Kolonies van de 5% sucroseplaat worden gepatcht op LB + Cb²⁰⁰ agar en LB agar om de gewenste Cb^S- en Gm S-kolonies te onthullen en de creatie van de ongemarkeerde stam te bevestigen. Gm⁵⁰, gentamicine bij 50 μg/ml; Cb²⁰⁰, carbenicilline in een dosis van 200 μg/ml; ^R, resistent; ^S, gevoelig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Plasmiden die in dit protocol worden gebruikt. Algemene plasmidekaarten van (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (insertieplasmide), (B) pTNS2 (helperplasmide) en (C) pFLP2^ab (excisieplasmide). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Schema van invoegen en demarkeren. (A) Invoegen. De enkele Tn7-insertieplaats in het A. baumannii-chromosoom bevindt zich op 24 bp van het uiteinde van het glmS2-gen. Co-elektroporatie van het insertieplasmide en het helperplasmide zorgt voor complementatie van het gen van belang (ingebracht gen, paars) samen met de rest van de insertiecassette (FRT-plaatsen voor markerexcisie, geel; accC1-gen voor gentamicineresistentie, groen; lacIq-gen voor induceerbare expressie, blauw) in het chromosoom. (B) Markering ongedaan maken. Elektroporatie van de gecomplementeerde, gemarkeerde insertiestam met het pFLP2 ab-excisieplasmide vergemakkelijkt de verwijdering van het gentamicineresistentiegen (accC1, groen) via Flp-FRT-recombinatie (FRT-plaatsen, geel), waardoor een ongemarkeerde stam ontstaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Transformatie, patching en insertiebevestiging door kolonie-PCR. Representatief resultaat van (A) de groei van transformatiekolonies na patching, en (B) PCR-amplificatie van kolonies met ABglmS_F_New (grijze) en Tn7R (oranje) primers om chromosomale insertie te bevestigen. Baan 1: DNA-ladder met laag molecuulgewicht; Baan 2: ATCC 179798; Baan 3: AB258; Baan 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Baan 5: controle zonder sjabloon. De verwachte bandbreedte van 382 bp is gelabeld. Merk op dat de gentamicine-specifieke primers (Gm_F en Gm_R, groen) ook kunnen worden gebruikt om chromosomale insertie te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Bevestiging van verlies van marker door kolonie-PCR. Representatief resultaat van kolonie-PCR-amplificatie met gentamicine-specifieke primers (Gm_F en Gm_R) om het verlies van de antibioticamarker via pFLP^{ab-gebaseerde} excisie te bevestigen. Baan 1: DNA-ladder met laag moleculair gewicht; Baan 2: ATCC 179798; Baan 3: AB258; Baan 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Baan 5: AB258::adeIJK; Baan 6: controle zonder sjabloon. De verwachte bandbreedte van 525 bp is gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Stammen, plasmiden en primers	Relevante kenmerken	Referentie
Vlek
A. baumannii ATCC 17978	Type stam	ATCC
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Plasmiden
pUC18T-miniTn7T-GM-LAC	GMR, VersterkerR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	Deze studie
pTNS2	VersterkerR	9
pFLP2ab	pWH1266 oorsprong of replicatie, sacB, AmpR	7
Inleidingen	Sequentie (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Deze studie
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	Deze studie

Tabel 1: Bacteriestammen, plasmiden en primers die in dit protocol worden gebruikt. Gm, gentamicine; Ampère, ampicilline; ^R, resistent.

	Ciprofloxacine		Tetracycline		Kanamycine
IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	Nd	0.500	Nd	1.5	Nd
AB258	0.031	Nd	0.063	Nd	4	Nd
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Vouw verandering		4.01		4.03		0.25

Tabel 2: Testen van de functionaliteit van de ingebrachte genen via antibioticagevoeligheid. Vergelijking van minimale remmende concentratie (MIC)-waarden voor A. baumannii ATCC 17978, AB258, niet-geïnduceerd AB258::adeIJK en IPTG-geïnduceerd AB258::adeIJK tegen ciprofloxacine, tetracycline en kanamycine. Vouwverandering = geïnduceerd (+ IPTG)/niet-geïnduceerd (− IPTG); nd = niet bepaald.

Discussion

Hoewel deze procedure voor het chromosomaal inbrengen van een induceerbaar genexpressiesysteem met één kopie in A. baumannii technisch eenvoudig en niet arbeidsintensief is, zijn er een paar belangrijke stappen die moeten worden benadrukt. Ten eerste moet de voorbereiding van de competente cellen zoveel mogelijk op ijs gebeuren, omdat de cellen kwetsbaar worden tijdens het vervangen van de media door ijskoud water. Idealiter worden de centrifugatiestappen uitgevoerd bij 4 °C, maar centrifugeren bij kamertemperatuur is acceptabel. Gezien de toenemende kwetsbaarheid van de cellen tijdens het wassen van het water, is voorzichtig pipetteren ook van cruciaal belang. Ten tweede is elektroporatie gevoelig voor de aanwezigheid van ionen. Door de cellen te wassen met meerdere pelletrondes en opnieuw te suspenderen in water, wordt ervoor gezorgd dat de media volledig worden verwijderd. Ook moeten plasmiden vers worden gezuiverd en kunnen ze worden geëlueerd in standaard kit-elutiebuffers (normaal gesproken TE-buffer) zolang de plasmide-DNA-concentratie hoog genoeg is. We streven ernaar om <5 μL plasmide toe te voegen aan 100 μL celsuspensie om de ionische sterkte van het monster zeer laag te houden, hoewel tot 10 μL moet worden verdragen. Ten derde moeten selectieve agarplaten zo nodig worden bereid om de werkzaamheid van het toegevoegde antibioticum te garanderen. Merk op dat carbenicilline werd gebruikt in plaats van het gebruikelijke ampicilline voor selectie tijdens de transformatie van het excisieplasmide, pFLP2^ab. A. baumannii is intrinsiek resistent tegen aminopenicillines (ampicilline)¹⁶; Het vervangen van een carboxypenicilline (carbenicilline) maakt voortdurende selectie mogelijk met het plasmide-gecodeerde β-lactamase.

Optimalisatie van het experimentele protocol is genuanceerder en zal variëren tussen verschillende soorten Acinetobacter (of zelfs genetisch gemanipuleerde stammen binnen dezelfde soort) en mogelijk de specifieke reagentia die in het laboratorium worden gebruikt. De spanning die wordt gebruikt voor elektroporatie kan bijvoorbeeld variëren tussen 1,8 en 2,5 kV, en de thermocyclusomstandigheden moeten mogelijk enigszins worden gewijzigd, afhankelijk van het DNA-polymerase dat voor PCR wordt gebruikt. Nuttige tips om te overwegen of cellen slecht groeien na elektroporatie zijn onder meer het verlagen van de concentratie gentamicine in de agarplaten van 50 μg/ml naar 30 μg/ml en/of het verlengen van de incubatietijd van de agarplaten tot ≥24 uur. Wat betreft de stappen om de gentamicinecassette te verwijderen, kan meer succes worden geboekt met LB-agarplaten met 10% sucrose en/of incubatie bij 30 °C gedurende ≥24 uur als de carbenicillineresistentie aanhoudt.

In de literatuur zijn talrijke methoden voor het prepareren van A. baumannii-cellen voor gebruik met elektroporatie te vinden, maar deze omvatten vaak een subculturatiestap na de eerste nachtelijke kweek en vervolgens een lange groeifase tot een voorgeschreven optische dichtheid. We hebben ontdekt dat een eenvoudige nachtcultuur net zo effectief kan worden gebruikt. Elektroporatie van A. baumannii is goed beschreven, en lezers kunnen hier meer inzicht krijgen in dit specifieke aspect van het protocol^17,18. De belangrijkste voordelen van dit mini-Tn7 chromosomale gencomplementatiesysteem in vergelijking met een plasmide-gebaseerd complementatiesysteem zijn de mogelijkheid om het expressieniveau van het gecomplementeerde gen te reguleren via het IPTG-controleerbare lacI q-repressorsysteem en de keuze om de gentamicinemarker (aacC1-gen) te verwijderen via de flankerende FRT-locaties. Er werd waargenomen dat de tolerantie van de cellen voor de expressie van effluxpompen kan variëren afhankelijk van de geplaatste pomp. Cellen zijn bijvoorbeeld gevoeliger voor de expressie van AdeIJK in vergelijking met AdeABC of AdeFGH; dit kan worden aangepakt door de concentratie van IPTG in kweekomstandigheden aan te passen. Het verwijderen van de antibioticamarker vermindert het mutatierisico voor de stam als gevolg van constante selectiedruk en maakt ook onbeperkt onderzoek naar de gevoeligheid voor antibiotica mogelijk³.

Dit mini-Tn7-systeem is met succes gebruikt bij Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ en Acinetobacter ^5,6,21,22 soorten, maar er zijn enkele beperkingen. In A. baumannii is er bijvoorbeeld slechts één functionele attTn7-insertieplaats in het genoom⁵, dus een stam kan worden gecreëerd met meerdere deleties, maar slechts één gen tegelijk kan worden aangevuld. Ook is dit systeem nog niet bewezen effectief voor Gram-positieve bacteriën¹⁰.

RND-effluxpompen zijn belangrijke facilitators van antibioticaresistentie bij A. baumannii. Wat ze zo krachtig maakt, is hun driedelige structuur die zich uitstrekt over de binnen- en buitenmembranen, waardoor antibiotica van het periplasma naar buiten de cel kunnen worden verwijderd. Van de meest bestudeerde en alomtegenwoordige RND-pompen - aangeduid als AdeABC, AdeFGH en AdeIJK - is aangetoond dat ze antibiotica elimineren die alle klassen omvatten. Het in detail ophelderen van de werking van de effluxpomp zal een goed startpunt bieden voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische opties tegen multiresistente stammen. Door gebruik te maken van de AB258 triple RND-pompdeletiestam en één pomp tegelijk aan te vullen, kan elke pomp onafhankelijk van de andere worden bestudeerd, waarbij voor elk hun unieke substraatprofielen en meest effectieve remmers worden onderscheiden. Natuurlijk hebben effluxpompen ook een "dagelijkse" rol in de normale functie van de bacterie. Het begrijpen van die rollen zou kunnen leiden tot indirecte verlamming van de pompen, wat op zijn beurt de uitstroom van antibiotica zou onderbreken, waardoor multiresistente bacteriën mogelijk opnieuw vatbaar zouden worden voor veelgebruikte antibiotica. Over het algemeen kan het mini-Tn7-systeem worden gebruikt om elk gen te introduceren dat van belang is voor gedetailleerd onderzoek of nuttige markers, bijvoorbeeld fluorescerende eiwitten voor microscopische beeldvorming⁶.

De toenemende prevalentie van multiresistente bacteriën is een zorg voor ons allemaal. Inzicht in de beschermende mechanismen van effluxpompen in ziekteverwekkers zoals A. baumannii is van cruciaal belang voor het bestrijden van ernstige infecties. Dit chromosomale single-copy genexpressiesysteem is een krachtig hulpmiddel voor mechanistische studies en voor het identificeren van remmers om de effluxpompfunctie te dwarsbomen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates