Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Karakterisering van multidrug effluxsystemen in Acinetobacter baumannii met behulp van een efflux-deficiënte bacteriestam en een single-copy genexpressiesysteem

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66471

⸱

5 januari 2024

 , 
1Department of Microbiology, University of Manitoba

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een eenvoudige procedure voor de single-copy chromosomale complementatie van een effluxpompgen met behulp van een mini-Tn7-gebaseerd expressiesysteem in een gemanipuleerde efflux-deficiënte stam van Acinetobacter baumannii. Dit nauwkeurige genetische hulpmiddel maakt gecontroleerde genexpressie mogelijk, wat essentieel is voor de karakterisering van effluxpompen in multiresistente pathogenen.

Samenvatting

Acinetobacter baumannii wordt erkend als een uitdagende Gram-negatieve ziekteverwekker vanwege de wijdverbreide resistentie tegen antibiotica. Het is van cruciaal belang om de mechanismen achter deze weerstand te begrijpen om nieuwe en effectieve therapeutische opties te ontwerpen. Helaas wordt ons vermogen om deze mechanismen in A. baumannii te onderzoeken belemmerd door het gebrek aan geschikte genetische manipulatie-instrumenten. Hier beschrijven we methoden voor het gebruik van een chromosomaal mini-Tn7-gebaseerd systeem om genexpressie met één kopie te bereiken in een A. baumannii-stam die geen functionele RND-type effluxmechanismen heeft. Het inbrengen van één kopie en de expressie van de induceerbare effluxpomp zijn vrij voordelig, aangezien de aanwezigheid van RND-operonen op plasmiden met een hoog aantal kopieën vaak slecht wordt verdragen door bacteriële cellen. Bovendien helpt het opnemen van recombinante mini-Tn7-expressievectoren in het chromosoom van een surrogaat A. baumannii-gastheer met verhoogde effluxgevoeligheid interferentie van andere effluxpompen te omzeilen. Dit systeem is niet alleen waardevol voor het onderzoeken van niet-gekarakteriseerde bacteriële effluxpompen, maar ook voor het beoordelen van de effectiviteit van potentiële remmers die zich op deze pompen richten.

Inleiding

Acinetobacter baumannii is een ziekteverwekker met de hoogste prioriteit van de Wereldgezondheidsorganisatie vanwege zijn alomvattende resistentie tegen alle klassen antibiotica1. Het is een opportunistische ziekteverwekker die vooral gehospitaliseerde, gewonde of immuungecompromitteerde mensen treft. A. baumannii ontwijkt antibiotica grotendeels via effluxpompen, de meest relevante is de Resistance-Nodulation-Division (RND)-familie van exporteurs2. Door te begrijpen hoe deze effluxpompen mechanistisch werken, kan men gerichte therapeutische opties ontwikkelen.

Een veel voorkomende manier waarop cellulaire processen specifiek kunnen worden onderscheiden, is door middel van genetische manipulatie. De instrumenten die beschikbaar zijn voor genetische studies van A. baumannii zijn echter beperkt, en om het experimentele ontwerp verder te verwarren, zijn klinische isolaten vaak resistent tegen de antibiotica die routinematig worden gebruikt voor selectie bij genetische manipulaties3. Een tweede hindernis die men tegenkomt bij het specifiek bestuderen van effluxpompen is dat ze strikt worden gereguleerd - vaak door onbekende factoren - waardoor het moeilijk is om een enkele pomp nauwkeurig te isoleren en functie toe te schrijven4. Omdat we deze noodzaak zagen om de onderzoekstoolbox uit te breiden, ontwikkelden we een mini-Tn7-gebaseerd, single-copy-insertion, induceerbaar expressiesysteem dat een Flp-recombinasedoelcassette (FRT) bevat, waarmee de selectiemarker 5,6,7 kan worden verwijderd (Figuur 1). Dit elegante kloon- en expressiesysteem, dat voor het eerst werd ontwikkeld voor Pseudomonas 8,9,10, werd gebruikt om enkelvoudige efluxpompcomplementen te genereren in een RND-effluxpomp-deficiënte stam van A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: hierna A. baumannii AB258) genoemd die we11. Omdat men in staat is om één effluxpomp tegelijk te bestuderen en de bacteriële cellen niet te overweldigen met expressie met hoge kopieën (zoals over het algemeen wordt gezien bij op plasmiden gebaseerde expressiesystemen), kan men beter leren over de kritische, fysiologische aspecten van elke effluxpomp met minimale interferentie en minder complicaties.

Dit artikel beschrijft hoe het mini-Tn7-systeem kan worden gebruikt om een verwijderd gen van belang, RND-effluxpomp adeIJK, aan te vullen in het chromosoom van A. baumannii AB258 door middel van een reeks ongecompliceerde stappen die in de loop van 9 dagen worden uitgevoerd7. De eerste reeks stappen herintroduceert de verwijderde effluxpompgenen die zijn gekloond in het mini-Tn7-gebaseerde insertieplasmide (Figuur 2A) op de enkele attTn7-insertieplaats stroomafwaarts van het goed geconserveerde glmS-gen (Figuur 3A). Dit proces wordt vergemakkelijkt door een niet-replicatief helperplasmide (Figuur 2B) dat codeert voor de transposasegenen die nodig zijn voor Tn7-gestuurde insertie. De tweede reeks stappen maakt gebruik van een excisieplasmide (Figuur 2C) voor Flp-recombinase-gemedieerde verwijdering van het gentamicine-gen geflankeerd door FRT-plaatsen (Figuur 3B) om een ongemarkeerde stam te creëren. Hoewel dit systeem wordt gebruikt om de essentiële rollen en mogelijke remmers van RND-effluxpompen met betrekking tot antibioticaresistentie op te helderen, kan het worden gebruikt om elk interessant gen te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Experimentele voorbereiding

  1. Zuiver het plasmide pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (insertieplasmide, figuur 2A) met het gen van belang.
    OPMERKING: Hier is het gen van belang adeIJK. De uiteindelijke plasmideconcentratie moet ≥100 ng/μL zijn.
  2. Zuiver het helperplasmide (pTNS2)9 en het excisieplasmide (pFLP2ab)6 (respectievelijk figuur 2B,C), idealiter tot een uiteindelijke plasmide-DNA-concentratie van ≥100 ng/μL.
  3. Bereid 50 ml steriel ultrapuur water en 25 ml steriele LB (Lennox) bouillon (zie Materiaaltabel).
  4. Bereid minimaal 10 LB-agarplaten, elk met de volgende additieven: gewoon (geen toevoegingen), gentamicine (Gm) in een dosis van 50 μg/ml, carbenicilline (Cb) in een dosis van 200 μg/ml (voor selectie via het ampicillineresistentiegen) en 5% sucrose (zie materiaaltabel).
  5. Streep de stam uit die moet worden gebruikt voor het inbrengen op LB-agar en incubeer gedurende 16-18 uur bij 37 °C. Hier wordt A. baumannii AB258 gebruikt.
    LET OP: Dit protocol moet zoveel mogelijk in een steriele omgeving worden uitgevoerd door gebruik te maken van een bunsenbrander op de werkbank of een biologische veiligheidskast. Alle verbruiksartikelen (pipetpunten, inoculatielussen, microfuge-buisjes, enz.) moeten steriel zijn.

2. Voorbereiding van de cultuur

  1. Inoculeer een enkele kolonie A. baumannii AB258 in 4 ml LB-bouillon in een steriele kweekbuis van 13 ml met behulp van een steriele inoculatielus of steriele houten inoculatiestok.
    OPMERKING: Een enkele kweek van 4 ml wordt gebruikt voor één monster en één controle. Verhoog het aantal culturen, afhankelijk van het aantal benodigde monsters.
  2. Incubeer een nacht bij 37 °C met schudden (250 rpm).
  3. Zet een fles steriel gedestilleerd water (25-50 ml) 's nachts op 4 °C voor gebruik in stap 3.

3. Bereiding van elektrocompetente cellen

  1. Plaats alle steriele microfugebuisjes van 1,5 ml (twee per cultuur) en steriele elektroporatiecuvetten (twee per cultuur) op ijs (zie materiaaltabel). Bewaar de monsters tijdens de procedure zoveel mogelijk op ijs.
  2. Plaats de fles steriel water die bij 4 °C is bewaard op ijs.
  3. Breng 1,5 ml van de bacteriecultuur 's nachts over in een van de 1,5 ml microfuge-buisjes.
  4. Centrifugeer op 13.000 x g gedurende 2 minuten om de cellen te pelleteren.
    OPMERKING: Centrifugeren zou idealiter worden uitgevoerd bij 4 °C, maar centrifugeren bij kamertemperatuur is acceptabel en niet schadelijk.
  5. Verwijder met een pipet van 1 ml al het supernatans zonder de celpellet te verstoren.
  6. Voeg nog eens 1,5 ml bacteriecultuur toe aan dezelfde microfuge-buis. Centrifugeer op 13.000 x g gedurende 2 minuten en verwijder vervolgens al het supernatant.
  7. Herhaal stap 3.6 nog een laatste keer met de resterende 1 ml kweek.
  8. Voeg 1 ml ijskoud steriel water toe aan de celpellet en resuspendeer met voorzichtig pipetteren totdat de pellet niet meer op de bodem van de microfuge-buis zit.
  9. Centrifugeer de geresuspendeerde cellen bij 13.000 x g gedurende 2 min.
  10. Verwijder het supernatans voorzichtig met een pipet van 1 ml. Giet het supernatant niet af, vooral niet in de volgende wasstappen wanneer de cellen de neiging hebben om minder compacte pellets te vormen.
  11. Herhaal deze wasstap met ijskoud steriel water, stap 3.8 tot en met stap 3.10, nog twee keer.
  12. Resuspendeer de uiteindelijke celpellet voorzichtig in 200 μL ijskoud steriel water.
  13. Breng 100 μL van de uiteindelijke celsuspensie over in de tweede ijskoude microfugebuis van 1,5 ml. Dit tweede aliquot wordt de negatieve controle voor elektroporatie. Bewaar de celmonsters op ijs.

4. Elektroporatie

  1. Verwarm 1 ml LB-bouillon en een LB + Gm50 agarplaat (bereid in stap 1.4) voor elk monster en controleer in een statische incubator die is ingesteld op 37 °C.
  2. Voeg in een gecombineerd volume van 5 μL of minder 100-200 ng van het pTNS2-helperplasmide en het pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK-insertieplasmide toe aan een aliquot elektrocompetente cellen.
  3. Meng met zacht tikken met de vingertoppen om ervoor te zorgen dat de plasmiden volledig worden gemengd met de elektrocompetente cellen zonder luchtbellen te introduceren.
  4. Voeg een gelijkwaardige hoeveelheid steriel gedestilleerd water toe aan de negatieve controlecel aliquot en meng voorzichtig zoals hierboven.
  5. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten op ijs.
  6. Breng het hele celmonster over in een ijskoude elektroporatiecuvet en plaats de cuvet vervolgens terug op ijs. Herhaal dit voor het monster van de negatieve controlecel.
  7. Elektropoleren van het celmonster.
    1. Schakel de elektroporator in en stel deze in op 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (zie Materiaaltabel).
    2. Veeg het oppervlak van de cuvet af met een zachte tissue om aanhangend ijs of vocht te verwijderen.
    3. Steek de cuvet in de elektroporator en geef de elektrische schok af.
    4. Voeg onmiddellijk 0,9 ml voorverwarmde LB-bouillon toe aan de cellen in de cuvet en pipetteer voorzichtig op en neer om de cellen met de media te mengen.
    5. Breng de hele celsuspensie over in een nieuwe microfuge-buis van 1,5 ml (kamertemperatuur).
    6. Controleer de tijdconstante waarde op de elektroporator; Voor de beste resultaten moet deze waarde tussen 4 en 6 liggen.
  8. Herhaal de elektroporatieprocedure (stappen 4.7.1 tot en met 4.7.6) voor het negatieve controlecelmonster.
  9. Incubeer de geëlektropoleerde monsters bij 37 °C gedurende 1 uur bij 250 tpm om celherstel mogelijk te maken.
  10. Verspreid met behulp van een inoculatieverspreider 100 μL van elk geëlektropoleerd celmonster op een voorverwarmde LB + Gm50 agarplaat.
    1. Centrifugeer de resterende monsters gedurende 2 minuten bij 13.000 x g om de cellen te pelleteren.
    2. Nadat u al het supernatans met een pipet hebt verwijderd, resuspendeert u de cellen in 100 μL LB-bouillon.
    3. Verdeel elk volledig monster over afzonderlijke voorverwarmde LB + Gm50 agarplaten.
      OPMERKING: De efficiëntie van elektroporatie kan afhankelijk zijn van de spanning. Wanneer een stam voor de eerste keer wordt geëlektropoleerd, kan het informatief zijn om verschillende volumes, of zelfs verdunningen, van het elektroporatiemonster uit te brengen om ervoor te zorgen dat de resulterende platen geïsoleerde kolonies hebben.
  11. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 16-18 uur.

5. Selectie van getransformeerde kolonies voor PCR-gebaseerde screening

  1. Controleer de elektroporatieplaten. De negatieve controle mag geen kolonies hebben; Het monster moet verschillende kolonies hebben.
    OPMERKING: Platen met kolonies kunnen bij deze stap en bij alle volgende stappen waarbij agarplaten met kolonies of pleisters worden geproduceerd, maximaal 3 dagen bij 4 °C worden bewaard voordat ze verder gaan.
  2. Pak met steriele tandenstokers tot 10 enkele kolonies van de LB + Gm50 agarplaten en plak ze op een verse LB + Gm50 agarplaat.
  3. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 16-18 uur.

6. Verificatie van chromosomale insertie door middel van kolonie-PCR

  1. Haal de LB + Gm50 agarplaten met de gepatchte kolonies uit de broedmachine.
  2. Verwijder met een steriele tandenstoker of steriele pipetpunt een kleine portie (ongeveer zo groot als een grote kolonie) uit een pleister in 20 μL steriel gedestilleerd water in een PCR-buisje van 0,2 ml; goed mengen. Het watermonster moet zichtbaar troebel worden als de cellen uit de tandenstoker vrijkomen. Bereid een willekeurig aantal monsters voor dat moet worden gescreend, maar 6 zou voldoende moeten zijn.
  3. Incubeer het PCR-buisje met de bacteriële suspensie bij 100 °C gedurende 5-10 minuten.
  4. Gebruik een minicentrifuge (zie Materiaaltabel) om het monster gedurende 2 minuten op de vaste maximale snelheid te laten draaien om celresten te pelleteren.
  5. Breng het supernatans over in een nieuw PCR-buisje van 0,2 ml en plaats het op ijs. Dit monster bevat het sjabloon-DNA voor de PCR-reactie.
    OPMERKING: Dit sjabloon-DNA kan worden opgeslagen bij -20 °C voordat verder wordt gegaan met PCR.
  6. Bereid een PCR-reactiemengsel met 1x polymerasebuffer, 200 μM dNTP's, 0,18 μM ABglmS2_F_New voorwaartse primer, 0,18 μM Tn7R omgekeerde primer (tabel 1), 1 U Taq-DNA-polymerase en 1 μL van het bereide sjabloon-DNA in een totaal volume van 25 μL. Bereid een no-template control (NTC) voor, met inbegrip van al het DNA behalve het sjabloon (zie Materiaaltabel).
  7. Voer de reactiecondities in een thermische cycler in: 95 °C gedurende 2 min; 95 °C gedurende 30 s, 49 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s gedurende in totaal 35 cycli; 72 °C gedurende 10 min; 12 °C vasthouden. Voer de voorbeelden uit.
  8. Na toevoeging van DNA-laadkleurstof tot een eindconcentratie van 1x, laadt u 10 μL van elke PCR-reactie op een agarosegel van 2% en laat u deze gedurende 40 minuten op 80 V draaien. De verwachte amplicongrootte voor dit primerpaar is 382 bp. De NTC zou geen bands moeten hebben.
  9. Identificeer de monsters die het verwachte PCR-product hebben geproduceerd. Bereid een streepplaat voor op LB + Gm50 agarplaten van een van de PCR-positieve pleisters; incubeer bij 37 °C gedurende 16-18 uur. Het doel is om een plaat met enkele kolonies te genereren voor de bereiding van een glycerolvoorraad om deze gemarkeerde stam te behouden en als uitgangspunt voor het creëren van een niet-gemarkeerde stam (hieronder beschreven).

7. Verwijdering van de GmR-marker met behulp van pFLP2ab

  1. Volg de procedure vermeld in stap 2: Kweekvoorbereiding. Het monster dat wordt gebruikt om de nachtcultuur te bereiden, is een enkele kolonie van de LB + Gm50 agarplaten die zijn voorbereid om discrete kolonies te genereren in stap 6.9.
  2. Volg de procedure vermeld in stap 3: Bereiding van elektrocompetente cellen. Bereid de cellen van de nachtkweek voor op elektroporatie.
  3. Volg de procedure vermeld in stap 4: Elektroporatie. Hier is het plasmide dat in de cellen moet worden geïntroduceerd pFLP2ab (100-200 ng), dat het gentamicine-resistentiegen zal verwijderen, naast het chromosomaal ingebrachte gen van belang.
  4. Nadat de cellen gedurende 1 uur zijn hersteld (stap 4.9), verdeel 100 μl van het geëlektropoleerde celmonster op een voorverwarmde LB + Cb200 agarplaat (bereid in stap 1.4). Deze selectiedruk zorgt ervoor dat alleen cellen die het pFLP2 ab-excisieplasmide herbergen, zullen groeien.
  5. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 16-18 uur.
  6. Controleer de plaat op kolonies. De negatieve controleplaat mag geen kolonies hebben; de LB + Cb200 agar-monsterplaat moet verschillende kolonies hebben.
  7. Gebruik steriele tandenstokers om tot 20 geïsoleerde kolonies te kruisen op een LB + Cb200 agarplaat en een LB + Gm50 agarplaat.
  8. Incubeer de platen gedurende 16-18 uur bij 37 °C.
  9. Controleer de platen op vlekken. Bij klonen die groeien op de LB + Cb200 agarplaat maar niet op de LB + Gm50 agarplaat is het gentamicine-resistentiegen verwijderd uit de oorspronkelijke insert.
  10. Selecteer de pleisters die carbenicillineresistent zijn en gentamicine die vatbaar zijn voor strepen op individuele LB-agarplaten aangevuld met 5% (w/v) sucrose, waardoor het pFLP2-abplasmide uit de bacteriën wordt verdreven. Kies maximaal 10 kolonies.
  11. Incubeer de platen gedurende 16-18 uur bij 37 °C.
  12. Controleer de platen op kolonies.
  13. Als laatste bevestiging van het verlies van pFLP2 ab-plasmide, kruis je 4-6 geïsoleerde kolonies van de 5% sucroseplaten op een LB + Cb200 agarplaat en een LB-agarplaat.
  14. Incubeer de platen gedurende 16-18 uur bij 37 °C.
  15. Kies een kloon die groeit op de LB-agarplaat en die carbenicilline gevoelig is voor de bereiding van een glycerolvoorraad om deze ongemarkeerde stam te behouden.
    1. Genetische verificatie van de niet-gemarkeerde stam kan worden uitgevoerd met kolonie-PCR (stap 6: Chromosomale insertie verifiëren door kolonie-PCR) met behulp van de primers die zich richten op het gentamicine-resistentiegen.
    2. Bereid een PCR-reactiemengsel met 1x polymerasebuffer, 200 μM dNTP's, 0,18 μM Gm_F voorwaartse primer, 0,18 μM Gm_R omgekeerde primer (tabel 1), 1 U Taq-DNA-polymerase en 1 μL van het bereide sjabloon-DNA in een totaal volume van 25 μL. Bereid een no-template control (NTC) voor, met inbegrip van al het DNA behalve het sjabloon, en een positieve controle met behulp van DNA van de gemarkeerde stam.
    3. Voer de reactiecondities in een thermische cycler in: 95 °C gedurende 2 min; 95 °C gedurende 30 s, 50 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 40 s gedurende in totaal 35 cycli; 72 °C gedurende 10 min; 12 °C vasthouden. Voer de voorbeelden uit.
    4. Na toevoeging van DNA-laadkleurstof tot een eindconcentratie van 1x, laadt u 10 μL van elke PCR-reactie op een 1% agarosegel en laat u deze gedurende 40 minuten op 80 V draaien. De verwachte amplicongrootte voor dit primerpaar is 525 bp. De positieve controle moet één band hebben; de samples en de NTC mogen geen banden hebben.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De chromosomale insertieprocedure duurt in totaal slechts 2 uur gedurende 3 dagen om een resultaatkolonie te zien groeien op een selectieve agarplaat (Figuur 1A-C). Het verwachte aantal kolonies op de transformatieplaat is afhankelijk van de stam: men kan 20-30 of zelfs honderden kolonies zien, aangezien het inbrengen van Tn7 op Tn7-locaties specifiek en efficiënt is9. Door transformatieplaatkolonies op selectieve media te pa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel deze procedure voor het chromosomaal inbrengen van een induceerbaar genexpressiesysteem met één kopie in A. baumannii technisch eenvoudig en niet arbeidsintensief is, zijn er een paar belangrijke stappen die moeten worden benadrukt. Ten eerste moet de voorbereiding van de competente cellen zoveel mogelijk op ijs gebeuren, omdat de cellen kwetsbaar worden tijdens het vervangen van de media door ijskoud water. Idealiter worden de centrifugatiestappen uitgevoerd bij 4 °C, maar centrifugeren bij kamertemperat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een Discovery Grant van de Natural Science and Engineering Council of Canada aan AK. De schema's die in de figuren worden gebruikt, zijn gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL PCR tubeVWR20170-012Voor colony boil-voorbereidingen en PCR-reacties
1.5 mL microfuge tubesSarstedt72-690-301Algemeen gebruik
13-mL cultuurbuizen, PyrexFisher14-957KVloeibare cultuurvaten
6x DNA loading bufferFroggabioLD010Sample ladingsverf voor agarose gel elektroforese
Glazuurzuur, glazuurFisher351271-212Agarose gel lopende buffer component
AgarBioshopAGR003Vaste groei media
AgaroseBioBasicD0012Elektroforetische scheiding van PCR reactie producten; gebruikt bij een concentratie van 0.8–2%
Agarose gel elektroforese unitFisher29-237-54Agarose gel elektroforese; scheiding van PCR reactie producten
CarbenicillineFisher50841231Selectieve media
Cultuurbuis sluitingenFisher13-684-138Roestvrijstalen sluiting voor 13-mL cultuurbuizen
Deoxynucleotide trifosfaat (dNTP) setBiobasicDD0058PCR reactie component; geleverd als 100 mM elk dATP, dCTP, dGTP, dTTP; gemengd en verdund voor 10 mM elk dNTP
Droogbaad/blok verwarmerFisher88860023Isotemp digitale droogbad voor boil-voorbereidingen
Electroporatie cuvettesVWR89047-2082 mm electroporatie cuvettes met ronde dop
ElectroporatorCole Parmer940000009110 VAC, 60 Hz electroporator
EthidiumbromideFisherBP102-1Visualisatie van PCR reactie producten en DNA marker in agarose gel
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)VWRCA-EM4050Agarose gel lopende buffer component
GentamicineBiobasicGB0217Voor de bereiding van selectieve media
GlycerolFisherG33Bereiding van bacteriële voorraden voor langdurige opslag in een ultra-lage vriezer
Incubator (schudden)New Brunswick ScientificM1352-0000Excella E24 Incubator Shaker voor vloeibare cultuurgroei
Incubator (statisch)Fisher11-690-550DIsotemp Incubator Oven Model 550D voor solide (LB agar) cultuurgroei
InoculatieschapelSarstedt86.1562.050Streaks kolonies op agar platen
InoculatiespreiderSarstedt86.1569.005Verspreiding van cultuur op agar platen
Lysogeny bouillon (LB) bouillon, LennoxFisherBP1427Vloeibare groei media (20 g/L: 5 g/L natriumchloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L gistextract)
MicrofugeFisher75002431Sorvall Legend Micro 17 voor centrifugatie van monsters
Mini-centrifugeFisherS67601BCentrifugeren van 0.2 mL PCR tubes
Petri schotelsSPL Life Sciences10090Voor solide groei media (agar platen): 90 x 15 mm
Pipetten MandelVariousGilson enkele kanaal pipetten (P10, P20, P200, P1000)
VoedingBiorad1645050PowerPac Basic voeding voor elektroforese
PrimersIDTNAPCR reactie component; specifiek voor gen van belang; bereid op 100 μM zoals vermeld op de productspecificatie sheet
SucroseBioBasicSB0498Voor de bereiding van counterselectieve media voor verwijdering van de pFLP2ab plasmide uit getransformeerde A. baumannii
Taq DNA polymeraseFroggaBioT-500PCR reactie component; polymerase geleverd met een 10x buffer
Thermische cyclerBiorad1861096Model T100 voor PCR
ToothpicksFisherS24559Voor het patchen van kolonies op agar platen
Trizma baseSigmaT1503Agarose gel lopende buffer component
Ultrapuur waterMillipore SigmaZLXLSD51040MilliQ waterzuiveringssysteem: ultra puur water voor media en oplossingsbereiding, en celwassing
Breed scala DNA markerBiobasicM103R-2Grootte bepaling van PCR producten op een agarose gel
Houten inoculatiestokjesFisher29-801-02Inoculate culturen met kolonies van agar platen

Referenties

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380(2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288(2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373(2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110(2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045(2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Expressie van effluxpompenchromosomaal mini-Tn7-systeemRND-effluxmechanismenelektrocompetente cellencolony PCR-screeningantibioticaresistentiegeninsertie
Karakterisering van multidrug effluxsystemen in Acinetobacter baumannii met behulp van een efflux-deficiënte bacteriestam en een single-copy genexpressiesysteem
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.