Method Article

Kwantificering van de dendritische wervelkolom met behulp van automatische driedimensionale neuronreconstructiesoftware

DOI:

10.3791/66493

⸱

September 27th, 2024

 ,  ,  , 
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, 2Colgate University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische stekels zijn postsynaptische compartimenten van de meeste excitatoire synapsen. Veranderingen in de morfologie van de dendritische wervelkolom treden op tijdens neurologische ontwikkeling, veroudering, leren en vele neurologische en psychiatrische aandoeningen, wat het belang van betrouwbare analyse van de dendritische wervelkolom onderstreept. Dit protocol beschrijft het nauwkeurig en reproduceerbaar kwantificeren van de morfologie van de dendritische wervelkolom met behulp van automatische driedimensionale neuronreconstructiesoftware.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synaptische verbindingen zorgen voor de uitwisseling en verwerking van informatie tussen neuronen. De postsynaptische plaats van excitatoire synapsen wordt vaak gevormd op dendritische stekels. Dendritische stekels zijn structuren die van groot belang zijn in onderzoek naar synaptische plasticiteit, neurologische ontwikkeling en neurologische en psychiatrische stoornissen. Dendritische stekels ondergaan tijdens hun levensduur structurele veranderingen, waarbij eigenschappen zoals het totale aantal ruggengraat, de grootte van de dendritische wervelkolom en morfologisch gedefinieerd subtype veranderen als reactie op verschillende processen. Het afbakenen van de moleculaire mechanismen die deze structurele veranderingen van dendritische stekels reguleren, is gebaseerd op morfologische metingen. Dit vereist nauwkeurige en reproduceerbare analyse van de dendritische wervelkolom om experimenteel bewijs te leveren. De huidige studie schetst een gedetailleerd protocol voor kwantificering en classificatie van de dendritische wervelkolom met behulp van Neurolucida 360 (automatische driedimensionale neuronreconstructiesoftware). Dit protocol maakt het mogelijk om de belangrijkste eigenschappen van de dendritische wervelkolom te bepalen, zoals de totale dichtheid van de wervelkolom, het volume van de wervelkolomkop en classificatie in subtypes van de wervelkolom, waardoor een effectieve analyse van structurele fenotypes van de dendritische wervelkolom mogelijk is.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische stekels zijn uitsteeksels van dendrieten die vaak de postsynaptische plaats van glutamaterge synapsen omvatten 1,2. Dendritische stekels zijn van bijzonder belang op het gebied van synaptische plasticiteit. Stekels worden vaak veranderd wanneer de synaptische kracht verandert, en worden groter en sterker bij synaptische potentiëring op de lange termijn of kleiner en zwakker bij langdurige synaptische depressie 3,4,5,6,7. Naast synaptische plasticiteit verandert het profiel van dendritische stekels gedurende de levensduur. In de vroege ontwikkeling is er een periode van vorming en groei van de dendritische wervelkolom, gevolgd door het snoeien van de dendritische wervelkolom tot het bereiken van een stabiele toestand 8,9,10. In de ouder wordende hersenen gaat het verlies van de wervelkolom gepaard met krimp van de hersenen en cognitieve achteruitgang11. Bovendien worden veel neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische aandoeningen gekenmerkt door afwijkende dendritische stekels. Meerdere hersengebieden bij personen met schizofrenie hebben minder dendritische stekels, waarschijnlijk als gevolg van veranderde synaptische snoei12. Autismespectrumstoornissen worden ook gekenmerkt door pathologieën van de dendritische wervelkolom13. Verlies van dendritische wervelkolom is een kenmerk van zowel de ziekte van Alzheimer als de ziekte van Parkinson 14,15. Gezien het brede scala aan onderzoeksonderwerpen die onderzoek naar de eigenschappen van dendritische wervelkolom omvatten, zijn technieken voor nauwkeurige kwantificering van de wervelkolom van het grootste belang.

Kleuring, d.w.z. de Golgi-methode, of het labelen van neuronen via kleurstofvulling of het tot expressie brengen van fluorescerende eiwitten zijn veelgebruikte methoden voor visualisatie van de dendritische wervelkolom 16,17,18. Eenmaal gevisualiseerd, kunnen stekels worden geanalyseerd met een verscheidenheid aan gratis en in de handel verkrijgbare softwareclients. De gewenste output van de analyse is een belangrijke factor om te bepalen welke software het meest bruikbaar zal zijn. Fiji is een haalbare software-optie voor vragen over de dichtheid van de dendritische wervelkolom. Deze techniek is echter grotendeels afhankelijk van tijdrovende handmatige tellingen die de kans op vertekening kunnen introduceren. Nieuwe plug-ins zoals SpineJ maken automatische kwantificering mogelijk, waardoor bovendien een nauwkeurigere analyse van de wervelkolom mogelijk is19. Een nadeel van deze benaderingen is het verlies van een driedimensionale analyse voor het bepalen van het wervelkolomvolume, aangezien SpineJ beperkt is tot tweedimensionale beeldstapels. Bovendien wordt het verkrijgen van informatie over het subtype van de wervelkolom via deze processen een uitdaging. De vier overheersende subtypes van de wervelkolom, dun, paddestoel, stomp en filopodia, duiden allemaal op individuele functies en worden grotendeels geclassificeerd via morfologie20. Dunne stekels worden gekenmerkt door een langwerpige nek en een gedefinieerd hoofd21. Paddenstoelstekels hebben een veel grotere en geprononceerde stekel22. Stompe stekels zijn kort en hebben weinig variatie tussen hoofd en nek23. Filopodia zijn onrijpe stekels met een lange, dunne nek en geen duidelijk waarneembare kop24. Hoewel classificatie waardevolle informatie oplevert, bestaan stekels op een continuüm van dimensies. De indeling in categorieën is gebaseerd op morfologische metingen25,26. Het handmatig meten van stekels voor classificatie vergroot de logistieke last voor onderzoekers in deze aanpak.

Andere software-opties die specifiek gericht zijn op driedimensionale analyse van de dendritische wervelkolom zijn beter geschikt voor onderzoek naar het volume en de eigenschappen van het subtype van de wervelkolom 27,28,29,30,31. Ondanks de moeilijkheid van driedimensionale analyse, zoals een slechte resolutie van het z-vlak en uitstrijkjes, maken deze software-opties een betrouwbare driedimensionale reconstructie van dendrieten en dendritische stekels mogelijk op een door de gebruiker geleide semi-geautomatiseerde manier. Automatische classificatie van geïdentificeerde stekels in hun subtypen is ook een functie die aanwezig is in sommige van deze softwarepakketten voor wervelkolomanalyse. Dit kan de bezorgdheid over mogelijke werkdruk en experimentele vooringenomenheid wegnemen. Neurolucida 360 is een in de handel verkrijgbare software die betrouwbare en reproduceerbare driedimensionale identificatie en classificatie van de dendritische wervelkolom mogelijkmaakt 32. Hier presenteren we een uitgebreid protocol om vast weefsel effectief voor te bereiden, beelden te verkrijgen en uiteindelijk dendritische stekels te kwantificeren en te classificeren met behulp van deze software.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven volgden de richtlijnen van de Amerikaanse National Institutes of Health voor het gebruik van dieren in intramuraal onderzoek en werden goedgekeurd door het National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee.

1. Bereiding van vaste plakjes hippocampus

  1. Verdoof muizen met een intraperitoneale injectie van Ketamine/Xylazine (Ketamine: 100 mg/kg; Xylazine: 8 mg/kg). Valideer de anesthesie via staartknijp en bevestig de muis op de perfusieplaat.
  2. Verwijder met een grote chirurgische schaar de huid en vacht van de borst, zodat de onderliggende ribbenkast gemakkelijker kan worden gevisualiseerd.
  3. Maak een horizontale snede onder de breedte van de ribbenkast, vermijd de lever en het middenrif. Trek met een fijne tang het xiphoid-proces omhoog en snijd elke zijkant van de ribbenkast door. Klap de ribbenkast omhoog naar het nekgebied en klem deze op zijn plaats met een hemostaattang.
  4. Steek een vlindernaald van 21 G in de linker hartkamer en begin te doordringen met kamertemperatuur 1x PBS bij ongeveer 5 ml/min. Maak een kleine snee in het rechter atrium met een kleine chirurgische schaar. Perfuseren met PBS totdat de oplossing die het atrium verlaat helder is.
  5. Schakel de perfusiepomp uit om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de slang komen. Plaats de slang van PBS in ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Perfuseer met PFA met een snelheid van 5 ml/min totdat het dier volledig is verstijfd, ongeveer 25 ml.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de PFA vers is (niet meer dan 1 week oud als de voorraad bij 4° C wordt bewaard) voor een optimale fixatie.
  6. Verwijder de huid van het oppervlak van de schedel met een kleine chirurgische schaar. Maak een midsagittale snee met een kleine chirurgische schaar langs de centrale spleet van de schedel. Maak zijwaartse sneden rostraal naar de bulbus olfactorius en over het cerebellum.
  7. Open de schedel met een fijne pincet om de hersenen bloot te leggen. Schep met een spatel de hersenen voorzichtig uit de reukbollen en doe ze een nacht in 4% PFA in PBS.
    OPMERKING: Voor een uitgebreider protocol van knaagdierperfusie, verwijzen wij u naar Gage et al.33.
  8. Cryobescherm de vaste hersenen door de 4% PFA te vervangen door 15% sucrose in PBS gedurende 1 dag. Vervang hierna de 15% sucrose door 30% sucrose in PBS-oplossing gedurende 1 dag totdat de hersenen in de oplossing zinken.
  9. Haal de hersenen uit de sucrose-oplossing en plaats deze in een petrischaaltje met PBS. Snijd het cerebellum en de bulbus olfactorius af met een scalpelmesje.
  10. Plaats een kleine hoeveelheid, met een diameter van 1-2 cm, van de optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) op het oppervlak van de preparaathouder. Monteer de hersenen coronaal op de preparaathouder met het caudale snijvlak in de OCT. Bevries de hersenen snel door de preparaathouder in verpulverd droogijs te plaatsen tot ze zichtbaar bevroren zijn, ongeveer 5-7 minuten.
  11. Zorg ervoor dat de bladhoek van de cryostaat is ingesteld tussen 0° en 5° om uniforme secties te produceren. Pas de hoek van de rolplaat aan voor een optimale afvlakking van de plakjes. Raadpleeg de handleiding van de apparatuur voor specifieke instructies.
  12. Plaats de monsterhouder in de cryostaat met het ventrale oppervlak van de hersenen zich het dichtst bij het mes. Snijd de hersenen in dorsale hippocampussecties van 30 μm en gooi alle plakjes rostraal naar de hippocampus weg.
    OPMERKING: Dit deel van het protocol kan worden aangepast aan elk gewenst hersengebied naar keuze. De stappen 1.9-1.12 veranderen afhankelijk van de interesseregio.
  13. Breng dorsale hippocampusplakjes over naar PBS. Monteer de hippocampussecties voorzichtig met een penseel op een microscoopglaasje. Verwijder overtollige oplossing met wattenstaafjes of delicate taakdoekjes.
  14. Breng 100 μL hardhard montagemedium aan op het microscoopglaasje dat alle plakjes hersenen bedekt. Om luchtbellen te voorkomen, laat u het dekglaasje langzaam met een pincet op het montagemedium zakken. Als er luchtbellen ontstaan, tik dan zachtjes met een tang op het dekglaasje om ze te laten ontsnappen. Laat de objectglaasjes een nacht staan voordat u de beeldvorming uitvoert.

2. Confocale beeldvorming met hoge resolutie

  1. Gebruik oculairs met een lage vergroting om fluorescerende cellen te identificeren. Schakel over naar een objectief van 63x (NA = 1,4) of hoger en pas het juiste dompelmedium toe op het objectief.
    OPMERKING: Gebruik voor de beste resultaten een confocale laserscanmicroscoop met een objectief van 63x of hoger.
  2. Identificeer goed gelabelde dendritische segmenten met beperkte overlap voor beeldacquisitie. Stel het laservermogen en de versterking in om ervoor te zorgen dat de fluorescerende dendrieten niet verzadigd raken. Bovendien kan het verlagen van de scansnelheid zorgen voor een betere beeldresolutie.
  3. Verwerf z-stacks die de volledige dendritische segmenten omvatten voor toekomstige analyse. Z-stacks groter dan 10 μm zijn ongewenst vanwege de extra kans op dendritische overlap in het z-vlak.
    NOTITIE: Gebruik de kleinste z-stapgrootte die beschikbaar is (0.2-0.7 μm) en 1 luchtige eenheidsgaatje. De kleinere stapgrootte resulteert in meer beelden in de z-stack, wat de beperkte Z-resolutie van veel microscopen compenseert.
  4. Optioneel: Indien beschikbaar, gebruik de respectievelijke deconvolutiesoftwarefunctionaliteit van de microscoop om beelden te deconvolven. Dit zorgt voor afbeeldingen met een hogere resolutie.

3. Kwantificering van de dendritische wervelkolom

  1. Open Neurolucida 360 (v2022.1.1 of hoger). Open het afbeeldingsbestand in de wervelkolomanalysesoftware (Bestand > Open > Afbeelding). Zorg ervoor dat het afbeeldingsbestand zichtbaar is in het hoofdvenster en de 3D-omgeving. Als het 3D-omgevingsvenster niet verschijnt, klikt u met de linkermuisknop op 3D-omgeving in de bovenste werkbalk van het hoofdvenster op het tabblad Traceren (aanvullende afbeelding 1)
    OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol kan worden aangepast voor alle dendritische beelden, niet uitsluitend dendrieten uit muizenweefsel.
  2. Zorg er op het tabblad Afbeeldingsweergave wijzigen van het venster 3D-omgeving voor dat de afbeelding wordt weergegeven als 3D-volume in het vak Afbeelding weergeven als . Selecteer in het vak Instellingen voor afbeeldingsstapel van het tabblad Afbeelding de optie Maximale projectie in het vervolgkeuzemenu Oppervlak weergeven als . (Aanvullende figuur 2)
  3. Identificeer een geschikt dendritisch segment voor tracering.
    1. Klik met de linkermuisknop op het gereedschap Draaipunt verplaatsen in de bovenste werkbalk van het venster 3D-omgeving . Klik met de linkermuisknop op de gewenste dendriet om een nieuw draaipunt in te stellen. Hierdoor wordt de oriëntatie gewijzigd om effectief inzoomen mogelijk te maken.
    2. Herstel de oorspronkelijke oriëntatie door met de linkermuisknop op het pictogram Oriëntatie resetten te klikken. Nadat u het draaipunt hebt ingesteld, klikt u met de linkermuisknop op het gereedschap Draaipunt verplaatsen om te beginnen met het traceren van de dendriet. (Aanvullende figuur 2).
      OPMERKING: De ideale dendriet is er een met beperkte overlap met andere dendrieten in een van de coördinatenvlakken en niet kruisend met een andere dendriet of oppervlakkig met een andere eronder. Dendrieten in de lage nabijheid van anderen in het XY-vlak hebben ook de voorkeur om ongepaste toewijzing van naburige stekels aan de getraceerde dendriet te voorkomen. Er moet ook worden opgemerkt dat dendrieten van verschillende diktes, orden en afstanden van soma verschillende dendritische wervelkolomdichtheden hebben34,35. Hiermee moet rekening worden gehouden in de experimentele opzet. Dendrieten van secundaire orde met een dikte van <1,5 μm zijn ideale kandidaten voor tracering (Figuur 1).
  4. Klik met de linkermuisknop op het tabblad Structuur van het venster 3D-omgeving . Klik met de linkermuisknop op Door de gebruiker geleid voor de traceringsmodus en op Directionele kernels als de methode in Door de gebruiker geleide traceringsopties.
  5. Klik met de linkermuisknop op de dendriet wanneer een cirkelvormige kern verschijnt om het traceren te beginnen. Beweeg de cursor langs het dendritische segment. Hierdoor worden de kernels automatisch gevuld. Als de kernels niet automatisch worden gevuld, zie stap 3.51.
    1. Beweeg de cursor voorzichtig heen en weer op de dendriet totdat de korrels zich bevolken. Klik met de linkermuisknop om de bestaande gedetecteerde kernels te behouden. Als de kernels niet meer worden gevuld, klikt u met de linkermuisknop wanneer een kernel zich verderop in de dendriet vult om er handmatig een te plaatsen. Klik met de rechtermuisknop om de tracering te beëindigen. Zorg ervoor dat de getraceerde dendriet minimaal 7 μm lang is (aanvullende figuur 3).
  6. Controleer de nauwkeurigheid van de dendritische tracering met behulp van alle drie de richtingen van de 3D-omgeving, stampen, gieren en rollen, door met de linkermuisknop te klikken en het 3D-omgevingsvenster te slepen. Identificeer punten waar de dendritische tracering zich buiten de juiste locatie op de dendriet bevindt. Er kunnen gevallen zijn waarin het er van boven naar beneden nauwkeurig uitziet, maar in de z-dimensie bevinden de punten zich niet op de dendriet (Figuur 2).
  7. Als u onjuist getraceerde dendritische segmenten wilt corrigeren, klikt u met de linkermuisknop op het tabblad Bewerken in het menu Boom . Klik met de linkermuisknop op de betreffende dendriet en klik vervolgens met de linkermuisknop op Punten.
  8. Verplaats onjuist geplaatste punten terug op het dendrietsegment door te klikken en te slepen. Verwijder overbodige punten door met de linkermuisknop op het punt te klikken en op de knop Verwijderen te klikken. Verander de grootte van de punten als de dendriet niet voldoende gevuld is. Als u de grootte van het punt wilt wijzigen, klikt u met de linkermuisknop op een punt en past u de dikteschuifregelaar aan om de grootte te wijzigen (aanvullende afbeelding 4).
    OPMERKING: Onvoldoende gevulde dendrieten kunnen leiden tot het identificeren van valse stekels die componenten zijn van het dendritische segment. Omgekeerd kan overvulling van dendrieten echte stekels verdoezelen.
  9. Herhaal stap 3.3-3.8 voor meerdere dendrieten in de afbeelding voordat u verder gaat met de identificatie van de wervelkolom in stap 3.10.
  10. Klik met de linkermuisknop op het tabblad Wervelkolom in het venster 3D-omgeving. Stel detectie-instellingen in voor het buitenbereik, de minimale hoogte en het minimale aantal voxels. Afhankelijk van de voorbereiding kan het nodig zijn de vooraf ingestelde waarden te wijzigen in het geval van een duidelijke en specifieke rechtvaardiging voor wijzigingen. De vooraf ingestelde voorwaarden zijn Outer Range: 2.5 μm, Minimum Height: 0.3 μm, Minimum Voxel Count: 10 Voxels.
    OPMERKING: Verschillende preparaten, zoals celculturen versus acute weefsels, evenals verschillende ontwikkelingstijdstippen vereisen verschillende criteria die moeten worden afgeleid uit bestaande literatuur. Het is ook van vitaal belang op te merken dat het wijzigen van de detectie-instellingen de resultaten aanzienlijk kan wijzigen. Een hogere minimumhoogte kan bijvoorbeeld korte stekels uitsluiten. De detectie-instellingen moeten gedurende het gehele verloop van het experiment consistent blijven.
  11. Stel de gevoeligheid van de detector in op 70% en klik met de linkermuisknop op Alles detecteren. Dit zal de stekels bevolken die door deze detector zijn geïdentificeerd gevoeligheid op alle dendrieten. Als het gewenst is om stekels op een dendriet-specifieke manier te selecteren, klikt u met de linkermuisknop op het vakje Klik op afbeelding om alles op de dichtstbijzijnde tak te detecteren en klik u met de linkermuisknop handmatig op elke dendriet met verschillende detectorgevoeligheden.
    OPMERKING: In dit stadium is het normaal dat niet alle dendritische stekels zullen bevolken. Evenzo kunnen niet-stekels onjuist worden bevolkt. De initiële gevoeligheid van 70% is ook flexibel; Dit kan veranderen afhankelijk van de bereiding.
  12. Onderzoek de stekels die door deze detectorgevoeligheid zijn geselecteerd door de dendriet in alle drie de richtingen te klikken en te slepen. Als de meerderheid van de gedetecteerde stekels niet volledig gevuld is, ga dan verder met stap 3.12.1. Als de gedetecteerde stekels overvol zijn, ga dan verder met stap 3.12.2. Als de gedetecteerde stekels voldoende gevuld lijken te zijn, ga dan verder met stap 3.13.
    1. Verhoog de gevoeligheid van de detector met 5%-10% en klik nogmaals met de linkermuisknop op Alles detecteren . Hierdoor worden alle eerder gedetecteerde stekels vervangen door nieuwe met een hogere gevoeligheid. Herhaal indien nodig totdat de gedetecteerde stekels voldoende zijn gevuld.
    2. Verlaag de gevoeligheid van de detector met 5%-10% en klik nogmaals met de linkermuisknop op Alles detecteren . Dit zal alle eerder gedetecteerde stekels vervangen door nieuwe met een lagere gevoeligheid . Herhaal indien nodig totdat de gedetecteerde stekels voldoende zijn gevuld.
  13. Klik met de linkermuisknop op Bestaande ruggen behouden op het tabblad Wervelkolom van de 3D-omgeving. Als Klik op Afbeelding om alles op dichtstbijzijnde tak te detecteren is geselecteerd, deselecteer deze dan.
    OPMERKING: Door Bestaande stekels behouden aan te vinken, zorgt u ervoor dat nieuw geïdentificeerde dendritische stekels handmatig de eerder geïdentificeerde stekels niet overschrijven. Zorg ervoor dat dit vakje is ingeschakeld voordat u doorgaat om het vorige werk niet te overschrijven.
  14. Klik met de linkermuisknop op Draaipunt verplaatsen en klik met de linkermuisknop op de dendriet die verdere wervelkolomdetectie vereist om het draaipunt in te stellen.
    1. Schakel de optie Draaipunt verplaatsen uit. Identificeer een ongevulde dendritische wervelkolom. Verhoog de gevoeligheid van de detector 10%-20% ten opzichte van de vorige detectie en klik met de linkermuisknop op de wervelkolom. Als de gedetecteerde wervelkolom onder- of overvol is, ga dan verder met stap 3.14.3 of 3.14.4. Als de wervelkolom niet wordt ingevuld, verschijnt het bericht Kan geen wervelkolom detecteren op de geselecteerde locatie. Ga in dit geval verder met stap 3.14.2.
    2. Verhoog de gevoeligheid van de detector stapsgewijs, mogelijk boven de 100%, totdat de wervelkolom is gedetecteerd en voldoende is gevuld. Als de wervelkolom wordt gedetecteerd maar onvoldoende is gevuld, ga dan verder met stap 3.14.3. Als de wervelkolom overvol is, ga dan verder met stap 3.14.4 (figuur 3).
    3. Klik met de linkermuisknop op het tabblad Bewerken en klik met de linkermuisknop op de ondergevulde rug. Klik met de linkermuisknop op Verwijderen. Schakel het tabblad Bewerken uit. Verhoog de gevoeligheid met 5%-10% en klik met de linkermuisknop op de wervelkolom. Herhaal deze stap als de wervelkolom nog steeds ondergevuld is.
    4. Klik met de linkermuisknop op het tabblad Bewerken en klik met de linkermuisknop op de overvolle rug. Klik met de linkermuisknop op Verwijderen. Schakel het tabblad Bewerken uit. Verlaag de gevoeligheid met 5%-10% en klik op de ruggengraat. Herhaal deze stap als de wervelkolom nog steeds overvol is.
  15. Herhaal stap 3.14-3.14.4 totdat alle stekels die door visuele identificatie zijn geïdentificeerd, zijn gedetecteerd. Controleer de dendriet nogmaals op stekels die behoren tot naburige dendrieten, valse stekels die overeenkomen met geen echt signaal of mogelijke segmenten van dendriet die ten onrechte als een stekel zijn gelabeld. Verwijder deze valse stekels met de functie Verwijderen .
  16. Onderzoek de geïdentificeerde stekels op de dendriet. In sommige gevallen kunnen meerdere stekels verschijnen als één conglomeraatstekel. Als een ruggengraat uit twee ruggengraat lijkt te bestaan, klikt u met de linkermuisknop op het tabblad Bewerken . Klik met de linkermuisknop op de rug en klik met de linkermuisknop op Selectie verbergen. Nadat u de ruggengraat van een conglomeraat hebt bevestigd, klikt u op het tabblad Bewerken met de linkermuisknop op Selectie weergeven en selecteert u Splitsen. Als er meer dan twee stekels in één conglomeraat zitten, moet deze stap mogelijk worden herhaald (Figuur 4).
    OPMERKING: Als de wervelkolom van het conglomeraat na stap 3.16 niet splijt, verwijder dan de wervelkolom. Selecteer vervolgens de intensere wervelkolom van het conglomeraat met een lagere gevoeligheid. Zodra de intensere wervelkolom is gevuld, verhoogt u de gevoeligheid om de andere ongevulde wervelkolom te selecteren. Als alternatief kan het verwijderen van de conglomeraatwervelkolom en vervolgens het verhogen van de gevoeligheid een goede splitsing mogelijk maken.
  17. Als alle visueel herkenbare stekels zijn gedetecteerd en op de juiste manier zijn gevuld, klikt u op het tabblad Wervelkolom met de linkermuisknop op Alles classificeren om de stekels in vier subtypen te classificeren: dun, paddestoel, stomp en filopodia (Afbeelding 5).
    OPMERKING: De classificatieparameters van de wervelkolom kunnen worden gewijzigd in het venster Instellingen van het vak Classificatie op het tabblad Wervelkolom . Net als bij de instellingen van de detector wordt een duidelijke reden voor het wijzigen van de bestaande parameters sterk aangemoedigd. De vooraf ingestelde waarden zijn de verhouding tussen hoofd en nek: 1,1, de verhouding lengte/hoofd: 2,5, de grootte van de paddenstoelenkop: 0,35 μm, de lengte van het Filopodium 3 μm.
  18. Selecteer in de bovenste werkbalk van het 3D-omgevingsvenster de optie Opslaan en weergeven in Neurolucida Explorer. Neurolucida Explorer is waar de gegevens worden verzameld uit de traceringen. Het werk wordt opgeslagen als een .dat bestand met daarin alle traceringen en stekels.
  19. Klik in het Verkenner-venster op het tabblad Weergave met de linkermuisknop op Alles selecteren om alle dendrieten en stekels te markeren.
  20. Klik met de linkermuisknop op het tabblad Analyseren in de bovenste werkbalk. Klik met de linkermuisknop op het vervolgkeuzemenu Structuur . Klik met de linkermuisknop op Vertakte structuuranalyse.
  21. Afhankelijk van de variabelen die van belang zijn, kan elk van de analyses worden geselecteerd. De twee meest bruikbare vragen over de dichtheid van de wervelkolom en het gemiddelde volume van de wervelkolom zijn Each Tree > Each Dendrite en Spines > Spine Details. Selecteer OK en de gegevens verschijnen in twee afzonderlijke vensters.
  22. Kopieer de gegevens naar een spreadsheet voor verdere compilatie en analyse.
    OPMERKING: De individuele boom wordt gescheiden door dendriet, maar het stekelvolume niet. Met behulp van de sorteerfunctie in de spreadsheet kunnen de details van de wervelkolom worden gefilterd op functies.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het effectief gebruik van deze analysemethode begint met de selectie van dendritische segmenten voor tracering. Zoals beschreven in figuur 1, bevinden de ideale dendrieten voor tracering zich niet in de nabijheid van andere dendrieten. Parallel lopende dendrieten kunnen resulteren in het onjuist identificeren van stekels van een naburige dendriet. Dendrieten die elkaar direct kruisen of loodrecht op een ander z-vlak lopen, voegen ook aanzienlijke moeilijkheden toe aan nauwkeurige dendritische tracering. Het is ook belangrijk om de verschillen in dendrietdikte op te merken. Zoals eerder gemeld, zijn er belangrijke verschillen in de dichtheid van de wervelkolom met dendrieten van verschillendedikte36. Er kunnen ook verschillen zijn in dezelfde dendriet met een grotere afstand tot het aftakpunt37. Het traceren van dendrieten van dezelfde orde en dikte, idealiter met een vergelijkbare oorsprong van vertakkingspunten, kan de bestaande heterogeniteit van de dichtheid van de dendritische wervelkolom controleren. Het identificeren van het aftakpunt in sommige preparaten kan onhaalbaar blijken te zijn, maar de dikte van de dendriet moet altijd een controleerbare factor zijn bij het traceren van dendrieten. Het nauwkeurig traceren van dendritische segmenten is van vitaal belang om nauwkeurige resultaten uit deze analyse te verkrijgen. Het is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat alle punten van de getraceerde dendriet zich echt in de dendriet bevinden. Het bekijken van de driedimensionale dendriet vanuit verschillende richtingen kan helpen bij dit proces. Zoals aangetoond in figuur 2A,B, toont het bovenaanzicht wat een correct getraceerde dendriet lijkt te zijn. In het zijaanzicht; Veel punten bevinden zich echter niet op de dendriet zelf. Deze problemen zijn niet aanwezig in het zijaanzicht van figuur 2C. Het is ook van vitaal belang om ervoor te zorgen dat dendrieten goed worden gevuld tijdens het traceren. Een dendriet die ondergevuld is, kan ertoe leiden dat stukjes dendrieten ten onrechte als stekels worden geïdentificeerd. Een dendriet die overvol is, kan voorkomen dat echte stekels worden geïdentificeerd vanwege de minimale hoogtedrempel. Deze handmatige beoordeling van de door de gebruiker geleide tracering is van cruciaal belang om een nauwkeurige analyse van de dendritische wervelkolom mogelijk te maken.

De identificatie van dendritische stekels vereist ook een gebruikersgerichte aanpak. Het gebruik van de functie "Alles detecteren" om de uniforme gevoeligheidsdrempel van de detector in te stellen, is om verschillende redenen ontoereikend. Het gebruik van de functie "Alles detecteren" is handig voor het identificeren van de meest flagrante stekels, maar de vulling van deze stekels moet worden gecontroleerd om te verifiëren. De geïdentificeerde stekels met de initiaal "Alles detecteren" zijn mogelijk ondergevuld. Om dit te corrigeren, moet de geïdentificeerde wervelkolom afzonderlijk worden verwijderd en vervolgens handmatig opnieuw worden geïdentificeerd met een hogere detectorgevoeligheid (Figuur 3A-C). Dit zorgt ervoor dat de wervelkolom voldoende wordt gevuld. Er is een aanzienlijke heterogeniteit in de vereiste detectorgevoeligheid voor stekels die handmatig moeten worden verantwoord. Het verhogen van de gevoeligheid van de detector om alles te detecteren kan resulteren in te volle stekels, die ook handmatige correctie vereisen (Figuur 3D). Een bijkomend probleem met onjuiste detectorgevoeligheid is de ongepaste creatie van een conglomeraatstekekel, één gevulde dendritische stekel die meerdere stekels omvat. Twee stekels die dicht bij elkaar liggen, kunnen ten onrechte worden samengevoegd tot één conglomeraatstekel (Figuur 4A,B). De wervelkolomdetectiesoftware heeft een "Split"-functie, die kan worden gebruikt om stekels te scheiden die zijn samengevoegd door overvulling. De "Split"-functie maakt het mogelijk om de individuele stekels gemakkelijk te genereren uit de conglomeraatstekel (Figuur 4C). Nauwkeurige tracering van dendrieten en vulling van de dendritische wervelkolom zorgen voor een nauwkeurige indeling in subtypen van de wervelkolom. De classificatie van de wervelkolom is gebaseerd op de morfologie van de gevulde stekels en de afstand tot dendrieten, dus elke stap in het proces speelt een rol in de morfologische classificatie (Figuur 5).

Vanwege de noodzaak van handmatige selectie en drempelbepaling is het cruciaal om een uniforme standaard te volgen voor alle analyses. Dit is vooral relevant als meerdere gebruikers bijdragen aan data-analyse. Om ervoor te zorgen dat alle onderzoekers die analyses uitvoeren dezelfde standaard volgen, moeten onderzoekers gegevens van dezelfde getraceerde dendrieten vergelijken. Dit kan de kans op vooringenomenheid van de onderzoeker verminderen door ervoor te zorgen dat elke onderzoeker stekels identificeert op basis van gedeelde, uniforme criteria op een geblindeerde manier. Er is ook de mogelijkheid van bias van een enkele onderzoeker tussen dagen of zelfs op dezelfde dag als gevolg van vermoeidheid. Dit moet gedurende het hele proces van gegevensanalyse worden gecontroleerd. Om de validiteit van de analyse verder te waarborgen, zorgt het vergelijken van de eerste resultaten met die gepubliceerd in de literatuur ervoor dat het protocol effectief wordt gevolgd. Het is van cruciaal belang op te merken dat deze vergelijking alleen effectief zal zijn als de voorbereiding en parameters worden gedeeld. Verschillen in kleuring, het verkrijgen van fluorescerende signalen, volgorde en dikte van dendrieten of hersengebied kunnen bijdragen aan verschillende resultaten 8,36. In het geval van ontbrekende gepubliceerde resultaten, zorgt het gebruik van meerdere onderzoekers om de identificatie van de wervelkolom te valideren voor meer vertrouwen in de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de analyse. In dit manuscript is een aanvullende analysemap opgenomen. Deze map bevat bestanden met voorbeeldafbeeldingen van dendritische segmenten, getraceerde dendrieten, getraceerde dendrieten met geïdentificeerde en geclassificeerde stekels, en gegevensuitvoer (aanvullende tabel 1, aanvullend bestand 1, aanvullend bestand 2, aanvullend bestand 3 en aanvullend bestand 4). Nieuwe gebruikers kunnen op deze dataset trainen om de procedures te oefenen die in dit document worden beschreven. Door de gebruiker gegenereerde resultaten binnen 10% van de verstrekte steekproefdataset worden als acceptabel beschouwd voor het reproduceren van de analysestandaard. Vanwege de mogelijk subjectieve criteria van een volledig gevulde wervelkolom en de noodzaak van handmatig onderzoek van automatisch gedetecteerde stekels, is variatie tussen en binnen onderzoekers een normaal onderdeel van de analyse. Mochten de gegenereerde resultaten die drempel overschrijden; Er moet echter een zij-aan-zij vergelijking worden uitgevoerd om gevallen van verschillende wervelkolomvolumes te bepalen, evenals onjuist opgenomen of uitgesloten stekels. De steekproefgegevensset kan vervolgens opnieuw worden geanalyseerd totdat de aanvaardbare drempelwaarde is bereikt.

figure-results-1
Figuur 1: Selectie van dendrieten voor analyse van de dendritische wervelkolom. (A) 3D-volumeweergave van confocale beelden van z-stack confocale beelden genomen van CA1 proximale dendrieten in de THY1-YFP transgene muislijn. Let op de heterogeniteit van de dendrietenorde met dikkere primaire dendrieten in blauwe ovalen en dunnere, secundaire en tertiaire dendrieten in roze ovalen. (B) Ideale kandidaten voor het traceren van dendrieten worden aangeduid met groene ovalen. Let op de dikte en beperkte kruispunten, overlappingen en de nabijheid van andere dendrieten. Het rode ovaal geeft dendritische segmenten aan die moeten worden vermeden voor dendritische tracering vanwege hoge kruispunten, overlappingen en de nabijheid van andere dendrieten. Dikkere, primaire dendrieten zijn ook geen geschikte kandidaten om te traceren. Schaalbalk = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Nauwkeurig traceren van dendritische segmenten. (A) 3D-volumeweergave van confocale beelden van z-stack genomen van CA1 proximale dendrieten in de THY1-YFP transgene muislijn die moeten worden getraceerd via de door de gebruiker geleide directionele kernelmethode. Schaalbalk = 10 μm. (B) Voorbeeld van een slechte dendriettracering. De dendriet lijkt goed te zijn getraceerd in het bovenaanzicht. Het zijaanzicht laat zien dat de dendriet niet goed gevuld is met punten die afwijken van de dendriet. (C) Voorbeeld van een goede dendriettracering. Het bovenaanzicht lijkt op B, maar het zijaanzicht verschilt aanzienlijk. De dendriet in C is correct getraceerd, zoals aangegeven, door volledig gevuld te zijn zonder afwijkingen van de dendriet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Nauwkeurig vullen van dendritische stekels met behulp van handmatige selectie. (A) 3D-volumeweergave van confocale beelden van z-stack confocale beelden genomen van CA1 proximale dendrieten in de THY1-YFP transgene muislijn van een wervelkolom in afwachting van handmatige detectie. Schaalbalk = 0,5 μm. (B) Voorbeeld van een ondergevulde dendritische wervelkolom. Er is nog een substantieel fluorescerend signaal zichtbaar door onvolledige vulling. (C) Voorbeeld van een goed gevulde dendritische wervelkolom. De aanwezigheid van een "corona" van signaal dat nauwelijks zichtbaar is rond de buitenkant van de vulling is de standaard voor het nauwkeurig vullen van dendritische stekels. (D) Voorbeeld van een overvolle dendritische wervelkolom. De gevoeligheid van de detector is te hoog, wat resulteert in een overvolle ruggengraat. De vulling is voorbij de grenzen van de fluorescentie gegaan en heeft een bijna onmerkbare corona. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Splitsing van dendritische stekels van conglomeraten. (A) 3D-volumeweergave van confocale beelden van z-stack confocale beelden genomen van CA1 proximale dendrieten in de THY1-YFP transgene muislijn met twee stekels dicht bij elkaar. Schaalbalk = 0,15 μm. (B) Een voorbeeld van twee onafhankelijke stekels die onjuist zijn gevuld als één conglomeraat dendritische stekels. (C) Na het gebruik van de "Split"-functie wordt de conglomeraatstekel gesplitst in twee afzonderlijke, goed gevulde dendritische stekels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Identificatie en classificatie van de dendritische wervelkolom in subtypes. (A) 3D-volumeweergave van confocale beelden van z-stack confocale beelden genomen van CA1 proximale dendrieten in de THY1-YFP transgene muislijn van een getraceerd dendritisch segment geïsoleerd voor kwantificering en classificatie van de dendritische wervelkolom. Schaalbalk = 5 μm. (B) Getraceerd dendritisch segment met alle dendritische stekels geïdentificeerd en onderzocht om een goede vulling en splitsing te garanderen. De software wijst in deze stap willekeurig kleuren toe aan geïdentificeerde stekels. (C) Classificatie van alle geïdentificeerde dendritische stekels in subtypen met behulp van gedefinieerde parameters in de software. Blauw = paddenstoel, geel = dun en groen = stomp. Filopodia zijn niet aanwezig vanwege de ouderdom van dit weefsel. (D) Representatieve afbeeldingen van paddestoel-, dunne en stompe stekels ongevuld (boven) en gevuld (onder). Schaalbalk = 0,3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Toegang tot de 3D-omgeving. Z-stapel van confocale beelden bekeken in de software-interface. De navigatie in de 3D-omgeving op het tabblad Traceren in de hoofdviewer is geel gemarkeerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 2: Beeldparameters en oriëntatie-instellingen voor 3D-omgeving. 3D Environment viewer voor confocale z-stack afbeeldingen. Parameters in het gemarkeerde tabblad Afbeelding wijzigen Weergave, aangeduid met gele pijlen, zijn ingesteld op Afbeelding weergeven als: 3D-volume en Oppervlak weergeven als: Maximale projectie. Draaipunt verplaatsen en Oriëntatie resetten worden aangeduid met gele pijlen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Tracering van dendrietsegmenten. (A) 3D-volume van z-stack confocale beelden voor het traceren van dendrieten. Als het tabblad Boomstructuur, de door de gebruiker geleide en directionele kernels allemaal zijn geselecteerd, begint het traceren met het plaatsen van de eerste kernel op de dendriet met een klik met de linkermuisknop. (B) Voortplanting van gerichte pitten langs de dendriet na cursorbeweging. (C) Door verder naar beneden te klikken, vult de dendriet de richtingspitten. (D) Voorbeeld van directionele pitten die niet in dendriet bevolken. In plaats daarvan is er verderop in het segment een eenzame kernel aanwezig. (E) Door met de linkermuisknop op de eenzame kern te klikken, wordt de dendriet tussen de twee punten gevuld. Als u met de rechtermuisknop klikt, wordt de tracering beëindigd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Instelpunten in getraceerde dendrieten. (A) Getraceerd dendrietsegment in afwachting van puntaanpassing. Voor het bewerken van dendrieten moeten het tabblad "Boom" en het tabblad "Bewerken" worden geselecteerd. Beide zijn geel gemarkeerd. Dendriet is geselecteerd om te bewerken met een klik met de linkermuisknop. (B) Door het geel gemarkeerde tabblad Punten te selecteren, kunt u afzonderlijke punten op het dendrietsegment selecteren. De groene punt heeft een dikte van 1,2 μm. (C) Aangepast punt om de dendriet nauwkeuriger te vullen. De nieuwe diktewaarde van het groene punt is 0,6 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Voorbeelden van beeldanalyseresultaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Voorbeeld van beeldtracering met dendrieten en spines.dat Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Voorbeeldtraceringen met dendrites.dat Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Voorbeeld dendriet afbeelding bestand.czi Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Voorbeeld dendriet afbeelding bestand.jpx Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de specifieke stappen van monstervoorbereiding, beeldvorming en het proces van kwantificering en classificatie van de dendritische wervelkolom met behulp van driedimensionale reconstructiesoftware. Deze software is een krachtig hulpmiddel dat in staat is om robuuste structurele gegevens te produceren die bijdragen aan een breed scala aan onderzoeken. Gedurende het hele proces zijn er enkele cruciale stappen die dit protocol minder methodologische last maken en de algehele output van de gegevens verbeteren. De methode voor het labelen van dendritische stekels is een van de eerste dingen die onderzoekers moeten overwegen voordat ze aan dit protocol beginnen. Problemen met de kwantificering van de wervelkolom kunnen het gevolg zijn van onvoldoende etiketteringsmethoden. Kleuring voor bepaalde eiwitten die op lage niveaus in stekels tot expressie komen, kan resulteren in signalen die te laag zijn voor de software. Er moet ook worden opgemerkt dat bias kan worden geïntroduceerd door de helderste fluorescerende dendrieten te traceren. Hoewel het onduidelijk is of verschillende fluorescerende dendrieten verschillende fysiologische eigenschappen hebben, is het nog steeds een beperking van het protocol om te overwegen. Bovendien verschijnt fluorescentie in sommige transgene lijnen, zoals de THY1-YFP-H-lijn, pas rond P21 in dendritische stekels. Dit maakt deze lijn ongeschikt voor onderzoek naar jongere ontwikkelingsmomenten. Overweging van de methode die wordt gebruikt om stekels te labelen voor de onderzoeksweg is geen triviaal aspect, aangezien de software zonder voldoende fluorescentie de bruikbaarheid heeft verminderd. Evenzo moet er rekening worden gehouden met de hardware voor beeldacquisitie. Er zijn sommige bestandstypen die minder compatibel blijken te zijn met de analysesoftware dan andere. In het bijzonder zijn ND2-bestanden geïdentificeerd als problematische bestandstypen voor effectief gebruik van de software. De softwareleveranciers raden conversie naar bestandstypen zoals JPEG2000 aan als er problemen optreden.

Weefselpreparatie en beeldacquisitie zijn ook belangrijke stappen voor hoogwaardige kwantificering van de wervelkolom. De juiste fixatie, snijden en monteren van weefsels zorgt voor een langdurig monster met minimale artefacten die de gegevensanalyse kunnen verstoren. Het in beeld brengen van het weefsel is ook niet alleen een kwestie van het maken van z-stack-afbeeldingen van het hele hersenplakje. Tijdens beeldvorming moet het altijd de bedoeling zijn om stapels dendrieten te verkrijgen voor kwantificering van de wervelkolom. De nadruk moet worden gelegd op het verwerven van z-stacks met dendrieten die gemakkelijk te traceren zijn. Een dikkere z-stapel resulteert doorgaans in meer achtergronddendrieten. Dit maakt het moeilijker om dendrieten effectief op te sporen met de software. Door tijdens de beeldvorming extra tijd te nemen om betere kandidaten voor tracering te vinden, wordt meer tijd bespaard tijdens de analyse van de kwantificering van de wervelkolom. Zorg er bovendien voor dat de z-stack-afbeeldingen de volledige dendrieten bevatten die moeten worden getraceerd. Als de dendrieten slechts gedeeltelijk zichtbaar zijn in de z-stack, zal het traceren van dendrieten en de identificatie van de wervelkolom moeilijk en onnauwkeurig blijken te zijn vanwege onvolledige 3D-weergave.

Het proces van het traceren van dendrieten en het verkrijgen van een nauwkeurig profiel van geïdentificeerde dendritische stekels kan een moeizaam proces zijn. Er zit een zekere mate van nuance in. Tijdens het traceren van dendrieten kan de door de gebruiker geleide functie soms niet werken zoals bedoeld. Soms zullen de directionele kernels niet over een bepaald segment worden gevuld of beginnen ze zich te vullen over een ongewenst segment. Een manier om dit te omzeilen is om te beginnen met een kleinere typische procesbreedte. Dit maakt de dendriet beter detecteerbaar in de software, waardoor het traceren gemakkelijker is. Als de directionele kernel niet volledig wordt gevuld, zal linksklikken op de dendriet er handmatig een plaatsen. Het zal tot een heel klein punt komen en de dendriet niet vullen, maar dat kan worden gecorrigeerd met de dikte-aanpassing zoals beschreven in stap 3.8 van het protocol. Hoewel dendrieten handmatig kunnen worden getraceerd als de software ontoereikend blijkt te zijn, is het handmatig traceren van stekels geen mogelijkheid van de software. Er zullen gevallen zijn waarin een duidelijke wervelkolom zichtbaar lijkt te zijn, maar hoe hoog de gevoeligheid van de detector ook is, de software zal deze niet detecteren. Een ding om te controleren is of de verdachte wervelkolom buiten bereik is. Als het binnen bereik is maar nog steeds niet wordt geïdentificeerd door de software, wordt deze wervelkolom uitgesloten van de analyse. Hoewel dit zelden voorkomt, is het een beperking om te overwegen. Zoals bij elke analyse die drempelwaarden en een handmatige classificatiecomponent vereist, is er de mogelijkheid om bias te introduceren. Dit probleem kan verder worden verergerd bij het vergelijken van gegevens die door meerdere gebruikers zijn gegenereerd. Het semi-geautomatiseerde karakter van deze analyse is bedoeld om de introductie van deze bias te minimaliseren, maar deze is niet volledig geëlimineerd. In ons lab was een variantie van 10% tussen onderzoekers op een standaard dataset redelijk met voldoende oefening en training. Hoewel er inspanningen zijn geleverd om vooringenomenheid te minimaliseren, is het nog steeds belangrijk om rekening te houden met vooringenomenheid tussen onderzoekers bij het evalueren van gegevens die via dit protocol worden gegenereerd.

Rekening houdend met de kleine nadelen van de software, is de output van dendritische wervelkolomanalyse met behulp van deze techniek zeer robuust. Zoals eerder beschreven, zijn er een groot aantal metrieken die kunnen worden geëxtrapoleerd uit nauwkeurige tracering van dendritische segmenten en identificatie van de wervelkolom. De mogelijkheid om informatie over het subtype van de wervelkolom te verkrijgen, biedt waardevol inzicht op een dieper niveau dan de basisstatistieken. Deze gegevens zijn belangrijk vanwege de onderlinge samenhang tussen structuur en functie. Elk subtype van de wervelkolom impliceert een functie. Dunne stekels zijn het overheersende subtype dat een overvloedige omzet ondergaat21. Dunne stekels hebben ook het potentieel om zich te ontwikkelen tot paddenstoelstekels38. Dit komt overeen met het feit dat de stekels van paddenstoelen sterk geassocieerd zijn met leren en geheugen38,39. Stompe stekels worden bovendien verondersteld een onderdeel van het leren te zijn, mogelijk als overblijfselen van paddenstoelstekels40. Hoewel filopodie niet veel voorkomt in veel volwassen weefsels, zijn het voorlopers van de wervelkolom die van cruciaal belang zijn voor de ontwikkeling 41,42. 3D-elektronenmicroscopie blijft de gouden standaard voor de meest nauwkeurige classificatie van subtypes van de wervelkolom. Hoewel deze techniek waardevol is, wordt ze beperkt door moeizame handmatige sortering en classificatie die vatbaar zijn voor menselijke fouten. Het semi-geautomatiseerde ontwerp van deze analyse vermindert het aantal gevallen waarin subjectieve vooringenomenheid zou kunnen worden geïntroduceerd. Hoewel er nadelen kunnen zijn in termen van de absolute resolutie en fluorescentie-intensiteit die nodig zijn om perfecte classificaties in dit protocol te maken, biedt het nog steeds een methodologisch minder belastend alternatief voor 3D-elektronenmicroscopie en handmatige classificatie. Bovendien is volledige dendrietanalyse van meerdere dendritische vertakkingen uit een breder staal van hersengebieden mogelijk met behulp van de analyse die in dit werk wordt beschreven. Bij elektronenmicroscopie is dit niet het geval. Door het gebruik van dit protocol is het mogelijk om structuurgerichte vragen in meerdere disciplines, inclusief maar niet beperkt tot synaptische plasticiteit, ontwikkeling en neurologische en psychiatrische stoornissen, op een betrouwbare en reproduceerbare manier te behandelen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Carolyn Smith, Sarah Williams Avram, Ted Usdin en het NIMH SNIR bedanken voor hun technische assistentie. We willen ook de Colgate University Bethesda Biomedical Research Study Group erkennen. Dit werk wordt ondersteund door het NIMH Intramural Program (1ZIAMH002881 naar Z.L.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
518F Immersion OilZeiss444960-0000-000
CryostatLeicaCM3050SFor slice preparation
Fine ForcepsFST11150-10
Hemostat ForcepsFST13020-12
Large Surgical ScissorsFST14002-16
LSM 880 Confocal MicroscopeZeissLSM 880
Microscope Cover GlassFisherbrand12-541-035
Mini-Peristaltic Pump IIHarvard Apparatus70-2027For perfusions
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1Spine Analysis Software
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1Spine Analysis Software
OCT CompoundSakura Finetek4583For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)FisherbrandF79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DICZeiss440762-9904-000
Scalpel BladeFST10022-00
Small Surgical ScissorsFST14060-09
Spatula FST10091-12
SucroseFIsherbrandS5-500
Superfrost Plus MicroslidesDiaggerES4951+
Vectashield HardSet Mounting MediumVector LaboratoriesH-1400-10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).">Gray, E. G. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).
  2. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).">Ramón Y Cajal, S. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).
  3. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).">Desmond, N. L., Levy, W. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).
  4. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).">Engert, F., Bonhoeffer, T. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).
  5. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).">Yang, Y., Wang, X. B., Frerking, M., Zhou, Q. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).
  6. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).">Oh, W. C., Parajuli, L. K., Zito, K. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).
  7. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).">Shinoda, Y., Tanaka, T., Tominaga-Yoshino, K., Ogura, A. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).
  8. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).">Markus, E. J., Petit, T. L. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).
  9. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).">Duan, H., Wearne, S. L., Rocher, A. B., Macedo, A., Morrison, J. H., Hof, P. R. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).
  10. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).">Chen, C. C., Lu, J., Zuo, Y. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).
  11. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).">Dickstein, D. L., Weaver, C. M., Luebke, J. I., Hof, P. R. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).
  12. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).">Glausier, J. R., Lewis, D. A. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).
  13. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).">Phillips, M., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).
  14. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).">Dorostkar, M. M., Zou, C., Blazquez-Llorca, L., Herms, J. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).
  15. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).">Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).
  16. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).">Cheng, C., Trzcinski, O., Doering, L. C. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).
  17. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).">Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  18. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).">Baloyannis, S. J. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).
  19. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).">Levet, F., Tonnesen, J., Nagerl, U. V., Sibarita, J. B. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).
  20. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).">Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).
  21. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).">Pfeiffer, T., et al. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).
  22. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).">Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
  23. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).">Hering, H., Sheng, M. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).
  24. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).">Jontes, J. D., Smith, S. J. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).
  25. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).">Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).
  26. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).">Berry, K. P., Nedivi, E. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
  27. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).">Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).
  28. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).">Swanger, S. A., Yao, X., Gross, C., Bassell, G. J. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).
  29. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).">Basu, S., et al. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).
  30. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).">Ekaterina, P., Peter, V., Smirnova, D., Vyacheslav, C., Ilya, B. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).
  31. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).">Li, B. Z., Sumera, A., Booker, S. A., Mccullagh, E. A. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).
  32. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).">Dickstein, D. L., et al. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).
  33. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).">Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  34. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).">Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).
  35. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).">Ferreira, J. S., et al. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).
  36. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).">Megias, M., Emri, Z. s, Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).
  37. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).">Katz, Y., et al. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).
  38. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).">Bourne, J., Harris, K. M. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).
  39. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).">Runge, K., Cardoso, C., De Chevigny, A. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).
  40. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).">Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).
  41. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).">Mattila, P. K., Lappalainen, P. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).
  42. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).">Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Spine QuantificationThree Dimensional Neuron ReconstructionDendritic Spine AnalysisSpine DensitySpine Head VolumeSpine Subtype ClassificationSynaptic PlasticityNeurolucida 360Hippocampal DendritesSpine Morphology

Related Articles