Het huidige protocol beschrijft de methode voor het opstellen van een patiënt-afgeleid xenotransplantaat (PDX) muismodel met behulp van humaan osteosarcoomweefsel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Oprichting van een van de patiënt afgeleid xenotransplantaatmuismodel met humaan osteosarcoomweefsel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Osteosarcoom is de meest voorkomende primaire kwaadaardige bottumor bij kinderen en adolescenten. Ondanks de ontwikkeling van nieuwe behandelplannen in de afgelopen jaren, is de prognose voor osteosarcoompatiënten niet significant verbeterd. Daarom is het van cruciaal belang om een robuust preklinisch model met hoge betrouwbaarheid op te zetten. Het van de patiënt afgeleide xenotransplantaat (PDX) -model behoudt getrouw de genetische, epigenetische en heterogene kenmerken van menselijke maligniteiten voor elke patiënt. Bijgevolg worden PDX-modellen beschouwd als authentieke in vivo modellen voor het bestuderen van verschillende vormen van kanker in transformatiestudies. Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor het maken en onderhouden van een PDX-muismodel dat de morfologische kenmerken van humaan osteosarcoom nauwkeurig weerspiegelt. Dit omvat de onmiddellijke transplantatie van vers verwijderd menselijk osteosarcoomweefsel in immuungecompromitteerde muizen, gevolgd door opeenvolgende passaging. Het beschreven model dient als een platform voor het bestuderen van de groei, resistentie tegen geneesmiddelen, terugval en metastase van osteosarcoom. Bovendien helpt het bij het screenen van de doeltherapieën en het opstellen van gepersonaliseerde behandelschema's.
Inleiding
Osteosarcoom is een primaire botmaligniteit afkomstig van interossale kwabcellen en komt het meest voor bij zowel adolescenten als kinderen. Het komt vaak voor in de epifyse van de lange diafyse en wordt gekenmerkt door hoge maligniteit, vroege metastase en slechte prognose 1,2. Longmetastase is de belangrijkste doodsoorzaak bij patiënten met osteosarcoom. De 5-jaarsoverleving van patiënten met niet-gemetastaseerd osteosarcoom is 65%-70%3. In de afgelopen 40 jaar is de 5-jaarsoverleving (slechts 20%) van patiënten met gemetastaseerd osteosarcoom echter niet significant verbeterd, en 25% van de osteosarcoompatiënten heeft metastasen op het moment van diagnose4. Momenteel hebben de eerstelijnsgeneesmiddelen voor de behandeling van osteosarcoom een consensus bereikt, maar er zijn nog steeds significante verschillen in het chemotherapieregime en de behandelingstijd5. Het is belangrijk om preklinische experimenten uit te voeren op basis van geschikte diermodellen om effectievere chemotherapieregimes te verkrijgen.
Momenteel omvatten modellen die vaak worden gebruikt voor preklinische experimenten met osteosarcoom in vitro celcultuur en in vivo celafgeleide xenotransplantaten (CDX), evenals patiëntafgeleide xenotransplantaten (PDX)6,7.
De cellijnen zijn geschikt voor kweek en voor gebruik in in vitro studies, of voor transplantatie in immunodeficiënte muizen om CDX-modellen op te stellen8. Het is echter mogelijk dat in vitro gekweekte cellijnen de heterogeniteit van maligniteiten en de individuele kenmerken van patiënten niet nauwkeurig weerspiegelen als gevolg van mogelijke mutaties die optreden om zich aan te passen aan de in-vitrocultuuromgeving tijdens herhaalde passages. Bovendien missen ze de micro-omgeving en het immuunsysteem die nodig zijn voor tumorgroei en -ontwikkeling in vivo. Hoewel CDX-modellen enkele voordelen bieden ten opzichte van in vitro celcultuur, weerspiegelen ze mogelijk nog steeds niet volledig de individuele kenmerken van osteosarcoompatiënten, hoewel tumorweefsels verkregen uit CDX-modellen een beperkte intratumorale heterogeniteit en vertegenwoordiging van het immuunsysteem hebben in vergelijking met cellijnen die in vitro zijn gekweekt 9. Daarom is het van cruciaal belang om een preklinisch model met hoge betrouwbaarheid op te stellen.
PDX-modellen omvatten de onmiddellijke transplantatie van vers weggesneden menselijk kankerweefsel in immunodeficiënte muizen. Deze methode zorgt voor het getrouw behoud van genetische, epigenetische en heterogene kenmerken van menselijke maligniteiten voor elke patiënt, zelfs na opeenvolgende passages bij muizen. Bovendien is bekend dat PDX-modellen latere klinische resultaten nauwkeurig voorspellen10, waardoor ze waardevolle hulpmiddelen zijn voor het creëren van geïndividualiseerde behandelingen en het bevorderen van onderzoek naar precisiegeneeskunde11.
Dit werk beschrijft de procedure voor het opzetten van een PDX-model bij immunodeficiënte muizen door menselijk osteosarcoomweefsel te transplanteren. Dergelijke modellen dienen als platforms voor het uitvoeren van preklinische experimenten voor osteosarcoom.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle onderzoeken met menselijke weefsels zijn goedgekeurd door de Institutional Ethics Review Committee van het Longhua Hospital, verbonden aan de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Shanghai, China) (2013LC52), en er is schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van de patiënten in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Het IACUC-nummer voor deze dierstudie is PZSHUTCM221017013. Vier weken oude mannelijke CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl-muizen werden voorzien van double lion Irradiated Knaagdier Diet GB 14924.3 en steriel water, en werden gehuisvest in IVC-muizenkooi met vijf muizen per kooi, onder SPF-omstandigheden met een licht/donker-cyclus van 12 uur. De materiaaltabel bevat gedetailleerde informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Bereiding van menselijk osteosarcoomweefsel
OPMERKING: In deze studie werd het menselijke osteosarcoomweefsel12 verwijderd van de dijbeenlaesie van een 15-jarige osteosarcoompatiënt vóór chemotherapie.
- Bewaar het vers verwijderde osteosarcoomweefsel onmiddellijk in een weefselbeschermende oplossing om het behoud van osteosarcoomcelactivering te maximaliseren na spoelen met steriele fysiologische zoutoplossing.
OPMERKING: Vers verwijderde osteosarcoomweefsels moeten zo snel mogelijk in muizen worden getransplanteerd. Ze kunnen maximaal 24 uur vóór de transplantatie in de weefselbeschermende oplossing worden bewaard. Osteosarcoomweefsels die voor modellering worden gebruikt, moeten afkomstig zijn van patiënten die geen chemotherapie hebben gekregen. De activiteit van tumorcellen van patiënten die chemotherapie hebben gekregen, zal slecht zijn, wat leidt tot het falen van modelvorming en verlies van hoge trouw. - Breng de vers verwijderde osteosarcoomweefsels die in de weefselbeschermende oplossing zijn opgeslagen zo snel mogelijk over naar het laboratorium.
- Bereid experimentele instrumenten en materialen voor om het PDX-model vast te stellen: scalpels (Figuur 1A); oogheelkundig pincet (figuur 1B,C); oogheelkundige schaar (figuur 1D); hechtnaald (figuur 1E); hechtdraad (Figuur 1F); rechte naaldhouder (Figuur 1G); markeerstift (Figuur 1H).
NOTITIE: Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten voor gebruik worden gesteriliseerd door middel van autoclaveren. - Spoel de osteosarcoomweefsels twee keer af met voorgekoelde steriele fysiologische zoutoplossing in een steriele kap.
- Verwijder delen van het osteosarcoomweefsel met bloedingen en necrose.
- Snijd het gereinigde osteosarcoomweefsel in 3 mm3 stukken met een scalpel in een kweekschaaltje met voorgekoelde steriele fysiologische zoutoplossing en bewaar het op ijs.
2. Opstellen van PDX-modellen door osteosarcoom weefseltransplantatie in de flankregio van de muis
- Dien preoperatieve analgesie van meloxicam (5 mg/kg/24 uur) toe door middel van subcutane injectie bij muizen en plaats de naakte muizen op steriele chirurgische gordijnen. Zorg voor thermische ondersteuning tijdens de procedure.
- Induceer anesthesie bij muizen door ze bloot te stellen aan 3% isofluraan en 97% zuurstof. Nadat de muizen volledig zijn verdoofd, brengt u ze over naar de neuskegel en handhaaft u de anesthesie met 1,5% isofluraan en 98,5% zuurstof.
- Knijp in de tenen om ervoor te zorgen dat de muizen volledig verdoofd zijn en wacht langer als er nog steeds spasmen of krampachtige reacties zijn.
NOTITIE: Alle procedures moeten worden uitgevoerd met behulp van steriele apparatuur in een steriele kap. Voorkom uitdroging van muizen tijdens anesthesie door oogheelkundige zalf op hun ogen aan te brengen. - Zet de muis vast in een laterale decubituspositie (Figuur 2A). Desinfecteer 3 keer één kant van het flankgebied van de muis voor osteosarcoomweefseltransplantatie met afwisselende rondes povidonjodium en 70% ethanol desinfecterende wattenbolletjes.
OPMERKING: Chirurgische desinfectie wordt uitgevoerd in een cirkelvormig patroon, beginnend in het midden en spiraalsgewijs naar buiten. - Markeer de plaats van de chirurgische incisie op de huid met een markeerstift.
- Maak met een scalpel een incisie van 5 mm van de huid naar de onderhuidse weefsels (Figuur 2B).
- Til de bovenste zijhuid van de incisierand op met een oogheelkundig pincet met de linkerhand en voer een stompe dissectie uit onder de dermis van de muizen met een rechte naaldhouder met de rechterhand (Figuur 2C).
- Houd de bovenste zijhuid van de incisie vast met het oogheelkundig pincet met de linkerhand en plaats het osteosarcoomweefsel onder de huid ongeveer 5 mm boven de incisiemarge met een oogheelkundig pincet met de rechterhand om het osteosarcoomweefsel te transplanteren (Figuur 2C).
OPMERKING: Zorg ervoor dat het osteosarcoomweefsel net onder de dermis van de huid wordt getransplanteerd. Stompe dissectie wordt uitgevoerd met een rechte en stompe dissectietang, zoals een rechte naaldhouder, om te voorkomen dat de borstholte van de muis binnendringt terwijl de dermislaag van de muishuid wordt gevonden. - Hecht de incisie met behulp van resorbeerbare hechtdraad met 2-3 hechtingen voor een incisie van 5 mm (Figuur 2D).
- Breng de muizen terug naar schone kooien en houd ze in de gaten totdat ze volledig herstellen van de anesthesie.
OPMERKING: PDX tot stand gebracht door transplantatie van het menselijke osteosarcoomweefsel wordt aangeduid als passage 0 (P0), PDX vastgesteld door transplantatie van het PDX-weefsel op P0 wordt aangeduid als passage 1 (P1), gevolgd door P2 en P3.
3. Verzameling van PDX-tumorweefsels
- Meet eenmaal per week het tumorvolume. Wanneer de tumorgrootte 1500 mm3 bereikt, euthanaseert u de muizen met behulp van de cervicale dislocatiemethode na inhalatie van CO2 . Humane eindpunten zijn onder meer tumorzweren of problemen met de mobiliteit van de voorste ledematen.
OPMERKING: Meet de lange diameter (a) en korte diameter (b) van de tumor met behulp van een schuifmaat. Bereken het tumorvolume (V) met behulp van de formule: V = 1/2 × a × b2. - Plaats de muis zijdelings om de tumor bloot te leggen en desinfecteer de huid op de plaats van de tumor met een met alcohol doordrenkt watje.
- Gebruik een oogheelkundige schaar om de hele tumor te scheiden. Weeg de tumormassa met behulp van een elektronische weegschaal.
4. Pathologisch onderzoek van primair, klinisch en PDX-tumorweefsel
- Fixeer de tumorweefsels13 in een tube van 50 ml met 30 ml 10% neutrale gebufferde formaline-oplossing gedurende 24 uur. Spoel de tumorweefsels grondig af met stromend water om het fixeermiddel te verwijderen.
- Dehydrateer en veranker het tumorweefsel in paraffine14.
- Snijd de tumorweefsels in plakjes en voer het routinematige histologische onderzoekuit 15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor het opstellen van een PDX-muismodel, waarbij de morfologische kenmerken van humaan osteosarcoom behouden blijven na onmiddellijke transplantatie van vers verwijderd menselijk osteosarcoomweefsel en opeenvolgende passages bij muizen. Hier werd met succes een PDX-muismodel opgesteld met behulp van humaan osteosarcoomweefsel.
Figuur 3A toont een representatieve muis van PDX op ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De PDX-modellen kunnen de kenmerken van menselijke kankers simuleren en meer gelijkenis met de primaire tumor behouden, inclusief genetische en genomische veranderingen, histologie, heterogeniteit en genexpressieprofiel 16,17,18,19. Daarom behouden ze de moleculaire fenotypes en genotypen van kankerpatiënten, waardoor ze innovatieve benaderingen bieden voor het...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van (1) de National Nature Science Foundation (81973877 en 82174408); (2) bouwproject van het Shanghai Top Priority Research Center (2022ZZ01009); (3) Nationaal belangrijk R&D-programma van China (2020YFE0201600); (4) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation en (5) Onderzoeksprojecten binnen het budget van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10% formalin neutral solution | Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd | G1101-500ml | Fix de weefsels |
| Autoclaaf | Japan Hiryama Company | HVE-50 | Sterisatie chirurgische instrumenten |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | Dier |
| Meetlat | Yantai Green Forest Tools Co., Ltd. | 034180A | Meet het tumorvolume |
| Schotel (60mm) | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 430166, Corning | Plaatsing van monsters tijdens transplantatie |
| Ontsmettingswatten | Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd. | 20230627 | Ontsmet de huid van muizen |
| Sterile wegwerphandschoenen | Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd. | YT21131 | Steriele operatie |
| Double lion bestraalde knaagdiervoeding | Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd. | GB 14924.3 | Diervoeder |
| Elektronische weegschaal | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 1-2000 | Weeg het gewicht van de tumor |
| Eosine | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | E4009-25G | Hematoxyline eosine kleurstof |
| Hematoxyline | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | H3136-25G | Hematoxyline eosine kleurstof |
| Isofluraan | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Muisanesthesie |
| IVC's muizenkooi | Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd. | HH-MMB-2 | Dierbarriere |
| Markeerpen | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | Markeer de chirurgische incisie |
| Olympus optisch microscoop | Japanese Olympus Company | BH20 | Scan weefselsneden |
| Oogzalf | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | SOICOEYEGRL | Voorkom droge ogen van muizen tijdens anesthesie |
| Oogheelkundige scharen | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | Y00030 JZ | Snij de huid |
| Oogheelkundige pincetten | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | BS-ZER-S-100 Biosharp | Houd osteosarcoomweefsels vast tijdens transplantatie |
| Paraffine | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. | 80200-0015 | Begraven osteosarcoomweefsel |
| Paraffine snijmachine | Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd. | RM2235 | Osteosarcoomweefselsectie |
| fysiologische zoutoplossing | Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd. | 605-004057 | Spoel en tijdelijke opslag van osteosarcoomweefsel |
| Schilfers | Surgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. | J11010-10# JZ | Scheiden van osteosarcoomweefsel en het maken van chirurgische incisies |
| Steriele kap | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | ECO0.9 | Chirurgische operatietafel |
| steriele chirurgische lakens | Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd. | 20160090 | Bied een steriele operatiegebied |
| Naaldhouder | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | J31050 JZ | Naai de wond |
| Hechtdraad | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Naai de wond |
| Hechtnaald | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Naai de wond |
| Weefselbeschermingsoplossing | Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD | BC-CFM-03 | Behoud de activiteit van weefselcellen |
| Buis (50 mL) | Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. | BLD-BL2002500 | Installeer formolfixatie-oplossing |
Referenties
- Saraf, A. J., Fenger, J. M., Roberts, R. D. Osteosarcoma: accelerating progress makes for a hopeful future. Front Oncol. 8, 4(2018).
- Ligon, J. A., et al. Pathways of immune exclusion in metastatic osteosarcoma are associated with inferior patient outcomes. J Immunother Cancer. 9 (5), e001772(2021).
- Miwa, S., et al. Current and emerging targets in immunotherapy for osteosarcoma. J Oncol. 2019, 7035045(2019).
- Eaton, B. R., et al. Osteosarcoma. Pediatr Blood Cancer. 68 (2), e28352(2021).
- Ritter, J. Osteosarcoma. Ann Oncol. 21, 320-325 (2010).
- Lowery, C. D., et al. Broad spectrum activity of the checkpoint kinase 1 inhibitor prexasertib as a single agent or chemo potentiator across a range of preclinical pediatric tumor models. Clin Cancer Res. 25 (7), 2278-2289 (2019).
- Hingorani, P., et al. Trastuzumab deruxtecan, antibody-drug conjugate targeting Her2, is effective in pediatric malignancies: a report by the pediatric preclinical testing consortium. Mol Cancer Ther. 21 (8), 1318-1325 (2022).
- Brennecke, P., et al. CXCR4 antibody treatment suppresses metastatic spread to the lung of intratibial human osteosarcoma xenografts in mice. Clin Exp Metastasis. 31 (3), 339-349 (2014).
- Pan, B., Wei, X., Xu, X. Patient-derived xenograft models in hepatopancreatobiliary cancer. Cancer Cell Int. 22 (1), 41(2022).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumor xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
- Stitzlein, R. N., Wojcik, J., Sebro, R. A., Balamuth, N. J., Weber, K. L. Team approach: Osteosarcoma of the distal part of the femur in adolescents. JBJS Rev. 5 (12), 5(2017).
- Kai, K., et al. Formalin fixation on Her-2 and PD-l1 expression in gastric cancer: A pilot analysis using the same surgical specimens with different fixation times. World J Clin Cases. 7 (4), 419-430 (2019).
- Yang, T. S., et al. A practical protocol to prepare paraffin-embedded whole tick histology sections. Ticks Tick Borne Dis. 14 (4), 102162(2023).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Mol Med Rep. 18 (1), 945-957 (2018).
- de Alava, E. Ewing sarcoma, an update on molecular pathology with therapeutic implications. Surg Pathol Clin. 10 (3), 575-585 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Eoh, K. J., et al. Comparison of clinical features and outcomes in epithelial ovarian cancer according to tumorigenicity in patient-derived xenograft models. Cancer Res Treat. 50 (3), 956-963 (2018).
- Stewart, E. L., et al. Clinical utility of patient-derived xenografts to determine biomarkers of prognosis and map resistance pathways in EGFR-mutant lung adenocarcinoma. J Clin Oncol. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Kresse, S. H., Meza-Zepeda, L. A., Machado, I., Llombart-Bosch, A., Myklebost, O. Preclinical xenograft models of human sarcoma show nonrandom loss of aberrations. Cancer. 118 (2), 558-570 (2012).
- Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer Metastasis Rev. 35 (4), 547-573 (2016).
- Abdolahi, S., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research. J Transl Med. 20 (1), 206(2022).
- Deng, N., et al. Deep whole-genome sequencing identifies recurrent genomic alterations in commonly used breast cancer cell lines and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Res. 24 (1), 63(2022).
- Chen, F., et al. Generation and characterization of patient-derived xenografts from patients with osteosarcoma. Tissue Cell. 79, 101911(2022).
- Fortuna-Costa, A., et al. An association between successful engraftment of osteosarcoma patient-derived xenografts and clinicopathological findings. Histol Histopathol. 35 (11), 1295-1307 (2020).
- Beck, J., et al. Canine and murine models of osteosarcoma. Vet Pathol. 59 (3), 399-414 (2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
