Dissectie, histologische verwerking en genexpressieanalyse van supraclaviculaire bruine vetweefsel bij muizen

Summary

Hier bieden we een praktische procedure voor het ontleden en uitvoeren van histologische en genexpressie-analyses van supraclaviculair bruin vetweefsel bij muizen.

Abstract

Bruin vetweefsel (BAT)-gemedieerde thermogenese speelt een belangrijke rol bij de regulatie van het metabolisme, en de morfologie en functie ervan kunnen sterk worden beïnvloed door omgevingsstimuli bij muizen en mensen. Momenteel is muizen interscapulaire BAT (iBAT), die zich tussen twee schouderbladen in de bovenste dorsale flank van muizen bevindt, het belangrijkste BAT-depot dat door onderzoekslaboratoria wordt gebruikt om de BAT-functie te bestuderen. Onlangs werden een paar voorheen onbekende BAT-depots geïdentificeerd bij muizen, waaronder een analoog aan menselijk supraclaviculair bruin vetweefsel. In tegenstelling tot iBAT bevindt het supraclaviculaire bruine vetweefsel van muizen (scBAT) zich in de tussenlaag van de nek en is het dus niet zo gemakkelijk toegankelijk.

Om de studie van nieuw geïdentificeerde scBAT bij muizen te vergemakkelijken, wordt hierin een protocol gepresenteerd waarin de stappen worden beschreven om intacte scBAT van postnatale en volwassen muizen te ontleden. Vanwege de kleine omvang van scBAT in vergelijking met andere vetdepots, zijn de procedures aangepast en specifiek geoptimaliseerd voor het verwerken van scBAT. Een van deze wijzigingen is het gebruik van een ontleedmicroscoop tijdens weefselafname om de precisie en homogenisatie van bevroren scBAT-monsters te verhogen om de efficiëntie van de daaropvolgende qPCR-analyse te verhogen. Met deze optimalisaties kan de identificatie van, het morfologische uiterlijk en de moleculaire karakterisering van de scBAT bij muizen worden bepaald.

Introduction

De toenemende prevalentie van obesitas in de VS en wereldwijd heeft grote belangstelling gewekt voor het begrijpen van de etiologie ervan en het identificeren van mogelijke behandelingen ^1,2. Vetweefsel speelt een vitale rol in het metabolisme en ontregeling van het vetweefsel kan leiden tot de ontwikkeling van obesitas. Over het algemeen zijn er twee soorten vetweefsel, wit en bruin vetweefsel. Terwijl wit vetweefsel (WAT) chemische energie kan opslaan en endocriene factoren kan afscheiden, kan bruin vetweefsel (BAT) chemische energie gebruiken om warmte op te wekken en de lichaamstemperatuur in de kou op peil te houden ^3,4. Vanwege dit unieke vermogen kan activering van BAT ook het energieverbruik verhogen en de insulinegevoeligheid^verbeteren5.

BBT oefent zijn functie uit door middel van niet-rillende thermogenese, een proces dat wordt gemedieerd door ontkoppelingseiwit 1 (UCP1)⁶. Zoogdieren, waaronder muizen en mensen, bezitten verschillende hoeveelheden BBT. De klassieke opvatting van BAT is dat deze vetweefsels overvloediger aanwezig zijn bij muizen en zuigelingen dan bij volwassen mensen. iBAT, gelegen in de bovenste dorsale flank tussen de schouderbladen, is het meest bestudeerde BAT-depot bij muizen. Door radio-isotopenbeeldvorming en biopsietests toe te passen, identificeerden recente studies verschillende BBT-depots bij volwassen mensen. Sommigen van hen, waaronder de depots die in de diepe nek en het supraclaviculaire gebied zijn gevonden, waren niet eerder geïdentificeerd bij muizen of andere modeldieren 7,8,9,10,11. Van deze BAT-depots is de scBAT het meest voorkomende depot bij volwassen mensen. Om de oorsprong en moleculaire bijdrage van deze nieuw gevonden BBT-depots bij mensen beter te begrijpen, is het essentieel om equivalente depots in muizen te identificeren die genetische en moleculaire manipulaties mogelijk maken om de functionele rol van deze depots te traceren en te testen. Zo identificeerden wij en anderen een paar voorheen onbekende BAT-depots op verschillende anatomische locaties bij muizen, waaronder scBAT^12,13, thoracale perivasculaire BAT^14,15, perirenale BAT¹⁶ en periaorta-BAT¹⁷. ScBAT van muizen lijkt anatomisch op menselijk scBAT en morfologisch op klassieke iBAT, met hoge niveaus van UCP1¹².

In tegenstelling tot iBAT bij muizen, dat gemakkelijk kan worden ontleed, bevindt scBAT zich in de tussenlaag van de muizenhals, onder de speekselklieren en langs de uitwendige halsader. Het isoleren van dit depot voor histologische en moleculaire analyses kan een uitdaging zijn. Hier beschrijven we in detail de procedure voor het ontleden van scBAT van postnatale en volwassen muizen en het verwerken van dit depot voor histologie en genexpressie-analyse.

Protocol

De dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Baylor College of Medicine. Alle procedures werden uitgevoerd op C57BL/6J mannelijke muizen van 3 weken en 3 maanden oud. Voorafgaand aan de dissectie werden alle muizen geëuthanaseerd met behulp van de goedgekeurde euthanasieprocedure voor kooldioxide bij knaagdieren. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. Ontleding van scBAT

1. Plaats het muizenkarkas op de werkbank en reinig de chirurgische schaar en superfijne punttang met 70% ethanol.
2. Spuit de buikhals van de muis in met 70% ethanol om de vacht nat te maken en besmetting van de vacht te minimaliseren.
3. Maak een bilaterale incisie, ongeveer 1,5 cm, langs de sleutelbeenderen.
4. Snijd vanaf de uiteinden van de vorige incisie in de lengterichting naar de oren toe, ongeveer 1 cm lang. Dit vormt een vierkante U-vormige incisie rond de nek (Figuur 1A,B).
   LET OP: scBAT ligt in de tussenlaag van de nek. De oppervlakkige laag, bestaande uit de huid, het onderhuidse vetweefsel en de speekselklieren, wordt tijdens deze stap blootgelegd. De tussenlaag bevat, samen met scBAT, de halsaders en nekspieren. De diepe laag van de nek, met daarin diepe nek-BAT en slagader en halsaders, wordt blootgelegd door de skeletspier te verwijderen.
5. Plaats de muis onder een ontleedmicroscoop en breng de blootgestelde nek scherp (Figuur 1C).
   OPMERKING: Deze extra stap verhoogt de precisie van de weefselverzameling aanzienlijk, wat nodig is gezien de kleine omvang van scBAT.
6. Leg de speekselklieren volledig bloot door de ingesneden huiddelen met een tang weg te tillen.
7. Gebruik een chirurgische schaar en een pincet om het weefsel los te koppelen dat de speekselklieren verbindt met het weefsel rond de sleutelbeenderen en met elkaar.
8. Leg de scBAT-depots bloot door de speekselklieren op te tillen. Zoek naar de BAT langs de uitwendige halsader en mogelijk verbonden met de onderkant van de speekselklieren. Identificeer het aan de hand van zijn oranjeachtige kleur, die afsteekt tegen het omringende weefsel.
9. Houd het vetweefsel van het doelwit met een pincet vast en trek het voorzichtig weg van de speekselklieren.
10. Eenmaal losgemaakt van de speekselklieren, blijft u de scBAT loskoppelen van de uitwendige halsader en de musculatuur van de nek totdat de depots aan weerszijden van de nek in hun geheel kunnen worden verwijderd.
11. Inspecteer elk ontleed scBAT-monster onder de ontleedmicroscoop (Figuur 1D,E) en gebruik een pincet om eventueel achtergebleven bindweefsel te verwijderen.
12. Plaats elk monster in een glazen scintillatieflacon met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en haal de muis onder de microscoop vandaan.

2. Verwerking en hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) van scBAT (geïllustreerd in figuur 2A)

1. Vervang de PBS (stap 1.12) door 10 ml koude 4% paraformaldehyde (PFA) en plaats de injectieflacon op een nutator, die een nacht op 4 °C schommelt om de scBAT te fixeren.
   OPMERKING: Perfusiefixatie kan worden toegepast bij postnatale, vooral volwassen muizen, wanneer verdere verwerking voor immunohistochemische analyse nodig is.
2. Verwijder de volgende dag de PFA-oplossing uit de injectieflacon met een steriele transferpipet en vervang deze door 10-15 ml PBS. Plaats de injectieflacon op een nutator en schud gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Vervang PBS door 0.85% zoutoplossing en blijf nog 30 minuten schommelen bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: De zoutoplossing is 0,85% zoutoplossing (NaCl) w/v in DEPC-behandeld water (RNase-vrij). PBS kan in deze en de volgende stap worden vervangen door de zoutoplossing.
3. Verwijder de 0,85% zoutoplossing met een overdrachtspipet en voeg 10 ml 70% ethanol/0,85% zoutoplossing toe aan de injectieflacon. Bewaar de injectieflacon een nacht in een koelkast van 4 °C of tot hij klaar is voor het inbedden van paraffine.
   OPMERKING: PBS kan worden gebruikt als er geen zoutoplossing van 0.85% beschikbaar is. scBAT moet zo snel mogelijk worden verwerkt om het in secties te vergemakkelijken en de morfologie van het weefsel beter te bewaren.
4. Voorafgaand aan het inbedden van paraffine, dehydrateert scBAT door middel van een reeks ethanoluitwisselingen om water uit het weefsel te verwijderen.
   1. Verwijder om te beginnen 70% ethanol/0,85% zoutoplossing uit de injectieflacon met een transferpipet en voeg 10-15 ml 95% dehydrantalcohol toe, waarbij u de injectieflacon gedurende 1 uur op kamertemperatuur op een nutator laat schommelen. Herhaal deze stap één keer.
      NOTITIE: Ethanol kan worden gebruikt in plaats van dehydrant-alcoholoplossingen.
   2. Vervang vervolgens 95% dehydrant alcohol door 10-15 ml 100% dehydrant alcohol en blijf 1 uur schommelen op een nutator. Vul bij met nieuwe 100% dehydrant alcohol en blijf enkele uren of een nacht schommelen, afhankelijk van de hoeveelheid scBAT in de flacon.
5. Om scBAT vrij te maken voor inbedding, voegt u 10 ml tolueen toe aan de injectieflacon en blijft u op een nutator schommelen totdat scBAT transparant is, ongeveer 6-8 uur.
   OPMERKING: De tijd die nodig is om tot een bevredigende clearing te komen, is afhankelijk van de grootte van de scBAT. Het is aan te raden om 's morgens direct te beginnen met opruimen, zodat infiltratie en inbedding 's middags kan plaatsvinden.
6. Om scBAT in paraffinewas in te bedden, verwijdert u tolueen en voegt u 10 ml gesmolten infiltratieparaffinewas toe aan de injectieflacon. Plaats de injectieflacon gedurende 1 uur in een oven op 65 °C. Herhaal deze stap met nieuwe wax.
   NOTITIE: Begin met het smelten van waspellets in een oven 's nachts voordat het inbedden begint om ervoor te zorgen dat de was volledig vloeibaar is.
7. Vervang infiltratieparaffinewas door ingebedde paraffinewas en plaats de injectieflacon gedurende 1 uur op dezelfde temperatuur. Herhaal deze stap één keer.
   OPMERKING: De infiltratiefase kan worden onderbroken en later worden voortgezet. Haal de injectieflacon uit de oven en bewaar deze op kamertemperatuur tot u klaar bent om verder te gaan.
8. Veranker het weefsel door het eerst in een weefselinbeddingsmal te plaatsen, voeg gesmolten inbeddingswas toe aan de mal en heroriënteer het weefsel onder een stereomicroscoop. Plaats vervolgens een inbeddingscassette bovenop de was en blijf inbeddingswas over de was gieten totdat deze vol is en de inbeddingsdop aan het wasblok is bevestigd. Zet het blok een nacht in een koelkast van 4 °C om de was te laten opstijven en krimpen voordat u de metalen mal verwijdert.
9. Snijd de scBAT met een microtoom in delen tot een dikte van 5-6 μm¹⁸, drie tot vier secties per microscoopglaasje, en plaats deze in een warm floatbad met paraffinesectie bij ~42 °C om de weefselsecties glad te laten strijken.
10. Breng de secties over naar glijbanen en plaats de glijbanen rechtop tegen het drijfbad om water van de glijbanen te laten druppelen.
11. Breng de glaasjes over naar een roestvrijstalen kleurrek en plaats het rek op een droogbank om een nacht te drogen.
    OPMERKING: De paraffineglaasjes kunnen langdurig bij kamertemperatuur worden bewaard voordat verdere verwerking wordt bereikt.
12. Voer de H&E-kleuring¹⁹ uit. Plaats om te beginnen de objectglaasjes in een kleurrek en plaats het rek vervolgens gedurende 40 seconden in een kleurpot met xyleen. Herhaal deze stap één keer.
    OPMERKING: Als paraffine na de twee fasen nog steeds zichtbaar is, wacht dan tot het volledig is opgelost voordat u verder gaat.
13. Om het weefsel te hydrateren, plaatst u het glaasjesrek in een kleurpot gevuld met 100% dehydrantalcohol gedurende twee fasen van 20 seconden, gevolgd door een fase van 15 seconden in 95% dehydrantalcohol en een laatste spoeling van 15 seconden in ddH₂O.
14. Plaats de objectglaasjes gedurende 75 s in een kleurschaal gevuld met hematoxyline-oplossing om nucleaire kleuring te bereiken en spoel de objectglaasjes vervolgens gedurende 45 s af in een kleurschaal met ddH₂O.
    OPMERKING: De tijd kan worden aangepast afhankelijk van de gewenste beitskleur.
15. Differentieer de kleuring door objectglaasjes gedurende 15 s in een kleurschaal gevuld met HCl-ethanoloplossing te dompelen en vervolgens gedurende 15 s over te brengen in een andere ddH₂O-spoeling.
    OPMERKING: De HCl-ethanoloplossing wordt bereid volgens een gepubliceerde methode¹⁹.
16. Voor cytoplasmatische kleuring plaatst u het objectglaasje gedurende 15 s in een Eosine Y-tegenvlekoplossing.
17. Droog het weefsel uit door de objectglaasjes elk 15 seconden te dompelen in drie opeenvolgende oplossingsfasen van 95% dehydrantalcohol, daarna twee opeenvolgende 100% dehydrantalcoholbaden - de eerste gedurende 15 s en de tweede gedurende 45 s - om de uitdroging te beëindigen.
18. Breng ten slotte de objectglaasjes gedurende 45 seconden over in een xyleenbad om het weefsel opnieuw te laten wennen aan organische oplosmiddelen. Na deze stap is de kleuring voltooid; Verwijder het weefsel uit de oplossing.
19. Breng montagemedium aan op elke schuif en dek het af in een chemische zuurkast. Droog een nacht voor beeldvorming. De resultaten van de beeldvorming worden weergegeven in figuur 2B.

3. Genexpressie-analyse van scBAT

1. Weefselafname (slijpen)
   1. Na het ontleden van scBAT doet u het weefsel onmiddellijk in een microcentrifugebuisje, prikt u met een steriele naald een gaatje in de bovenkant van het buisje en vriest u het vloeibare stikstof snel in.
      OPMERKING: De belangrijkste stappen van het protocol die hier worden beschreven, worden geïllustreerd in figuur 3A. Door een gat in de bovenkant van de buis te prikken voordat u deze in vloeibare stikstof laat vallen, wordt voorkomen dat de buis barst door de plotselinge drukverandering.
   2. Vul een plastic bekerglas met vloeibare stikstof en laat een stamper en een dunne spatel weken.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de temperatuur van alle gereedschappen en weefselmonsters tijdens de hele procedure zo koud mogelijk te houden, dicht bij de temperatuur van vloeibare stikstof, om te voorkomen dat het weefsel ontdooit. Ontdooid vetweefsel is zeer hechtend en maakt het poederen uitdagender. Verwijder gereedschap en monsters alleen direct voor gebruik uit de baden met vloeibare stikstof.
   3. Neem één ingevroren weefselmonster per keer en giet het uit de microcentrifugebuis in de vijzel.
   4. Voeg een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof toe aan de vijzel en gebruik de stamper om het bevroren weefsel te malen totdat het volledig is verpulverd.
      NOTITIE: Als het weefsel op enig moment zacht of plakkerig begint te worden, ontdooit het; Giet meer vloeibare stikstof in de vijzel.
   5. Gebruik de dunne spatel om het verpulverde weefsel voorzichtig te schrapen en terug in de microcentrifugebuis over te brengen. Giet vloeibare stikstof in de vijzel terwijl je schraapt om overgebleven stukjes weefsel te verzamelen voordat je het met een spatel overbrengt. Herhaal de overdrachtsstappen totdat al het weefsel uit de mortel is verwijderd.
   6. Reinig de mortel met een lichte doekwisser en 70% ethanol voordat u het volgende monster dumpt om te malen. Bewaar het poedervormige zakdoekje langdurig in een vriezer van -80 °C.
2. Totale RNA-isolatie
   1. Voorbereiding
      1. Reinig de werkbank, pipetten, tiphouders en buisrekken met zowel 70% ethanol als oppervlakteontsmettingsmiddel om RNase te verwijderen.
      2. Laat de centrifugemachine draaien om 4 °C te bereiken.
      3. Verwarm de elutie-oplossing tot 70 °C.
      4. Verdun DNase I door 5 μl gereconstitueerde DNase I te mengen met 75 μl DNase-verdunningsoplossing per monster. Plaats de DNase I-oplossing op ijs tot gebruik.
   2. Procedure
      1. Label voor elk monster twee microcentrifugebuisjes, twee kolomhouderbuisjes (twee microcentrifugebuisjes zonder dop) en één bindende minikolom.
      2. Voeg 500 μL RNA-isolatieoplossing toe aan elk monster en sonificeer gedurende 30 s met behulp van een pelletstampermotor.
      3. Pak een spuit voor elk monster en pipetteer 10x op en neer om het weefsel verder te lyseren. Zorg ervoor dat er geen vaste stoffen zichtbaar zijn na het spuiten.
      4. Voeg af en toe 250 μL chloroform en vortex toe terwijl u 5 minuten wacht tot de monsters bij kamertemperatuur zijn geïncubeerd.
      5. Centrifugeer bij 21.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
      6. Breng het bovenste waterige gedeelte over in een nieuwe microcentrifugebuis en voeg een equivalente hoeveelheid 70% ethanol (~500 μL) toe.
         OPMERKING: Het bovenste waterige gedeelte moet helder zijn, de onderkant moet de rode RNA-isolatieoplossing zijn en tussen de twee lagen moeten enkele ongewenste vaste stoffen zitten.
      7. Breng 500 μL van het nieuwe lysaat over in de bindingskolom. Centrifugeer bij 18.000 × g gedurende 60 s en gooi het filtraat vervolgens weg.
      8. Herhaal de vorige stap met het resterende lysaat om al het RNA in de bindingskolom te krijgen.
      9. Voeg 700 μL wassing met een lage strengheid toe aan de bindingskolom, centrifugeer gedurende 30 s en gooi het filtraat weg.
      10. Voeg 80 μL verdund DNase I toe aan elke bindingskolom. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      11. Voeg 700 μL was met hoge strengheid toe, centrifugeer gedurende 30 s en gooi het filtraat weg.
      12. Voeg 700 μL wasgoed met lage strengheid toe, centrifugeer gedurende 60 s en gooi het filtraat weg.
      13. Verplaats de bindkolommen in de^2e nieuwe doploze kolomhouderbuis en centrifugeer gedurende 2 minuten om ervoor te zorgen dat alle vloeistoffen uit de bindkolom worden verwijderd.
      14. Verplaats de bindingskolommen naar een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 30 μL verwarmde elutieoplossing toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
      15. Centrifugeer gedurende 2 minuten om het geëlueerde RNA op de bodem van de microcentrifugebuis te verzamelen.
      16. Meet de totale RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
          OPMERKING: Als de totale RNA-zuiverheid laag is, aangegeven door een waarde van 260/280 onder 2.0 of een waarde van 260/230 onder 1.8, dan kunnen de monsters na stap 3.2.2.12 nog een keer worden gewassen met een lage stringentie, gevolgd door een wasbeurt met 80% ethanol voordat ze verder gaan met stap 3.2.2.13.
      17. Bewaar het RNA in een vriezer van -80 °C.
   3. Omgekeerde transcriptie (RT)
      1. Voeg in een PCR-buisstrip 0,5-1 μg totaal RNA verdund in met DEPC behandeld water toe tot een totaal van 8 μL voor elk RNA-monster aan een ander putje.
         OPMERKING: De hoeveelheid RNA die wordt gebruikt voor reverse transcriptie kan omhoog of omlaag worden geschaald volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Voeg 1 μL Oligo dT en 1 μL dNTP's toe aan elk monster in de PCR-buis. Zorg ervoor dat het totale volume 10 μL per monster is.
      3. Plaats de PCR-buisstrip in een thermocycler en stel deze in op 65 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 4 °C voor onbepaalde tijd.
      4. Haal na 5 minuten bij 65 °C de strip van de PCR-buis eruit en plaats de buis minimaal 2 minuten op ijs. Voeg na incubatie op ijs vijf reagentia toe: 4 μL 5x First-Strand buffer, 2 μL 25 mM MgCl₂, 2 μL 0,1 M DTT, 1 μL RNaseremmer en 1 μL reverse transcriptase aan elk monster. Zorg ervoor dat het totale volume nu 20 μL per monster is.
      5. Plaats de PCR-buisstrip terug in de thermocycler en stel het programma in op 50 °C gedurende 50 min, vervolgens 85 °C gedurende 5 minuten en vervolgens 4 °C voor onbepaalde tijd.
      6. Zodra het programma 4 °C bereikt, haalt u de strip eruit en voegt u 1 μL Ribonuclease H (RNase H) toe.
         OPMERKING: RNase H wordt gebruikt om eventuele resterende RNA-sjablonen in de RT-reactie te verwijderen; door deze stap zou het gewenste RNA al moeten worden omgezet in cDNA.
      7. Plaats de strip terug in de thermocycler en laat 37 °C gedurende 20 minuten draaien en vervolgens 4 °C voor onbepaalde tijd.
      8. Omgekeerde transcriptie is voltooid; cDNA-concentratie meten met behulp van een spectrofotometer.
      9. Verdun het cDNA tot 250 ng/μL; bewaar het cDNA in een vriezer van -80 °C of -20 °C.
   4. Kwantitatieve PCR (qPCR)
      1. Maak een spreadsheet om de positie van elke primer en elk monster op de qPCR-plaat met 96 putjes te organiseren.
         OPMERKING: Een van de primers moet een referentiegen zijn om de expressie van alle andere interessante genen, zoals 36B4, te normaliseren.
      2. Maak een primer master mix voor elke "primer + sample" combinatie. Voeg aan elk qPCR-reactieputje 3 μL water van moleculaire biologiekwaliteit, 5 μL qPCR-enzymmastermengsel, 0,5 μL voorwaartse primer en 0,5 μL omgekeerde primer toe, wat neerkomt op 9 μL per reactie. Voeg 1 μL cDNA per reactie toe om een totaal van 10 μL per reactieputje te maken.
         OPMERKING: De standaard is om drie technische replicaten te hebben voor elke "primer + sample" combinatie, dus elke mastermix moet 4x van de bovenstaande hoeveelheden zijn.
      3. Voeg 1 μL cDNA toe voor elke replicatie aan elke primer master mix. Als elke mastermix 4x is, pipet dan 4 μL van elk monster cDNA in hun eigen gelabelde buis.
      4. Pipetteer ten slotte 10 μL van elk reactiemengsel in de qPCR-plaat met 96 putjes op de posities die door de spreadsheet worden bepaald.
      5. Sluit de plaat af met een dikke zelfklevende afdichting en centrifugeer vervolgens de plaat met 96 putjes bij 450 × g bij 20 °C gedurende 2 min.
         NOTITIE: Het is van cruciaal belang dat de plaat volledig is afgesloten om te voorkomen dat monsters verdampen tijdens het thermocyclen. Gebruik lichte doekdoekjes om de afdichting op de plaat te drukken, vooral de randen.
      6. Laat de plaat in een real-time PCR-instrument lopen. Programmeer de PCR-reactie volgens de instructies van de fabrikant: 2 minuten bij 50 °C, gevolgd door nog eens 2 minuten bij 95 °C en tenslotte 40 cycli van 15 s bij 95 °C en 30 s bij 60 °C. De resultaten van de qPCR-genexpressieanalyse zijn weergegeven in figuur 3B.

Results

In tegenstelling tot iBAT, dat zich in de onderhuidse laag van de rug tussen twee schouderbladen bevindt, bevindt scBAT zich in de tussenlaag van de nek en strekt het zich diep uit tussen de lagen skeletspieren en de speekselklier terwijl deze langs de uitwendige halsader groeit (Figuur 1A). Het ontleden van scBAT is niet zo eenvoudig als iBAT. Hier geven we een gedetailleerde procedure inclusief cruciale stappen voor het ontleden van intacte scBAT van postnatale en volwassen muizen (Figuur 1B,C). Na het openen van de nek met behulp van het meegeleverde protocol, kan een dunne laag scBAT worden geïdentificeerd onder een ontleedmicroscoop en met een pincet worden afgepeld van de aangesloten speekselklier en externe halsader (Figuur 1D,E). Om de morfologie van het depot te beoordelen, werd vers geïsoleerde scBAT verwerkt met behulp van de verstrekte verwerkingsprocedure in combinatie met een eerder gepubliceerde H&E-kleuringsprocedure¹⁹ (Figuur 2A). Zoals te zien is in figuur 2B, bezit scBAT weefselstructuren die typisch zijn voor BBT-depots en is het samengesteld uit vele kleine, multiloculaire adipocyten bij gezonde postnatale en volwassen muizen. Om de genexpressieniveaus in scBAT te beoordelen, werd RNA geëxtraheerd uit geïsoleerde scBAT-depots met behulp van de verstrekte procedures (Figuur 3A). Expressieniveaus van genen die van belang zijn, kunnen vervolgens worden beoordeeld met standaard RT-qPCR-methoden (Figuur 3A). Zoals te zien is in figuur 3B, de differentiële expressieniveaus van genen die betrokken zijn bij de mediërende scBAT-functie, waaronder Pparg, de hoofdregulator van de BBT-ontwikkeling; Fabp4 en Glut4, twee nutriëntentransporters; en Ucp1 en Ppargc1a, twee genen die betrokken zijn bij thermogenese, kunnen gemakkelijk worden bepaald. Ter vergelijking werd RNA geëxtraheerd uit geïsoleerde iBAT en werd de expressie van de hierboven genoemde genen ook beoordeeld met behulp van de verstrekte procedures (Figuur 3A). De expressieniveaus van deze genen zijn relatief vergelijkbaar tussen deze twee depots. (Figuur 3B).

Figuur 1: Anatomische locatie van scBAT en proces van dissectie. (A) de locatie van scBAT in de tussenlaag van de nek. (B) De oppervlakkige laag van de nek voor en na het verwijderen van de huid. Schaalbalk = 250 μm. Gele stippellijnen schetsen het gebied dat moet worden blootgelegd na het maken van de U-vormige incisie. (C) Afbeelding van een muizenkarkas dat onder een ontleedmicroscoop wordt geplaatst om de visuele helderheid tijdens de dissectie te vergroten. (D,E) Representatieve beelden van de tussenlaag van de nek voor en na scBAT is verwijderd bij muizen van 3 weken en 3 maanden oud. Schaalbalk = 250 μm. Gele stippellijnen omlijnen blootgestelde bilaterale scBAT-depots; n = 2. Afkortingen: scBAT = supraclaviculair bruin vetweefsel; SFI = oppervlakkige laag; sg = speekselklier; tr = luchtpijp; JV = uitwendige halsader; sm = skeletspier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Verwerking van scBAT voor H&E-kleuring. (A) Stroomdiagram ter illustratie van de belangrijkste stappen van scBAT-verwerking voor H&E-kleuring. Na het ontleden van het weefsel wordt het achtereenvolgens gefixeerd, gedehydrateerd, ingebed, in secties gesneden en gekleurd. (B) representatieve beelden van H&E-gekleurde scBAT van muizen van 3 weken en 3 maanden oud; n = 3 voor elke ontwikkelingsfase; schaalbalk = 250 μm voor beelden met een lagere vergroting; Schaalbalk = 50 μm voor beelden met een hogere vergroting. Afkortingen: scBAT = supraclaviculair bruin vetweefsel; PFA = paraformaldehyde; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbereiding van RNA uit scBAT voor genexpressie-analyse. (A) Stroomdiagram dat de stadia van RNA-isolatie en RT-qPCR-analyse van scBAT-genexpressie illustreert. Vanwege het kleine formaat en de zachte textuur is het snel invriezen van het scBAT-depot en het vermalen in vloeibare stikstof cruciaal voor een succesvolle RNA-isolatie. (B) Relatieve expressie van markergenen, waaronder Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 en Ppargc1a, in scBAT en iBAT geïsoleerd uit mannelijke muizen van 3 maanden oud, n = 5. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. 36B4 werd gebruikt als een huishoudelijk gen voor normalisatie. Afkortingen: scBAT = supraclaviculair bruin vetweefsel; RT-qPCR = reverse transcriptie-kwantitatieve PCR; LN₂ = vloeibare stikstof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

In dit protocol presenteren we in detail de procedures voor het ontleden en verwerken van scBAT voor H&E- en genexpressie-analyses. Omdat scBAT zich in de tussenlaag van de hals bevindt en langs de grote aders ligt, vereist de isolatie van dit depot een nauwkeurige techniek. Om een duidelijk zicht op het depot te krijgen, raden we aan om de muis na het openen van de hals onder een ontleedmicroscoop te leggen. Met behulp van een superfijne punttang om scBAT van de speekselklier en de omliggende aderen te verwijderen, moet ervoor worden gezorgd dat de aderen niet worden doorboord. Overmatig bloeden kan het moeilijker maken om de scBAT te lokaliseren. Om scBAT voor H&E-kleuring te verwerken, hebben we het gebruik van een gepubliceerd protocol¹⁹ met kleine wijzigingen aangepast om het gebruik van 4% PFA, dehydrantalcoholen en een organisch oplosmiddel, tolueen, voor weefselverwerking op te nemen, zoals weergegeven in het protocolgedeelte. De hele procedure duurt ~6 dagen om te voltooien en H&E-gekleurde objectglaasjes kunnen de volgende dag na voltooiing van de kleuring worden afgebeeld.

RT-qPCR met RNA als uitgangsmateriaal is de meest gebruikte methode voor genexpressie-analyse op het gebied van vetweefselbiologie. Omdat scBAT een relatief klein BAT-depot is in vergelijking met iBAT, kan het moeilijk zijn om voldoende RNA voor genexpressie te verkrijgen. Om de RNA-opbrengst te verhogen, raden we aan om sequentiële lysaatbereidingsstappen toe te passen zoals beschreven in het protocolgedeelte, te beginnen met het verpoederen van het weefsel met een stamper en vijzel terwijl het bevroren is. Met behulp van deze lysaatbereidingsmethode hebben we met succes een RNA-monster met een hoge opbrengst en hoge kwaliteit verkregen voor genexpressie-analyse van scBAT van één volwassen muis. Deze lysaatbereidingsmethode kan ook worden toegepast om hoogwaardige eiwitlysaten uit scBAT te verkrijgen voor western blotting met behulp van eiwitlysisbuffer.

Met behulp van muizen iBAT hebben onderzoekers substantiële kennis opgedaan over de BAT-functie in thermogenese en metabolisme. De recente identificatie van enkele voorheen niet-herkende BAT-depots bij muizen en mensen, waaronder scBAT, onthulde de noodzaak van meer studies voordat we de fysiologische bijdrage van BAT bij muizen en volwassen mensen volledig kunnen begrijpen. Met name studies die de oorsprong, functies en betrokkenheid van deze nieuw gevonden BAT-depots bij thermogenese en regionaal metabolisme of metabolisme van het hele lichaam belichten, zijn gerechtvaardigd.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)	Epredia	8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-well PCR plate	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Base Molds (for embedding)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ1500
DNase Dilution Solution	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elution solution	Bio-Rad	7326801
EM 400 embedding medium paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Embedding Cassettes	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Mortar Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (for 0.85% saline)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffin Section Flotation Bath	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’			Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (surface decontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Scintillation Vial (glass)	Electron Microscopy Sciences	72632
Slide drying bench	Electrothermal (Cole-Parmer)	MH6616
Stainless staining rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Stereo microscope (for embedding)	Olympus	SZ51
Sugical scissors	McKesson	43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)	Electron Microscopy Sciences	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Transfer pipette	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL