Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hemostase van punctiewonden en voorbereiding van monsters voor gemonteerde elektronenmicroscopieanalyse met een groot gebied

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66479

⸱

24 mei 2024

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Een punctiewondprocedure voor hemostatische trombusvorming wordt hier gepresenteerd. De gevormde trombi zijn groot en hebben een diameter van honderden microns. Daarom zijn benaderingen voor volumebeeldvorming geschikt. We stellen geassembleerde elektronenmicroscopie met een breed gebied voor als een benadering met hoge resolutie die voor velen beschikbaar is en detailleren een preparatief protocol.

Samenvatting

Hemostase, het proces van normale fysiologische controle van vasculaire schade, is van fundamenteel belang voor het menselijk leven. We hebben allemaal wel eens last van kleine snijwonden en prikwonden. Bij hemostase leidt zelfbeperkende aggregatie van bloedplaatjes tot de vorming van een gestructureerde trombus waarbij het stoppen van het bloeden het gevolg is van het van buitenaf afdekken van het gat. Gedetailleerde karakterisering van deze structuur zou kunnen leiden tot onderscheid tussen hemostase en trombose, een geval van overmatige aggregatie van bloedplaatjes die leidt tot occlusieve stolling. Hier wordt een op beeldvorming gebaseerde benadering van de trombusstructuur van een punctiewond gepresenteerd die gebruikmaakt van het vermogen van elektronenmicroscopie met dunne doorsnede om het inwendige van hemostatische trombi te visualiseren. De meest elementaire stap in elk op beeldvorming gebaseerd experimenteel protocol is een goede monstervoorbereiding. Het protocol biedt gedetailleerde procedures voor het voorbereiden van prikwonden en bloedplaatjesrijke trombi bij muizen voor daaropvolgende elektronenmicroscopie. Er wordt een gedetailleerde procedure gegeven voor in situ fixatie van de vormende prikgewonden trombus en de daaropvolgende verwerking ervan voor kleuring en inbedding voor elektronenmicroscopie. Elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd als de eindbeeldvormingstechniek vanwege het vermogen, in combinatie met sequentiële doorsneden, om de details van het inwendige van de trombus met hoge resolutie te visualiseren. Als beeldvormingsmethode geeft elektronenmicroscopie onbevooroordeelde bemonstering en een experimentele output die schaalt van nanometer tot millimeter in 2 of 3 dimensies. Geschikte freeware elektronenmicroscopiesoftware wordt aangehaald die elektronenmicroscopie met een groot gebied zal ondersteunen, waarbij honderden frames kunnen worden gemengd om beeldvorming op nanometerschaal van volledige doorsnedes van de trombi van de punctiewond te geven. Daarom kan elk subgebied van het afbeeldingsbestand gemakkelijk in de context van de volledige doorsnede worden geplaatst.

Inleiding

De vorming van een punctiewond trombus die leidt tot het stoppen van het bloeden is een van de meest essentiële gebeurtenissen in het leven1. Maar ondanks die essentie is de kennis van wat er structureel gebeurt tijdens de vorming van trombus, of het nu in een ader, een slagader, een atherosclerotische gebeurtenis of een occlusief stolsel is, beperkt door resolutie en beeldvormingsdiepte. Conventionele lichtmicroscopie is beperkt in diepte in vergelijking met een volledig gevormde punctiegewonden trombus, 200 tot 300 μm in Z1, en in resolutieniveau in vergelijking met de grootte van bloedplaatjesorganellen en hun afstand, vaak minder dan 30 nm2. Microscopie met twee fotonen kan de benodigde beelddiepte opleveren, maar verbetert de resolutie niet significant. De meest recente ontwikkelingen in lichtmicroscopie, bijvoorbeeld superresolutietechnieken, zijn nog steeds resolutiebeperkt, in de praktijk ~20 nm in XY en twee keer zo groot als in Z, en dieptebeperkt, niet meer dan conventionele lichtmicroscopie. Bovendien is superresolutie lichtmicroscopie, zoals veel van de onderzoekslichtmicroscopie, gebaseerd op fluorescentiemicroscopie, een techniek die inherent bevooroordeeld is voor een kleine set kandidaat-eiwitten waarvoor goede antilichamen bestaan of goed gelabelde constructen3. Concluderend kan conventionele scanning-elektronenmicroscopie hoogstens het oppervlak van de vormende bloedplaatjesrijke trombus visualiseren.

Om deze technische beperkingen bij het karakteriseren van de trombusstructuur te overwinnen, hadden we drie doelen. Produceer eerst reproduceerbaar een gedefinieerde prikwond in een muizenader of slagader die vervolgens gemakkelijk ter plaatse kan worden gestabiliseerd door chemische fixatie. Ten tweede, pas een preparatieve procedure toe die de nadruk legt op membraanbehoud, een doel dat consistent is met het doel om de positie van individuele bloedplaatjes binnen de vormende trombus te definiëren. Ten derde, gebruik een onbevooroordeelde visualisatietechniek die, in een enkele afbeelding, kan worden geschaald tussen nanometer tot bijna millimeterschaal.

Gemonteerde, breedveld-elektronenmicroscopie werd gekozen als een belangrijke eindvisualisatietechniek om één belangrijke reden: bij elektronenmicroscoopbeeldvorming ziet men een breed scala aan kenmerken in een cel die de organellen en kenmerken in de organellen schetsen. Kleine voorwerpen zoals ribosomen kunnen worden herkend. Dit scala aan kenmerken wordt gezien omdat de elektronendichte zware metaalvlekken, uranyl, lood en osmium, die worden gebruikt voor elektronenmicroscopie om contrast op te leveren, binden aan een breed scala aan moleculen. In een elektronenmicroscoopbeeld zie je veel van wat er is, terwijl je bij immunofluorescentie en eiwittagging alleen ziet wat oplicht. Dit betekent bijvoorbeeld de antigeenplaatsen die aanwezig zijn op een bepaalde individuele eiwitsoort. In het geval van een gelabeld molecuul, vaak een eiwit, is het de plaats(en) waar dat eiwit zich bevindt. Alle andere moleculen zijn donker en niet verlicht. Is deze keuze voor elektronenmicroscopie echter praktisch? Een prikgewond trombus heeft een grootte van 300 bij 500 μm en bij een pixelgrootte van 3 nm is dat een beeld van 100.000 bij 167.000 pixels. Een hoogwaardige elektronenmicroscoopcamera heeft 4000 bij 4000 pixels. Dat betekent dat er ongeveer 1000 frames moeten worden samengevoegd/gemengd om een enkel beeld te geven. Dat is een mogelijkheid die aanwezig is in de meeste elektronenmicroscopen die de afgelopen 15 jaar zijn vervaardigd. De microscooptafel is gecomputeriseerd en de beelden kunnen met een computer aan elkaar worden genaaid. Dat is de gedachte die heeft geleid tot keuzes die ten grondslag liggen aan de formulering van het gepresenteerde protocol.

Concluderend presenteren we hieronder een reeks stappen die een reproduceerbare wond in de ader of slagader van muizen geven die vervolgens, na in situ fixatiestappen en latere inbeddingsstappen, kan worden gevisualiseerd door gemonteerde, breed-gebied transmissie elektronenmicroscopie op nm-schaal en in het gestikte beeld gevisualiseerd op bijna mm-schaal, de schaal van de werkelijke in situ vaste trombus. Een dergelijke schaalbaarheid is nodig om de vorming van trombus te begrijpen als zowel een probleem in de hematologie/gezondheid als als een ontwikkelingsbiologisch systeem waarin bloedplaatjes het belangrijkste celtype zijn. Deze vooruitgang levert een belangrijke deugd van elektronenmicroscopie op, namelijk dat men ziet wat er is, niet alleen wat oplicht. Voor een gedetailleerd protocol over de voorbereiding van monsters voor seriële blokvlakscanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM), wordt de lezer verwezen naar een recent artikel van Joshi et al.4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Experimenten werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Arkansas voor Medische Wetenschappen. Hier werden 8 - 12 weken oude, wildtype mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 muizen gebruikt. Deze muizen zijn jonge volwassenen met weinig vetophoping. Dezelfde procedures zijn van toepassing op muizenmutanten voor verschillende eiwitten die belangrijk zijn voor hemostase, zoals von Willebrand-factor of bloedplaatjesglycoproteïne VI (GPVI)5,6. Alle apparatuur, chirurgische instrumenten, reagentia en andere gebruikte materialen worden weergegeven in afbeelding 1 en vermeld in de materiaaltabel.

1. Prikwond van de halsader/dijbeenslagader 1,7

  1. Verdoving van de muis
    1. Plaats de muis in de inductiekamer en zet de isofluraanverdamper op een hoge stroomsnelheid (500 ml/min, 3% isofluraan). Er is gekozen voor isofluraan omdat het weinig effect heeft op de diameter van de bloedvaten.
      LET OP: Langdurige blootstelling aan isofluraan kan nadelige gezondheidseffecten veroorzaken. Het gebruik van een verdamper met een laag debiet, anesthesiegasopvangbussen en goede ventilatie van de kamer kan de blootstelling aanzienlijk verminderen.
    2. Wanneer de muis in slaap lijkt te vallen, knijpt u in een van de tenen van de muis om te zien of de muis reageert. Als dit het geval is, plaatst u de muis een paar minuten terug in de inductiekamer en probeert u de knijptest opnieuw. Als de muis niet reageert, plaats hem dan in rugligging op de verwarmingsplaat (eerder bedekt met aluminiumfolie).
    3. Draai de verdamper omlaag naar een laag debiet (100 ml/min, 1,75% isofluraan). Plaats de neus van de muis in de neuskegel. Verleng elk ledemaat en plak af met kleine stukjes plakband.
    4. Plaats de rectale temperatuursonde en stel de temperatuur in op 37 °C op de temperatuurregelaar. Plak het snoer van de temperatuursonde vast om te voorkomen dat de sonde er per ongeluk uit wordt getrokken.
  2. Muis incisie
    1. Scheer met de tondeuse de nek en borst van de muis (voor halsader) of de binnenkant van het rechterbeen (voor de dijbeenslagader). Veeg het vachtknipsel weg met een alcoholdoekje. Ga indien nodig opnieuw met de tondeuse over het gebied om eventuele achtergebleven vacht te verwijderen.
    2. Veeg het gebied opnieuw af met een vers alcoholdoekje om al het knipsel te verwijderen. Het is erg belangrijk dat de ruimte zo schoon mogelijk is. Bevestig het chirurgische vlak van anesthesie door in de tenen te knijpen.
    3. Til met een schaar en een stompe tang de huid op en knip deze over de rechter halsader. Snijd een rond venster in de huid dat groot genoeg is om de halsader en een deel van het omliggende weefsel bloot te leggen.
  3. Reiniging van de halsader (dezelfde principes gelden voor de dijbeenslagader)
    1. Duw met behulp van de stompe dissectietechniek voorzichtig vet- en lymfeklieren en bindweefsel opzij.
      OPMERKING: Bij deze stap vindt enige algemene reiniging rond het vat plaats; Er vindt echter een zorgvuldige, grondige reiniging plaats onder de microscoop nadat de halsader gedurende 24 uur in paraformaldehyde is gefixeerd.
    2. Vul een spuit van 20 ml met een normale zoutoplossing die is opgewarmd tot 37 °C. Plaats de spuit in de infuuspomp van de spuit. Bevestig de 27G vlindernaald en de bijbehorende slang aan de spuit.
    3. Stel de spuitpomp in op een debiet van 0,5 ml/min. De zachte stroom zoutoplossing zal het bloed van de doorboorde ader/slagader wegspoelen. Plaats de stroom zoutoplossing een paar mm naar de zijkant van de prikplaats, niet er direct overheen.
  4. Aanboren van de halsader/dijbeenslagader
    1. Start de timer. Verkrijg een injectienaald van 30 G (nominale diameter van 300 μm) voor de halsader en een injectienaald van 33 G (diameter van 200 μm) voor de dijbeenslagader. Het gebruik van een kleinere naald geeft slechts een iets langere bloedingstijd voor de arteriële situatie met hogere druk.
    2. Draai de afschuining naar boven. Plaats de naald in een hoek van 25° over de halsader/dijbeenslagader. Noteer de tijd.
    3. Prik het vat snel door en zorg ervoor dat u alleen de bovenkant van het vat doorboort. Pas op dat u niet ook de bodem van het vat doorboort. Noteer het tijdstip waarop het bloeden volledig stopt.
    4. Wacht gedurende de juiste hoeveelheid tijd om trombusvorming te verkrijgen (Figuur 2A) voordat u met perfusiefixatie begint (d.w.z. 1, 5, 10 of 20 minuten om verschillende stadia van trombusontwikkeling te verkrijgen). Euthanaseer het dier door verbloeding of volg de lokale institutionele richtlijnen voor euthanasie.
  5. Transcardiale perfusiefixatie uitvoeren
    1. Stel de peristaltische pomp in voordat de operatie begint. Plaats twee conische buisjes van 50 ml in een reageerbuisrek. Vul een buisje met 4% paraformaldehydefixeeroplossing bereid in natriumcacodylaatbufferoplossing (0,2 M natriumcacodylaat, 0,15 M natriumchloride bij pH 7,4) voor halsslagaderpunctieonderzoek en vul het andere buisje met natriumcacodylaatbufferoplossing.
      OPMERKING: De hier beschreven omstandigheden zijn voldoende voor het lagedrukgeval van de halsslagader en worden vervolgens aangepast voor het hogere drukgeval van een slagader. Voor onderzoek naar het hogedruksysteem met slagaders, d.w.z. de dijbeenslagader, wordt het paraformaldehydefixeermiddel aangevuld met 0,1% glutaaraldehyde en wordt externe druppelfixatie gecombineerd met perfusiefixatie.
    2. Plaats het opnameuiteinde van de pompslang in de slang met de bufferoplossing. Bevestig een 27G vlindernaald met bijbehorende slang aan het uitgangsuiteinde van de pompslang en plaats de naald in een schone beker.
    3. Stel de slangenpomp in op een debiet van 10 ml/min. Zet de perfusiepomp aan.
    4. Wanneer de bufferoplossing van de naald in het bekerglas begint te stromen, zet u de pomp uit. De slang en naald zijn nu klaar voor de transcardiale perfusie.
    5. Leg de borstholte bloot door een middellijn in de huid te snijden vanaf de bovenkant van het borstbeen tot een paar millimeter voorbij de onderkant van het borstbeen met behulp van een ontleedschaar en een stompe pincet. Maak dwarse incisies langs de basis van de ribbenkast, beginnend bij de middellijn en aan elke kant van mediaal naar lateraal snijdend.
    6. Snijd onmiddellijk voor het starten van de transcardiale perfusie snel de ribbenkast open en reflecteer elke kant om het hart bloot te leggen.
    7. Zet de peristaltische pomp aan. Plaats de punt van de 27G vlindernaald in de basis van de linker hartkamer.
    8. Terwijl u de naald stevig in de linkerventrikel houdt, knipt u met een scherpe ontleedschaar een spleet in de rechteroorschelp af om bloed en perfusievloeistof naar buiten te laten stromen. Noteer de tijd op de timer.
    9. Perfuseer gedurende 3 minuten met bufferoplossing om het bloed uit de bloedsomloop te spoelen. Terwijl u de naald nog steeds stevig in de linkerventrikel houdt, schakelt u de peristaltische pomp uit en verplaatst u het opnameuiteinde van de slangen van de peristaltische pomp naar de slang van 50 ml met de fixeeroplossing.
    10. Noteer de tijd op de timer. Zet de peristaltische pomp weer aan en laat 7 minuten perfuseren met de fixeervloeistof. Zet de slangenpomp uit.
    11. Haal de naald uit de linker hartkamer en plaats deze in een afvalbeker. Plaats het opnameuiteinde van de pompslang in een beker met gedestilleerd water.
    12. Zet de slangenpomp aan en laat ongeveer 20 ml water door de slang stromen en uit de naald van 27G in het afvalbekerglas om de slang schoon te maken. Zorg ervoor dat al het water uit de slang en naald loopt voordat u de pomp uitschakelt.

2. Verzameling van monsters voor elektronenmicroscopie

  1. Na perfusiefixatie aangevuld met een eerste 2 minuten extern fixeermiddel in het geval van prikwonden van de dijbeenslagader, ontleedt u zorgvuldig het deel van de halsader/dijbeenslagader dat de prikplaats en de trombus bevat (figuur 2A). Maak met een scherpe schaar een diagonale snede over het distale uiteinde van het vaatsegment en maak een rechte snede over het proximale uiteinde van het vaatsegment.
    OPMERKING: Door op deze manier sneden te maken, kunt u het vat later oriënteren en de richting van de bloedstroom in het vat bepalen.
  2. Dompel het vaatsegment onder in verse 4% paraformaldehyde op kamertemperatuur in een bufferoplossing voor natriumcacodylaten (0,2 m natriumcacodylaat, 0,15 m natriumchloride bij pH 7,4) en plaats het gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Breng het vaste weefsel over naar 4 °C gedurende 24 uur. Neem de volgende dag een kweekschaal van 35 mm met een siliconenmat van ~5 mm dik (van tevoren bereid volgens de instructies van de fabrikant). Giet voldoende natriumcacodylaatbufferoplossing in de schaal om het vaste adersegment onder te dompelen.
  4. Terwijl u onder een lichtmicroscoop (~15x vergroting) kijkt, brengt u het weefsel voorzichtig over naar de 35 mm-schaal met bufferoplossing en speldt u elk uiteinde van het vat op de siliconenmat met behulp van roestvrijstalen minutien-pinnen en een fijne pincet.
  5. Reinig het segment van de halsader/dijbeenslagader voorzichtig met een microschaar en een zeer fijne pincet.
    1. Alleen voor de halsader: Verwijder een van de pinnen en knip met de microschaar de vaatwand tegenover de prik-/trombusplaats in de lengte af. Open het vat voorzichtig en speld het met 4 tot 5 pinnen (elk doormidden gesneden met een draadknipper) op de siliconenmat met de intraluminale kant naar boven.
  6. Zuig de bufferoplossing op, vervang deze snel door 1% paraformaldehydeoplossing in natriumcacodylaatbufferoplossing en plaats het deksel op de schaal. Laat het zakdoekje op geen enkel moment uitdrogen. Houd het altijd ondergedompeld in vloeistof.
  7. Bewaar het weefsel bij 4 °C totdat het tijd is om het te verwerken voor elektronenmicroscopie (Figuur 2B). Verwerk een deel van de steekwondmonsters van de halsader/dijbeenslagader voor beeldvorming met SBF-SEM4 en andere voor beeldvorming met WA-TEM 8,9. De WA-TEM-stappen worden hieronder in detail beschreven.
    LET OP: Voer alle werkzaamheden uit met formaldehyde, propyleenoxide, OsO4 en 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)fenol (DMP-30) in een chemische zuurkast. Dit zijn gevaarlijke chemicaliën. Blootstelling aan OsO4 kan blindheid en de dood veroorzaken.
    OPMERKING: Alle spoel- en vlekvolumes zijn minimaal 2x het volume van het monster. De 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) kan worden vervangen door de 0,1 M natriumcacodylaatbuffer. Tijdens de fixatieprocedure is het erg belangrijk om de monsters nooit te laten uitdrogen, omdat dit de ultrastructuur aanzienlijk zou aantasten. Gebruik polypropyleen buizen.

3. Voorbereiding van het monster voor gemonteerde wide-area transmissie-elektronenmicroscopie (WA-TEM)

OPMERKING: Deze stap vertegenwoordigt een beslissingspunt waarop de onderzoeker zich inzet voor de voorbereiding op WA-TEM. Deze preparatieve procedure ondersteunt SBF-SEM niet. Voor SBF-SEM volume EM moet alle kleuring worden uitgevoerd voordat deze in plastic wordt ingebed. Zie4 voor een SBF-SEM voorbereidingsprotocol.

  1. Was het weefselmonster in de 35 mm schaal 2x met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) of PBS op kamertemperatuur (RT). Houd het monster vastgezet, zodat u de oriëntatie van het monster kunt volgen door middel van deze voorbereidende stappen.
  2. Fixeer met 0,8 ml 0,05% malachietgroen / 2,5% glutaaraldehyde / 0,1 M natriumcacodylaat (pH 6,7 - 7,0) gedurende 20 minuten op ijs.
  3. Verwijder het fixeermiddel en was het monster 4x gedurende 5 minuten met 0,1 M natriumcacodylaat. Verwijder 0,1 M natriumcacodylaat.
  4. Postfix met 0,8 ml 0,8% K3Fe(CN)6 of K4Fe(CN)6 / 1,0% OsO4 K3Fe(CN)6 in 0,1 M natriumcacodylaat. Plaats een deksel over de schaal om het licht buiten te houden (OsO4 is lichtgevoelig). Vlek gedurende 20 minuten tot 1 uur bij RT.
  5. Verwijder de OsO4 en spoel 4x gedurende 5 minuten elk met 0,1 M natriumcacodylaatbuffer. Verwijder de natriumcacodylaatbuffer en vlek met 1% looizuur gedurende 20 minuten op ijs.
  6. Verwijder looizuur en was gedurende 5 minuten met 0,1 M natriumcacodylaatbuffer 1x en 2x gedurende 5 minuten elk met gedestilleerd (DI) water van moleculaire kwaliteit.
  7. Vlek met 0,5% uranylacetaat (UA) gedurende 1 uur RT of 's nachts bij 4 °C in het donker.
  8. Verwijder het uranylacetaat en spoel 5x gedurende 5 minuten met gedestilleerd water van moleculaire kwaliteit. Voor de laatste wasbeurt en terwijl het monster nog ondergedompeld is in DI-water, snijdt u met een scheermesje de siliconenmat rond het vastgezette monster door. Til dit kleine stukje siliconenmat uit de plaat en plaats het in een polypropyleen buis.
    OPMERKING: Het is belangrijk dat het monster vastgepind blijft op het siliconenstuk terwijl het in de buis zit. Het is noodzakelijk om in deze stap over te schakelen op polypropyleen buizen omdat het propyleenoxide dat in de volgende stappen wordt gebruikt, het polystyreen van de 35 mm-platen zal aantasten.
  9. Na het verwijderen van de laatste buffer 1x kort spoelen met 25% ethanol. Gooi de 25% ethanol weg en incubeer met 25% ethanol gedurende 3 minuten op ijs.
  10. Verwijder de 25% ethanol. 1x kort spoelen met 50% ethanol. Gooi de 50% ethanol weg en incubeer met 50% ethanol gedurende 3 minuten op ijs.
  11. Verwijder de 50% ethanol en spoel 1x kort met 75% ethanol. Gooi de 75% ethanol weg en incubeer met 75% ethanol gedurende 3 minuten op ijs.
  12. Verwijder de 75% ethanol en spoel 1x kort af met 95% ethanol. Gooi de 95% ethanol weg en incubeer met 95% ethanol gedurende 3 minuten op ijs.
  13. Verwijder de 95% ethanol en was 3x, minimaal 10 minuten per keer, met 100% ethanol (200 proof). Verwijder 100% ethanol en voeg propyleenoxide (PO) toe. Spoel 3x minimaal 10 min af, met PO.
  14. Bereid de harsmix voor zoals hieronder beschreven.
    1. Verwarm de harscomponenten op 60 °C om volledig vloeibaar te worden. Meng 12,5 ml Embed-218, 7,5 ml Araldite 502 en 27,5 ml DDSA grondig samen in een tube van 50 ml bij 60 °C. Dit mengsel is 6 maanden houdbaar bij 4 °C. Verwarm het voor gebruik tot 60 °C. Aliquot de vereiste hoeveelheid voor gebruik.
  15. Sluit de voorbeelden in zoals hieronder wordt beschreven.
    1. Doe een aliquot van het harsmengsel in een tube en voeg 20 μL/ml DMP-30 activator toe. Meng grondig door te draaien op 60 °C; De kleur moet donkerder worden.
    2. Verdun dit aliquot actieve hars met 50% in PO en laat de hars en PO volledig mengen.
    3. Verwijder de laatste PO-spoeling uit de monsterhoudende buis en vervang deze door het 50% hars/PO-mengsel, waardoor de buis bijna volledig wordt gevuld. Draai het monster een nacht op kamertemperatuur.
    4. Meng de volgende dag een nieuwe hoeveelheid hars (1 ml per monster) met 20 μL/ml DMP-30.
  16. Plaats het monster in een polypropyleen schaal met een klein volume van 50% hars/PO-mix uit de monsterbuis onder een ontleedmicroscoop (~6x vergroting) en haal de pinnen voorzichtig uit het weefsel. Breng alleen het weefsel over naar een andere polypropyleen schaal met een kleine hoeveelheid 100% hars met een DMP-30-activator.
  17. Vul een siliconen embedding mal met de 100% hars met de DMP-30 activator en plaats het monster voorzichtig in de mal. Zet de vorm in de oven en bak minimaal 48 uur op 60 °C. Het voorbereide monster is weergegeven in figuur 2B.
  18. Voer geassembleerde wide-area transmission electron microscopy (WA-TEM) beeldvorming uit zoals beschreven in10,11. Zie figuur 3 voor een weergave van het proces van een eerste punctie tot een 3-dimensionaal gerenderde trombus van 1 minuut. De opname van een gedetailleerd protocol voor geassembleerde WA-TEM-elektronenmicroscopiebeeldvorming is hier niet opgenomen en valt buiten het bereik van de huidige protocollen voor monstervoorbereiding.
    OPMERKING: WA-TEM is een ondergewaardeerde mogelijkheid van de meeste moderne transmissie-elektronenmicroscopen met een geautomatiseerde tafel. Shareware-software die deze functies 10,11 ondersteunt, is verkrijgbaar bij de groep van Dr. David Mastronarde, University of Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwantificering van de effecten van geneesmiddelen op de bloedingstijd van de prikwond
De bloedingstijden van prikwonden bieden een fysiologisch model van een geneesmiddelrisico dat gemakkelijk bij muizen kan worden uitgevoerd. Uitkomsten die voortkomen uit een experiment met een prikwond zijn voorspellend. Hier tonen we een dabigatran dosis-respons bloedingscurve. Dabigatran, een trombineremmer, wordt gebruikt als een oraal direct werkend antistollingsmiddel, een zoge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteren een gedetailleerde procedure voor het produceren van hemostatische trombi in halsaders en dijbeenslagaders, hun in situ perfusiefixatie en monsterverwerking voor gemonteerde transmissie-elektronenmicroscopie met een groot gebied. De algemene procedures zijn nuttig voor het genereren van hemostatische trombi voor ultrastructurele analyse en voor het vergelijken van bloedingstijden bij experimentele muizen, bijvoorbeeld muizen die zijn behandeld met verschillende so...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot deze studie.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken onze collega's van de University of Arkansas for Medical Sciences (Jerry Ware en Sung W. Rhee), de University of Pennsylvania (Tim Stalker en Lawrence Brass), de University of Kentucky (Sidney W. Whiteheart en Smita Joshi) en het National Institute of Bioimaging and Bioengineering van de National Institutes of Health (Richard D. Leapman en Maria A. Aronova) van wie we veel hebben geleerd. De auteurs spreken hun waardering uit voor de American Heart Association en het National Heart Lung and Blood Institute van de National Institutes of Health (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 aan BS en subprijzen van NIH-subsidies R01 HL146373 en R35 HL150818) voor financiële steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% Normal Saline SolutionMedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein setMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needlesMedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needlesMedlineNDA26393
50 mL Conical TubesFisher Scientific06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)MedlineMDS090670Z
Aluminum FoilFisher Scientific01-213-100
Animal Heating PlatePhysitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502Electron Microscopy Sciences10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy CameraCarl Zeiss Microscopy426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mLMedlineB-D303310Z
Calcium ChlorideFisher ScientificC79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mmCorning Inc.430165
Cotton Tipped ApplicatorsMedlineMDS202055H
DMP-30 ActivatorElectron Microscopy Sciences13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSAElectron Microscopy Sciences13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tippedIntegra Miltex6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serratedIntegra Miltex6-6
EMBED 812 ResinElectron Microscopy Sciences14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proofElectron Microscopy Sciences15055
Fisherbrand 4-Way Tube RackFisher Scientific03-448-17
Fisherbrand Digital TimerFisher Scientific14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion PumpFisher Scientific7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 PlyMedlineNON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)Electron Microscopy Sciences16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mLMedline66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5FIntegra Miltex17-305Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 FtVWRMFLX96410-15
L-Aspartic AcidFisher ScientificBP374-100
Lead NitrateFisher ScientificL-62
Malachite Green 4Electron Microscopy Sciences18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump HeadVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital DriveVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire CuttersFisher Scientific50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences19150
Paraformaldehyde (16% Solution)Electron Microscopy Sciences15710
Physitemp Temperature ControllerPhysitemp InstrumentsTCAT-2LV
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP-8131
Propylene Oxide, ACS ReagentElectron Microscopy Sciences20401
Pyrex Glass BeakersFisher Scientific02-555-25B
Rectal Temperature Probe for MicePhysitemp InstrumentsRET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"3M Company305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4Electron Microscopy Sciences11623
SomnoFlo Low Flow Electronic VaporizerKent ScientificSF-01
SomnoFlo Starter Kit for MiceKent ScientificSF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien PinsFine Science Tools26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12Carl Zeiss Microscopy495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone ElastomerWorld Precision InstrumentsSYLG184silicone mat
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21700
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma-Aldrich88535
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Vannas Spring Micro ScissorsFine Science Tools15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, SerratedIntegra Miltex18-818Need 2 pairs.
Wagner ScissorsFine Science Tools14068-12
Wahl MiniFigura Animal TrimmerBraintree ScientificCLP-9868
Zen Lite SoftwareCarl Zeiss Microscopy410135-1001-000
```

Referenties

  1. Rhee, S. W., et al. Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates. Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).
  2. Pokrovskaya, I. D., et al. Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site. Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).
  3. Yadav, S., Storrie, B. The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships. Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).
  4. Joshi, S., et al. Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis. J Vis Exp. (193), e64985(2023).
  5. Guerrero, J. A., et al. Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation. Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).
  6. Kato, K., et al. The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion. Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).
  7. Tomaiuolo, M., et al. Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury. Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).
  8. Cocchiaro, J. L., et al. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  9. Pokrovskaya, I. D., et al. Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway. Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).
  10. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  11. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  12. Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants. Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).
  13. Kiernan, J. A. Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do. Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).
  14. Storrie, B., Attardi, G. Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation. J CellBiol. 56, 819-831 (1973).
  15. Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking. Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).
  16. Klarhofer, M., et al. High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger. Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).
  17. Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. Physiology, cardiovascular. StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).
  18. Pokrovskaya, I. D., et al. SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets. Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).
  19. Pokrovskaya, I. D., et al. 3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets. Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Bloedplaatjesaggregatietrombusstructuurmonstervoorbereidingmuismodellenperfusiefixatiewide-area imagingsequentiële sectievasculaire beschadiging
Hemostase van punctiewonden en voorbereiding van monsters voor gemonteerde elektronenmicroscopieanalyse met een groot gebied
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.