Methodenartikel

Microfluïdische benadering om gelijktijdige en sequentiële cytokinesecretie van individuele polyfunctionele cellen op te lossen

DOI:

10.3791/66492

⸱

8 maart 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Functional Immune Repertoire Analysis, Institute of Pharmaceutical Sciences, Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zürich, 2Department of Biomedicine, Aarhus University, 3Laboratory for Tumor and Stem Cell Dynamics, Institute of Molecular Health Sciences, Department of Biology, ETH Zürich

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft een geavanceerd microfluïdisch platform om de cytokinesecretiedynamiek van individuele menselijke perifere mononucleaire bloedcellen kwantitatief te meten. Het platform meet tot drie cytokines parallel (IL-6, TNFα en IL-1β) voor elke individuele cel die wordt gestimuleerd met lipopolysaccharide als voorbeeld.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infecties, auto-immuunziekten, gewenste en ongunstige immunologische reacties op de behandeling kunnen leiden tot een complexe en dynamische cytokinerespons in vivo. Deze reactie omvat talrijke immuuncellen die verschillende cytokines afscheiden om de immuunreactie te orkestreren. De secretiedynamiek, hoeveelheden en het gelijktijdig voorkomen van de verschillende cytokinen door verschillende celsubtypes blijven echter slecht begrepen vanwege een gebrek aan geschikte hulpmiddelen om ze te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol dat gebruik maakt van een microfluïdisch druppelplatform dat de tijd-opgeloste kwantitatieve meting van de secretiedynamiek voor verschillende cytokines parallel op het niveau van één cel mogelijk maakt. Dit wordt mogelijk gemaakt door de inkapseling van individuele cellen in microfluïdische druppeltjes samen met een gemultiplexte immunoassay voor parallelle kwantificering van cytokineconcentraties, hun immobilisatie voor dynamische fluorescerende beeldvorming en de analyse van de respectieve beelden om uitgescheiden hoeveelheden en dynamiek af te leiden. Het protocol beschrijft de bereiding van gefunctionaliseerde magnetische nanodeeltjes, kalibratie-experimenten, celvoorbereiding en de inkapseling van de cellen en nanodeeltjes in druppeltjes voor fluorescerende beeldvorming en daaropvolgende beeld- en gegevensanalyse met behulp van het voorbeeld van door lipopolysaccharide gestimuleerde menselijke perifere bloedmononucleaire cellen. Het gepresenteerde platform identificeerde duidelijk cytokinesecretiegedrag voor enkelvoudige en co-secreterende cellen, waardoor de verwachte fenotypische heterogeniteit in het gemeten celmonster werd gekarakteriseerd. Bovendien maakt het modulaire karakter van de test het mogelijk om deze aan te passen en toe te passen om een verscheidenheid aan eiwitten, cytokinen en celmonsters te bestuderen, wat mogelijk kan leiden tot een beter begrip van de wisselwerking tussen verschillende immuunceltypen en de rol van de verschillende cytokinen die dynamisch worden uitgescheiden om de strak gereguleerde immuunrespons vorm te geven. Deze nieuwe inzichten kunnen met name interessant zijn in de studies van immuunontregelingen of in het identificeren van doelpopulaties in therapie en medicijnontwikkeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infecties veroorzaken vaak complexe gastheerreacties waarbij het aangeboren en adaptieve immuunsysteem betrokken is 1,2. Bij infectie of herkenning van infectieuze agentia kunnen gastheercellen een breed scala aan chemo- en cytokines produceren, dit zijn kleine eiwitten die bekend staan als kritische communicatoren en modulerend zijn voor hetimmuunsysteem. Pro-inflammatoire cytokinen worden vroeg bij infectie vrijgegeven om de immuunrespons op gang te brengen, later gevolgd door ontstekingsremmende cytokines, die van cruciaal belang zijn om weefselbeschadiging en daaropvolgende chronische of auto-inflammatoire ziekten te voorkomen. Deze balans tussen eliminatie van bedreigingen en weefselbescherming manifesteert zich als een breed repertoire van cytokinen die verschillende functies uitoefenen tijdens de infectie, waardoor een fijnafstemming van de respons mogelijk is 4,5. Binnen dit mengsel kunnen unieke handtekeningen worden waargenomen, afhankelijk van de ziekteverwekker en de signalen die ze induceren, de weefsellocatie en de immuuncellen waaruit ze afkomstig zijn. De afgifte van cytokines lijkt echter ook een multifunctioneel biologisch proces te vormen dat uniek is voor elke celpopulatie, divers in secretiedynamiek en individuele respons. Deze heterogeniteit is al vele jaren in de literatuur beschreven, bijvoorbeeld onder T-celsubpopulaties 6,7, waar onderzoeken naar auto-inflammatoire ziekten en ernstige COVID-19-infecties een grote functionele diversiteit aan ontstekingsmarkers binnen en tussen patiënten vertoonden 8,9. De laatste tijd benadrukte de komst van single-cell sequencing de hoge plasticiteit en overspraak tussen subpopulaties binnen immuunmicro-omgevingen die voorheen niet duidelijk waren, wat aangeeft dat single-cell-methoden nodig zijn om deze heterogeniteit vast te leggen10,11. Hoewel er nieuwe methoden worden ontwikkeld om het transcriptoom te analyseren, blijft fenotypische analyse een uitdaging, omdat dit gelijktijdige, kwantitatieve en tijdopgeloste metingen van eiwitsecretie op eencellig niveau vereist. Dergelijke metingen stellen ons in staat om secreterende celidentiteiten, dynamiek en secretiepatronen (langzaam/snel, vroeg/laat, gelijktijdig/opeenvolgend) te onderzoeken voor een repertoire of een panel van cytokines. Door de studie van de dynamiek van de afgifte van cytokines tijdens een immuunrespons kwantitatief en met temporele resolutie mogelijk te maken, kunnen de resulterende inzichten een begrip van het cellulaire ensemble en de geïnduceerde respons mogelijk maken.

In standaardprotocollen worden cytokinen meestal gedetecteerd in het supernatans van celsuspensies en serum met behulp van enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA), wat bulk-uitgescheiden hoeveelheden oplevert. Bulkmetingen maken het niet mogelijk om de hoeveelheden cytokines die door elke cel worden geproduceerd te kwantificeren, een probleem dat vooral wordt benadrukt in heterogene celmonsters. Alternatieve methoden zoals intracellulaire cytokinekleuring, enzymgekoppelde immunospot (ELISpot)-test of micro-gegraveerde assays (bijv. Isoplexis) detecteren cytokines die door individuele cellen tot expressie worden gebracht, maar leveren slechtseindpuntmetingen 12,13. Dit betekent dat de secretiedynamiek en veranderingen die kunnen optreden in het cellulaire secretiepatroon gedurende de incubatietijd worden genegeerd. Bovendien kunnen eindpuntmetingen geen onderscheid maken tussen gelijktijdige en sequentiële cytokinesecretie, dus de ware omvang van gelijktijdige polyfunctionaliteit van immuuncellen in cytokinesecretie blijft onduidelijk met behulp van deze methoden.

Resolutie van één cel kan worden bereikt met behulp van druppelmicrofluïdica om fysieke compartimenten ter grootte van picoliter te genereren en te verwerken om immuuncellen te bestuderen op hun unieke cytokinesecretiefenotypes op het niveau van één cel14,15. Deze compartimenten bestaan uit water-in-olie-emulsies en kunnen worden gegenereerd met behulp van microfluïdische chips16,17. Op druppeltjes gebaseerde microfluïdische assays hebben inderdaad een extreme veelzijdigheid aangetoond bij het mogelijk maken van de analyse van verschillende biologische monsters en repertoires op het niveau van één cel en hun integratie met stroomopwaartse (cel- en reagensverwerking) en stroomafwaartse processen (enkelvoudige celsortering, proteomics of sequencing)18,19,20,21,22. Met name opstellingen die druppelimmobilisatie mogelijk maken, maken het mogelijk om in de loop van de tijd een eencellige functionaliteit te meten, wat waardevol is voor de analyse van eiwitsecretie18. Bovendien vergemakkelijkt de integratie van gemultiplexte, kwantitatieve assays aanvullend onderzoek in voorheen ontoegankelijke dimensies, naar processen zoals co-secretie en de identificatie van polyfunctionele immuuncellen23,24.

In dit protocol beschrijven we een geïmmobiliseerde, op druppeltjes gebaseerde eencellige workflow om de secretie van maximaal drie cytokines parallel van individuele cellen te detecteren, kwantificeren en tijdelijk te meten17,23. De technologie biedt de mogelijkheid om cytokineresponsen van meer dan 20.000 cellen parallel te volgen.

De gepresenteerde workflow bestaat uit de microfluïdische inkapseling van afzonderlijke immuuncellen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes in water-in-oliedruppels van 60 pL. De immobilisatie van >100.000 druppeltjes in een observatiekamer en tijdopgeloste fluorescentiemicroscopie maken het mogelijk om de dynamiek van de cytokinesecretie in elke druppel en elk cytokine te meten (Figuur 1A). Voor elke individuele cel in een druppel wordt de cytokinesecretie gemeten door een sandwich-immunoassay, waarbij magnetische nanodeeltjes die zijn gefunctionaliseerd met een specifiek vangantilichaam het uitgescheiden cytokine binden, wat leidt tot de daaropvolgende verplaatsing en binding van fluorescerend gelabelde detectie-antilichamen (Figuur 1B,C). Een kralenlijn wordt gevormd door de magnetische nanodeeltjes uit te lijnen, waarnaar de fluorescentieverplaatsing kan worden gekwantificeerd in aanwezigheid van cytokine. Hier wordt fluorescentieverplaatsing gedefinieerd als de gemiddelde fluorescentie-intensiteit op de hiellijn gedeeld door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de resterende druppel. Deze test kan worden gemultiplext voor verschillende cytokines door verschillend gefunctionaliseerde nanodeeltjesbatches en respectieve detectie-antilichamen die in verschillende fluorescentiekanalen zijn gelabeld te mengen23, wat resulteert in specifieke fluorescentieverplaatsingen in de verschillende kanalen. Met behulp van een op maat gemaakt analysescript kunnen fluorescentieverplaatsingswaarden worden geëxtraheerd en kunnen de beelden worden omgezet in secretiedynamische profielen voor elke individuele cel en cytokine. Daarom leveren de resulterende datasets talrijke uitlezingen op, zoals de kwantitatieve secretiemeting in de loop van de tijd, de identificatie van co-secreterende subpopulaties en de verdelingen van de cellen volgens uitgescheiden hoeveelheden, snelheden en combinaties van cytokines.

figure-introduction-1
Figuur 1: Werkstroom en analyseprincipe. (A) Overzicht van de werkstroom voor het analyseren van cytokine-afscheidende cellen na stimulatie. Eencellige suspensies en magnetische nanodeeltjes worden bereid en ingekapseld in olie/water-emulsies (druppeltjes) met een volume van 60 pL. Druppels worden geïmmobiliseerd en nanodeeltjes worden uitgelijnd in een magnetisch veld voordat ze gedurende maximaal 4 uur per 30 minuten worden gemeten. Ten slotte worden beelden geanalyseerd en worden de parameters voor elke druppel, elk tijdstip en elk fluorescerend kanaal geëxtraheerd. Dit cijfer is gewijzigd van17. (B) Principe van de bioassay van de druppelsandwich. Gefunctionaliseerde nanodeeltjes binden de uitgescheiden cytokines, wat leidt tot de daaropvolgende verplaatsing van fluorescerend gelabelde detectie-antilichamen naar de nanodeeltjes. Deze verplaatsing van fluorescentie wordt gekwantificeerd en gevalideerd met kalibratie-experimenten die worden uitgevoerd met recombinante cytokines. Het mengen van verschillende gefunctionaliseerde nanodeeltjes maakt de gemultiplexte metingen van maximaal drie cytokines tegelijk mogelijk. (C) In celgebaseerde experimenten worden druppeltjes gevolgd gedurende de meettijd en worden afscheidende cellen geïdentificeerd door een overwerktoename van fluorescentieverplaatsing op de nanodeeltjes. Schema's zijn niet op schaal. Figuur gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd onder ethische overeenkomst EK202-N-56 en goedgekeurd door de ethische commissie van ETH Zürich. De behandeling van menselijke cellen werd uitgevoerd in een laminaire flowkast in een laboratorium met bioveiligheidsniveau 2.

OPMERKING: In de volgende secties wordt het protocol beschreven voor het meten van tijdopgeloste cytokinesecretie op het niveau van één cel. De hier beschreven procedure wordt toegepast op de stimulatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) met lipopolysaccharide (LPS) en de parallelle meting van de cytokines IL-6, TNFα en IL-1β. Indien nodig kan het protocol echter worden aangepast aan andere celtypen, stimulerende middelen en cytokines.

1. De vervaardiging van de observatiekamer

OPMERKING: Om beweging van de druppels tijdens de beeldvorming te voorkomen, is een observatiekamer voorbereid met een hoogte die ongeveer 10% kleiner is dan de druppeldiameter.

  1. Voorbereiding van de snijdubbelzijdige tape en de bovenste glasplaat
    1. Teken of laad het gewenste ontwerp van de kameruitsparing in het tabblad Ontwerp van de snijsoftware. Voor de specifieke afmetingen die hier worden gebruikt, zie figuur 2E.
    2. Bevestig het dubbelzijdige plakband van 32 μm dikte met tape op de zelfklevende snijmat en plaats de snijmat in de automatische snijmachine.
    3. Knip het kamerontwerp uit de tape, terwijl u erop let dat de lange zijden van de kamer in dezelfde richting worden gesneden om het gemakkelijker los te maken in stap 1.3.
    4. Bewaar de tape-uitsparingen bij kamertemperatuur voor langdurige opslag. Bewaar ze voor kortstondige opslag bij -20 °C en verwijder ze pas kort voor stap 1.3. voor een eenvoudigere bediening.
    5. Boor twee gaten met een diameter van ongeveer 1 mm in het midden van een standaard microscoopglaasje (76 mm x 26 mm x 1 mm), met een afstand tussen de twee gaten van ongeveer 3,5 cm.
  2. Reiniging en plasma-activering van objectglaasjes
    1. Reinig een glasplaatje met gaatjes en een zonder gaatjes met zeep. Spoel goed af met gedestilleerd water en droog af met pluisvrije precisiedoekjes.
    2. Plaats de objectglaasjes in een plasmareiniger en plasmabehandel de bovenste oppervlakken gedurende 10 minuten op 55 W. Verwijder de glasplaatjes en ga verder met stap 1.3.
  3. Samenstelling van de kamer
    1. Plaats het objectglaasje met gaten op een schoon oppervlak met de plasma-geactiveerde kant naar boven, zonder het geactiveerde oppervlak aan te raken.
    2. Verwijder de beschermlaag van één kant van het dubbelzijdige plakband, in dezelfde snijrichting. Lijn de tape-uitsparing uit met de randen van het objectglaasje en de geboorde gaten zonder aan te raken en breng de tape langzaam in contact met het glasplaatje, beginnend bij de korte zijde.
      OPMERKING: Let erop dat er geen rekken of vouwen in de tape ontstaan, omdat dit zal resulteren in onjuiste kamerhoogtes. Aangezien deze stap foutgevoelig is en enige praktijkervaring vereist, is het raadzaam om meerdere glasplaatjes parallel te maken.
    3. Verwijder de tweede beschermlaag van de tape, opnieuw in de snijrichting, en plaats het tweede glasplaatje zonder gaten met het geactiveerde oppervlak naar beneden gericht. Druk het hele oppervlak van de twee glasplaatjes tegen elkaar door er een plat bord op te leggen en met kracht van het bovenlichaam ongeveer 10 s naar beneden te drukken.
    4. Nadat u de twee glasplaatjes in elkaar hebt gezet, draait u de kamer om zodat de twee gaten naar u toe wijzen. Lijm de nanopoorten op de twee gaten door een kleine hoeveelheid UV-uithardende lijm in de ring onder de poort te doen en de poort bovenop het gat in het glasplaatje te plaatsen. Voeg een ring van UV-uithardende lijm toe rond de poort en hard de lijm uit met een UV-lamp. De kamer zou er nu uit moeten zien zoals afgebeeld in figuur 2E. Ga direct door naar stap 1.4.
      OPMERKING: UV-licht kan de ogen en huid beschadigen. Draag geschikte beschermingsmiddelen.
  4. Fluorofiele coating van het kameroppervlak
    OPMERKING: Deze stap moet plaatsvinden binnen 1 uur na plasmabehandeling van de objectglaasjes (stap 1.2.2) om een goede coatingefficiëntie te garanderen.
    1. Bereid vers 1 ml 1% fluorosilaanoplossing (1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichloorsilaan) in gefluoreerde olie (HFE-7500) en vul deze in een spuit. Duw de coatingoplossing door een PTFE-spuitfilter en een naald van 27G x 0.75 inch die is aangesloten op een PTFE-microslang van 0.3 mm x 0.76 mm in de observatiekamer.
    2. Spoel na 1 minuut incubatie de coatingoplossing uit de kamer met behulp van stikstofdruk onder een zuurkast. Spoel de kamer met gefluoreerde olie (alleen HFE-7500) met behulp van een andere spuit.
    3. Bewaar de kamer gevuld met gefluoreerde olie met gesloten inlaten bij kamertemperatuur (RT). Spoel na elk experiment de cellen en druppels direct uit om een goed behoud van de coating te garanderen.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de kamers kunnen enkele maanden worden opgeslagen en hergebruikt.
  5. Kamerhouder met magneten
    1. Voor de uitlijning van de magnetische nanodeeltjes brengt u een statisch magnetisch veld aan op de observatiekamer tijdens het inkapselen en de beeldvorming van druppels. Plaats hiervoor de kamer in een op maat gemaakte 3D-geprinte microscopiehouder (zie figuur 2D en het bestand in Bounab et al.17 Aanvullende gegevens 4) die twee neodymiummagneten langs de lange zijden van de kamer houdt.

2. Functionalisering van nanodeeltjes

OPMERKING: Het proces voor de functionalisering van nanodeeltjes is vergelijkbaar voor elk cytokine, het enige verschil is de toevoeging van cytokine-specifieke vangstantilichamen. De functionalisatie voor elk cytokine wordt parallel uitgevoerd in verschillende, individuele reactiebuisjes. Voorafgaand aan dit protocol werden het TNFα-vangstantilichaam en het IL-1β-detectieantilichaam intern gelabeld met respectievelijk biotine en Alexa Fluor 647. De conjugatie werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant op de website van de verkoper (zie links in de materiaaltabel) en de antilichamen werden gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 °C.

  1. Voeg 50 μL streptavidine-gefunctionaliseerde nanodeeltjes (diameter (Ø) 300 nm) toe aan de buis die bestemd is voor TNFα-detectie, 50 μL voor IL-1β en 100 μL voor IL-6. Verdun de nanodeeltjesoplossing 1:1 (v/v) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Voeg aan elk buisje 1/20 (v/v) van het respectieve volume van de gebiotinyleerde vangantilichamen toe (voorraadconcentraties bij 0,5 mg/ml) en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    OPMERKING: Wanneer u kleine hoeveelheden aan de nanodeeltjesoplossing toevoegt, deponeert u het volume aan de bovenkant van de buis en spoelt u het meerdere keren weg met het grootste deel van de oplossing. Dit zorgt voor een goede menging en voorkomt de vorming van aggregaten.
  3. Voeg 1/100 (v/v) 1 mM D-biotineoplossing toe aan de buis en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Dit resulteert in een uiteindelijke biotineconcentratie van 10 μM.
    OPMERKING: Overtollig biotine blokkeert vrije bindingszijden op de nanodeeltjes en vermindert ongewenste aggregaatvorming.
  4. Verzamel de deeltjes door een neodymium magneet dicht bij de buis te houden. Wacht tot het supernatans helder is en gooi het supernatant weg.
    OPMERKING: De magneten die tijdens de test worden gebruikt, vertonen zeer sterke aantrekkingskrachten, die fysieke schade kunnen veroorzaken als twee magneten per ongeluk in elkaar klikken.
  5. Om niet-specifieke adsorptie aan het oppervlak van nanodeeltjes te verminderen, resuspendeert u de nanodeeltjes onmiddellijk in 0,5x het uiteindelijke volume van stap 2.1 van Pluronic F-127 (10%) en 0,5x het volume PBS. Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij RT.
  6. Verzamel de deeltjes met behulp van de magneet, gooi het supernatant weg en resuspendeer in 1x het volume van de opslagbuffer (RPMI 1640, 5% knock-out serumvervanging, 1% pen/streptokokken, 1% recombinant humaan serumalbumine (HSA), 25 mM HEPES, 0,1% Pluronic F-127). Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij RT.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de deeltjes kunnen nu maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
  7. Onmiddellijk voor het inkapselen, resuspendeert de deeltjes door te pipetteren en mengt de geconjugeerde nanodeeltjes in een verhouding van 2:1:1 (v/v) voor respectievelijk IL-6:TNFα:IL-1β.
    OPMERKING: De verschillende verhoudingen van gefunctionaliseerde nanodeeltjes zijn afhankelijk van het gebruikte antilichaampaar voor elk cytokine en zijn experimenteel bepaald door middel van kalibratiemonsters om een optimaal dynamisch bereik te verkrijgen.
  8. Wassen met volledige media (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen/Streptokokken, 25 mM HEPES) door de deeltjes met de magneet te verzamelen, het supernatans weg te gooien en opnieuw te suspenderen. Herhaal deze stap, maar resuspendeer alleen in 0,5x het volume van volledige media uit stap 2.7.
  9. Voeg de verschillend gelabelde IL-6-, TNFα- en IL-1β-detectieantilichamen toe aan de oplossing om een eindconcentratie van elk 10 nM te bereiken. De oplossing is nu klaar om gebruikt te worden voor de druppelexperimenten.

3. Voorbereiding van de cel

OPMERKING: PBMC werden geïsoleerd uit een buffy coat die ze hadden ontvangen van de bloedbank van Zürich. De cellen werden ingevroren en gedurende enkele maanden bewaard in cryovials (1 x 10,7 cellen/flacon) in vloeibare stikstof.

  1. Cel ontdooien
    1. Laat 1 uur voor aanvang van het experiment de volledige media en MACS-buffer (2 mM EDTA, 0,5% BSA in DPBS, steriel gefilterd) opwarmen bij RT. Bereid de buis met de cellen voor door 9 ml volledige media toe te voegen aan een buis van 15 ml en deze in het waterbad bij 37 °C te bewaren.
    2. Haal een PBMC cryovial (met ~1 x 107 cellen) uit de opslag in vloeibare stikstof. Draai de cryotube in het waterbad bij 37 °C tot er nog maar een kleine hoeveelheid ijs overblijft.
    3. Veeg de buis af met 70% EtOH en breng deze over naar de laminaire stromingskast. Voeg 1 ml voorverwarmde complete media toe aan de cryovial, meng voorzichtig en breng alle cellen over in de buis met warme complete media. De cryovial kan worden gewassen met 1 ml warme, complete media om het maximale aantal cellen te herstellen.
    4. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g bij RT, gooi het supernatans weg en resuspendeer voorzichtig met een pipet de celpellet met 1 ml volledig medium. Voeg 9 ml volledig medium toe.
    5. Draai de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatans weg en resuspendeer zoals eerder in 1 ml volledig medium.
    6. Tel de cellen met behulp van de beschikbare cellenteller. In dit geval werd een geautomatiseerde cellenteller gebruikt. Cellen werden geteld door 10 μL celsuspensie te mengen met 10 μL Trypanblauw en 10 μL van het mengsel over te brengen naar het cellentelglaasje.
  2. Kleuring en FcR-blokkering
    1. Bereken het totale aantal cellen en het volume dat nodig is om de cellen te resuspenderen bij 2 x 106 levende cellen/ml. Bereid de celkleuringsoplossing (CellTrace Violet) voor door de bouillon (5mM) 1000x te verdunnen in PBS (werkconcentratie van 5 μM).
    2. Draai de cellen 5 minuten rond op 500 x g bij RT. Gooi het supernatans weg en breng de cellen opnieuw in suspensie in het berekende volume van de in stap 3.2.1 bereide celkleuringsoplossing. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 5 min.
    3. Blus aan het einde van de incubatie de resterende kleurstof in de oplossing af door volledige media toe te voegen (ten minste 2x het volume van de kleurstofoplossing). Draai de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    4. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de celpellet in 60 μL MACS-buffer en voeg 20 μL humaan FcR-blok toe per 1 x 107 cellen. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij RT.
    5. Vul de buis tot 10 ml met MACS Buffer en draai de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    6. Gooi het supernatans weg en suspendeer de cellen in 1 ml volledig medium Tel de cellen zoals beschreven in stap 3.1.6.
  3. Celstimulatie met LPS
    1. Verdun de cellen met behulp van het celgetal tot 1 x 106 cellen/ml en breng 2 ml cellen over in elk putje in een plaat met ultralage binding van 6 putjes.
    2. Verdun LPS in volledige media en voeg het toe aan het putje met de cellen voor een uiteindelijke concentratie LPS van 1 μg/ml. Incubeer de cellen gedurende 6 uur bij 37 °C.
  4. Voorbereiding voor inkapseling
    1. Aan het einde van de stimulatietijd brengt u de celsuspensie over in een nieuw buisje van 15 ml.
    2. Voeg 1 ml volledig medium toe aan het lege vakje. Maak met een celschraper de resterende cellen los. Breng de cellen over in een nieuw buisje van 15 ml. Was het putje met 1 ml volledig medium en breng het over naar een andere buis van 15 ml.
    3. Draai de twee buisjes 5 minuten rond op 500 x g bij RT en breng 1 ml van de onverdunde supernatansoplossing (uit het eerste buisje met de niet-gewassen cellen) over naar een nieuw buisje voor verdere analyse indien nodig (bijv. ELISA).
    4. Gooi de rest van de supernatanten weg.
    5. Resuspendeer de pellets in 0,5 ml compleet medium, combineer de cellen uit dezelfde put en breng ze over in een centrifugebuis. Tel de cellen zoals beschreven in stap 3.1.6.
    6. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g bij RT en gooi het grootste deel van het supernatans weg (laat ongeveer 100 μl over). Zonder de pellet opnieuw te suspenderen, voegt u heel voorzichtig 200 μL volledig medium toe.
    7. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in volledige media in een concentratie van 6,6 tot 13,3 x 106 cellen/ml om een gemiddeld celaantal per druppel van λ = 0,2-0,4 voor inkapseling te bereiken, zoals gedefinieerd in stap 8.6.
      OPMERKING: Stappen 3.4.6 en 3.4.7 moeten onmiddellijk voor de inkapseling worden uitgevoerd om cytokinesecretie in het supernatant te voorkomen. Het aantal cellen per druppel volgt een Poisson-verdeling: figure-protocol-1, waarbij P de fractie druppeltjes aangeeft die X cellen bevatten en λ het gemiddelde aantal cellen per druppel is.

4. Inkapseling en druppelproductie

OPMERKING: De inkapseling van cellen in druppeltjes wordt mogelijk gemaakt door een microfluïdische druppelgeneratorchip, waarvan de fabricage elders in zeer detail wordt beschreven17. Alternatieven zijn in de handel verkrijgbaar (zie voorbeeld in de materiaaltabel). Een geschikt chipontwerp voor druppelgeneratoren heeft twee inlaten voor waterige fasen, één inlaat voor de oliefase en één uitlaat voor de gegenereerde druppels. Bovendien moet een geschikte chip voor commerciële druppelgeneratoren de productie van water in gefluoreerde oliedruppels van 40-60 pL volume mogelijk maken. Het hier beschreven protocol resulteert in water/olie-emulsies (druppels) met een diameter van 50 μm. Het gebruik van verschillende opties voor het wijzigen van het protocol kan resulteren in grotere of kleinere druppels.

  1. Voorbereiding van de spuitpomp (Figuur 2A)
    1. Vul een spuit van 1 ml met 500 μL continue fase bestaande uit 2% 008-fluorsurfactant in HFE-7500 gefluoreerde olie. Sluit een naald van 27G x 0,75 inch aan op PTFE-microslangen van 0,30 mm x 0,76 mm en monteer het geheel op de spuit en vervolgens op de spuitpomp.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen lucht in de spuit of canule achterblijft, omdat dit consistente stroomsnelheden voorkomt.
    2. Bereid twee op maat gemaakte pipetpuntconnectoren voor op de waterige fasen (Figuur 2B): Pons een gat met een biopsiepons van Ø0,75 mm in het midden van een ~5 mm hoge PDMS-uitsparing met Ø6 mm. Trek ~3 cm PTFE-slang (0.56 mm binnendiameter, 1.07 mm buitendiameter) door het gat in de PDMS-uitsparing en duw het geheel in de bovenkant van een pipetpunt van 200 μL. Sluit de andere kant van de buis aan op een naald van 23Gx 1.25 inch. Sluit de connector af door UV-uithardende lijm op de pipet te smeren en uit te harden met UV-licht.
      OPMERKING: Aangezien UV-licht schadelijk is voor het oog, moet u ter bescherming een UV-blokkerende bril dragen.
    3. Vul twee spuiten van 1 ml met 500 μl lichte minerale olie, bevestig twee naalden van 23 G met de op maat gemaakte opzetstukken en monteer beide op de spuitpomp.
    4. Aspireer 30 μl nanodeeltje en 30 μl celoplossing in de pipetpunten van de waterige fasen met behulp van de besturingssoftware van de spuitpomp.
    5. Bereid een observatiekamer voor door het oppervlak met water schoon te maken om vuil en stof te verwijderen en droog het af met precisiedoekjes. Klem de kamer in de bedrukte kamerhouder die is uitgerust met twee neodymium magneten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de magneten in de juiste richting wijzen (elkaar aantrekken) om een langwerpig aggregaat te vormen.
    6. Kantel de kamer lichtjes (30°). Open beide poorten en steek een papieren handdoek in de bovenste poort om de overtollige buitenfase tijdens het vullen te absorberen.
  2. Druppelproductie en kamervulling
    1. Sluit de continue fase via een slang aan op de bovenste inlaat van de microfluïdische chip (Figuur 2A,C,F). Spoel de chip gedurende ongeveer 30 s met continue fase met een debiet van 1800 μL/h.
    2. Sluit de pipetpunten van de waterige oplossingen aan op de twee middelste inlaten (Figuur 2A, C, F).
    3. Start de stroom van de waterige oplossing met elk 200 μL/u en laat de kanalen en de uitlaat met vloeistof vullen. Bij gebruik van magnetische nanodeeltjes moet een homogene, bruinrood gekleurde oplossing uit de chipuitlaat stromen.
    4. Zodra de vloeistof bij de uitlaat verschijnt, start u de gefluoreerde oliefasestroom op 800 μL/u en wacht u tot een stabiele druppelproductie is vastgesteld, bevestigd door de uitstroom van een homogene, grijze, glanzende oplossing bij de uitlaat.
    5. Zodra een stabiele productie van druppeltjes is vastgesteld, verzamelt u de geproduceerde druppeltjes door PTFE-microslangen (0.3 mm binnendiameter x 0.76 mm buitendiameter) aan te sluiten op de uitlaatpoort en ze naar een observatiekamer te leiden door de microslang door de hulsmodule van een handdichte fitting uit één stuk te halen (Figuur 2A).
    6. Als de juiste druppelproductie optreedt, moet een homogene, glanzende vloeistof de kamer vullen met een rechte voorkant van onder naar boven.
    7. Zodra de kamer is gevuld, stopt u de stroom en sluit u de poorten af met poortpluggen met handvaste druk.
      NOTITIE: Let op dat u de kamer niet te strak sluit. Insluiting of instroom van lucht kan leiden tot bewegingen van de druppels en zo de tracking tijdens de meting in gevaar brengen.
    8. Spoel de chip na de druppelproductie met gefluoreerde olie en blaas eventuele herinneringen aan vloeistof uit met stikstof om de functie te behouden. Chips kunnen meerdere keren worden hergebruikt en maandenlang worden bewaard, zolang ze niet verstopt raken.

figure-protocol-2
Figuur 2: Overzicht van de microfluïdische opstelling. (A) Opstelling voor druppelinkapseling met de spuitpomp, de druppelgeneratiechip en de observatiekamer en microscoophouder. (B) Afbeelding van de geperforeerde PDMS-plug (boven) om een connector te vormen naar een pipetpunt van 200 μl (onder), zoals beschreven in protocolstap 4.1.2. (C) Afbeeldingen van de aansluiting van de slangen en pipetpunten op de chip voor het genereren van druppels. (D) Foto van de kamer die in de op maat gemaakte 3D-geprinte microscoophouder is geplaatst met twee magneten aan de boven- en onderkant. (E) Foto van de observatiekamer (met witte tape ter illustratie). (F) Lay-out van de microfluïdische chip voor het maken van druppels (schaalbalk: 750 μm). Dit cijfer is gewijzigd van17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Beeldacquisitie en -meting

OPMERKING: Beeldacquisitie wordt uitgevoerd op een standaard omgekeerde epifluorescentiemicroscoop die is ingesloten in een incubator, waardoor metingen bij 37 °C mogelijk zijn. De hier beschreven instellingen zijn specifiek voor een Nikon Eclipse Ti2-microscoop die draait met de NIS Elements-software (V. 5.30.04) die is uitgerust met een Orca Fusion-camera, maar zijn over het algemeen aanpasbaar aan andere fluorescentiemicroscopen en camera's.

  1. Meetparameters instellen
    1. Als u de grootte van de afbeelding wilt instellen, selecteert u een matrixgrootte van 10 x 10 afbeeldingen. Deze array zal ongeveer 50.000-70.000 druppels bevatten. Gebruik 1% overlap en activeer overvloeien voor het samenvoegen van afbeeldingen.
    2. Om het aantal gemeten kanalen in te stellen, selecteert u het DAPI-kanaal voor celdetectie, FITC-, TRITC-, Cy5-kanalen voor cytokinedetectie (beadlines) en het BF-kanaal voor druppeldetectie. Gebruik pixelbinning 2 x 2 en 16-bits voor bitdiepte. Pas de camera-instellingen aan om pixelwaarden met druppelintensiteit te bereiken die niet voor elk fluorescentiekanaal het maximum van de camera bereiken.
      OPMERKING: Exacte belichtingstijden en lampintensiteiten voor elk kanaal zijn afhankelijk van het gebruikte model en de reagentia en worden vastgesteld voordat kalibratiecurven worden gegenereerd (stap 7). Het gebruik van dezelfde acquisitie-instellingen bij kalibratie en celmetingen is belangrijk voor nauwkeurige kwantificering.
    3. Om de tijdopgeloste meting in te stellen, selecteert u elke 30 minuten een meting voor in totaal 9 metingen.
      OPMERKING: Meetparameters kunnen verschillen voor gebruikte cellen, stimulerende middelen, reagentia, gemeten cytokines, incubatietemperatuur en microscoopmodellen.
  2. De meting starten
    1. Monteer de kamerhouder op de microscoop met een tafel in putplaatformaat (Figuur 2D) en schakel over naar het helderveldkanaal (BF) met behulp van het 10x-objectief.
    2. Concentreer u op de geïmmobiliseerde druppels in BF en zorg ervoor dat het geheel in een perfect vlak wordt gemonteerd door rond te pannen en indien nodig aan te passen. Ga naar het midden van de kamer voor de volgende stappen.
    3. Activeer het geautomatiseerde scherpstelsysteem (PFS) en stel het in op het optimale meetvlak op het BF-kanaal, zodat druppelranden eruitzien als zwarte, scherpe cirkels die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van de oliefase en de achtergrond.
      OPMERKING: Metingen zijn ook mogelijk zonder een geautomatiseerd scherpstelsysteem, maar als de microscoop ermee is uitgerust, raden we ten zeerste aan om dit te gebruiken. Dit verbetert de meetkwaliteit voor grote en zwaar gestikte afbeeldingen.
    4. Doorloop alle fluorescentiekanalen en stel voor elk kanaal het optimale meetvlak in. Voor verplaatsingsmetingen op de FITC-, TRITC- en Cy5-kanalen, zorg ervoor dat het nanodeeltjesaggregaat perfect scherp is, voor het DAPI-kanaal zorg ervoor dat de cellen scherp zijn.
      OPMERKING: Optimale brandpuntsvlakken en z-waarden kunnen verschillen voor alle gemeten kanalen. Zorg ervoor dat u voor elk kanaal afzonderlijke PFS-offsets opslaat.
    5. Voordat u met de meting begint, doorloopt u alle kanalen om de afzonderlijke brandpunten te controleren en wacht u 5 minuten om in evenwicht te komen, aangezien er in eerste instantie beweging kan optreden terwijl de oplossingen opwarmen.
    6. Start de meting. Controleer na het genereren van de eerste afbeelding op eventuele onregelmatigheden (focus, bewegende druppels, verkeerde kanalen, enz.). Start de acquisitie indien nodig opnieuw, of vul in het geval van lucht de kamer opnieuw (begin bij stap 4.1.4). Laat het geheel de druppeltjes gedurende 4 uur in beeld brengen.

6. Analyse van het beeld

  1. Installeer beeldanalysesoftware (DropMap Analyzer App v 4.023) in MatLab (https://github.com/ESPCI-LCMD/MiMB) en breng het gegenereerde .nd2-bestand over van het experiment naar een analysecomputer.
  2. Open de applicatie. Selecteer de opgegeven instellingen, anders laat u de standaardwaarde geselecteerd: CH1: DAPI, WD (hele druppel); CH2: FITC, BL (beadline) geselecteerd; CH3: TRITC, BL geselecteerd; CH4: Cy5, BL geselecteerd; Maximale druppeldiameter (μm): 70; Valdetectie: vol; Volgen: Ja. Druk op de Start-knop (fruitpictogram) om de .nd2-bestandslocatie te selecteren en de analyse te starten.
  3. Na een paar minuten toont het programma een voorbeeldgedeelte van de afbeelding (Figuur 3A). Druk op de spatiebalk totdat u er een vindt die geschikt is voor druppeldetectie en druk vervolgens op Enter. Teken in hetzelfde afbeeldingsgedeelte een rechthoek in een representatief gebied voor het vinden van drempelparameters om druppels te detecteren.
  4. Na een paar minuten wordt een ander venster geopend met de intensiteitsverdeling van het DAPI-kanaal. Sleep de schuifregelaar om alleen het signaal van de bevlekte cellen te detecteren en klik op Gereed in de rechterbovenhoek.
  5. Na het segmenteren van het beeld in enkele druppels met diameters kleiner dan Max. Druppeldiameter (μm), voert het programma nu de volgende stappen uit voor elke druppel, elk tijdstip en elk fluorescentiekanaal zonder verdere invoer van de gebruiker (zie afbeelding 3).
    1. De software berekent de verplaatste pixels van de druppel tussen tijdstippen (druppels die meer dan 40 pixels bewegen, worden automatisch uitgesloten).
    2. De software meet de gemiddelde fluorescentiewaarde van de hele druppel, detecteert en meet de gemiddelde parellijnintensiteit door de helderste pixel op een horizontale lijn te vinden en het gemiddelde te nemen van alle pixelintensiteiten op een verticale lijn van boven naar beneden van de druppel. Dit gebeurt automatisch en wordt gebruikt om de gemiddelde verplaatsingswaarden van de hiellijn te berekenen (Figuur 3B) volgens de vergelijking:
      figure-protocol-3
    3. De software berekent het percentage van het totale aantal pixels in het druppelgebied boven de drempel die is ingesteld op het DAPI-kanaal.
  6. Het resulterende .xslx-bestand bevat de volgende kolommen die van belang zijn voor verdere analyse: DropIdX (ID van de druppel die in de loop van de tijd wordt gevolgd), TrueCentroid_ t*2-1 en t+2 (x- en y-coördinaten, respectievelijk, van het druppelcentrum voor tijdstip t), DiameterMicrons (druppeldiameter in μm), TrackingMove (aantal pixels verplaatst over de gehele meettijd), FluoChannel_BL_Ratio_t (verplaatsingswaarde voor FluoChannel op tijdstip t), DAPI_WD_PosPxlCount_t (aantal pixels boven de drempelwaarde in de hele druppel in het DAPI-kanaal op tijdstip t).

figure-protocol-4
Figuur 3: Beeldanalyse uitgevoerd door de beeldanalysesoftware. (A) Druppels worden gedetecteerd in het helderveldkanaal (BF) met behulp van een Hough-transformatie, waarbij elke druppel wordt gemarkeerd met een rode cirkel. Schaal balken: 200 μm. (B) Binnen elke druppel wordt de nanodeeltjesparellijn geïdentificeerd door de helderste pixels in het horizontale vlak en de fluorescentie-intensiteiten gemiddeld voor alle pixels die zich uitstrekken van boven naar beneden van de druppel. Bovendien wordt de cel geïdentificeerd door een pixelpercentage >0 boven de drempelwaarde voor het hele druppelgebied. Schaalbalk: 20 μm. (C) De analysatorsoftware vergelijkt de fluorescentie-intensiteit op de nanodeeltjes met de druppelachtergrond voor de FITC-, TRITC- en Cy5-kanalen over alle gemeten tijdstippen voor elke individuele druppel. Weergegeven zijn de tijdstippen 0, 4 (120 min) en 9 (240 min). Om handmatig te controleren op de juiste druppel- en celdetectie, worden ook de DAPI- en BF-kanalen weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Kalibratie

OPMERKING: Voor een kwantitatieve uitlezing moet de kalibratie van cytokineconcentraties naar fluorescentieverplaatsingswaarden één keer worden uitgevoerd, omdat er verschillen kunnen optreden tussen verschillende experimentele opstellingen. Alle vereiste stappen worden gedetailleerd beschreven in de vorige protocolsecties zoals verwezen.

  1. Bereid nanodeeltjes voor zoals beschreven in stap 2.
  2. Reconstitueer de humane recombinante eiwitten IL-6, TNFα en IL-1β volgens de instructies van de fabrikant.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat ingevroren aliquots slechts één keer worden ontdooid en onmiddellijk worden gebruikt.
  3. Bereid een 2-voudige verdunningsreeks voor alle drie de eiwitten samen met behulp van volledige media (10% FBS, 1% Pen/Streptokokken, 25 mM HEPES) met een startconcentratie van 80 nM tot 0,625 nM.
  4. Voer de inkapseling uit zoals beschreven in stap 4 met gefunctionaliseerde nanodeeltjes in de eerste en RPMI pas in de tweede waterige fase. Deze meting dient als blanco en de gemeten standaarddeviatie wordt later gebruikt voor gegevensanalyse.
  5. Wacht 5 minuten en maak een foto van de druppels zoals beschreven in stap 5. Maak 3 foto's met een arraygrootte van 2 x 2 in de respectievelijke fluorescentiekanalen.
  6. Herhaal stap 7.4 en 7.5 met alle bereide kalibratieoplossingen, beginnend met de laagste en eindigend met de hoogste concentratie.
  7. Analyseer de afbeeldingen zoals beschreven in stap 6. Gebruik de WD-optie niet voor het DAPI-kanaal en stel Tracking in op Nee.
  8. De analyse voert fluorescentieverplaatsingswaarden uit voor elke gemeten druppel in één beeld. Extraheer de mediaan en standaarddeviatie voor elk fluorescentiekanaal. Gemiddeld het gemiddelde van de mediaan en standaarddeviatie voor elk gemeten beeld per concentratie.
  9. Genereer een kalibratiecurve door de gemiddelde mediane verplaatsing uit te zetten tegen de gemeten concentraties van elk recombinant eiwit.
  10. Pas de curven aan met behulp van een eenfasige associatie: figure-protocol-5,
    met Y = verplaatsing op x, Y0 = verplaatsing van blanco meting en x de gebruikte concentratie. De verkregen kalibratiecurve wordt gebruikt om de verplaatsingswaarden te kwantificeren zoals beschreven in stap 8.
    OPMERKING: Pas alleen waarden aan tot de hoogst gemeten verplaatsing en sluit waarden uit van hogere concentraties met een lagere gemeten verplaatsing. Een afname van de gemeten verplaatsingswaarden bij hogere concentraties is te verwachten en treedt op als gevolg van het Hook-effect en de beperkte bindingscapaciteit van de nanodeeltjes.

8. Gegevensanalyse

  1. Sluit druppels uit met een TrackingMove-waarde hoger dan 10, d.w.z. die in de loop van de meting meer dan 10 pixels hebben verplaatst.
  2. Identificeer druppels die gekleurde cellen bevatten (DAPI-kanaal) op het eerste tijdstip door te sorteren op druppels met waarden hoger dan 0 in de kolom DAPI_WD_PosPxlPercent_1.
  3. Identificeer druppeltjes die secreterende cellen bevatten door de volgende 3 criteria toe te passen op de fluorescentieverplaatsing van elk fluorescentiekanaal (FluoChannel_BL_Ratio_t kolommen).
    1. Identificeren van druppels met toenemende verplaatsingswaarden, door te sorteren op een positieve helling over de meettijd.
    2. Identificatie van druppeltjes met verplaatsingswaarden die de detectielimiet (LOD) bereiken. Een druppel wordt geselecteerd wanneer de maximale fluorescentieverplaatsing gedurende de meettijd groter is dan de LOD, berekend zoals elders beschreven25: figure-protocol-6, waarbij μVerplaatsing t0 de mediaan is van alle verplaatsingswaarden op tijdstip 0 en σBLK de standaarddeviatie van de blanco gemeten tijdens de kalibratie, elk cytokinespecifiek zijn.
    3. Verifiëren dat de toename van de verplaatsingswaarde significant is door te controleren of de verandering tussen de maximale en minimale gemeten fluorescentieverplaatsing gedurende de meettijd groter is dan: figure-protocol-7.
  4. Identificeer co-secreterende cellen door te voldoen aan de criteria beschreven in stap 8.3. voor meer dan één fluorescentiekanaal tegelijkertijd.
  5. Herhaal stap 8.3. voor alle druppels die geen cel bevatten (DAPI_WD_PosPxlPercent_1 = 0). Gebruik deze druppeltjes om het percentage fout-positieven te berekenen.
  6. Bepaal de nauwkeurige λ-waarde van de meting door willekeurig 200 - 500 druppels te selecteren en deze te inspecteren met de functie Verifiëren en sorteren van de beeldanalysesoftware. Tel het aantal cellen in deze druppeltjes en bereken:
    λ = aantal getelde cellen / aantal geanalyseerde druppeltjes
  7. Bereken het totale aantal ingekapselde cellen voor de meting door:
    Totaal celgetal = λ × aantal geanalyseerde druppeltjes
  8. Bereken het percentage afscheidende cellen aan de hand van het bepaalde celgetal. Bereken bovendien het fout-positieve percentage voor elke cytokine (meestal minder dan 3%-5% ten opzichte van het aantal echte positieven per kanaal) en gebruik ze als interne controle voor experimentele consistentie en reproduceerbaarheid.
  9. Om de uitgescheiden cytokineconcentraties te berekenen, converteert u de verplaatsingswaarden naar de concentratie met behulp van de vastgestelde kalibratievergelijkingen uit stap 7.10.
  10. Bereken de secretiesnelheid (SR) tussen tijdstippen met behulp van de volgende vergelijking.
    figure-protocol-8
  11. Bereken de gemiddelde secretiesnelheid over de meting door het gemiddelde te nemen van de afzonderlijke secretiesnelheden tussen tijdstippen. Als de maximaal meetbare verplaatsing vóór het einde van de meting is bereikt, stel dan de concentratie in op de maximaal meetbare concentratie (deze waarde is cytokinespecifiek en komt overeen met de maximale concentratie die is gemeten en gebruikt in de kalibratiecurve in stap 6.10) en bereken geen verdere concentratie. Bereken de secretiesnelheid en het gemiddelde alleen tot dit tijdstip.
    OPMERKING: Als er minder dan 50 secreterende cellen in één fluorescentiekanaal worden gedetecteerd, moeten de druppels visueel worden onderzocht via de verificatie- en sorteerfunctie en kunnen druppeltjes met fluorescentie- of nanodeeltjesaggregaten worden uitgesloten van de analyse.
  12. Om verdere parameters uit de secretiecurve van elke afzonderlijke cel te extraheren, voert u een kleinste kwadratische aanpassing uit aan de tijdconcentratiecurve voor elke cel en cytokine met behulp van een aangepast Python-script (beschikbaar op aanvraag). De passende functie is een sigmoïdale curve volgens de hieronder beschreven formule (past bij R2<0,95 is uitgesloten van de volgende stappen):
    figure-protocol-9
    waarbij C overeenkomt met het concentratieplateau [nM], t50 met de verschuiving van het halve maximum [s] en m met de heuvelhelling [min-1]. Uit deze parameters worden de volgende curvedescriptoren geëxtraheerd zoals hieronder beschreven.
    1. Cmax [nM]: Maximaal gemeten concentratie.
    2. figure-protocol-10: Tijdstip van aanvang van de secretie, waarbij de pasvorm 10% van C bereikt.
    3. figure-protocol-11: secretiesnelheid als de geschatte lineaire helling van de curve tussen 10% en 90% van de tijdconcentratiecurve.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde functionele single-cell platform maakte het mogelijk om verschillende parameters te meten. Ten eerste, en net als bij standaardtechnieken, wordt de frequentie van de afscheidende cellen aan het einde van de meting weergegeven (Figuur 4A). Na de stimulatie met 1 μg/ml lipopolysaccharide (LPS) gedurende 6 uur van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC), scheidde 5,81% van de cellen IL-6 (n= 1270), 4,55% TNFα (n= 995) en 6,06% IL-1β (n= 1326) uit.

Om de cytokinesecretie te kwantificeren, werden kalibratiecurven gegenereerd met bekende concentraties van recombinante cytokines (Figuur 4B). Deze kalibratiecurven maken het mogelijk om de cytokineconcentraties in de druppel in de loop van de tijd te kwantificeren. Voorbeeldig is dat de gemiddelde IL-6-concentratie in de druppel na 90 minuten een plateau bereikte voor LPS-gestimuleerde PBMC, terwijl de gemiddelde in-druppel IL-1β sneller toenam vanaf 90 minuten, wat de dynamische resolutie van het platform weergeeft en de mogelijkheid om celsubpopulaties te extraheren die specifieke cytokines afscheiden (Figuur 4C). Omdat de concentratie tussen de meetpunten verandert, is het mogelijk om dynamische secretiesnelheden per cytokine te berekenen. Rekening houdend met de gemiddelde secretiesnelheid voor elk cytokine (figuur 4D), vertoonden IL-6-secreterende cellen een constante afname van de gemiddelde secretiesnelheid, terwijl TNFα- en IL-1β-secreterende cellen beide een toename van de secretiesnelheid vertoonden na een meettijd van 90 minuten en een tweede afname na 150 minuten.

Bovendien is het mogelijk om cellen te clusteren in subpopulaties, afhankelijk van de uitgescheiden en gelijktijdig uitgescheiden cytokines (Figuur 4E). Hier worden IL-6 en TNFα enkelvoudig uitgescheiden door respectievelijk 30,2% en 26,4% van de cellen die IL-6 of TNFα afscheiden, terwijl enkelvoudige afscheidende IL-1β-cellen 68,8% van alle IL-1β-uitscheidende cellen uitmaakten. Bovendien kunnen de effecten van co-secretie op de uitgescheiden concentraties en secretiesnelheden worden opgelost (Figuur 4F). Door naar IL-6-afscheidende cellen te kijken, werden verschillende hoeveelheden IL-6 uitgescheiden als de cellen bovendien TNFα of IL-1β produceerden. Evenzo verschilde de verdeling van de gemiddelde secretiesnelheden over de meting statistisch tussen de cellen die alleen IL-6 of IL-6 afscheidden naast TNFα (hogere secretiesnelheden) en IL-1β (lagere IL-6-secretiesnelheden).

figure-results-1
Figuur 4: Representatieve resultaten van IL-6, TNFα en IL-1β uitscheidende PBMC na 6 uur stimulatie met 1 μg/ml LPS. (A) Percentage PBMC dat IL-6, TNFα en IL-1β uitscheidt aan het einde van de 4 uurs meting. (B) Gemultiplexte cytokinekalibratiecurven worden gegenereerd met bekende concentraties van recombinante cytokines. Dit maakt het mogelijk om celexperimenten te kwantificeren door uit de verplaatsingswaarde de cytokineconcentratie in de druppel te berekenen. Punten werden aangebracht met behulp van een niet-lineaire eenfasige associatiecurve-fit, r2=0,9926 (IL-6), 0,9901 (TNFα), 0,9990 (IL-1β). (C) Gemiddelde uitgescheiden concentraties van IL-6, TNFα en IL-1β die vrijkomen door PBMC uit te scheiden gedurende de meettijd van 4 uur. (D) Gemiddelde secretiesnelheden van IL-6, TNFα en IL-1β gedurende de meettijd van 4 uur. (E) Relatief percentage gelijktijdig afscheidende cellen die IL-6, TNFα of IL-1β afscheiden en combinaties daarvan. Genormaliseerd naar alle afscheidende cellen die voor elk cytokine zijn gedetecteerd. (F) Gemiddelde IL-6-concentraties gedurende de meettijd en gemiddelde secretiesnelheid (log) verdelingen voor IL-6-secreterende cellen met co-secretieresolutie (n=383 alleen voor IL-6, n=531 voor IL-6 + TNFα, n= 213 voor IL-6 + IL-1β en n=143 voor IL-6+TNFα+IL-1β). Statistische verschillen in secretiesnelheidsverdelingen werden beoordeeld met behulp van tweezijdige, ongepaarde, niet-parametrische Kolmogorov-Smirnov-tests met een betrouwbaarheid van 95%, de p-waarde wordt weergegeven. ** (p <0,002) en **** (p <0,0001). De volledige lijn geeft de mediaan weer en de stippellijn de kwartielen. ntotaal aantal cellen = 21 866. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om aanvullende informatie op het niveau van een enkele cel te extraheren, kan een sigmoïde functie worden aangepast aan de concentratietijdpunten van elke cel en cytokine (Figuur 5). Een voorbeeldige dataset over concentratie in de tijd voor één cel en de bijbehorende sigmoïdale pasvorm wordt weergegeven in figuur 5A. Hier levert de procedure voor het aanpassen van de kleinste kwadraten de volgende parameters op: C, die overeenkomt met de bovenste plateauwaarde van de curve, t50 die de tijdgewijze verschuiving van de curve van nul kwantificeert, en de Hill-helling m, die de steilheid van het stijgende deel van de sigmoïde curve beschrijft met concentratiewaarden van 10% en 90% die tijdens de meting worden bereikt. Uit deze fitparameters kunnen enkele curve-descriptoren worden geëxtraheerd, zoals uitgelegd in stap 7.12. wat de Cmax oplevert, de hoogste concentratiewaarde van de gegevens, tstart, de starttijd van de secretie, gedefinieerd als het bereiken van 10% van de bovenste plateauconcentratiewaarde, en SRlin, de secretiesnelheid tijdens het stijgende deel van de curve.

Om celsubpopulaties te classificeren, werden de curvedescriptoren verkregen uit alle eencellige fits elk in drie categorieën ingedeeld: Cmax-waarden werden gegroepeerd in laag, gemiddeld en hoog voor tstart in vroeg, gemiddeld en laat en SRlin in langzame, gemiddelde en snelle secretoren. Om deze classificatie te illustreren, worden vier voorbeeldige eencellige secretiecurven en de bijbehorende curvedescriptoren getoond (Figuur 5A-D), waarbij curve A de kenmerken vertoont van een vroege lage secretor met een gemiddelde snelheid, curve B een vroege, langzame en hoge secretor, curve C een vroege snelle hoge secretor en curve D late lage secretie vertoont. Het is belangrijk op te merken dat de cutoffs voor deze criteria cel-, cytokine- en testparameterspecifiek zijn en voor elke onderzoeksvraag moeten worden aangepast. Bovendien werd hier alleen rekening gehouden met IL-6-secretie van PBMC na 1 μg/ml LPS-stimulatie gedurende 6 uur, wat betekent dat de meeste cellen vroege en hoge secretoren waren met respectievelijk 80% en 79% (Figuur 5E-F). Wat de secretiesnelheid betreft, werd een bipolaire respons waargenomen waarbij 55% van de IL-6-secreterende cellen langzame secretoren zijn en 39% snelle secretoren (Figuur 5G).

Om het secretiegedrag verder te karakteriseren, werden de curvedescriptoren voor elke cel tegen elkaar uitgezet en werden verschillende clusters geëxtraheerd (Figuur 5H-J). Er wordt geen duidelijke correlatie gegeven tussen tstart en Cmax (Figuur 5H): de twee grootste populaties waren vroege lage secretoren en hoge secretoren onafhankelijk van de secretiestart. Rekening houdend met de relatie tussen tstart en SRlin (Figuur 5I), waren de meeste cellen vroege langzame secretoren met een duidelijke populatie van vroege hoge secretoren en weinig langzame/gemiddelde tot late secretoren. Wat betreft SRlin en Cmax (Figuur 5J) correlaties, waren er bijna geen snelle lage tot gemiddelde secretoren, met alleen een grotere populatie van snelle lage secretoren. Bovendien was er een grote populatie van snelle secretoren die niet afhankelijk waren van de maximaal gemeten concentratie, en twee populaties van hoge secretoren scheidden langzaam of snel uit. Samenvattend kan worden geconcludeerd dat het onderzoeken van de relatie tussen de curvedescriptoren voor individuele cellen een veel gedetailleerdere analyse oplevert en mogelijk nieuwe biologische bevindingen kan extraheren uit metingen van de secretie van eencellige cellen.

Met de hierboven geïntroduceerde analyse hebben we de secretiedynamiek van co-secreterende cellen geëxtraheerd (Figuur 6). Twee voorbeeldcurves tonen een verschillende dynamiek van co-secretie voor IL-6 en TNFα van twee afzonderlijke cellen met een gelijktijdige start van beide cytokines (Figuur 6A), of een sequentiële secretiestart, waarbij IL-6 eerst wordt uitgescheiden (Figuur 6B). Om alle co-secreterende cellen te classificeren, werd een secretievertraging van 60 minuten gedefinieerd, waarbij alle cellen die binnen dit bereik beginnen met secretie worden beschouwd als gelijktijdige secretoren en alle cellen met langere vertragingen als sequentiële secretoren worden beschouwd. Deze analyse maakte het ook mogelijk om te observeren welk cytokine als eerste werd uitgescheiden. Voor IL-6 en TNFα werd voornamelijk gelijktijdige co-secretie waargenomen in 76% van de cellen (Figuur 6C), terwijl voor IL-6 en IL-1β sequentiële co-secretie werd waargenomen in 86% van de cellen, waarbij IL-6 in de meeste gevallen het eerste cytokine was dat werd uitgescheiden (Figuur 6D).

Kijkend naar de starttijd van secretie voor de verschillende cytokinen voor alle individuele co-secreterende cellen, werd er geen duidelijke correlatie waargenomen tussen de starttijden van de secretie in de uitgevoerde experimenten. Voor de co-secretie van IL-6 en TNFα (figuur 6E) was een groter verticaal cluster aanwezig rond 0 minuten, wat overeenkomt met de co-secreterende cellen die vaker beginnen met IL-6. Voor IL-6 en IL-1β co-secretie (figuur 6F) begonnen de meeste cellen IL-6 uit te scheiden rond het begin van de meting, terwijl IL-1β voornamelijk later werd uitgescheiden. Samenvattend maakte de hier gepresenteerde analyse de identificatie mogelijk van verschillende secretorsubpopulaties en complexe cytokine-co-secretiedynamiek.

figure-results-2
Figuur 5: Gedetailleerde analyse van verschillende secretiedynamische patronen voor enkelvoudige IL-6 secreterende celcurves. (A) Representatieve gegevens over de concentratie van eencellige cytokines gedurende de meettijd met de passende sigmoïde curve en de geëxtraheerde parameters. (B-D) Drie voorbeeldige eencellige cytokineconcentratiecurven voor de verschillende soorten cytokinesecretoren die worden gevonden voor IL-6-secretie na LPS-stimulatie. (E-G) Percentages IL-6-secreterende cellen die zijn ingedeeld in de verschillende secretortypen met de volgende criteria (n=633): E. Cmax: laag <5 nM, hoog >19,5 nM, F. tstart: vroeg <30 min, laat >120 min, G. SRlin: langzaam <250 moleculen/s, snel >750 moleculen/s. (H-J) Relatie tussen de drie secretiecurve-descriptoren Cmax, tstart en SRlin voor elke individuele cel (n=633). De grote populatie bij Cmax=20nM is het resultaat van het bereiken van de bovenste detectielimiet van de test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 6: Extractie van co-secretiepatronen uit enkelcellige concentratiecurves. (A-B) Representatieve concentratiecurven voor enkelvoudige cellen die respectievelijk IL-6 en TNFα (A) gelijktijdig en (B) achtereenvolgens afscheiden. (C-D) Percentage cellen dat gelijktijdige en sequentiële co-secretie van IL-6 en TNFα (n=249), of respectievelijk IL-6 en IL-1β (n=72) vertoont. Sequentiële secretie wordt gedefinieerd door de vertraging tussen de start van de cytokinesecretie van meer dan 60 minuten. Kleuren geven aan welke van de cytokinen het eerst met de secretie is begonnen. (E-F) Relatie tussen de starttijden van de secretie voor de verschillende cytokinen voor elke secreterende cel (nIL6-TNFα=249, nIL6-IL1β=72). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afgifte en secretie van cytokines worden vaak onderzocht in de immunologie en de klinische geneeskunde. Onevenwichtige cytokinesecretie kan leiden tot nadelige effecten voor patiënten die lijden aan infecties, maar ook bij neurologische aandoeningen, ontstekingen of kanker 26,27,28. Hoewel hun belang voor gezondheid en ziekte algemeen bekend is, blijft het bestuderen van cytokinen en hun afscheidende cellen een uitdaging, aangezien de huidige methodologieën niet in staat zijn om cytokinen afkomstig van een enkele cel nauwkeurig te detecteren en te kwantificeren op een tijdgebonden manier. Voor de hier gepresenteerde workflow werd een vastgesteld stimulatieprotocol met PBMC gebruikt en werd hun secretie van IL-6, TNF-α en IL-1β gemeten. De keuze om PBMC's te gebruiken in plaats van individuele, gezuiverde subpopulaties vloeide voort uit de vorige aanvraag om cytokine release syndromes (CRS)23 te onderzoeken23, een aandoening die wordt gekenmerkt door sterk verhoogde plasmaconcentraties van pro-inflammatoire cytokines, waaronder IL-6, TNF-α en IL-1β29. Omdat CRS meestal niet alleen aan één populatie is gekoppeld, gebruikten we PBMC's omdat ze in vivo aanwezig zouden zijn. Cellulaire subpopulaties kunnen echter individueel worden gezuiverd en beoordeeld, als de wetenschappelijke vraag deze stap vereist. De incubatietijd, stimulatieomstandigheden en dynamische testbereiken werden geoptimaliseerd om de secretie voor de drie interessante cytokines te meten. De workflow en gegevens die hier worden gepresenteerd, laten zien hoe u de tijdopgeloste eencellige secretie van meerdere cytokines kunt instellen, kalibreren, kwantificeren, meten en analyseren. Dit protocol biedt een blauwdruk voor hoe multifunctionele analyse van cytokinesecretie de grote functionele en dynamische diversiteit van het cytokine dat bij patiënten wordt uitgescheiden, mogelijk kan maken.

Verschillende cruciale aspecten van het beschreven testprotocol maken een unieke biologische uitlezing mogelijk. Ten eerste maakte inkapseling van één cel in microfluïdische druppeltjes het mogelijk om gegevens voor elke individuele cel te extraheren. Gebeurtenissen van meerdere celinkapselingen kunnen worden gedetecteerd en gesorteerd of gesorteerd door beeldanalyse, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Ten tweede maakte de opname van verschillende onafhankelijke fluorescerende immunoassays in druppeltjes en de uitlijning van de gefunctionaliseerde nanodeeltjes de kwantitatieve meting van maximaal drie cytokineconcentraties parallel mogelijk. Deze multiplexing maakte de analyse van cytokine co-secretiepatronen op het niveau van één cel mogelijk. Ten derde maakte immobilisatie van de druppeltjes de tijdgewijze meting en correlatie van cytokinesecretie voor elke afscheidende cel mogelijk en maakte het mogelijk om co-occurrent te onderscheiden van sequentiële secretie. De tijdresolutie leverde op unieke wijze gegevens op over secretiepatronen en subpopulaties van verschillende soorten secretoren. Ten slotte maakte geparallelliseerde beeldanalyse het mogelijk om efficiënt grote hoeveelheden gegevens te extraheren en te volgen uit metingen met meer dan 20.000 individuele cellen. De extractie uit enkelvoudige secretiecurven maakte het verder mogelijk om fenotypische subpopulaties en functionaliteiten te ontdekken.

Naast de unieke uitlezing heeft de test ook technische voordelen ten opzichte van standaard cytokineanalyse. Dankzij de kleine omvang van de inkapselingscompartimenten van ongeveer 60 pL kunnen absolute hoeveelheden uitgescheiden cytokinen direct vanuit de biologische bron worden gedetecteerd met detectielimieten die passen bij de celsecretie. De miniaturisatie van de test maakt ook gebruik van kleinere hoeveelheden dure bioreagentia. Bovendien vereist de opstelling zeer weinig gespecialiseerde apparatuur, die vaak al beschikbaar is in laboratoria voor biologie en bio-engineering. Fluorescentiemicroscopen zijn overal verkrijgbaar en spuitpompen worden vaak gebruikt in bio-engineeringlaboratoria of kunnen tegen relatief lage kosten worden gekocht. Als er een celcultuur aanwezig is, bedragen de kosten voor de volledige apparatuur die nodig is om de experimenten uit te voeren ongeveer 148.000 euro, waarbij het grootste deel wordt bijgedragen door de geautomatiseerde epifluorescentiemicroscoop (130.000 euro). Een dergelijk instrument is echter vaak te vinden in biologische laboratoria en de rest van de kosten wordt verdeeld over de spuitpomp (13.000 euro, maar er zijn goedkopere alternatieven beschikbaar) en kleinere apparatuur. De fabricage van de druppelchip en de observatiekamer is zeer goed beschreven17 en kan worden uitgevoerd buiten een cleanroom-omgeving met de nodige infrastructuur, zoals ovens en plasmareinigers die in de meeste bio-engineeringlaboratoria aanwezig zijn. Als alternatief zijn er verschillende leveranciers beschikbaar om geïnteresseerde laboratoria te voorzien van druppelgeneratorchips. Vanwege de kleine volumes die nodig zijn, is de test kosteneffectief en eenvoudig op te zetten.

Om de hoogste mate van reproduceerbaarheid te garanderen, hebben we enkele cruciale stappen geïdentificeerd voor het succes van het protocol. Een veelvoorkomend probleem voor nieuwe gebruikers is de beweging van de druppel tijdens de meting. Hoewel de analysesoftware individuele druppels tot op zekere hoogte kan volgen, leidt overmatige beweging tot verlies van de resolutie van één cel en onnauwkeurige resultaten. Beweging kan worden vermeden door gebruik te maken van goed luchtdichte meetkamers, de juiste druppelgrootte en kamerafmetingen, een korte evenwichtsperiode voordat met de meting wordt begonnen en de juiste concentratie van oppervlakteactieve stoffen. Een andere cruciale stap is nauwkeurige scherpstelling voordat met de meting wordt begonnen. Onjuiste scherpstelling leidt tot aanzienlijk verlaagde fluorescentieverplaatsingswaarden en onderschatting van de hoeveelheid uitgescheiden cytokine. Ten slotte is, afhankelijk van de vraag en het protocol in kwestie, de juiste timing tussen de verschillende stappen van het grootste belang voor de reproduceerbaarheid. Vooral de wachttijd tussen het vullen van de kamer en het starten van de meting moet consistent zijn, anders kan het meetvenster van de uitgescheiden cytokines worden gemist.

Beperkingen van de gepresenteerde technologie zijn onder meer het beperkte vermogen om de cellen na inkapseling verder te manipuleren. Het is daarom momenteel niet mogelijk om stimulerende middelen, antilichamen of extra reagentia toe te voegen of te verwijderen. Aangezien de cellen zijn ingekapseld in hun geïsoleerde bioreactor, kunnen er tijdens de meting bovendien geen interacties tussen cellen (contactgebaseerde of paracriene signalering) plaatsvinden. Deze beperking kan gedeeltelijk worden ondervangen met bulkincubaties vooraf. Bovendien zijn versterkte autocriene effecten van uitgescheiden cytokines ook mogelijk en deze effecten kunnen niet met zekerheid worden gekwantificeerd of uitgesloten, aangezien alleen door antilichamen gedetecteerde uitgescheiden cytokines worden gemeten. De geïsoleerde kijk op cytokinesecretie moet dus altijd worden beschreven in de context van de bijbehorende vraag en toepassing. Deze beperking kan echter ook worden gebruikt voor de gedetailleerde studie van ingekapselde veelvouden, doubletten en drietallen, indien van belang. Dit zou een interessante opzet bieden die nuttig is om cel-celcontact of paracriene vragen te onderzoeken. Ten slotte is ook het dynamisch bereik van de test beperkt en moet het worden aangepast aan de specifieke toepassing. Hier hebben we het dynamische bereik van de test aangepast aan de verwachte uitgescheiden hoeveelheid van de gemeten cytokines.

Om de mogelijkheden en toepasbaarheid van de test verder te verbeteren, kunnen in de toekomst verschillende ontwikkelingen worden aangepakt, op het gebied van biologische, technische en data-analyseaspecten. Aan de biologische kant zou de meting van extra cytokines, andere uitgescheiden eiwitten, metabole of celoppervlaktemarkers kunnen worden geïntegreerd door de test aan te passen. Bovendien kan deze test worden geïntegreerd in een workflow naast andere celgebaseerde assays om de uitlezingen te verbreden (bijv. flowcytometriekleuring of sequencing). Bovendien zou de bruikbaarheid van de test kunnen worden vereenvoudigd, bijvoorbeeld door een geïntegreerde microfluïdische chip te creëren voor het maken en observeren van druppels, waardoor een bredere toepassing buiten bio-engineeringlaboratoria in een klinische omgeving mogelijk wordt. Wat de gegevensanalyse betreft, zou de extractie en het volgen van informatie uit afbeeldingen kunnen worden uitgebreid door de automatisering te verbeteren en machine learning-benaderingen te gebruiken, bijvoorbeeld om de aanwezigheid en positie van de cel(len) en kralenlijn in elke druppel te detecteren zonder fluorescerende etikettering. Dit zou extra fluorescerende kanalen openen die kunnen worden gebruikt voor immunoassays, wat zou resulteren in de meting van nog meer cytokines parallel.

De gepresenteerde test en de bijbehorende protocollen en analyse kunnen worden toegepast voor diverse potentiële gebruiksscenario's die verband houden met de dynamiek van cytokinesecretie. Meer specifiek zou de test mogelijk fundamentele immunologische vragen kunnen beantwoorden, zoals het identificeren van celtype- en activeringsspecifieke cytokinesecretieprofielen, polyfunctionaliteit van cytokine-secreterende cellen, of de tijdelijkheid en onderhoudsmechanismen van cytokinebalansen. Bovendien kan het platform in klinische toepassingen het mogelijk maken om de rol van cytokinen tijdens actieve of chronische ontstekingsreacties te ontrafelen, zoals waargenomen bij COVID-1930, of een hulpmiddel bieden voor het stratificeren van patiënten en het personaliseren van behandelingen op basis van unieke handtekeningen zoals bij auto-inflammatie31. Concluderend is een kwantitatieve, tijdopgeloste beoordeling van cytokinesecretie van afzonderlijke cellen een broodnodige methode, omdat het opheldert hoe een bepaald medicijn, infectie, genetische verandering of ex vivo-stimulatie een bepaalde reactie induceert.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specifieke aspecten zoals de kralenmetingen van cellen zijn gepatenteerd.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project werd ondersteund door subsidie #2021-349 van het strategische focusgebied Personalized Health and Related Technologies (PHRT) van het ETH-domein (Zwitserse Federale Instituten voor Technologie), de startsubsidie van de European Research Council (subsidie #803,336) en de Zwitserse Nationale Wetenschapsstichting (subsidie #310030_197619). Daarnaast bedanken we Guilhem Chenon en Jean Baudry voor hun werk en de ontwikkeling van de eerste DropMap-analyzer.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
008-FluoroSurfactantRAN Biotechnologies008-FluoroSurfactant-10G
2-Stream flow-focusing droplet maker, 30 µm nozzle, PFOS hydrophobic surface treatmentWunderli chips
Alexa Fluor 647 NHS Ester ThermoFisherA20006https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html
Anti-Human IL-1β (Monoclonal Mouse), AF647 labelled in-housePeproTech500-M01B
ARcare92524 double-sided adhesive tapeAdhesvies ReasearchARcare92524
Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nmAdemtechCat#03233
Biotinylated Goat Anti-Human IL-1βPeproTech500-P21BGBT
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3059
Cell ScraperTPP99002
CellTrace Violet Cell Proliferation KitInvitrogenC34557Celkleuroplossing
Chromafil Xtra PTFE-45/25 spuitfiltersMacherey-Nagel729205
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low AttachmentCorning3471
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10283
D-BiotinFluorochemM02926
DPBS, geen calcium, geen magnesiumGibco 14196-094
epT.I.P.S. Standard 2-200 µlEppendorf30000889
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solutionSigma-Aldrich3690
EZ-LINK-NHS-PEG4-BiotinThermoFisherA39259https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217
FcR Blocking Reagent, humanMiltenyi Biotec130-059-901
Fetal Bovine SerumGibco 10270-106
Handy dish soapMigros5.01002E+11
HEPES (1 M)Gibco 15630-080
HFE-7500 Oil 3M TM NovecFluorochemB40045191
Idex F-120 Fingertight One-Piece Fitting, Standard Knurl, Natural PEEK, 1/16" OD Tubing, 10-32 ConedCole-ParmerGZ-02014-15
IL-6 Monoclonal Antibody (MQ2-13A5 - Rat), FITCThermoFisher11-7069-81
IL-6 Monoclonal Antibody (MQ2-39C3), BiotinThermoFisher13-7068-85
KnockOut Serum ReplacementThermoFisher10828-010
Loctite AA 3491 curable UV glueHenkel AG & Co3491
Microscope slides (76x26x1mm, clear white)Menzel Gläser
Mineral oil lightSigma-Aldrich330779
NanoPort Assembly Headless, 10-32 Coned, for 1/16" ODIdexN-333
Neodymium block magnetK&J MagneticsBZX082
Omnifix-F Spritze, 1 ml, LSBraun9161406V
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco 15140-122 
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP4417
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)ThermoFisherP6866
Precision wipesKimtech Science5511
PTFE microtubing 0.30 × 0.76 mmFisherScientific1191-9445
PTFE microtubing 0.56 × 1.07 mmFisherScientific1192-9445
Recombinant Human IL-1βPeprotechCat#200-01B
Recombinant Human IL-6PeprotechCat#200-06
Recombinant human serum albumine (HSA)Sigma-AldrichA9731
Recombinant Human TNF-αPeprotechCat#300-01A
Reusable biopsy punch diameter 0.75 mm and 6 mmStiefel 504529 and 504532
RPMI 1640 Medium, geen fenol roodGibco11835-030
Standard LPS, E. coli K12InvivoGentlrl-eklps
Sterican needles 23 G voor 0.56 mm diameter microtubingFisherScientific15351547
Sterican needles 27 G voor 0.30mm diameter microtubingFisherScientific15341557
TNF alpha Monoclonal Antibody (MAb11), PEThermoFisher12-7349-81
TNF-alpha Monoclonal Antibody (MAb1), biotinylated in-houseThermoFisher14-7348-85
Trypan Blue Stain (0.4%) voor gebruik met de Countess Automated Cell CounterInvitrogenT10282
Vacuum Filtration "rapid"-FiltermaxTPP99500
Devices
Cameo 4 automatic cutting machineSilhouette
Cetoni Base 120 + 3x NEMESYS Low Pressure Syringe PumpsCetoniNEM-B101-03 A
Countess II Automated Cell CounterThermoFisher
Inverted Epi-fluorescence microscope Ti2NikonECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1
OKO Lab

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, L., et al. Inflammatory responses and inflammation-associated diseases in organs. Oncotarget. 9 (6), 7204-7218 (2017).
  2. Cicchese, J. M., et al. Dynamic balance of pro- and anti-inflammatory signals controls disease and limits pathology. Immunol Rev. 285 (1), 147-167 (2018).
  3. Liu, C., et al. Cytokines: From clinical significance to quantification. Adv Sci. 8 (15), e2004433(2021).
  4. Rojas, J. M., Avia, M., Martín, V., Sevilla, N. IL-10: A multifunctional cytokine in viral infections. J Immunol Res. 2017, 6104054(2017).
  5. Kohanawa, Y. M. A regulatory effect of the balance between TNF-α and IL-6 in the granulomatous and inflammatory response to Rhodococcus aurantiacus infection in mice. J Immunol. 177 (1), 642-650 (2006).
  6. Geginat, J., et al. Plasticity of human CD4 T cell subsets. Front Immunol. 5, 630(2014).
  7. Sallusto, F. Heterogeneity of human CD4+ T cells against microbes. Ann Rev Immunol. 34 (1), 317-334 (2016).
  8. Chetaille Nézondet, A. L., Poubelle, P. E., Pelletier, M. The evaluation of cytokines to help establish diagnosis and guide treatment of autoinflammatory and autoimmune diseases. J Leukocyte Biol. 108 (2), 647-657 (2020).
  9. Sims, J. T., et al. Characterization of the cytokine storm reflects hyperinflammatory endothelial dysfunction in COVID-19. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 107-111 (2021).
  10. Yasen, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the heterogeneity of infiltrating immune cell profiles in the hepatic cystic echinococcosis microenvironment. Infection and Immunity. 89 (12), (2021).
  11. Jiang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing highlights intratumor heterogeneity and intercellular network featured in adamantinomatous craniopharyngioma. Sci Adv. 9 (15), (2023).
  12. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
  13. Bucheli, O. T. M., Sigvaldadóttir, I., Eyer, K. Measuring single-cell protein secretion in immunology: Technologies, advances, and applications. Eur J Immunol. 51 (6), 1334-1347 (2021).
  14. Brower, K. K., et al. Double emulsion flow cytometry with high-throughput single droplet isolation and nucleic acid recovery. Lab Chip. 20 (12), 2062-2074 (2020).
  15. Brower, K. K., et al. Double emulsion picoreactors for high-throughput single-cell encapsulation and phenotyping via FACS. Anal Chem. 92 (19), 13262-13270 (2020).
  16. Luo, X., Chen, J. Y., Ataei, M., Lee, A. Microfluidic compartmentalization platforms for single cell analysis. Biosensors. 12 (2), 58(2022).
  17. Bounab, Y., et al. Dynamic single-cell phenotyping of immune cells using the microfluidic platform DropMap. Nat Protoc. 15 (9), 2920-2955 (2020).
  18. Eyer, K., et al. Single-cell deep phenotyping of IgG-secreting cells for high-resolution immune monitoring. Nat Biotechnol. 35 (10), 977-982 (2017).
  19. Gaa, R., et al. Versatile and rapid microfluidics-assisted antibody discovery. mAbs. 13 (1), 198130(2021).
  20. Gerard, A., et al. High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics. Nat Biotechnol. 38 (6), 715-721 (2020).
  21. De Jonghe, J., et al. spinDrop: a droplet microfluidic platform to maximise single-cell sequencing information content. Nat Comm. 14 (1), 4788(2023).
  22. Wheeler, M. A., et al. Droplet-based forward genetic screening of astrocyte-microglia cross-talk. Science. 379 (6636), 1023-1030 (2023).
  23. Portmann, K., Linder, A., Oelgarth, N., Eyer, K. Single-cell deep phenotyping of cytokine release unmasks stimulation-specific biological signatures and distinct secretion dynamics. Cell Rep Meth. 3 (7), 100502(2023).
  24. Portmann, K., Linder, A., Eyer, K. Stimulation-induced cytokine polyfunctionality as a dynamic concept. eLife. 12, 89781(2023).
  25. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev. 29, S49-S52 (2008).
  26. Yang, J., et al. New insight into neurological degeneration: Inflammatory cytokines and blood-brain barrier. Front Mol Neurosci. 15, 1013933(2022).
  27. Kim, P. S., Ahmed, R. Features of responding T cells in cancer and chronic infection. Curr Opin Immunol. 22 (2), 223-230 (2010).
  28. Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17 (1), 49-59 (2017).
  29. Cosenza, M., Sacchi, S., Pozzi, S. Cytokine release syndrome associated with T-cell-based therapies for hematological malignancies: Pathophysiology, clinical presentation, and treatment. Int J Mol Sci. 22 (14), 7652(2021).
  30. Hu, B., Huang, S., Yin, L. The cytokine storm and COVID-19. J Med Virol. 93 (1), 250-256 (2021).
  31. Marcuzzi, A., et al. Autoinflammatory diseases and cytokine storms-Imbalances of innate and adaptative immunity. Int J Mol Sci. 22 (20), 11241(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microfluidic Droplet PlatformCytokine Secretion DynamicsSingle Cell AnalysisPolyfunctional CellsMultiplexed ImmunoassayMagnetic NanoparticlesFluorescent ImagingPeripheral Blood MononuclearImmune Cell HeterogeneitySequential Cytokine Secretion

Gerelateerde artikelen