Deze studie presenteert twee cruciale experimentele technieken: de constructie van een muiswondmodel voor het beoordelen van wondsluiting en de voorbereiding van suspensies van enkele cellen uit muishuid om de celviabiliteit te behouden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Muizenwondmodellen en het bereiden van single-cell suspensies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De behandeling van acute huidletsels met volledige dikte vormt een aanzienlijke uitdaging in de klinische praktijk. De complexiteit van wondgenezing, waarbij diverse celpopulaties en de ingewikkelde wondomgeving betrokken zijn, bemoeilijkt de beoordeling van behandelingseffecten en hun interacties met behulp van traditionele experimentele benaderingen. Single-cell transcriptoomsequentietechnologie heeft de begrip van cellulaire functies en mechanismen tijdens wondgenezing gerevolutioneerd. Echter, de variabiliteit in methodologieën voor het creëren van muiswondmodellen introduceert verstorende factoren die experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. Bovendien presenteert het proces van dissociatie van muishuidtissue aanzienlijke technische obstakels, wat de kritische behoefte aan hoogwaardige single-cell suspensies voor nauwkeurige transcriptoomsequentie benadrukt. Daarom heeft deze studie tot doel de constructie van muiswondmodellen te optimaliseren om veranderingen in wondsluiting nauwkeurig te beoordelen terwijl variabelen die het daaropvolgende sequentieresultaat zouden kunnen beïnvloeden worden geëlimineerd. Daarnaast werd de voorbereiding van single-cell suspensies uitgevoerd met behulp van zowel enzympreparaatprotocollen als testkitprotocollen om de kosten en effectiviteit te optimaliseren.
Inleiding
De muis is een wijd erkend diermodel in onderzoek vanwege zijn zeer homologe genetische sequentie aan die van mensen, snelle voortplanting, kosteneffectiviteit en beheersbare grootte1. Er bestaan echter verschillen in de huidstructuur tussen muizen en mensen. Muizen hebben een duidelijke cutane membraanlaag die bijdraagt aan huidcontractie en een cruciale rol speelt in wondgenezing bij deze soort. In tegenstelling daarmee omvat de wondgenezing bij mensen voornamelijk re-epithelialisatie en de vorming van granulatieweefsel1.
Ondanks deze interspecifieke verschillen in huidstructuur blijft het muismodel de voorkeurskeuze in wondreparatieonderzoek en behoudt het aanzienlijk belang in vergelijking met andere diermodellen2,3. Bij het gebruik van muizenhuid om menselijke wondgenezingsprocessen na te bootsen, is zorgvuldige overweging van verschillende invloedsfactoren essentieel. Deze factoren omvatten het selecteren van geschikte plaatsen voor chirurgische ingrepen, rekening houden met de muizenhaarfollikelcyclus en het begrijpen van de effecten van cutane membraancontractie4,5. Het implementeren van bijbehorende maatregelen is van vitaal belang om experimentele omstandigheden te optimaliseren en de nauwkeurigheid van observatieresultaten te verbeteren.
Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) sequentieert cellen op een veel verfijnder niveau dan conventionele RNA-sequencing en heeft een veel hogere eis voor monsterkwaliteit met minimale intragroepsverschillen. Er werden meerdere experimenten uitgevoerd om een stabiel muismodel voor acute volledige dikte huiddefecten te verfijnen. Deze experimenten maakten gebruik van een combinatie van gevestigde methoden uit de literatuur en innovatieve benaderingen om wondgenezing uitgebreid te evalueren2,5. Om het wondgenezingsmodel te ontwikkelen, werd volledige dikte huidexcisieverwijdering bij muizen gebruikt om het fysiologische proces van wondreparatie en regeneratie na te bootsen. Het doel was om de mogelijke veranderingen veroorzaakt door verschillende behandelingen te beoordelen met behulp van scRNA-seq. Huidweefseldissociatie van muizen stelt voor uitdagingen, inclusief lage celviabiliteit en hoge aggregatiepercentages, tijdens de bereiding van enkele-celsuspensies6. Deze moeilijkheden kunnen resulteren in problemen zoals instrumentverstopping en abnormale celaanvang, wat de datakwaliteit kan aantasten. Gezien de aanzienlijke kosten van single-cell sequencing, is het uitvoeren van meerdere voorlopige experimenten cruciaal om de stabiliteit en betrouwbaarheid van de enkele-celsuspensie te garanderen. Deze studie beoordeelde de werkzaamheid van gemengde enzymdissociatie en de weefselkit-dissociatiemethode om de optimale aanpak voor weefseldissociatie te identificeren6,7. Deze studie legt een robuuste basis voor verdere diepgaande onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door het Ethische Comité van het zevende Medisch Centrum van het Algemene Ziekenhuis van het Chinese Volksbevrijdingsleger, China. Er werden 6 weken oude mannelijke C57/BL6 muizen gebruikt.
1. Muis wondgenezingsmodel
- Groepeering van dieren
- Wijs muizen willekeurig toe aan experimentele en controlegroepen (6 per groep). Houd muizen in een specifiek pathogenvrije (SPF) dierfaciliteit, met een temperatuur van 23-25 °C, een luchtvochtigheid van 50%-60% en een licht-donkercyclus van 12 uur.
- Bied muizen onbeperkte toegang tot standaard voedsel en geautoclaveerd leidingwater.
- Preoperatieve voorbereiding
- Beperk de muis voorzichtig met behulp van een beperking of door de muis veilig in een buikligging te houden. Laad de spuit met 1% pentobarbital natrium dat hersteld is naar kamertemperatuur, toegediend in een dosis van 0,1 mL/20 g lichaamsgewicht.
OPMERKING: De 1% pentobarbital natriumoplossing moet in een donkere omgeving worden bewaard bij 4 °C. - Reinig de buik van de muis met alcohol wattenstaafjes. Steek de spuit in een lichte hoek in de buik. Aspirieer voor injectie om te voorkomen dat er onbedoeld in de blaas of darmen wordt geïnjecteerd. Wacht 10 minuten.
- Nadat de muis niet meer trilt en niet meer reageert op prikkels, breng witte petrolatum aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen. Gebruik een scheerapparaat om langere rugharen te trimmen.
- Breng ontharingscrème aan op de rug, wacht 2 minuten en veeg voorzichtig af met vochtige gaas om schade aan de huid van de muis te voorkomen. Zorg ervoor dat de ontharingscrème niet te lang op de huid blijft liggen.
- Desinfecteer de omliggende huid voorzichtig met drie afwisselende tampons van betadine en 70% alcohol.
- Steriele huidbiopsie pons, schaar, pincet en andere instrumenten autoclaveren. Zorg voor een steriele werkruimte. Voer de volgende operatie uit op een schone chirurgische doek.
- Beperk de muis voorzichtig met behulp van een beperking of door de muis veilig in een buikligging te houden. Laad de spuit met 1% pentobarbital natrium dat hersteld is naar kamertemperatuur, toegediend in een dosis van 0,1 mL/20 g lichaamsgewicht.
- Volledige huiduitsnijding
OPMERKING: Het wondsplintmodel werd gebruikt om de effectiviteit van de behandeling voor wondgenezing te beoordelen.- Markeer met een permanente stift het bovenste centrale gebied van de rug van de muis met een cirkel met een diameter van 8 mm.
- Til de rughuid op met schone pincetten en maak de eerste snede met fijne chirurgische schaar. Houd na de eerste snede het gedeeltelijk verwijderde huidgebied vast met pincetten en snijd voorzichtig de gemarkeerde cirkels uit.
- Gebruik een op maat ontworpen roestvrijstalen ring (interne diameter 15 mm, externe diameter 18 mm). Naai de metalen ring aan de rand van de incisieplaats met 5-0 niet-resorbeerbare hechtingen, om contractie van de incisieplaatshuid te voorkomen (Figuur 1A). Gebruik roestvrij staal als ringmateriaal om roest en vervorming te voorkomen.
- Dien een enkele subcutane injectie van 0,1 mL 10% buprenorfinehydrochloride verdunning toe nabij de wond om postoperatieve pijn te behandelen.
- Breng de muis weer onder in schone individuele kooien. Plaats de muis in buikligging. Laat de muis niet onbeheerd achter voordat de muis bij kennis is.
- Observeer en fotografeer de wond van de muis om de 2 dagen om de wondgrootte te meten na anesthesie zoals beschreven in stap 1.2.
- Wondmerking voor biopsieweefsel
- Bereid het experiment voor zoals beschreven in stappen 1.1 en 1.2.
- Maak aangepaste muiswondmerkingstempels met een cirkeldiameter van 8 mm en een vierkant zijde van 10 mm (Figuur 1B).
- Plaats de muis in buikligging en desinfecteer de rughuid met alcohol wattenstaafjes. Doop de stempel in inkt. Maak een merk op het boven-middelste gedeelte van de rug van de muis met de stempel.
- Verwijder voorzichtig de volledige huidlaag van de rug langs de cirkelvormige merk met chirurgische schaar, waardoor de spierlaag volledig wordt blootgesteld. Laat de wond open zonder verband om interferentie met de staat van de wond te voorkomen. Behoud de steriliteit van de wond door de muis in een schone en gedesinfecteerde omgeving te plaatsen en de wond natuurlijk een korst te laten vormen.
- Dien een enkele subcutane injectie van 0,1 mL 10% buprenorfinehydrochloride verdunning toe nabij de wond om postoperatieve pijn te behandelen.
- Breng de muis weer onder in schone individuele kooien. Plaats de muis in buikligging. Laat de muis niet onbeheerd achter voordat de muis bij kennis is.
- Observeer en fotografeer de wond van de muis om de wondgrootte te meten na anesthesie zoals beschreven in stap 1.2.
- Voer de behandeling toe zoals beschreven in 1.4
- Behandeling toediening
- Voer 4 uur na het bij kennis komen van de muis anesthesie uit zoals beschreven in stappen 1.2.2-1.2.3.
- Injecteer subcutaan de gewenste behandeling, hier 100 µg humaan navelstrengmesenchymale stamcel-afgeleide exosome (hucMSC-Exo) opgelost in 200 µL PBS rond de incisieplaats voor de behandelingsgroep.
- Injecteer subcutaan 200 µL PBS rond de incisieplaats voor de controlegroep.
- Herhaal stappen 1.5.2 en 1.5.3 om de twee dagen gedurende maximaal 14 dagen. Inspecteer de injectieplaats op zwelling, rood
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Meerdere variaties van de procedure werden onderzocht. Stamp-protocollen genoemd hadden de voorkeur, omdat ze minimale interferentie veroorzaken in het wondgenezingsproces en de integriteit van de wond behouden tegen invloeden zoals krabben en hechtingen. Dit is om het introduceren van ruis op single-cell niveau voor de daaropvolgende sequencing te voorkomen. Het aanbrengen van wonden aan beide zijden van een muis resulteerde in merkbare verschillen in wondoppervlakte vanwege de inherente elasticiteit van de muizenhuid (...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Verschillende cruciale stappen waren essentieel voor het succes van het protocol. Deze stappen omvatten nauwkeurige voorbereiding van het wondgebied door grondig scheren en schoonmaken, het creëren van gestandaardiseerde wonden van specifieke grootte en diepte, en zorgvuldige verzorging na de wond om infecties te controleren en geschikte behandelingen toe te dienen. Standaardisering van deze procedures zorgde voor consistentie in experimentele omstandigheden, waardoor de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van resulta...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (#82373494).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 75% Alcohol | Liuhe | JIUJING500ML | |
| C57/BL6J muizen | Charles River Laboratories | ||
| Collagenase D + Dispase II | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase I | Roche | 5349907103 | |
| Collagenase IV | Roche | 5267439001 | |
| Katoenen wattenstaafjes | Haishi | MIANQIAN | |
| Doodcelverwijderingskit | Miltenyi Biotec | 130-090-10 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| gentleMAC Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Medische nylondraad | Jinlong | HM507 | |
| Multi Tissue Dissociation Kit 1 | Miltenyi Biotec | 130-110-201 | |
| punchbiopsienaad | Integra Miltex | ||
| Rode bloedcellyse-oplossing | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| Chirurgische schaar | Jinglu | JIANDAO | |
| Witte petrolatum | Shangyuan | BAIFANSHILIN |
Referenties
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wu, J., Landén, N. X. Investigation of skin wound healing using a mouse model. Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
- Ganguli-Indra, G. Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model. Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
- Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells. Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).
- Dead cell removal kit. , Available from: https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline (2015).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
- Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy. STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).
- Gao, C., Zhang, M., Chen, L. The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium. Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
