Methodenartikel

Driedimensionale celkweekmodellen om de epitheelbarrière bij eosinofiele oesofagitis te onderzoeken

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66503

⸱

10 mei 2024

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een protocol verstrekt voor de cultuur van menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistof-interfacecultuur. De lucht-vloeistofinterfacecultuur van slokdarmorganoïden kan worden gebruikt om de impact van cytokines op de slokdarmepitheelbarrière te bestuderen.

Samenvatting

Het plaveiselepitheel van de slokdarm wordt direct blootgesteld aan de omgeving en wordt continu geconfronteerd met vreemde antigenen, waaronder voedselantigenen en microben. Het handhaven van de integriteit van de epitheelbarrière is van cruciaal belang voor het voorkomen van infecties en het voorkomen van ontstekingen veroorzaakt door onschadelijke van voedsel afgeleide antigenen. Dit artikel biedt vereenvoudigde protocollen voor het genereren van menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistofinterfaceculturen uit biopsieën van patiënten om het epitheelcompartiment van de slokdarm te bestuderen in de context van weefselhomeostase en ziekte. Deze protocollen zijn in het afgelopen decennium belangrijke wetenschappelijke mijlpalen geweest en beschrijven driedimensionale orgaanachtige structuren van van patiënten afgeleide primaire cellen, organoïden en lucht-vloeistofinterfaceculturen. Ze bieden de mogelijkheid om de functie van specifieke cytokines, groeifactoren en signaalroutes in het slokdarmepitheel te onderzoeken binnen een driedimensionaal kader met behoud van de fenotypische en genetische eigenschappen van de donor. Organoïden geven informatie over weefselmicroarchitectuur door het transcriptoom en proteoom na cytokinestimulatie te beoordelen. Lucht-vloeistof-interfaceculturen daarentegen maken de beoordeling van de integriteit van de epitheliale barrière mogelijk door middel van transepitheliale weerstand (TEER) of macromolecuulfluxmetingen. Het combineren van deze organoïden en lucht-vloeistof-interfaceculturen is een krachtig hulpmiddel om onderzoek naar verminderde slokdarmepitheliale barrièrecondities te bevorderen.

Inleiding

Slokdarmontsteking brengt de integriteit van de epitheelbarrièrein gevaar 1,2,3,4,5, zoals waargenomen bij eosinofiele oesofagitis (EoE), een door Th2 gedomineerde chronische ontstekingsziekte van de slokdarm 6. EoE werd voor het eerst beschreven inde jaren 1990 7,8 en wordt voornamelijk geïnduceerd door voedselantigenen 9,10,11,12,13. De meest voorkomende symptomen van EoE bij de volwassen bevolking zijn dysfagie en voedselimpactie14. Bij kinderen manifesteert EoE zich meestal met groeiachterstand, voedselweigering, braken en buikpijn15. Genoomwijde associatiestudies (GWAS) hebben EoE-risicogenen geïdentificeerd die betrokken zijn bij de integriteit van de epitheliale barrière, waardoor het epitheel in de focus van EoE-onderzoek is komen te staan 16,17,18. EoE-transcriptomics toonden verder aan dat een verstoord differentiatieproces en een reactieve hyperplasie van de basale zone de aangetaste barrièrefunctie van het slokdarmepitheel veroorzaken 3,5,19,20,21,22. Het vroege begrip dat EoE een Th2-gemedieerde ziekte is6 leidde tot de ontdekking van IL-13 als een drijvende mediator door de epitheliale integriteit te verstoren 3,4,21,23. Experimentele systemen die het mogelijk maken om cytokine-gemedieerde effecten op de epitheelintegriteit te ontleden van intrinsieke barrièrestoornissen door genetische predispositie, bieden de mogelijkheid om het complexe samenspel tussen immuuncellen en het epitheel in EoE te bestuderen. Menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistof-interface (ALI)-culturen zijn voorgesteld als waardevolle hulpmiddelen om de gevolgen van cytokinestimulatie op de epitheelintegriteit te analyseren.

Het eerste protocol voor het genereren van van volwassen weefselspecifieke stamcellen (ASC) afgeleide slokdarmorganoïden werd vijf jaar na de eerste gepubliceerde rapporten van darmorganoïden in 2009 vastgesteld met behulp van intestinale Lgr5+ ASC's die het epitheelcompartiment van de dunne darm recapituleerden24. DeWard et al. waren pioniers op het gebied van het genereren van organoïden uit slokdarmepitheelcellen van muizen25. In 2018 genereerden Kasagi et al. menselijke slokdarmorganoïden uit de onsterfelijke menselijke plaveiselepitheelcellijn EPC2-hTERT en primaire van patiënten afgeleide cellen26. In hetzelfde jaar genereerden Zhang et al. met succes geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide slokdarmorganoïden. Ze schetsten het belang van remming van TGFβ en botmorfogenetisch eiwit (BMP) voor de ontwikkeling van slokdarmvoorlopercellen (EPC) en de cruciale rol van Notch-signalering bij de differentiatie van het gestratificeerde plaveiselepitheel26,27. Trisno en collega's vulden deze bevindingen aan door Sox2 te identificeren als een Wnt-remmer die het ontwikkelingslot richt op slokdarmdifferentiatie28. De daaropvolgende verfijningen van protocollen, mediumsamenstelling en kweekomstandigheden verhoogden de vormingssnelheid van organoïden en maakten subcultuur en herstel van organoïden na cryopreservatie mogelijk 26,29,30,31,32. Hoewel deze organoïden krachtige instrumenten zijn voor het bestuderen van weefselarchitectuur en expressie van potentiële doelgenen na stimulatie met cytokines, zullen slokdarmorganoïden niet de mogelijkheid bieden om transepitheliale weerstand (TEER) of macromolecuulflux te meten als directe metingen voor barrière-integriteit. Zoals eerder beschreven door Sherrill en collega's22, maken ALI-culturen die epitheliale differentiatiemodelleren 4 directe beoordelingen van de epitheliale integriteit mogelijk. Het combineren van van patiënten afgeleide organoïden en ALI-culturen is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van weefselarchitectuur en integriteit van de epitheliale barrière in EoE.

Hier zijn procedures met instructies voor het isoleren van levensvatbare cellen uit slokdarmbiopsieën en het opzetten van slokdarmorganoïde- en ALI-culturen die verder kunnen worden gebruikt om de effecten van cytokinen op de integriteit van de barrière te bestuderen.

Protocol

De procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van Noordwest- en Centraal-Zwitserland (EKNZ; Project-ID 2019-00273). Alle patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voor het experimentele gebruik van biopsieën vóór het endoscopisch onderzoek. De reagentia en apparatuur die in het onderzoek worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Celisolatie voor slokdarmorganoïden van patiënten

OPMERKING: Een lijst van de mediumbestanddelen voor het kweken van menselijke slokdarmorganoïden is opgenomen in tabel 1.

  1. Verkrijg de biopsieën.
    OPMERKING: In de huidige studie worden twee biopsieën van één slokdarmsegment verkregen tijdens oesofagogastroduodenoscopie met een biopsietang met behulp van een gastroscoop met een werkkanaal van 2,8 mm.
  2. Breng de biopsieën over in een in de handel verkrijgbaar keratinocytenserumvrij medium (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE).
    OPMERKING: Biopsieën kunnen tot gebruik enkele uren op ijs worden bewaard.
  3. Vervang het KSFM-medium door 1 ml Dispase I (10 E/ml) en incubeer de biopsieën gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Centrifugeer de biopsieën bij kamertemperatuur bij 300 x g gedurende 2 minuten.
  5. Zuig de Dispase op met een pipet van 1000 μl zonder de biopsieën en de celrestpellet aan te raken.
  6. Spoel de biopsieën af met 1 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
  7. Centrifugeer de biopsieën bij kamertemperatuur bij 300 x g gedurende 2 minuten.
  8. Zuig het supernatans op met een pipet van 1000 μl.
  9. Incubeer de biopsieën met 500 μL trypsine-EDTA (0,05%) bij 37 °C gedurende 10 minuten terwijl ze schudden bij 800 tpm.
  10. Voer mechanische verstoring uit door herhaaldelijk op en neer pipetteren totdat een eencellige suspensie is verkregen.
  11. Filtreer de cellen door een celzeef van 70 μm met behulp van de rubberen zuigerkop van een tuberculinespuit.
  12. Was de zeef met 2-4 ml soja-trypsineremmer (250 μg/ml).
  13. Filtreer de cellen door een celzeef van 35 μm met een opklikdop op een polystyreenbuis van 5 ml met ronde bodem.
  14. Breng de eencellige oplossing over in een conische buis van 15 ml.
  15. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  16. Zuig het supernatans op met een pipet van 1000 μl.
  17. Resuspendeer de cellen in 100 μL KSFM-medium.
  18. Meng 10 μL trypanblauw met 10 μL celsuspensie.
  19. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller.

2. Organoïdecultuur op basis van de patiënt

  1. Voeg na het tellen 1-2 ml KSFM toe aan de celsuspensie.
  2. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  3. Zuig het supernatans op met een pipet van 1000 μl zonder de celkorrel te verstoren.
  4. Resuspendeer de celpellet in de hydrogelmatrix van het basale membraanextract (BME) (40 μL BME per 20.000 cellen).
    OPMERKING: Bewaar na het toevoegen van de BME de cellen op ijs om voortijdige stolling van de BME te voorkomen.
  5. Snijd een pipetpunt van 200 μl af om het stroperige BME-celsuspensiemengsel op te zuigen.
  6. Vorm druppeltjes van 40 μl in een voorverwarmde (37 °C) suspensiecelkweekplaat.
  7. Incubeer de plaat zonder medium gedurende 20-30 minuten bij 37 °C om ervoor te zorgen dat de BME-druppels stollen.
  8. Voeg voorverwarmd KSFM-C medium toe aangevuld met 10 μM Y27632 (ROCK-remmer) voor de eerste twee dagen van de kweek.
  9. Vervang het medium om de dag door een nieuw KSFM-C-medium (zonder Y27632 en +/- cytokine van belang).
  10. Zuig het medium op en kras de druppels weg met de pipetpunt terwijl u continu 1 ml Dispase II (1,5 E/ml) aan het putje toevoegt.
  11. Breng het BME-dispasemengsel over in een centrifugebuis van 15 ml en incubeer het gedurende 20 minuten bij 37 °C in een schudwaterbad om de BME te verteren.
  12. Centrifugeer bij 250 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C en zuig de Dispase II op.
  13. Ga te werk volgens het protocol van de rente-uitlezing (bijv. RNA-isolatie, eiwitisolatie of fixatie met 4% PFA voor histologie).

3. Celisolatie voor patiënt-afgeleide lucht-vloeistof interface (ALI) culturen

  1. Verkrijg de biopsieën. Tijdens slokdarmgastroduodenoscopie met behulp van een gastroscoop met een werkkanaal van 2,8 mm worden twee biopsieën genomen uit één slokdarmsegment met een biopsietang.
  2. Plaats de biopsieën in een in de handel verkrijgbaar keratinocytenserumvrij medium (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE) en enkele uren bewaren op ijs tot gebruik.
  3. Vervang KSFM door 1 ml Dispase (10 E/ml). Incubeer de biopsieën daarna gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Centrifugeer de biopsieën bij kamertemperatuur bij 300 x g gedurende 2 minuten.
  5. Verwijder de Dispase met een pipet van 1000 μl zonder de biopsieën en de celrestpellet aan te raken.
  6. Was de biopsieën met 1 ml DPBS.
  7. Draai de biopsieën bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten rond op 300 x g .
  8. Zuig het supernatans op met een pipet van 1000 μL.
  9. Incubeer de biopten in 500 μl trypsine-EDTA (0,05%) bij 37 °C gedurende 10 minuten en meng continu met 800 tpm tijdens de incubatie.
  10. Verstoor de biopsieën mechanisch met herhaaldelijk op en neer pipetteren totdat een eencellige suspensie is verkregen.
  11. Haal de gedissocieerde cellen door een celzeef van 70 μm met een rubberen zuigerkop van een tuberculinespuit en verzamel de cellen in een kegelvormige buis van 50 ml.
  12. Was de zeef met 2-4 ml soja-trypsineremmer (250 μg/ml) om de resterende cellen uit de zeef te verwijderen.
  13. Filtreer de cellen met een celzeef van 35 μm, klik de dop in een polystyreenbuis van 5 ml met ronde bodem.
  14. Breng de cellen over in een conische buis van 15 ml.
  15. Centrifugeer bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
  16. Verwijder het supernatans met een pipet van 1.000 μl.
  17. Resuspendeer de celpellet in 4 ml KSFM-medium (Ca2+ 0,09 mM), inclusief 10 μM Y27632.
  18. Breng de cellen over in een T25-celkweekkolf.
  19. Om de primaire keratinocyten uit te breiden, kweekt u de cellen tot 60%-80% samenvloeiing gedurende ongeveer 1 week.
    OPMERKING: Passage (P)0 vormt eilandjeachtige celconglomeraten en is geen monolaag. Primaire keratinocyten vormen monolagen vanaf P1.
  20. Passage bij 60%-80% confluentie en opnieuw zaaien P1 in 2-3 T25 of 1-2 T75 celkweekkolven.
  21. Doorgang P1 opnieuw wanneer keratinocyten een monolaag vormen met 60%-80% confluentie.

4. Patiënt-afgeleide lucht-vloeistof interface (ALI) cultuur

  1. Zaad P2 primaire keratinocyten op transwell-inserts voor de ALI-cultuur.
    OPMERKING: Zaad 400.000 cellen in 12 putjes (200.000 keratinocyten per 0,6cm2) in 500 μL KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE).
    1. Zaad 150.000 cellen in 24 putjes (155.000 keratinocyten per 0,5cm2) in 100 μL KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE).
    2. U kunt ook 24 uur invriezen in het KSFM-medium (Ca2 + 0,09 mM + 10% DMSO) bij -80 °C en de ingevroren cellen vervolgens overbrengen naar vloeibare stikstof voor later gebruik.
      OPMERKING: Bij gebruik van bevroren injectieflacons, na ontdooien nog een keer passeren voordat de cellen voor de ALI-cultuur worden gebruikt.
  2. Voeg medium toe aan het onderste putje onder het inzetstuk van de transwell-cultuurplaat.
    OPMERKING: Voor platen met 12 putjes: 1,5 ml KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE). Voor platen met 24 putjes: 600 μL KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE).
  3. Vervang de gemiddeld tot hoge calcium KSFM (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE) na 2 dagen.
  4. Vervang het KSFM-medium met een hoog calciumgehalte om de dag tot dag 7.
  5. Voer luchtlift uit op dag 7 door het medium uit de bovenste kamer op te zuigen en het medium in de onderste kamer te vervangen door KSFM met een hoog calciumgehalte (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE) met 10 ng/ml KGF (=FGF7), 75 μg/ml ascorbinezuur (AA).
    1. Optioneel: Voeg cytokine van belang in de gewenste concentratie toe aan het medium.
  6. Vervang het medium om de dag tot dag 14.

5. Meting van transepitheliale elektrische weerstand (TEER)

  1. Steriliseer de elektrode van de TEER-meter door deze gedurende 10-15 minuten onder te dompelen in een putje met een plaat van 24 putjes met 5% natriumhypochloriet.
  2. Spoel het 5% natriumhypochloriet af door de elektrode onder te dompelen in 4 opeenvolgende putjes met steriel ddH2O en de elektrode aan de lucht te laten drogen.
  3. Stel de blanco in door één elektrode in de put en de tweede elektrode in het transwell-inzetstuk te plaatsen, deze te vullen met PBS en de TEER te meten.
    OPMERKING: Aanbevolen volumes voor TEER-metingen: Voor 12 putjes (1900 μL in de put en 900 μL in de inzet). Voor 24 putjes (750-1000 μL in de put en 250 μL in de inzet).
  4. Vervang het medium van de ALI-culturen door steriel PBS op kamertemperatuur.
    OPMERKING: Verwijder het medium uit de onderste put en, in een tweede stap, uit het transwell-inzetstuk. Voeg op dezelfde manier PBS eerst toe aan het inzetstuk en vervolgens aan het onderste putje om te voorkomen dat de ALI-cultuur loskomt van het transwellmembraan.
  5. Plaats de TEER-meterelektroden in de experimentele putjes met ALI-culturen en voer de TEER-metinguit 1.
    NOTITIE: Voer om de dag TEER-metingen uit voordat het medium wordt vervangen.

6. Macromoleculaire flux

  1. Verdun de FITC-Dextran (3-5 kDa) stockoplossing tot een werkconcentratie van 1 mg/ml.
    OPMERKING: Bescherm FITC-Dextran altijd tegen blootstelling aan licht.
  2. Maak een verdunningsrij met afnemende FITC-concentratie (1000 μg/ml tot 0,25 μg/ml) als standaard voor de uitlezing.
  3. Voeg 500 μL FITC-dextranoplossing (1 mg/ml) toe aan de bovenste kamer van de transwell en 1,5 ml medium (+/- cytokine van belang) in het onderste compartiment en plaats de plaat in de incubator.
  4. Verzamel 120 μL medium uit het onderste compartiment op de respectievelijke tijdstippen (bijv. 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min en 180 min).
  5. Pipetteer duplicaten (50 μl/putje) van elk tijdstip in een zwarte transparante vlakke bodemplaat met 96 putjes.
  6. Exciteer de FITC-dextran bij 490 nm en lees de emissie af op een golflengte van 520 nm met behulp van een plaatlezer.
  7. Bereken de hoeveelheid macromoleculaire flux volgens de standaard.

Resultaten

Slokdarmorganoïden zullen groeien uit primaire cellen die zijn geëxtraheerd uit biopsieën van patiënten volgens de instructies van het meegeleverde protocol, zoals gedocumenteerd met een omgekeerde helderveldmicroscoop (Figuur 1). Epitheliale ASC's beginnen binnen de eerste twee dagen van de kweek op een zelforganiserende manier celclusters te vormen na het zaaien van de geïsoleerde cellen in het basaalmembraanextract, dat als steiger dient. De grootte en het aantal celclusters, waarneembaar met een omgekeerde helderveldmicroscoop, nemen in de eerste week continu toe (Figuur 2). Op dit punt missen de celclusters echter de ui-achtige structuur die kenmerkend is voor het meerlagige plaveiselepitheel van een ASC-afgeleide slokdarmorganoïde. Op dag 9 van de kweek worden de ui-achtige meerlagige structuur en een groeiende verhoornde kern in het midden van de organoïde duidelijk (Figuur 2A). De organoïdecultuur kan tot 21 dagen worden volgehouden26. Het is echter aangetoond dat de organoïden tussen dag 11 en dag 14 volledig rijpen en hun maximale grootte bereiken. Vanaf dag 11 wordt het kweekproces voornamelijk gekenmerkt door het bevorderen van keratinisatie en het verminderen van metabolisch actieve, levensvatbare cellen 5,26. De optimale tijd om organoïden op te halen voor experimenten hangt dus af van de gewenste differentiatiefase en valt tussen 5 en 11 dagen.

Er zijn tot 3 passages mogelijk voordat de organoïden stoppen met groeien, omdat de toenemende keratinekern het aantal levensvatbare cellen vermindert. De organoïden kunnen op de gewenste dagen worden geoogst voor RNA- of eiwitisolatie om gen-/eiwitexpressie te analyseren of voor histologie en biobanking.

De initiële celisolatiestappen voor de ALI en de organoïdecultuur zijn identiek. Voordat de ALI-cultuur kan worden vastgesteld, moeten de vers geïsoleerde primaire cellen worden uitgebreid in tegenstelling tot het organoïdeprotocol. Na de tweede passage worden de primaire keratinocyten gezaaid op transwell-inserts en gekweekt in een medium met een lage calciumconcentratie om monolaagvorming te induceren en voortijdige differentiatie van de geïsoleerde primaire keratinocyten te voorkomen. Na 48 uur, wanneer een confluente monolaag wordt gevormd, wordt de calciumconcentratie van het medium verhoogd tot 1,8 mM, waardoor differentiatie en stratificatie van de epitheellaag wordt geïnduceerd. Na 7 dagen stelt de luchtbrug de apicale kant van het meerlagige epitheel bloot aan lucht om keratinisatie te veroorzaken. De ALI-culturen kunnen meestal tot 14 dagen worden gehandhaafd (Figuur 2B). TEER-metingen en macromoleculaire fluxexperimenten zullen de functionaliteit van het epitheel monitoren. Hier werden TEER-metingen uitgevoerd in ALI-culturen van primaire slokdarmkeratinocyten, in primaire keratinocyten ALI-culturen met een NIH/3T3-fibroblastvoedingslaag op de bodem van elk putje, en in primaire keratinocyt-ALI-culturen met een NIH/3T3-fibroblastvoedingslaag op elk inzetstuk (Figuur 2C).

figure-results-1
Figuur 1: Het proces van slokdarm organoïde kweek door de patiënt. Een diagram ter illustratie van de procedure voor het verzamelen van monsters, celisolatie, organoïdeteelt en mogelijke experimentele toepassingen van van patiënten afkomstige slokdarmorganoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Vorming en differentiatie van slokdarmorganoïden afkomstig van patiënten. (A) Representatieve helderveldbeelden van slokdarmorganoïden gekweekt uit primaire cellen van patiëntenbiopsie. (B) Representatieve helderveldbeelden van slokdarm-ALI-culturen gekweekt uit van biopsie afgeleide primaire cellen op dag 14. Schaal balken: 50μM. (C) Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) metingen op aangegeven dagen in lucht-vloeistofinterface (ALI)-culturen van primaire slokdarmkeratinocyten, ALI gekweekt uit primaire keratinocyten met een NIH/3T3 fibroblastvoedingslaag op de bodem van elke put, en ALI gekweekt uit primaire keratinocyten met een NIH/3T3 fibroblastvoedingslaag op elk inzetstuk onder de keratinocytenlaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

GemiddeldKSFMKSFM-C
Basis mediumKeratinocyt-SFMKeratinocyt-SFM
SupplementenPenicilline/Streptomycine1%1%
Extract van runderhypofyse (BPE)50 μg/ml50 μg/ml
Epidermale groeifactor (EGF)1 ng/ml1 ng/ml
Calciumchloride (CaCl2)0,09 mM0,6 mM
Y-27632 (ROCK-remmer)-10 μM

Tabel 1: Primaire cell-afgeleide slokdarm organoïde media. Lijst van de gemiddelde bestanddelen voor het kweken van menselijke slokdarmorganoïden. SFM: Serumvrij medium.

Discussie

De aangeboden procedures maken het mogelijk om van patiënten afgeleide organoïden en ALI-culturen te kweken met een hoge kans op succes. Het organoïdenprotocol is aangepast van het eerste gepubliceerde protocol dat de generatie van menselijke slokdarmorganoïden rapporteert26 en van een recent gepubliceerd protocol32. Sherill en collega's hebben het ALI-model22 beschreven. Organoïden en ALI-kweekmodellen helpen elkaar bij het bestuderen van de impact van cytokines en andere mediatoren op de slokdarmepitheelbarrière in contexten van slokdarmaandoeningen, zoals EoE 5,26.

Een voordeel van het organoïdeprotocol is de eenvoud in het kweekproces en de samenstelling van het celkweekmedium. In tegenstelling tot andere op ASC en PSC gebaseerde protocollen, die meestal de toevoeging van meerdere dure supplementen en groeifactoren 24,25,27,28,33 vereisen, is het KSFM-medium relatief goedkoop. Het vereist alleen de toevoeging van menselijke recombinante epitheliale groeifactor (hEGF) en runderhypofyse-extract (BPE). KSFM is een basismedium dat is geoptimaliseerd voor het kweken van keratinocyten en elimineert de noodzaak van een fibroblast feeder laag34. Het is noodzakelijk om de Ca2+-concentratie van de KSFM te titreren van 0,09 mM tot 0,6 mM met behulp van CaCl2 om het KSFM-C-medium te verkrijgen dat wordt gebruikt voor organoïdecultuur. ALI-culturen vereisen een hogere Ca2+-concentratie van 1,8 mM dan het organoïdemodel. De hogeCa2+-concentratie is essentieel om keratinocytdifferentiatie op gang te brengen, waardoor de vorming van de typische ui-achtige configuratie van meerlagig plaveiselepitheel dat aanwezig is in slokdarmorganoïden 26,34,35 en de epitheliale stratificatie in ALI-culturen wordt vergemakkelijkt 22.

Het voorkomen van voortijdige differentiatie van keratinocyten, het genereren van organoïden en ALI-culturen vereist het vermijden van hoge Ca2+-concentraties tijdens celisolatie. Vroege differentiatie vermindert de vorming van kolonies en belemmert de zelforganiserende vorming van organoïden en de vorming van een samenvloeiende monolaag van ongedifferentieerde keratinocyten als basis van ALI-culturen. Het gebruik van serumhoudende media om de enzymatische activiteit van trypsine tijdens celisolatie te stoppen, schaadt een succesvolle organoïdegeneratie door voortijdige differentiatie op gang te brengen, vergelijkbaar met het gebruik van een met Ca2+ verrijkt medium tijdens celisolatie36. In plaats daarvan wordt een soja-trypsineremmer of een andere serumvrije trypsineremmer aanbevolen om de enzymatische reactie na biopsie-vertering met trypsine te stoppen. Het kweekmedium wordt tijdens de eerste twee dagen van de kweek aangevuld met de Rho-kinase (ROCK)-remmer Y27632 om de kolonievormingssnelheid te verhogen. Remming van ROCK heeft anti-apoptotische effecten, voorkomt senescentie van keratinocyten en verbetert zo de vormingssnelheid van organoïden37,38.

Het zaaien van ongeveer 20.000 cellen in een BME-druppel van 40 μl wordt aanbevolen om een bloeiende organoïdecultuur te garanderen en 150.000 tot 400.000 cellen voor de ALI-cultuur. Een adequaat aantal cellen zaait garandeert voldoende materiaal voor latere transcriptomics, proteomics en histologie. Bij gebruik van cellijnen zoals de menselijke slokkepitheelcellijn EPC2-hTERT, kan het aantal zaaicellen worden verlaagd vanwege de verhoogde organoïdevormingssnelheid die door deze cellijnwordt vertoond 26. Dit fenomeen wordt waarschijnlijk toegeschreven aan de homogeniteit en superieure synchroniciteit van de celcyclus die wordt aangetoond door cellijnen in vergelijking met van biopsie afgeleide primaire cellen. De onsterfelijke EPC2-hTERT-cellijn behoudt ook zijn proliferatieve capaciteit, waardoor een oneindige passatie van organoïden mogelijk is.

Omgekeerd kunnen menselijke organoïden afkomstig van slokdarmbiopten niet worden gehandhaafd voor langdurige kweek26,28. De afname van delende, levensvatbare cellen in volledig ontwikkelde slokdarmorganoïden en een afnemende snelheid van organoïdevorming bij elke passage26 geeft aan dat het verlies van proliferatieve capaciteit in van primaire cellen afgeleide organoïden te wijten is aan de terminale differentiatie en keratinisatie van voorlopercellen. Eerdere pogingen om de proliferatieve capaciteit te behouden door het kweekmedium aan te vullen met Noggin, Wnt3a of A83-01 waren niet succesvol 26,28,32. Daarom blijft biobanking op lange termijn van van patiënten afkomstige slokdarmorganoïden een uitdaging die in toekomstige studies moet worden aangepakt.

De komst van organoïdecultuur heeft nieuwe experimentele mogelijkheden met zich meegebracht die de ontdekking van belangrijke ontstekingsmediatoren en omgevingsfactoren die verantwoordelijk zijn voor epitheelveranderingen in EoE 5,39,40,41,42 sterk mogelijk hebben gemaakt. Desalniettemin is het essentieel op te merken dat ASC- en PSC-afgeleide slokdarmorganoïden beperkingen hebben, omdat ze niet perfect alle cellulaire compartimenten van de slokdarm samenvatten. ASC-afgeleide organoïden recapituleren het epitheelcompartiment 24,26,27,33, terwijl PSC-afgeleide organoïden de epitheel-, endotheel- en mesenchymale compartimenten recapituleren 28,43,44. Alle huidige organoïdemodellen missen echter de immunologische micro-omgeving. In een recente studie zijn menselijke slokdarmorganoïden en ALI-culturen gestimuleerd met cytokines uit de IL-20-cytokinefamilie om een nieuw aspect van de disfunctie van de epitheliale barrière in EoE5 te ontcijferen. De combinatie van beide driedimensionale cultuurmodellen evalueerde indirecte en directe metingen van de integriteit van de epitheliale barrière. Meer publicaties zullen waarschijnlijk slokdarmorganoïden gebruiken in combinatie met ALI-culturen om de effecten van gedefinieerde cytokines op het epitheel op te helderen. Hoewel deze benadering de complexiteit van de overspraak tussen het immuunsysteem en het epitheel vermindert om de functie van specifieke mediatoren op het epitheel te onthullen, negeert het vele andere mogelijk betrokken factoren. Het combineren van de organoïde en organ-on-a-chip-technologie kan een oplossing bieden voor deze beperking. De op microfluïdica gebaseerde organ-on-a-chip-technologie kan de luminale en basolaterale micro-omgeving van buisvormige organen nabootsen, waardoor in- en uitstroom van immuuncellen en andere circulatoire en luminale componenten mogelijk wordt. Dit maakt het mogelijk om interacties tussen het epitheel en immuuncellen bij homeostase en ziekte te onderzoeken45,46. De succesvolle kweek van fysiologisch gepolariseerde organoïden van nierbuisjes met een intacte epitheelbarrière en een functioneel transepitheliaal ionentransport op een organ-on-a-chip-platform47 ondersteunt het uitgebreide gebruik van van patiënten afgeleide organoïde-op-een-chip-technologie. Bovendien wordt een andere vooruitgang in het gebruik van de organoïde-op-een-chip-technologie gedemonstreerd door de uitgebreide kweek van organoïden afkomstig van primaire cellen door een luminale stroom door de microfluïdische kanalen aan de apicale zijde van buisvormige organoïden te implementeren om het afstoten van epitheelcellen te elimineren46. Dergelijke ontwikkelingen benadrukken het potentieel van deze technologie om in vivo-omgevingen in vitro te repliceren.

Het vermogen om 3D-organoïden te kweken die op alles lijken, van het epitheelcompartiment tot een bijna compleet mini-orgaan met de meeste celtypen, dringt aan op mogelijke klinische toepassingen 5,26,46. Hoewel er de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang is geboekt, moeten er nog meer obstakels worden overwonnen voordat organoïden in de klinische praktijk kunnen worden gebruikt. Een belangrijke hindernis voor de klinische implementatie van organoïden is de aanwezigheid van dierlijke eiwitten in het kweekmedium en de ECM-producten van de steigers. Hoewel er al dierbare, eiwitvrije media voor keratinocytenkweek beschikbaar zijn en er onlangs BPE-vrije KSFM-varianten zijn verschenen, lijkt het produceren van dierlijke-eiwitvrije ECM-alternatieven met vergelijkbare eigenschappen en kweekresultaten als traditionele ECM-producten een grotere uitdaging. Onlangs is een potentieel veelbelovend volledig chemisch gesynthetiseerd alternatief gemeld48. Desalniettemin is er momenteel geen commercieel toegankelijk ECM-product dat vrij is van dierlijke oorsprong.

Slokdarmorganoïden en ALI-culturen zijn essentiële instrumenten voor het bestuderen van EoE. De cultuur van organoïden en ALI-culturen met de verstrekte protocollen hier dienden als basis voor nieuwe onthullingen over de betrokkenheid van het epitheelcompartiment bij eosinofiele oesofagitis 5,26,39,41,42,49,50. De eenvoudige implementatie van deze protocollen en de voortdurende vooruitgang van driedimensionale celcultuurtechnologieën vergemakkelijkt de experimentele benadering van de in vivo-omgeving, wat resulteert in een betere vertaalbaarheid van ontdekkingen en mogelijk een geleidelijke vermindering van dierproeven.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De SNSF-subsidie 310030_219210 aan J.H.N. ondersteunde de publicatie van dit manuscript zonder beperkingen. Figuur 1 is tot stand gekomen met behulp van BioRender.com.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1250 µL Griptip - FilterIntegra4445
300 µL Griptip - FilterIntegra4435
70 µM cell strainerSarstedt83.3945.070
Ascorbic AcidSigma-Aldrich (Merck)A4544
Bovine pituitary extractGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Calcium chlorideSigma-Aldrich (Merck)21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension culturesGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, PathclearR&D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automated Cell CounterNanoEntekEVE-MC
EVE Cell counting slideNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFalcon352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextranSigma-Aldrich (Merck)FD4average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Human recombinant epidermal growth factorGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 ProteinR&D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL Integra3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL Integra3016
Syringe 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dihydrochlorideTocris (Bio-Techne)1254

Referenties

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355(2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755(2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), e1010 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593(2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), e515 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), e507 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109(2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106(2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 1 Suppl 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), jcs.260990 (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416(2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736(2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773(2020).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Slokdarm organo denlucht vloeistofinterfaceepitheliale differentiatiekeratinocytcultuurtransepitheliale weerstandcytokinestimulatieMAP kinasepad
Driedimensionale celkweekmodellen om de epitheelbarrière bij eosinofiele oesofagitis te onderzoeken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.