Methodenartikel

Modelleren van gezonde en dysbiotische vaginale micro-omgevingen in een menselijke vagina-op-een-chip

4.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66486

⸱

16 februari 2024

 ,  ,  , 
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Vascular Biology Program and Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School, 3Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een protocol voor het maken van een microfluïdisch vagina-op-een-chip (Vagina Chip) kweekapparaat dat de studie van menselijke gastheerinteracties met een levend vaginaal microbioom onder micro-aerofiele omstandigheden mogelijk maakt. Deze chip kan worden gebruikt als hulpmiddel om vaginale ziekten te onderzoeken en om mogelijke therapeutische tegenmaatregelen te ontwikkelen en te testen.

Samenvatting

De gezondheid van vrouwen, en in het bijzonder ziekten van het vrouwelijke voortplantingsstelsel (FRT), hebben niet de aandacht gekregen die ze verdienen, ook al kan een ongezond voortplantingssysteem leiden tot levensbedreigende ziekten, onvruchtbaarheid of nadelige gevolgen tijdens de zwangerschap. Een barrière in het veld is dat er een gebrek is aan preklinische, experimentele modellen die de fysiologie en pathofysiologie van de FRT getrouw nabootsen. De huidige in vitro - en diermodellen geven de hormonale veranderingen, micro-aerobe omstandigheden en interacties met het vaginale microbioom niet volledig weer. De komst van Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluïdische kweektechnologie die weefsel-weefselinterfaces, vasculaire perfusie, interstitiële vloeistofstromen en de fysieke micro-omgeving van een belangrijke subeenheid van menselijke organen kan nabootsen, kan mogelijk dienen als een oplossing voor dit probleem. Onlangs is een menselijke vaginachip ontwikkeld die de co-cultuur van menselijke vaginale microbiële consortia met primair menselijk vaginaal epitheel ondersteunt en die ook is verbonden met vaginaal stroma en een dynamische vloeistofstroom ervaart. Deze chip repliceert de fysiologische reacties van de menselijke vagina op gezonde en dysbiotische microbiomen. In dit artikel is een gedetailleerd protocol beschreven voor het maken van menselijke Vagina Chips.

Inleiding

Een vaginaal microbioom dat wordt gedomineerd door Lactobacillus spp. dat helpt bij het handhaven van een zure micro-omgeving, speelt een belangrijke rol bij het behoud van de reproductieve gezondheid vanvrouwen1. Soms kan er echter een verandering optreden in de samenstelling van microbiële gemeenschappen waaruit het microbioom bestaat, wat resulteert in een toename van de diversiteit van vaginale bacteriën. Deze dysbiotische veranderingen, die vaak resulteren in een overschakeling van een door Lactobacillus gedomineerde toestand naar een toestand die wordt gedomineerd door meer diverse anaërobe bacteriesoorten (bijv. Gardnerella vaginalis), worden in verband gebracht met verschillende ziekten van het voortplantingssysteem, zoals bacteriële vaginose, atrofische vaginitis, urineweginfectie, vulvovaginale candidiasis, urethritis en chorioamnionitis 2,3,4,5 . Deze ziekten verhogen op hun beurt de kansen van een vrouw om seksueel overdraagbare aandoeningen en bekkenontstekingsaandoeningen te krijgen 6,7,8,9. Ze vormen ook een hoger risico op vroeggeboorte en miskramen bij zwangere vrouwen 10,11,12 en zijn ook betrokken bij onvruchtbaarheid 13,14,15,16.

Hoewel er inspanningen zijn geleverd om vaginale dysbiose te modelleren met behulp van vaginale epitheelcellen die zijn gekweekt in statische, tweedimensionale (2D) kweeksystemen17,18, bootsen ze de fysiologie en complexiteit van de vaginale micro-omgeving niet effectief na19. Diermodellen zijn ook gebruikt om vaginale dysbiose te bestuderen; Hun menstruatiefasen en interacties tussen gastheer en microbioom verschillen echter sterk van die bij mensen, en daarom blijft de fysiologische relevantie van de resultaten van deze onderzoeken onduidelijk 19,20,21. Om deze problemen tegen te gaan, zijn organoïden en Transwell-invoegmodellen van menselijk vaginaal weefsel ook gebruikt om gastheer-pathogene interacties in de FRTte bestuderen 19,22,23,24. Maar omdat dit statische culturen zijn, kunnen ze slechts gedurende een korte periode (<16-24 uur) co-cultuur van menselijke cellen met levende microben ondersteunen, en ze missen veel andere potentieel belangrijke fysieke kenmerken van de menselijke vaginale micro-omgeving, zoals slijmproductie en vloeistofstroom22.

Orgaanchips zijn driedimensionale (3D) microfluïdische kweeksystemen die een of meer parallelle holle microkanalen bevatten die zijn bekleed met levende cellen die zijn gekweekt onder dynamische vloeistofstroom. De tweekanaals chips maken het mogelijk om weefsel-weefselinterfaces op orgaanniveau na te bootsen door verschillende celtypen (bijv. epitheel en stromale fibroblasten of epitheel en vasculair endotheel) te kweken aan weerszijden van een poreus membraan dat de twee parallelle kanalen scheidt (Figuur 1). Beide weefsels kunnen onafhankelijk worden blootgesteld aan vloeistofstroom en ze kunnen ook micro-aërobe omstandigheden ervaren om co-cultuur met een complex microbioom mogelijk te maken 25,26,27,28. Deze aanpak werd onlangs gebruikt om een menselijke vaginachip te ontwikkelen die is bekleed met hormoongevoelig, primair vaginaal epitheel dat is gekoppeld aan onderliggende stromale fibroblasten, die een lage fysiologische zuurstofconcentratie in het epitheellumen ondersteunt en co-cultuur met gezonde en dysbiotische microbiomen gedurende ten minste 3 dagen in vitromogelijk maakt 29. Er werd aangetoond dat de Vagina Chip kan worden gebruikt om kolonisatie door optimale (gezonde) L. crispatus consortia te bestuderen en ontstekingen en verwondingen te detecteren veroorzaakt door niet-optimale (niet-gezonde) G. vaginalis bevattende consortia. Hier beschrijven we in detail de methoden die worden gebruikt om de menselijke vaginachip te maken en om gezonde en dysbiotische bacteriële gemeenschappen op de chip tot stand te brengen.

Protocol

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen voor het gebruik van menselijke cellen. De cellen werden commercieel verkregen (zie Materiaaltabel). Alle stappen moeten aseptisch worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast (BSC). Gebruik voor dit protocol alleen filterpipetpunten (of barrièrepipetpunten).

1. Het kweken van menselijke vaginale epitheelcellen

  1. Verwarm 50 ml vaginaal epitheelmedium (VEM, zie materiaaltabel) tot 37 °C.
  2. Aliquot 9 ml VEM op een tube van 15 ml. Ontdooi vervolgens een injectieflacon met menselijke vaginale epitheelcellen (HVEC's) en voeg deze toe aan de buis met VEM.
  3. Centrifugeer de tube van 15 ml op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en zuig het supernatant op, waarbij de pellet achterblijft.
  4. Resuspendeer de pellet voorzichtig in 2 ml VEM en voeg 1 ml toe aan elk van de twee T75-kolven met 14 ml VEM.
  5. Incubeer de kolven bij 37 °C met 5% CO2 . Vervang VEM elke 2 dagen totdat HVEC's ongeveer 70% confluent zijn (ongeveer 5 dagen).

2. Het kweken van menselijke baarmoederfibroblastcellen

  1. Bereid 10 ml 15 μg/ml Poly-L-lysineoplossing (PLL) in dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Voeg 5 ml PLL-oplossing toe aan elk van de twee T75-kolven en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
  2. Verwarm 50 ml fibroblastmedium (FM, zie materiaaltabel) tot 37 °C.
  3. Zuig de PLL-oplossing op en was elke kolf met 5 ml ddH2O.
  4. Aliquot 9 ml FM in een tube van 15 ml en ontdooi een injectieflacon met menselijke baarmoederfibroblasten (HUF's).
  5. Voeg de HUF's toe aan de tube van 15 ml met FM.
  6. Centrifugeer de buis van 15 ml bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT en zuig de supernatant op, waarbij u de celpellet achterlaat.
  7. Resuspendeer de pellet voorzichtig in 2 ml FM en voeg 1 ml toe aan elk van de twee T75-kolven die 14 ml FM bevatten.
  8. Incubeer kolven bij 37 °C met 5% CO2 tot de cellen ongeveer 70% confluent zijn en vervang het medium om de 2 dagen.

3. Spaanactivering en kanaalcoating

  1. Ontgas de spanen (commercieel verkregen, zie Materiaaltabel) gedurende 30 minuten in een vacuümexsiccator
  2. Laat het activeringsreagens 1 (AR-1) en het activeringsreagens 2 (AR-2) (zie materiaaltabel) gedurende 15 minuten in evenwicht zijn met RT zonder de verpakking te verwijderen.
  3. Wikkel een conische buis van 15 ml in folie om deze tegen licht te beschermen. Voeg langzaam 1 ml AR-2-oplossing toe aan de wanden van de AR-1-injectieflacon en meng goed. Breng het mengsel over in de in folie verpakte tube van 15 ml.
  4. Voeg herhaaldelijk AR-2-oplossing toe aan de AR-1-injectieflacon in stappen van 1 ml totdat het AR-1-poeder volledig uit de injectieflacon is gewassen.
  5. Vul de AR-1 gereconstitueerde oplossing bij tot 10 ml met AR-2 oplossing.
  6. Voeg 200 μL van deze oplossing toe aan de apicale kanaalinlaat van elke chip terwijl u uit de uitlaat zuigt (Figuur 1A). Herhaal dit voor het basale kanaal. Houd de pipet loodrecht op de chip terwijl u de oplossing toevoegt om een goede afdichting met een onbelemmerde stroom te behouden.
  7. Herhaal stap 3.6 voor alle fiches.
  8. Controleer alle fiches op bubbels. Verwijder eventuele luchtbellen door meer oplossing toe te voegen aan het (de) aangetaste kanaal(en).
  9. Zuig alle overtollige AR-1-oplossing van het chipoppervlak en vermijd kanaalinlaten en -uitlaten.
  10. Plaats de frites in een petrischaal van 150 mm en plaats deze onafgedekte schaal in een UV-lichtbak.
  11. Richt de UV-lichtbak naar de achterkant van de BSC en laat de chips 30 minuten onder constant UV-licht staan. De kleur van de oplossing in de chips verandert van donkerroze naar mahonie.
  12. Was elk kanaal door 200 μL AR-2-oplossing aan de inlaat toe te voegen en tegelijkertijd uit de uitlaat te zuigen.
  13. Was elk kanaal twee keer door 200 μL koude DPBS (-/-) aan de inlaat toe te voegen en tegelijkertijd uit de uitlaat te zuigen.
  14. Bereid de apicale kanaalcoating voor (200 μg/ml collageen I en 30 μg/ml collageen IV-mengsel in DMEM) (zie materiaaltabel). Blijf op het ijs.
  15. Bereid de basaalkanaalcoating voor (15 μg/ml PLL en 200 μg/ml collageen I-mengsel in DMEM). Blijf op het ijs.
  16. Voeg 200 μL basale kanaalcoating toe aan de inlaat van het basale kanaal. Sluit het stopcontact aan met een P200-punt wanneer de coatingoplossing bij het stopcontact verschijnt. Doseer de oplossing totdat de volumes van de inlaat- en uitlaattip gelijk zijn en laat vervolgens de pipetpunt los van de pipet, terwijl u de tip in de inlaat laat.
  17. Voeg op dezelfde manier 200 μL apicale kanaalcoating toe aan het apicale kanaal.
  18. Zuig overtollige oplossing van het spaanoppervlak op.
  19. Controleer alle fiches op bubbels. Verwijder eventuele luchtbellen door meer kanaalcoating aan te brengen op het (de) aangetaste kanaal(en).
  20. Incubeer de chips een nacht in een petrischaaltje van 150 mm bij 37 °C met 5% CO2.

4. Zaaien van chip basaal kanaal met HUF's

  1. Bekijk dagelijks de groei van HUF's in de kolf onder een microscoop.
  2. Zodra HUF-culturen voor 70%-90% confluent zijn (~3 dagen na het uitplateren), verwarm dan 25 ml FM, 5 ml Ca2+/Mg2+ vrije DPBS (DPBS (-/-), 10 ml trypsine/EDTA en 15 ml trypsineneutraliserende oplossing (TNS, zie materiaaltabel) tot 37 °C.
  3. Zuig het medium uit de kolven op. Wassen met 5 ml DPBS (-/-) en vervolgens opnieuw opzuigen.
  4. Voeg 4 ml trypsine-EDTA toe aan elke kolf en incubeer bij 37 °C gedurende 3-5 minuten tot de cellen loskomen.
  5. Voeg 6 ml TNS toe aan elke kolf en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml.
  6. Meng de suspensie goed met een pipet en neem een aliquot van 10 μl voor het tellen van cellen. Meng 10 μL celsuspensie met 10 μL trypanblauw en tel met een hemocytometer.
  7. Centrifugecelsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet in warme FM tot een eindconcentratie van 7,5 x 105 cellen/ml.
  8. Was het basale kanaal met 200 μL FM.
  9. Verwarm 15 ml VEM tot 37 °C. Was het apicale kanaal met 200 μL VEM.
  10. Voeg 200 μL volledige VEM toe aan de inlaat van het apicale kanaal terwijl u het stopcontact aansluit met een pipetpunt. Doseer het medium totdat de volumes van de inlaat- en uitlaattip gelijk zijn en laat vervolgens de pipetpunt los van de pipet en laat de tip in de inlaat. Houd het bovenste kanaal gevuld en aangesloten bij zowel de inlaat als de uitlaat.
  11. Pipetteer langzaam 50 μl HUF-celsuspensie in de inlaat van het basale kanaal terwijl u tegelijkertijd uit de uitlaat zuigt. Verwijder de pipetpunt uit de inlaat wanneer ~2 μL van de celsuspensie in de pipetpunt achterblijft zonder op de pipetzuiger te drukken of deze los te laten om luchtbelvorming te voorkomen. Sluit de inlaat en het stopcontact af met pipetpunten.
  12. Controleer onder een microscoop op luchtbellen. Als ze aanwezig zijn, was dan het basaalkanaal met FM en herhaal stap 4.11.
  13. Draai de verstopte chips ondersteboven op een buisrek van 15 ml en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 1 uur. Observeer de chips na incubatie en controleer op celaanhechting.
  14. Sluit het stopcontact van het basale kanaal af met een pipetpunt. Voeg 200 μl FM toe aan de inlaat van het basale kanaal zonder de pipetzuiger naar beneden te drukken. Laat de punt van de pipet los en laat het medium vrij door het kanaal naar de punt van de uitlaatpipet stromen door middel van zwaartekracht.
  15. Incubeer HUF-gezaaide chips een nacht bij 37 °C met 5% CO2.

5. Zaaien van het apicale kanaal van de chip met vaginale epitheelcellen

  1. Verwarm 50 ml VEM tot 37 °C.
  2. Bereid een apicale kanaalcoating voor (200 μg/ml collageen I in DMEM). Blijf op het ijs.
  3. Sluit het stopcontact van het apicale kanaal aan met een pipetpunt.
  4. Voeg 200 μL apicale kanaalcoating toe aan de inlaat van het apicale kanaal. Doseer de apicale coatingoplossing totdat de volumes van de inlaat- en uitlaattip gelijk zijn, laat vervolgens de pipetpunt los van de pipet en laat de tip in de inlaat.
  5. Zuig overtollige oplossing van het oppervlak van de chip.
  6. Chips incuberen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 1 uur.
  7. Was na 1 uur de coating van het apicale kanaal door 200 μL VEM toe te voegen aan de inlaat van het apicale kanaal terwijl u uit de uitlaat zuigt.
  8. Controleer de HVEC-groei onder een microscoop op ~70%-90% confluentie.
  9. Als de cellen voor 70%-90% samenvloeien, verwarm dan 6 ml volledig vaginaal epitheelcelmedium en 4 ml trypsine/EDTA per kolf tot 37 °C.
  10. Zuig het medium op uit de HVEC-kolf en was met 5 ml DPBS (-/-) en zuig vervolgens op.
  11. Voeg 4 ml trypsine toe aan elke kolf en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3-5 minuten tot de cellen loskomen.
  12. Voeg 6 ml VEM toe aan de kolf om trypsine te inactiveren en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml.
  13. Meng de suspensie goed met een pipet en neem een aliquot van 10 μl voor het tellen van cellen. Meng 10 μL celsuspensie met 10 μL trypanblauw en tel met een hemocytometer.
  14. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Aspireer het supernatans op en resuspendeer de pellet in VEM tot een eindconcentratie van 3,5-4 miljoen cellen/ml.
  15. Verwarm 25 ml FM tot 37 °C.
  16. Sluit het stopcontact van het apicale kanaal aan met een pipetpunt. Pipetteer langzaam ten minste 40 μl HVEC-celsuspensie in de inlaat van het apicale kanaal. Doseer de celsuspensie totdat het volume van de inlaat- en uitlaattip gelijk is, laat vervolgens de pipetpunt los van de pipet en laat de tip in de inlaat. Houd het basale kanaal gevuld met FM en aangesloten op zowel de inlaat als de uitlaat.
  17. Zuig voorzichtig overtollig medium op het oppervlak van chips op en controleer op luchtbellen onder een microscoop. Als ze aanwezig zijn, herhaal dan stap 5.16.
  18. Leg de frites in een grote petrischaal en broed ze een nacht uit bij 37 °C met 5% CO2 .
  19. Bekijk de volgende dag chips onder een microscoop voor celaanhechting.
  20. Verwijder de pipetpunten uit de inlaten en uitlaten van zowel het apicale als het basale kanaal.
  21. Sluit de uitgang van het basaalkanaal af met een pipetpunt en voeg 200 μl FM toe aan de inlaat van het basale kanaal zonder op de pipetzuiger te drukken. Laat de pipetpunt los van de pipet en laat het medium vrij door het kanaal naar de uitlaatpipetpunt stromen door middel van zwaartekracht.
  22. Herhaal stap 5.21 voor het apicale kanaal met behulp van VEM.
  23. Incubeer de dubbel gezaaide chips bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.

6. Chips verbinden met peulen en vaginale epitheelcellen differentiëren

  1. Aliquot 50 ml FM en VEM om 50 ml conische buizen te scheiden en op te warmen tot 37 °C.
  2. Ontgas de FM- en VEM-media die zijn opgewarmd tot 37 °C onder een steriel vacuüm gedurende 5 minuten.
  3. Desinfecteer en reinig trays voor de Dynamic Flow Module (DFM, zie Materiaaltabel). Haal de peulen uit de verpakking en plaats ze in de bakjes.
  4. Voeg 2 ml ontgaste VEM toe aan het apicale inlaatreservoir (reservoir rechtsboven; Figuur 1B). Voeg medium toe langs de wanden van het reservoir om luchtbelvorming te voorkomen.
  5. Voeg 3 ml ontgaste FM toe aan het basale inlaatreservoir (reservoir linksboven, figuur 1B). Voeg medium toe langs de wanden van het reservoir om luchtbelvorming te voorkomen.
  6. Voeg 500 μL ontgaste VEM toe aan het apicale uitlaatreservoir (reservoir rechtsonder, figuur 1B). Kantel de pod zodat het medium het hele bodemoppervlak van het reservoir bedekt.
  7. Voeg 500 μL ontgaste FM toe aan het basale uitlaatreservoir (reservoir linksonder, figuur 1B). Kantel de pod zodat het medium het hele bodemoppervlak van het reservoir bedekt.
  8. Schuif trays met peulen in DFM en voer de Prime-cyclus twee keer uit. Controleer of er druppels uit de poorten aan de onderkant van elke pod komen.
  9. Als er zich na 4 "Prime"-cycli geen druppel vormt, maak dan direct contact met de poort in het uitlaatreservoir van de pod (Figuur 1B) en pipetteer 200 μL van het respectieve medium om het medium tussen het reservoir en het kanaal te laten stromen. Dit wordt "Hand-priming" genoemd.
  10. Verwijder de pipetpunten van de chips en plaats een druppel van het betreffende medium over alle poorten voor elke chip.
  11. Schuif de fiches in de peulen en plaats de peulen op de bakjes.
  12. Zuig eventuele media op het oppervlak van de chips op en schuif elke lade in een DFM.
  13. Stel de volgende parameters op de DFM in als: Boven en onder - Vloeistof; Apicale (bovenkanaal) stroom - 15 μL / uur; Basale (bodemkanaal) stroom - 30 μL / uur; Rek = 0%; Frequentie = 0 Hz.
  14. Voer de regelcyclus uit op de DFM en laat de stroom 's nachts toe.
  15. Wijzig na 24 uur de stroominstellingen in 0 μL/h voor het apicale kanaal en houd het basale kanaal nog 24 uur op 30 μL/h stroomsnelheid.
  16. Bereid 500 ml differentiatiemedium (DM) voor door 4 mM L-glutamine, 20 mM Hydrocortison, 1x ITES, 20 nM Triiodothyronine, 100 μM O-Phosphoryl Ethanolamine, 180 μM Adenine, 3,2 mM Calciumchloride, 2% Warmte-geïnactiveerde FBS, 1% Pen-streptokokken en 120 ml Ham's F-12-media toe te voegen aan DMEM met lage glucose (zie Materiaaltabel) en filtersteriliseer.
  17. Verwarm 50 ml DS tot 37 °C.
  18. Voeg 20 μL 10 μM estradiol (zie materiaaltabel) toe aan de 50 ml DM, meng goed en ontgas onder een steriel vacuüm gedurende 5 min.
  19. Verwarm 50 ml VEM tot 37 °C in een waterbad en ontgas onder een steriel vacuüm gedurende 5 min.
  20. Verwijder de trays uit de DFM, plaats ze in een BSC en zuig media op uit de pods, vermijd de poorten in de reservoirs (Figuur 1A). Voeg vervolgens 2 ml VEM toe aan het apicale kanaalinlaatreservoir en 3 ml DM aan het inlaatreservoir van het basale kanaal.
  21. Plaats de trays terug in de DFM en stel de apicale kanaalstroom in op 15 μL/h en de basale kanaalstroom op 30 μL/u.
  22. Laat de DFM 4-7 uur stromen. Stop vervolgens de apicale kanaalstroom door deze in te stellen op 0 μL/h. Laat de basale kanaalstroom doorgaan met 30 μL/u.
  23. Vervang de media volgens de stappen 6.16-6.19 elke 48 uur.
  24. Laat media met tussenpozen in het apicale kanaal gedurende 4-7 uur per dag gedurende 5 extra dagen volgens de stappen 6.20-6.21.
  25. Bereid Hanks' Balanced Salt Solution met een lage buffercapaciteit voor met glucose (HBSS (LB/+G)) media door 1.26 mM calciumchloride, 0.49 mM magnesiumchloridehexahydraat, 0.406 mM magnesiumsulfaat, 5.33 mM Kaliumchloride, 137.93 mM Natriumchloride, 0.441 mM Kaliumfosfaat monobasisch en 5.55 mM D-glucose toe te voegen aan dd H2O (zie Materiaaltabel); pH 4,8.
  26. Bereid 500 ml penstreptokokkenvrije DM voor door 4 mM L-glutamine, 20 mM hydrocortison, 1x ITES, 20 nM triiodothyronine, 100 μM O-fosforylethanolamine, 180 μM Adenine, 3,2 mM calciumchloride, 2% door warmte geïnactiveerde FBS en 120 ml Ham's F-12-media toe te voegen aan DMEM met lage glucose en filter te steriliseren.
  27. Vervang op dag 6 het apicale kanaalmedium door (HBSS (LB/+G)) en het basale kanaalmedium door pen-streptokokkenvrije DM volgens de stappen 6.16-6.19.
  28. Stel het debiet op de DFM in op 15 μL/h voor het apicale kanaal en 30 μL/h voor het basale kanaal gedurende 24 uur voordat u overgaat tot bacteriële inoculatie.

7. Bacteriële inoculatie van gedifferentieerde chips

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit in een laboratorium en BSC die voldoen aan de voorschriften voor het omgaan met microben.

  1. Bereken de kve/ml van elke bacteriestam die in het inoculum moet worden opgenomen. Meng de benodigde hoeveelheid van elke bacteriestam tot een totaal van ~5 x 106 kve/ml.
  2. Centrifugeer het mengsel op 7.000 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C en verwijder voorzichtig het supernatant. Resuspendeer de pellet in (HBSS (LB/+G)). Dit zal het bacteriële inoculum zijn.
  3. Maak de fiches los van de peulen. Sluit de uitlaat van het basale kanaal af met een pipetpunt en voeg 200 μl penstreptokokkenvrije DM toe aan de inlaat van het basale kanaal zonder de pipetzuiger naar beneden te drukken. Laat de pipetpunt los van de pipet en laat het medium vrij door het kanaal naar de uitlaat stromen door middel van zwaartekracht.
  4. Voeg 37 μL van het bacteriële inoculum toe aan de inlaat van het apicale kanaal, terwijl u uit de uitlaat zuigt. Als er nog ongeveer 2 μl in de pipetpunt zit, trekt u de punt naar buiten en sluit u de inlaat en uitlaat van het apicale kanaal af met pipetpunten.
  5. Herhaal voor de controlechips (niet-geënte) stap 7.4 met 37 μL (HBSS (LB/+G)).
  6. Zuig alle media op het oppervlak van de chip op. Leg de chips in een petrischaaltje van 150 mm en broed ze 24 uur uit bij 37 °C met 5% CO2 .
  7. Leg de peulen (zonder chips) op de bakjes en plaats ze in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
  8. Verwarm 50 ml (HBSS (LB/+G)) en 50 ml penstreptokokkenvrije DM tot 37 °C.
  9. Voeg 20 μL 10 μM Estradiol toe aan de 50 ml Pen-Streptokokkenvrije DM, meng goed en ontgas onder een steriel vacuüm gedurende 5 minuten. Ontgas de (HBSS (LB/+G)) onder vacuüm gedurende 5 min.
  10. Zuig het medium in de pods voorzichtig op terwijl u de inlaat- en uitlaatpoorten van het reservoir vermijdt.
  11. Voeg 3 ml ontgast (HBSS (LB/+G)) toe aan het apicale inlaatpodreservoir en 500 μl ontgast (HBSS (LB/+G)) aan het apicale uitlaatpodreservoir.
  12. Voeg 3 ml ontgaste Pen-Streptokokkenvrije DM toe aan het basale inlaatpod-reservoir en 500 μL ontgaste antibioticavrije DM aan het basale uitlaatpod-reservoir.
  13. Schuif de trays met de pods (zonder de chips) in de DFM en voer de Prime-cyclus twee keer uit. Controleer of er druppels uit elke poort aan de onderkant van de pod komen.
    NOTITIE: Als er zich na 4 "Prime"-cycli geen druppel vormt, maak dan direct contact met de poort in het uitlaatreservoir van de pod (Figuur 1B) en pipetteer 200 μL van het respectieve medium om het medium tussen het reservoir en het kanaal te laten stromen.
  14. Verwijder de pipetpunten van de spanen en plaats een druppel van de respectievelijke media over alle kanaalinlaten en -uitgangen.
  15. Schuif de chips in de peulen en plaats de peulen in bakjes.
  16. Zuig media op in de apicale en basale uitlaatpod-reservoirs en alle media op het oppervlak van de chips. Schuif vervolgens de trays in de DFM.
  17. Stel de volgende parameters in op de DFM: Boven en onder - Vloeistof; Apicale (boven) stroom - 40 μL / uur; Basale (bodem) stroom - 40 μL / u; Rekken - 0%; Frequentie - 0 Hz. Voer de regelcyclus uit.
  18. Stop de stroom na 4 uur en verzamel het effluent, d.w.z. de media in de apicale en basale uitlaatreservoirs.
  19. Meet en registreer de effluentvolumes.
  20. Plaats de chips terug in de DFM en stel het apicale debiet in op 0 μL/h en het basale debiet op 30 μL/h. Start de stroom om 's nachts te draaien.
  21. Aliquot het verzamelde afvalwater voor verschillende geplande tests en bewaar ze bij de juiste temperaturen.
    OPMERKING: Voeg voor CFU-meting glycerol toe tot een eindconcentratie van 16% en bewaar onmiddellijk bij -80 °C.
  22. Zuig het medium alleen op in de basale uitlaatreservoirs en stel de apicale en basale stroomsnelheden in op 40 μl/h in de DFM. Start de stroom gedurende 4 uur en herhaal stap 7.18-7.21. Dit is de inzameling van het afvalwater gedurende 48 uur.
  23. Herhaal stap 7.22 gedurende 72 uur of totdat het experiment is afgelopen.
  24. Verzamel aan het eindpunt van het experiment het afvalwater volgens de stappen 7.18-7.19.
  25. Bereid de digestieoplossing voor door 1 mg/ml Collagenase IV toe te voegen in TrypLE express. Verwarm 10 ml spijsverteringsoplossing tot 37 °C.
  26. Sluit de uitlaatpoort van het basale kanaal af met een pipetpunt. Voeg 100 μL digestieoplossing toe aan het basale kanaal. Meng goed en verzamel met een pipet alle oplossing uit het kanaal in een buisje met het label 'Tube B'.
  27. Sluit de uitlaatpoort van het apicale kanaal af met een pipetpunt. Voeg 100 μL digestieoplossing toe aan het apicale kanaal. Meng goed en verzamel met een pipet alle oplossing uit het kanaal in een buisje met het label 'Tube A'.
  28. Voeg nog eens 100 μl van de digestieoplossing toe aan zowel de apicale als de basale kanaalinlaten terwijl u de stopcontacten met pipetpunten afsluit. Incubeer de chips en buizen A en B bij 37 °C gedurende 1-1,5 uur.
  29. Meng de digestie-inhoud goed in de kanalen met behulp van de verstopte tips die al in de inlaten en uitlaten zijn geplaatst. Verzamel de inhoud van de apicale en de basale kanalen naar respectievelijk buizen A en B. Dit zijn de chip apicale en basale digesten.
  30. Tel de cellen in buis A met behulp van een hemocytometer. Verwijder ook een aliquot uit de chipdigests voor CFU-meting volgens stap 7.21.

8. Analyse van spaanafvalwater en -vergistingen

  1. Voor de telling van bacteriën uit de effluenten en digesten, de effluenten of digesten serieel verdunnen in steriel DPBS (-/-) en op een geschikte mediaplaat worden geplaatst, 24-48 uur bij 37 °C incuberen en de kolonies op de plaat tellen.
  2. Voor het meten van de pH neemt u onmiddellijk na het verzamelen 10 μl van het 72 h afvalwater en gebruikt u een pH-strip om de pH van het effluent te meten.
  3. Gebruik voor de analyse van de cytokinen de effluenten om specifieke cytokines te detecteren met behulp van een op Luminex gebaseerde test, ELISA of een andere toepasselijke techniek29,30.

Resultaten

De menselijke vagina is bekleed met een gelaagd epitheel dat een fibroblastrijk collageen stroma bedekt. Om dit te modelleren, werd een weefselinterface gecreëerd door primair menselijk vaginaal epitheel en fibroblasten aan weerszijden van een gemeenschappelijk poreus membraan te kweken in een tweekanaals microfluïdisch orgaanchipapparaat. De vorming van het vaginale epitheel wordt gecontroleerd met behulp van helderveldmicroscopische beeldvorming, die de vorming van een continu vel cellen onthult dat geleidelijk meerdere cellagen vormt (Figuur 2A). Eerdere rapporten bevestigden dat deze morfologie correleert met de ontwikkeling van een volledig gestratificeerd epitheel wanneer bekeken in dwarsdoorsnede29. Als de epitheellaag echter fragmentarisch en discontinu lijkt (Figuur 2B), is de vaginachip mogelijk niet geschikt voor gebruik in experimenten.

Figuur 3 toont een schematische weergave van het ontstaan van de Vagina Chip. Om de functionaliteit van de vaginachip te valideren, werden de chips geënt met L. crispatus en G. vaginalis om respectievelijk gezonde en dysbiotische vaginale omgevingen te modelleren. G. vaginalis is de bacterie die voornamelijk betrokken is bij bacteriële vaginose. Om te controleren of gezonde en dysbiotische bacteriën op de Vagina Chips zijn geënt, werd de bacteriële belasting gekwantificeerd in de Vagina Chips die waren geënt met de verschillende bacteriepopulaties door kanaaleffluenten en verteerde cellagen te plateren op selectieve bacteriële groeimedia (De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) agar voor L. crispatus en Brucella bloedagar (BBA) voor G. vaginalis) (zie Materiaaltabel) en deze te vergelijken met vergelijkbare culturen met behulp van het originele inoculum. Kolonies van L. crispatus en G. vaginalis werden gedetecteerd binnen 48 uur na het plateren (Figuur 2C), wat bevestigt dat zowel gezonde als dysbiotische bacteriën in de vaginachips zijn geënt. Als er echter bacteriekolonies worden waargenomen op de platen met de inoculums, maar niet worden waargenomen op platen met het effluent of de digest na de vereiste incubatie, kan worden geconcludeerd dat de bacteriën niet zijn ingeënt.

Een gezond vaginaal milieu is zuur en dysbiose resulteert in een verhoging van de vaginale pH31. Daarom werd ook de pH van het effluent van het apicale epitheelkanaal van de Vagina Chip geanalyseerd. De pH van vaginachips die waren geïnoculeerd met L. crispatus was vergelijkbaar met die van niet-geïnoculeerde controlechips, en wanneer ze samen met G. vaginalis werden gekweekt, ervoeren ze een aanzienlijk verhoogde pH (Figuur 2D). Als de pH van een niet-geïnfecteerde vaginachip hoog wordt waargenomen, geeft dit aan dat er een probleem is en dat deze chips niet voor experimenten mogen worden gebruikt.

De ontstekingstoestand van vaginaal weefsel is ook gevoelig voor de samenstelling van het vaginale microbioom, waarbij een dysbiotisch microbioom ontstekingen stimuleert. Bij analyse van de pro-inflammatoire cytokines in het apicale kanaal van de vaginachip 3 dagen na inoculatie met L. crispatus of G. vaginalis, bleek de pro-inflammatoire respons op dezelfde manier hoger te zijn met G. vaginalis in vergelijking met niet-geïnfecteerde chips en chips geïnoculeerd met L. crispatus (Figuur 2E). Alles bij elkaar genomen laten deze resultaten zien dat de Vagina Chip de menselijke vaginale micro-omgeving nauw nabootst in zowel gezonde als dysbiotische toestanden.

figure-results-1
Afbeelding 1: Een tweekanaals chip en zijn pod. (A) Afbeelding van een tweekanaals PDMS-chip met de kanalen en poorten. (B) Afbeelding van een pod met de reservoirs en poorten voor apicale en basale kanalen. (C) Schematisch diagram met de dwarsdoorsnede van een met microben geïnfecteerde vaginachip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Vagina Chip bootst gezonde en dysbiotische menselijke vaginale micro-omgevingen na. (A) Vaginale epitheelcellen in het apicale kanaal van een robuuste vagina Chip. De schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm van de chip in de bovenste afbeelding en 500 μm in de onderste afbeelding. (B) Vaginale epitheelcellen in het apicale kanaal van een ontoereikende vaginachip. De schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm van de chip in de bovenste afbeelding en 500 μm in de onderste afbeelding. (C) Implantatie van L. crispatus (LC) en G. vaginalis (GV) in de vaginachip. (D) pH van Vagina Chips na 72 uur incubatie met L. crispatus (LC) en G. vaginalis (GV) in vergelijking met niet-geïnfecteerde (controle) Vagina Chips. (E) Pro-inflammatoire respons van Vagina Chips op L. crispatus (LC) en G. vaginalis (GV) na 72 uur incubatie, in vergelijking met niet-geïnfecteerde (controle) Vagina Chips. (C-E) Grafieken tonen het gemiddelde ± SD voor 4-6 chips; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 in vergelijking met controle Vagina Chips; Elke (●) vertegenwoordigt gegevens van 1 chip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Schematische weergave van het protocol voor het genereren van de Vagina Chip. Schematische weergave van de stappen die betrokken zijn bij het zaaien van cellen en het genereren van de Vagina Chip. HVEC's - Menselijke vaginale epitheelcellen; HUF's - Menselijke baarmoederfibroblasten; VEM - Vaginaal epitheelmedium; FM - Fibroblast media; DM - Differentiatie medium; PS - Penicilline Streptomycine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Eerdere in vitro modellen van de menselijke vagina repliceren niet getrouw vaginale weefselstructuren, vloeistofstroom en interacties tussen gastheer en ziekteverwekker19,22. Diermodellen worden ook beperkt door variatie tussen soorten in het microbioom en verschillen in de oestrische of menstruatiecyclus19,22. Dit manuscript beschrijft een protocol om een orgaanchipmodel van de menselijke vagina te maken dat menselijke reacties op gezonde en dysbiotische microbiële gemeenschappen effectief kan nabootsen.

Dit protocol omvat het zaaien van vaginale epitheel- en fibroblastcellen aan weerszijden van een gedeeld poreus membraan dat parallelle microkanalen scheidt in een tweekanaals orgaanchipapparaat dat in de handel verkrijgbaar is (zie Materiaaltabel). Het poreuze membraan zorgt voor de migratie van groeifactoren en andere vormen van intercellulaire communicatie. De collageencoating en de aanwezigheid van de celmonolagen voorkomen echter het mengen van media tussen kanalen. Bij de vorming van een monolaag van een vaginale epitheelcel in het apicale kanaal, worden differentiatiefactoren geïntroduceerd in het medium dat in het basale kanaal stroomt, dat door de interstitiële ruimte gaat en daardoor de differentiatie van de vaginale epitheelcellen bevordert om een gelaagd epitheel te vormen. De dichtheid van de vaginale epitheelcellen op het moment van zaaien is een cruciale bepalende factor voor de gezondheid van de vaginachip aan het einde van de differentiatiefase. Daarom moet de dichtheid van vaginale epitheelcellen worden beoordeeld voordat differentiatie wordt gestart, die niet mag worden gestart totdat een monolaag is vastgesteld. De blootstelling aan de differentiatiefactoren kan worden voortgezet totdat de gewenste dichtheid van de vaginale epitheelcellen is bereikt en vóór bacteriële inoculatie. Verder moet worden opgemerkt dat de groeisnelheid kan variëren voor primaire vaginale epitheelcellen van verschillende donoren (of commerciële bronnen), wat de kwaliteit van de gegenereerde vaginachip kan beïnvloeden. In alle microfluïdische orgaanchiponderzoeken is het van het grootste belang om eventuele luchtbellen te verwijderen die zich in de kanalen in de chipcultuur kunnen vormen, omdat ze de mediumstroom verstoren en uiteindelijk zullen resulteren in een verminderde beschikbaarheid van voedingsstoffen en een verlies van de levensvatbaarheid van de cellen.

Dit protocol beschrijft ook hoe de Vagina Chip kan worden gebruikt om bacteriële gemeenschappen op de chip tot stand te brengen die de gezonde vaginale toestand of bacteriële vaginose nabootsen. De Vagina Chip kan ook worden gebruikt om andere vaginale ziekten of aandoeningen te bestuderen; Bij het uitvoeren van deze onderzoeken moet er echter voor worden gezorgd dat de kenmerken van elke ziekte worden begrepen en wat de beste manier is om de resultaten te correleren met klinische bevindingen. Samenvattend opent de menselijke vaginachip nieuwe wegen om een overvloed aan ziekten en aandoeningen die verband houden met de FRT te bestuderen, en het kan een waardevol hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van mogelijke therapieën.

Openbaarmakingen

Donald Ingber is oprichter, bestuurslid, voorzitter van de wetenschappelijke adviesraad en aandeelhouder van Emulate. De andere auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gesponsord door financiering van de Bill and Melinda Gates Foundation (INV-035977) en het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering aan de Harvard University. We danken ook Gwenn E. Merry, Wyss Institute, voor het redigeren van dit manuscript. Het diagram in figuur 1 is gemaakt met BioRender.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm SteriflipMillipore SCGP00525Om media te degassen
2 channel chipEmulateBRK-S1-WER-24Onderdeel van het twee-kanaals Chip-kit
200 μL barrier tips (of filtertips)Thomas Scientific, SHARP1159M40Tips gebruikt voor chip-seeding
Activation Reagent 1 (of ER-1 poeder) EmulateChip S1 Basic Research kit-24PKOnderdeel van het twee-kanaals Chip-kit; Opslagtemperatuur -20 °C  
Activation Reagent 2 (of ER-2 oplossing) EmulateChip S1 Basic Research kit-24PKOnderdeel van het twee-kanaals Chip-kit; Opslagtemperatuur 4 °C
AdenineSigma Aldrich A2786Component van het Differentiatie-medium
Brucella bloedagar platenVWR International Inc. 89405-032met Hemin en Vitamine K; Voor het tellen van Gardnerella vaginalis
Ca2+ en Mg2+ vrij DPBS (DPBS (-/-)ScienCell303Voor het wassen van cellen
CalciumchlorideSigma Aldrich C5670Component van het Differentiatie-medium
Calciumchloride (watervrij) Sigma Aldrich 499609Component van HBSS (LB/+G)
Collageen I Corning354236Voor de coatingoplossing voor HVEC
Collageen IV Sigma Aldrich C7521Voor de coatingoplossing voor HVEC
Collageenase IVGibco17104019Voor het dissociëren van cellen uit de Vagina Chips
Complete fibroblast medium ScienCell2301Medium voor de cultuur van HUF
Complete vaginaal epitheel mediumLifelineLL-0068Medium voor de cultuur van HVEC
D-Glucose (dextrose) Sigma Aldrich 158968Component van HBSS (LB/+G)
DMEM (Laag Glucose) Thermofisher12320-032Component van het Differentiatie-medium
Dynamic Flow Module (of Zoë)EmulateZoë-CM1Reguleert de stroomsnelheid van de chips
Ham's F12Thermofisher11765-054Component van het Differentiatie-medium
Heat inactivated FBS Thermofisher 10438018Component van het Differentiatie-medium
Human uterine fibroblastsScienCell7040HUF
Human vaginal epithelial cellsLifelineFC-0083HVEC
HydrocortisonSigma Aldrich H0396Component van het Differentiatie-medium
ITESLonza17-839ZComponent van het Differentiatie-medium
L-glutamineThermofisher25030081Component van het Differentiatie-medium
Magnesiumchloride hexahydraatSigma Aldrich M2393Component van HBSS (LB/+G)
Magnesiumsulfaat heptahydraatSigma Aldrich M1880Component van HBSS (LB/+G)
MRS agar platenVWR International Inc. 89407-214Voor het tellen van Lactobacillus
O-fosforylethanolamineSigma Aldrich P0503Component van het Differentiatie-medium
Pen/StrepThermofisher 15070063Component van het Differentiatie-medium
pH stripsFischer-Scientific13-640-520Voor het meten van pH 
Pods (1/chip) EmulateBRK-S1-WER-24Onderdeel van het twee-kanaals Chip-kit
Poly-L-lysineScienCell403Voor de coatingoplossing voor HUF's
Kaliumchloride Sigma Aldrich P3911Component van HBSS (LB/+G)
Kaliumfosfaat monobasischSigma Aldrich P0662Component van HBSS (LB/+G)
Steriel 80% glycerol MP Biomedicals 113055034Voor het invriezen van bacteriemonsters
TrijoodthyronineSigma Aldrich  T6397Component van het Differentiatie-medium
Trypan Blauw Oplossing (0.4%) Sigma Aldrich T8154Voor het tellen van levende/dode cellen
TrypLE ExpressThermofisher 12605010Voor het dissociëren van cellen uit de Vagina Chips
Trypsine Neutraliserende Oplossing (TNS) ScienCell113Voor neutralisatie van Trypsine
Trypsine/EDTA Oplossing (0.25%)ScienCell103Voor celdissociatie 
β-oestradiol Sigma Aldrich E2257Hormoon voor differentiatie-medium

Referenties

  1. Smith, S. B., Ravel, J. The vaginal microbiota, host defence and reproductive physiology. J Physiol. 595 (2), 451-463 (2017).
  2. Van De Wijgert, J., Jespers, V. The global health impact of vaginal dysbiosis. Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).
  3. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: Cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  4. Goldenberg, R. L., Hauth, J. C., Andrews, W. W. Intrauterine infection and preterm delivery. N Engl J Med. 342 (20), 1500-1507 (2000).
  5. Han, Y., Liu, Z., Chen, T. Role of vaginal microbiota dysbiosis in gynecological diseases and the potential interventions. Front Microbiol. 12, 643422(2021).
  6. Leitich, H., Kiss, H. Asymptomatic bacterial vaginosis and intermediate flora as risk factors for adverse pregnancy outcome. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 21 (3), 375-390 (2007).
  7. Torcia, M. G. Interplay among vaginal microbiome, immune response and sexually transmitted viral infections. Int J Mol Sci. 20 (2), 266(2019).
  8. Van Oostrum, N., De Sutter, P., Meys, J., Verstraelen, H. Risks associated with bacterial vaginosis in infertility patients: A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 28 (7), 1809-1815 (2013).
  9. Lewis, F. M. T., Bernstein, K. T., Aral, S. O. Vaginal microbiome and its relationship to behavior, sexual health, and sexually transmitted diseases. Obstet Gynecol. 129 (4), 643-654 (2017).
  10. Hong, X., et al. The association between vaginal microbiota and female infertility: A systematic review and meta-analysis. Arch Gynecol Obstet. 302 (3), 569-578 (2020).
  11. Peelen, M. J., et al. The influence of the vaginal microbiota on preterm birth: A systematic review and recommendations for a minimum dataset for future research. Placenta. 79, 30-39 (2019).
  12. Smith, P. P., et al. Outcomes in prevention and management of miscarriage trials: A systematic review. BJOG. 126 (2), 176-189 (2019).
  13. Harp, D. F., Chowdhury, I. Trichomoniasis: Evaluation to execution. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 157 (1), 3-9 (2011).
  14. Pastorek, J. G., Cotch, M. F., Martin, D. H., Eschenbach, D. A. Clinical and microbiological correlates of vaginal trichomoniasis during pregnancy. The vaginal infections and prematurity study group. Clin Infect Dis. 23 (5), 1075-1080 (1996).
  15. Petrin, D., Delgaty, K., Bhatt, R., Garber, G. Clinical and microbiological aspects of trichomonas vaginalis. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 300-317 (1998).
  16. Edwards, T., Burke, P., Smalley, H., Hobbs, G. Trichomonas vaginalis: Clinical relevance, pathogenicity and diagnosis. Crit Rev Microbiol. 42 (3), 406-417 (2016).
  17. Eade, C. R., et al. Identification and characterization of bacterial vaginosis-associated pathogens using a comprehensive cervical-vaginal epithelial coculture assay. PLoS One. 7 (11), e50106(2012).
  18. Fichorova, R. N., Yamamoto, H. S., Delaney, M. L., Onderdonk, A. B., Doncel, G. F. Novel vaginal microflora colonization model providing new insight into microbicide mechanism of action. mBio. 2 (6), e00168(2011).
  19. Herbst-Kralovetz, M. M., Pyles, R. B., Ratner, A. J., Sycuro, L. K., Mitchell, C. New systems for studying intercellular interactions in bacterial vaginosis. J Infect Dis. 214, S6-S13 (2016).
  20. Johnson, A. P., et al. A study of the susceptibility of three species of primate to vaginal colonization with gardnerella vaginalis. Br J Exp Pathol. 65 (3), 389-396 (1984).
  21. Yildirim, S., et al. Primate vaginal microbiomes exhibit species specificity without universal lactobacillus dominance. ISME J. 8 (12), 2431-2444 (2014).
  22. Edwards, V. L., et al. Three-dimensional models of the cervicovaginal epithelia to study host-microbiome interactions and sexually transmitted infections. Pathog Dis. 80 (1), 026(2022).
  23. Zhu, Y., et al. Ex vivo 2D and 3D HSV-2 infection model using human normal vaginal epithelial cells. Oncotarget. 8 (9), 15267-15282 (2017).
  24. Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infect Immun. 86 (11), e00282(2018).
  25. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nat Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Valiei, A., Aminian-Dehkordi, J., Mofrad, M. R. K. Gut-on-a-chip models for dissecting the gut microbiology and physiology. APL Bioeng. 7 (1), 011502(2023).
  28. Izadifar, Z., et al. Mucus production, host-microbiome interactions, hormone sensitivity, and innate immune responses modeled in human endo- and ecto-cervix chips. bioRxiv. , (2023).
  29. Mahajan, G., et al. Vaginal microbiome-host interactions modeled in a human vagina-on-a-chip. Microbiome. 10 (1), 201(2022).
  30. Masson, L., et al. Inflammatory cytokine biomarkers to identify women with asymptomatic sexually transmitted infections and bacterial vaginosis who are at high risk of HIV infection. Sex Transm Infect. 92 (3), 186-193 (2016).
  31. Amsel, R., et al. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med. 74 (1), 14-22 (1983).

Herprints en machtigingen

Tags

Vagina op een chiporgaan op een chipvaginaal microbioomvaginaal epitheelmicroflu dische cultuurdynamische vloeistofstroomvaginale dysbiosehumane uteriene fibroblastenbacteri le co cultuurvrouwelijk voortplantingsstelsel
Modelleren van gezonde en dysbiotische vaginale micro-omgevingen in een menselijke vagina-op-een-chip
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.