Deze studie presenteert twee cruciale experimentele technieken: de constructie van een muiswondmodel voor het beoordelen van wondsluiting en de voorbereiding van suspensies van enkele cellen uit muishuid om de celviabiliteit te behouden.
Methodenartikel
Muizenwondmodellen en het bereiden van single-cell suspensies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De behandeling van acute huidletsels met volledige dikte vormt een aanzienlijke uitdaging in de klinische praktijk. De complexiteit van wondgenezing, waarbij diverse celpopulaties en de ingewikkelde wondomgeving betrokken zijn, bemoeilijkt de beoordeling van behandelingseffecten en hun interacties met behulp van traditionele experimentele benaderingen. Single-cell transcriptoomsequentietechnologie heeft de begrip van cellulaire functies en mechanismen tijdens wondgenezing gerevolutioneerd. Echter, de variabiliteit in methodologieën voor het creëren van muiswondmodellen introduceert verstorende factoren die experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. Bovendien presenteert het proces van dissociatie van muishuidtissue aanzienlijke technische obstakels, wat de kritische behoefte aan hoogwaardige single-cell suspensies voor nauwkeurige transcriptoomsequentie benadrukt. Daarom heeft deze studie tot doel de constructie van muiswondmodellen te optimaliseren om veranderingen in wondsluiting nauwkeurig te beoordelen terwijl variabelen die het daaropvolgende sequentieresultaat zouden kunnen beïnvloeden worden geëlimineerd. Daarnaast werd de voorbereiding van single-cell suspensies uitgevoerd met behulp van zowel enzympreparaatprotocollen als testkitprotocollen om de kosten en effectiviteit te optimaliseren.
Inleiding
De muis is een wijd erkend diermodel in onderzoek vanwege zijn zeer homologe genetische sequentie aan die van mensen, snelle voortplanting, kosteneffectiviteit en beheersbare grootte1. Er bestaan echter verschillen in de huidstructuur tussen muizen en mensen. Muizen hebben een duidelijke cutane membraanlaag die bijdraagt aan huidcontractie en een cruciale rol speelt in wondgenezing bij deze soort. In tegenstelling daarmee omvat de wondgenezing bij mensen voornamelijk re-epithelialisatie en de vorming van granulatieweefsel1.
Ondanks deze interspecifieke verschillen in huidstructuur blijft het muismodel de voorkeurskeuze in wondreparatieonderzoek en behoudt het aanzienlijk belang in vergelijking met andere diermodellen2,3. Bij het gebruik van muizenhuid om menselijke wondgenezingsprocessen na te bootsen, is zorgvuldige overweging van verschillende invloedsfactoren essentieel. Deze factoren omvatten het selecteren van geschikte plaatsen voor chirurgische ingrepen, rekening houden met de muizenhaarfollikelcyclus en het begrijpen van de effecten van cutane membraancontractie4,5. Het implementeren van bijbehorende maatregelen is van vitaal belang om experimentele omstandigheden te optimaliseren en de nauwkeurigheid van observatieresultaten te verbeteren.
Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) sequentieert cellen op een veel verfijnder niveau dan conventionele RNA-sequencing en heeft een veel hogere eis voor monsterkwaliteit met minimale intragroepsverschillen. Er werden meerdere experimenten uitgevoerd om een stabiel muismodel voor acute volledige dikte huiddefecten te verfijnen. Deze experimenten maakten gebruik van een combinatie van gevestigde methoden uit de literatuur en innovatieve benaderingen om wondgenezing uitgebreid te evalueren2,5. Om het wondgenezingsmodel te ontwikkelen, werd volledige dikte huidexcisieverwijdering bij muizen gebruikt om het fysiologische proces van wondreparatie en regeneratie na te bootsen. Het doel was om de mogelijke veranderingen veroorzaakt door verschillende behandelingen te beoordelen met behulp van scRNA-seq. Huidweefseldissociatie van muizen stelt voor uitdagingen, inclusief lage celviabiliteit en hoge aggregatiepercentages, tijdens de bereiding van enkele-celsuspensies6. Deze moeilijkheden kunnen resulteren in problemen zoals instrumentverstopping en abnormale celaanvang, wat de datakwaliteit kan aantasten. Gezien de aanzienlijke kosten van single-cell sequencing, is het uitvoeren van meerdere voorlopige experimenten cruciaal om de stabiliteit en betrouwbaarheid van de enkele-celsuspensie te garanderen. Deze studie beoordeelde de werkzaamheid van gemengde enzymdissociatie en de weefselkit-dissociatiemethode om de optimale aanpak voor weefseldissociatie te identificeren6,7. Deze studie legt een robuuste basis voor verdere diepgaande onderzoeken.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door het Ethische Comité van het zevende Medisch Centrum van het Algemene Ziekenhuis van het Chinese Volksbevrijdingsleger, China. Er werden 6 weken oude mannelijke C57/BL6 muizen gebruikt.
1. Muis wondgenezingsmodel
- Groepeering van dieren
- Wijs muizen willekeurig toe aan experimentele en controlegroepen (6 per groep). Houd muizen in een specifiek pathogenvrije (SPF) dierfaciliteit, met een temperatuur van 23-25 °C, een luchtvochtigheid van 50%-60% en een licht-donkercyclus van 12 uur.
- Bied muizen onbeperkte toegang tot standaard voedsel en geautoclaveerd leidingwater.
- Preoperatieve voorbereiding
- Beperk de muis voorzichtig met behulp van een beperking of door de muis veilig in een buikligging te houden. Laad de spuit met 1% pentobarbital natrium dat hersteld is naar kamertemperatuur, toegediend in een dosis van 0,1 mL/20 g lichaamsgewicht.
OPMERKING: De 1% pentobarbital natriumoplossing moet in een donkere omgeving worden bewaard bij 4 °C. - Reinig de buik van de muis met alcohol wattenstaafjes. Steek de spuit in een lichte hoek in de buik. Aspirieer voor injectie om te voorkomen dat er onbedoeld in de blaas of darmen wordt geïnjecteerd. Wacht 10 minuten.
- Nadat de muis niet meer trilt en niet meer reageert op prikkels, breng witte petrolatum aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen. Gebruik een scheerapparaat om langere rugharen te trimmen.
- Breng ontharingscrème aan op de rug, wacht 2 minuten en veeg voorzichtig af met vochtige gaas om schade aan de huid van de muis te voorkomen. Zorg ervoor dat de ontharingscrème niet te lang op de huid blijft liggen.
- Desinfecteer de omliggende huid voorzichtig met drie afwisselende tampons van betadine en 70% alcohol.
- Steriele huidbiopsie pons, schaar, pincet en andere instrumenten autoclaveren. Zorg voor een steriele werkruimte. Voer de volgende operatie uit op een schone chirurgische doek.
- Beperk de muis voorzichtig met behulp van een beperking of door de muis veilig in een buikligging te houden. Laad de spuit met 1% pentobarbital natrium dat hersteld is naar kamertemperatuur, toegediend in een dosis van 0,1 mL/20 g lichaamsgewicht.
- Volledige huiduitsnijding
OPMERKING: Het wondsplintmodel werd gebruikt om de effectiviteit van de behandeling voor wondgenezing te beoordelen.- Markeer met een permanente stift het bovenste centrale gebied van de rug van de muis met een cirkel met een diameter van 8 mm.
- Til de rughuid op met schone pincetten en maak de eerste snede met fijne chirurgische schaar. Houd na de eerste snede het gedeeltelijk verwijderde huidgebied vast met pincetten en snijd voorzichtig de gemarkeerde cirkels uit.
- Gebruik een op maat ontworpen roestvrijstalen ring (interne diameter 15 mm, externe diameter 18 mm). Naai de metalen ring aan de rand van de incisieplaats met 5-0 niet-resorbeerbare hechtingen, om contractie van de incisieplaatshuid te voorkomen (Figuur 1A). Gebruik roestvrij staal als ringmateriaal om roest en vervorming te voorkomen.
- Dien een enkele subcutane injectie van 0,1 mL 10% buprenorfinehydrochloride verdunning toe nabij de wond om postoperatieve pijn te behandelen.
- Breng de muis weer onder in schone individuele kooien. Plaats de muis in buikligging. Laat de muis niet onbeheerd achter voordat de muis bij kennis is.
- Observeer en fotografeer de wond van de muis om de 2 dagen om de wondgrootte te meten na anesthesie zoals beschreven in stap 1.2.
- Wondmerking voor biopsieweefsel
- Bereid het experiment voor zoals beschreven in stappen 1.1 en 1.2.
- Maak aangepaste muiswondmerkingstempels met een cirkeldiameter van 8 mm en een vierkant zijde van 10 mm (Figuur 1B).
- Plaats de muis in buikligging en desinfecteer de rughuid met alcohol wattenstaafjes. Doop de stempel in inkt. Maak een merk op het boven-middelste gedeelte van de rug van de muis met de stempel.
- Verwijder voorzichtig de volledige huidlaag van de rug langs de cirkelvormige merk met chirurgische schaar, waardoor de spierlaag volledig wordt blootgesteld. Laat de wond open zonder verband om interferentie met de staat van de wond te voorkomen. Behoud de steriliteit van de wond door de muis in een schone en gedesinfecteerde omgeving te plaatsen en de wond natuurlijk een korst te laten vormen.
- Dien een enkele subcutane injectie van 0,1 mL 10% buprenorfinehydrochloride verdunning toe nabij de wond om postoperatieve pijn te behandelen.
- Breng de muis weer onder in schone individuele kooien. Plaats de muis in buikligging. Laat de muis niet onbeheerd achter voordat de muis bij kennis is.
- Observeer en fotografeer de wond van de muis om de wondgrootte te meten na anesthesie zoals beschreven in stap 1.2.
- Voer de behandeling toe zoals beschreven in 1.4
- Behandeling toediening
- Voer 4 uur na het bij kennis komen van de muis anesthesie uit zoals beschreven in stappen 1.2.2-1.2.3.
- Injecteer subcutaan de gewenste behandeling, hier 100 µg humaan navelstrengmesenchymale stamcel-afgeleide exosome (hucMSC-Exo) opgelost in 200 µL PBS rond de incisieplaats voor de behandelingsgroep.
- Injecteer subcutaan 200 µL PBS rond de incisieplaats voor de controlegroep.
- Herhaal stappen 1.5.2 en 1.5.3 om de twee dagen gedurende maximaal 14 dagen. Inspecteer de injectieplaats op zwelling, rood
Resultaten
Meerdere variaties van de procedure werden onderzocht. Stamp-protocollen genoemd hadden de voorkeur, omdat ze minimale interferentie veroorzaken in het wondgenezingsproces en de integriteit van de wond behouden tegen invloeden zoals krabben en hechtingen. Dit is om het introduceren van ruis op single-cell niveau voor de daaropvolgende sequencing te voorkomen. Het aanbrengen van wonden aan beide zijden van een muis resulteerde in merkbare verschillen in wondoppervlakte vanwege de inherente elasticiteit van de muizenhuid (Figuur 3A,B). Bilaterale puncties plaatsten de wonden dichter bij de randen, een regio die gevoelig is voor het zelf-krabgedrag van de muis. Muizen van 7 weken oud en ouder werden als ongeschikt voor de studie beschouwd, aangezien een subset van hen een onregelmatige donkerverkleuring van de dorsale huid vertoonde rond de 10e dag na de operatie, wat wees op het begin van haarhergroei (Figuur 4A). Dit introduceerde een ongewenste extra variabele.
Wanneer rubberen ringen werden gebruikt, ongeacht of er zachte of harde rubber werd ingezet, hadden deze ringen de neiging om los te laten en vaak uit de wondplaats te verschuiven binnen ongeveer 12 h door de frequente bewegingen van de muizen en de beperkte adhesieve eigenschappen van de ringen. Rubberen ringen die met hechtingen waren gefixeerd, waren gevoelig voor scheuren, waardoor herhaaldelijk hechten voor stabilisatie nodig was. Deze iteratieve hechtprocedure veroorzaakte op haar beurt extra trauma bij de muizen (Figuur 4B,C). In tegenstelling hiermee vertoonden metalen ringen een superieure stabiliteit en verbeterde retentie-eigenschappen, waardoor de effecten van re-epithelialisatie konden worden beoordeeld zonder interferentie door wondcontractie.
Gezien de mogelijkheid dat de met een metalen ring gehechte spalk buiten het wondgebied extra huidschade kan veroorzaken en niet-uniforme mechanische spanningen over de wond kan uitoefenen, werd een gestandaardiseerde stempel met vaste afmetingen gebruikt om daaropvolgende analyses te vergemakkelijken.
Het onderzoek wees uit dat de groep met de voorbeeldbehandeling (hucMSC-Exo) een sneller genezingsproces vertoonde in vergelijking met de controlegroep (Figuur 5A). Hoewel volledige genezing sneller optrad in het stempelmodel dan in de groep met de gehechte metalen ring, die wondcontractie beperkt, werd er gedurende de eerste periode van 7 dagen geen statistisch significant verschil in de genezingssnelheden waargenomen (Figuur 5B). Deze bevindingen komen overeen met eerder onderzoek door Lin et al., waaruit blijkt dat de eerste 10 dagen van de huidgenezing bij muizen primair bestaan uit re-epithelialisatie in plaats van contractie9.
Vergelijking van dissociatie
Na uitgebreide optimalisatie van de enzymsamenstelling vertoonde de combinatie van Dispase II en collagenase superieure prestaties in vergelijking met het gebruik van een enkel enzym (Tabel 1). Belangrijk is dat de aanwezigheid van rode bloedcellen of cellulair debris minimaal was, waarmee aan de essentiële criteria voor machinegebruik werd voldaan, waaronder een celviabiliteit van meer dan 85% en een aggregatiesnelheid van minder dan 20%.
Daarentegen leverde de aanpak met de testkit veelbelovende resultaten op, met een relatief hogere celviabiliteit en een lagere mate van celaggregatie (Tabel 1). Bovendien werden er geen rode bloedcellen of celfragmenten waargenomen, wat duidt op een algeheel superieure celkwaliteit in vergelijking met andere methoden.
Figuur 1: Gefinaliseerd wondmodel bij muizen. (A) Representatieve afbeelding van de gehechte op maat gemaakte metalen ring. (B) Representatieve afbeelding van de huidstempel en de uitgesneden wond. Diameter: 8 mm. Rand: 1 cm. (C) Wondsluitingssnelheid. Foutbalk: standaardfout. Tweezijdige T-test (n=6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema voor de bereiding van enkelcel-suspensies. De stappen omvatten monsterafname, dissociatie, lyse van rode bloedcellen, verwijdering van dode cellen en de uiteindelijke enkelcel-suspensie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Muiswondmodel met wonden aan beide zijden. (A) Een representatieve afbeelding van het muiswondmodel met wonden aan beide zijden wordt getoond. Witte ronde referentiediameter: 8 mm. (B) Representatieve afbeelding van wondgenezing op verschillende tijdstippen voor wonden aan beide zijden. De huid op de rug van de muis nabij de staart genas sneller dan de huid nabij de nek. Witte vierkante referentie-objectrand: 1 cm. Witte ronde referentie-objectdiameter: 8 mm. Afkortingen: POD = postoperatieve dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Muiswondmodel met enkelvoudige wonden. (A) Representatieve afbeelding van wondgenezing bij verschillende stadia van haargroei bij 7 weken oude muizen. De muizen bevinden zich op POD 10 in verschillende stadia van haargroei. Donkerdere huid genas sneller. (B) Representatieve afbeelding van rubberen adhesieringen. Rand van wit vierkant referentieobject: 1 cm. (C) Representatieve afbeelding van hechtlijnen. Diameter van wit rond referentieobject: 8 mm. Afkortingen: POD = postoperatieve dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Wondsluitingssnelheid. (A) Vergelijking tussen de controlegroep en de hucMSC-Exo-groep. Foutenbalken representeren standaardfouten. Tweezijdige T-test (n=6). (B) Vergelijking tussen de stamp- en de metalen ringgroep. Foutenbalken representeren standaardfouten. De significantie is berekend met behulp van de tweezijdige t-test (n=6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Celviabiliteitspercentage | Celaggregatiesnelheid | |
| In-house benadering | 86.90% | 18.50% |
| Testkit-benadering | 90.65% | 13.73% |
Tabel 1: Viabiliteit en aggregatiesnelheid van de twee benaderingen voor celpreparatie.
Discussie
Verschillende cruciale stappen waren essentieel voor het succes van het protocol. Deze stappen omvatten nauwkeurige voorbereiding van het wondgebied door grondig scheren en schoonmaken, het creëren van gestandaardiseerde wonden van specifieke grootte en diepte, en zorgvuldige verzorging na de wond om infecties te controleren en geschikte behandelingen toe te dienen. Standaardisering van deze procedures zorgde voor consistentie in experimentele omstandigheden, waardoor de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van resultaten werd verbeterd10.
We gebruikten wondstempelmarkering voor sequencing, omdat andere methoden extra variabelen introduceren zoals muiswondkrabben en hechtscheur2,5. Het stempelmodel verbetert de initiële consistentie van wonden bij muizen en biedt een gestandaardiseerde benchmark voor het beoordelen van wondgenezing, waardoor potentiële onnauwkeurigheden bij het schatten van de wondgenezingssnelheid in muismodellen worden verminderd. Bovendien vergemakkelijkt de stempelmarkering het gebruik van software zoals ImageJ. Omdat er echter geen verband wordt gebruikt om de wond te bedekken, heeft de stempelmethode veel hogere ontsmettingsvereisten voor de omgeving. Het experiment moet worden herhaald als er een infectie optreedt.
Biologische variabiliteit tussen individuele muizen kan variabiliteit introduceren in experimentele resultaten, wat grotere steekproeven vereist voor robuuste statistische analyses. Dit model kan worden uitgebreid naar andere sequencingtechnieken, zoals ruimtelijke sequencing, om zijn bruikbaarheid verder te verbeteren.
Het optimaliseren van de omstandigheden voor scRNA-Seq dissociatie en het selecteren van geschikte dissociatiemethoden zijn kritische stappen in het experimentele workflow. Momenteel omvatten de meest gebruikte methodologieën enzymatische vertering in combinatie met de aanbevolen 10x genomics reagent-gebaseerde aanpak11. Opmerkelijk is dat enzymatische vertering aanzienlijk kosteneffectiever is dan de reagent-gebaseerde methode; het vereist echter meerdere voor-experimentele iteraties om de enzymselectie en verteringsduur te optimaliseren.
In deze studie werden voorlopige experimenten uitgevoerd met verschillende enzymcombinaties. De geselecteerde methode voldeed aan de basisvereisten voor kwaliteitscontrole in de downstream ondanks het ontbreken van een 10x genomics reagent kit specifiek ontworpen voor muis volledige-dikte huiddissociatie. In plaats daarvan werd de multi-weefsel dissociatie kit 1 gebruikt om hoogwaardige single-cel suspensies te verkrijgen. Het is echter belangrijk om de relatief hoge kosten geassocieerd met deze methode te noteren, hoewel deze superieure stabiliteit biedt in vergelijking met in-house enzymverteringstechnieken. Voor waardevolle monsters wordt het gebruik van de 10x genomics reagent-gebaseerde dissociatiemethode aanbevolen.
Het is cruciaal om rekening te houden met de mogelijke impact van interindividuele variabiliteit op cellevensvatbaarheid, aangezien dit kan resulteren in sommige monsters die niet aan de vereiste criteria voldoen en daardoor de downstream datakwaliteit beïnvloeden12.
Aan de positieve kant biedt deze methode mogelijkheden voor integratie met ruimtelijke transcriptomie of andere multi-omics benaderingen, waardoor een meer uitgebreid analytisch raamwerk wordt geboden13. Bovendien benadrukken de potentiële klinische toepassingen de veelzijdigheid en relevantie ervan buiten basisonderzoekscontexten.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (#82373494).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 75% Alcohol | Liuhe | JIUJING500ML | |
| C57/BL6J muizen | Charles River Laboratories | ||
| Collagenase D + Dispase II | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase I | Roche | 5349907103 | |
| Collagenase IV | Roche | 5267439001 | |
| Katoenen wattenstaafjes | Haishi | MIANQIAN | |
| Doodcelverwijderingskit | Miltenyi Biotec | 130-090-10 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| gentleMAC Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Medische nylondraad | Jinlong | HM507 | |
| Multi Tissue Dissociation Kit 1 | Miltenyi Biotec | 130-110-201 | |
| punchbiopsienaad | Integra Miltex | ||
| Rode bloedcellyse-oplossing | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| Chirurgische schaar | Jinglu | JIANDAO | |
| Witte petrolatum | Shangyuan | BAIFANSHILIN |
Referenties
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wu, J., Landén, N. X. Investigation of skin wound healing using a mouse model. Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
- Ganguli-Indra, G. Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model. Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
- Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells. Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).
- Dead cell removal kit. , Available from: https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline (2015).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
- Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy. STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).
- Gao, C., Zhang, M., Chen, L. The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium. Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
Herprints en machtigingen
